間欠的ファスティングは腸内細菌叢を調節し、肥満と宿主のエネルギー代謝を改善する

2023年4月9日 10:59

オープンアクセス
発行：2023年4月7日
間欠的ファスティングは腸内細菌叢を調節し、肥満と宿主のエネルギー代謝を改善する

https://www.nature.com/articles/s41522-023-00386-4

Xiangwei Hu、
カイ・シャー（Kai Xia）、
...
段盛琳
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npj Biofilms and Microbiomes 9巻記事番号：19 (2023) この記事を引用する
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メートル法詳細
アブストラクト
間欠的絶食（IF）は、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスに基づき腸内細菌叢を調節することが示されている、減量の有望なパラダイムである。ここでは、幅広い体格指数（BMI）を持つ72名の中国人ボランティアが3週間のIFプログラムに参加し、最初の身体測定および腸内細菌叢の状態にかかわらず、臨床パラメータの改善を伴う平均3.67kgの体重減少が観察された。介入前後に糞便サンプルを採取し、ショットガン・メタゲノムシークエンスに供した。デノボアセンブリーにより2934個のメタゲノム（MAG）が得られた。プロファイリングにより、介入後にParabacteroides distasonisとBacteroides thetaiotaomicronが有意に濃縮され、これらの相対量と肥満や動脈硬化性心疾患（ASCVD）に関連するパラメータとの間に逆相関が見られた。介入後に濃縮されたMAGは、糖質活性酵素の豊富さと多様性を示し、コハク酸生成とグルタミン酸発酵に関連する遺伝子の相対存在量が増加した。
はじめに
経済の発展や近代的な欧米の食生活やライフスタイルの普及に伴い、肥満が世界的な問題となっています1。1980年と比較すると、2015年には肥満人口は倍増し、その内訳は子ども1億770万人、大人6億370万人となっています。さらに、世界の年間死亡者数400万人のうち60％以上が肥満と関連しています2。慢性代謝疾患として、肥満は2型糖尿病3,4、心血管疾患4、いくつかの種類のがんの素因となることが知られています5。肥満の治療と関連疾患の予防のために、手術、薬物療法、運動療法、絶食療法など、さまざまなタイプの介入が適用され、研究されてきました。
断食の1つの戦略として、間欠的断食（IF）は、体重減少および関連する臨床的改善に関して一貫した性能を示し、近年、世間の注目を集めている6。115人の肥満女性を対象とした並行群設計によるランダム化比較試験では、3ヶ月のIF介入後に平均4kgの体重減少が見られたが、対照的に従来のエネルギー制限による平均体重減少は2.4kgであった。さらに、IF後のインスリン抵抗性の低下（平均0.34単位）は、従来の絶食プログラム（平均0.20単位）と比較して大きかった7。また、他の研究でも、IF介入のパフォーマンスは、フィジカルトレーニングプログラムよりも優れていたことが報告されています8,9。これらの結果から、IFは肥満対策の選択肢の一つとして期待されています。しかし、ほとんどの研究が肥満の欧米人集団を対象に行われているため、IF介入が東アジアの集団や体重・体脂肪が正常な人に有益であるかどうかは十分に議論されていない。
腸内細菌叢は、肥満と関連疾患に重要な役割を果たしている10,11。腸内細菌叢の組成と機能ポテンシャルの変化は、栄養素の吸収を刺激し、宿主の代謝を調節することによって、肥満を予防または促進することができます12、13、14、15。したがって、腸内細菌叢のリモデリングは、肥満の予防と治療のための魅力的な戦略となっている16,17。腸内細菌叢と食習慣の相互作用も研究されている。食事摂取の種類と時間が腸内細菌叢の日内リズムを変化させることが報告されている18,19,20。また、マウスを用いた先行研究では、隔日絶食に伴う腸内細菌叢の変化が、白色脂肪組織の褐変や血圧の低下と関連することが示唆された21,22。しかし、ヒトの腸内細菌叢におけるIFによる変化、特に種レベルでの変化はよく分かっておらず、この変化がどのように体重減少を促進するのか、詳細は不明なままです。
本研究では、普通体型から肥満体型まで体重の異なる72名の中国人成人参加者に3週間のIF介入を行い、体重、体格指数（BMI）、動脈硬化指数（AI）など複数の臨床パラメータに顕著な改善が見られることを明らかにしました。IFによる腸内細菌叢の分類学的組成と機能性の変化、およびこれらの変化と臨床的改善との相関について、ショットガン・メタゲノムシークエンスアプローチに基づいて調査しました。その結果、5：2 IFの短期介入により、腸内細菌叢の分類学的組成と機能的潜在能力がベースラインに依存しない方法で有意に変化し、Parabacteroides distasonisやBacteroides thetaiotaomicronなどの有益と考えられる種の相対存在量の増加に関連することが示唆された。この種は有益代謝物の合成や分泌を通じて体重減少や宿主代謝改善をもたらすと考えられる。
結果
IF介入後の体重減少および臨床的改善
図1aに示すように、5：2プログラムを実施した72名の成人中国人ボランティアを対象に、3週間の介入試験を実施しました。ボランティアは、普通体型の人から肥満体型の人まで、さまざまな人が参加しました（補足表1）。参加者全員について、介入前と介入後の両方で17の臨床パラメータが測定されました。その結果、BMI、体重、AIなどの肥満関連パラメータに有意な改善が認められました（図1b、補足図1、補足表1）。体重は平均3.67kg（調整後p＜0.0001）、BMIは平均1.32（調整後p＜0.0001）、AIは平均1.53（調整後p＜0.0001）減少した。これらの変化は、本研究で適用した5：2プログラムの効率性を証明するものである。
図1：研究デザインおよび3週間のIF介入後の臨床的改善。
a 本試験の模式図。週5日の非断食日には、夕食の主食としてミールリプレイスメントパウダーを配置し、参加者には自由摂取を指示した（「通常摂取」と表示）。不連続の2日間は、食事代替パウダーとプロテインスティックによる500-600kCal（参加者の通常摂取量の約25％）のエネルギー摂取とした。 b 体重指数（BMI）、体重、動脈硬化指数（AI）は介入後に有意な改善を示した（***は調整後p<0.001、ペアウィルコクソンテスト）。この改善は、異なるレベルのBMIを持つ参加者間で一様であった。箱の境界はそれぞれ第1四分位（Q1）と第3四分位（Q3）を表し、中央の線は中央値を、ひげはQ1-1.5×（Q3-Q1）からQ3＋1.5×（Q3-Q1）の範囲を表す。 c介入前のメタゲノム集合ゲノム（MAGs）の相対存在量に基づいてランダムフォレスト分類器の受信動作特性（ROC）カーブを示す。曲線下面積（AUC）＝0.570、0.681、0.582をそれぞれ示す。
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さらに、IF介入によって引き起こされた臨床的な改善は、肥満の参加者に限定されず、正常なBMIの個人でも観察されたことが示されました。例えば、異なるレベルのBMIを持つ参加者は、介入後、平均で2.82kg（普通、p<0.0001）、3.84kg（過体重、p<0.0001）、4.82kg（肥満、p=0.0003）の体重を減らし、AIもそれぞれ1.23 (p < 0.0001), 1.50 (p < 0.0001) and 2.10 (p < 0.0001) 低下しました。測定されたパラメータのほとんどについて、IFによる臨床的変化の傾向は、肥満（n = 17）、過体重（n = 26）、および普通（n = 29）の個人間で一貫して観察された（図1bおよび補足図1）。注目すべきは、介入前の腸内細菌叢の分類学的組成に基づくランダムフォレスト分類器は、特定の参加者のBMI、体重、またはAIの改善が中央値より高いか低いかを予測する性能が低いことであり（図1c）、IF介入に対する大きな反応は、一般のカロリー制限に関する研究23で見られたように腸内細菌叢のベースライン分類学組成に依存していないことが示唆された。
IF介入は腸内細菌叢の分類学的組成に大きな変化をもたらす
IF介入による腸内細菌叢への影響を特徴付けるため、参加者に介入前と介入後の糞便サンプルの提供を依頼しました。72組の一致したサンプルが得られ、その後、ショットガン・メタゲノミック・シーケンスが行われた。
合計で、241の既知の属と538の既知の種を含む2934のMAGが、de novoアセンブルとビニングによって回収されました。介入前後で採取したサンプルを比較したところ、合計201のMAGで存在量に差があることがわかり、147がParabacteroides（30 MAG）、Bacteroides（51 MAG）、Agathobacter（22 MAG）、Fusicatenibacter（10 MAG）、Clostridium Q（17 MAG）、Clostridium（4 MAG）、Coprococcus（7 MAG）、Enterocloster（6 MAG）の公知種として注釈されていました（補表 2）。特に、介入後に濃縮されたMAGの大部分は、Parabacteroides属、Bacteroides属、Fusicatenibacter属と注釈され、介入後に存在量が減少したMAGは、Agathobacter属、Clostridium属、Clostridium Q属、Coprococcus属、Enterocloster属と注釈されました（図2）。Parabacteroides merdae、Parabacteroides distasonis、Fusicatenibacter saccharivorans、Bacteroides uniformis、Bacteroides thetaiotaomicron、Bacteroides cellulosilyticusとして注釈されたMAGは平均して正のフォールドチェンジを示し、Coprococcus sp900066115とAgathobacter rectalisとして注釈されたものは平均して負のフォールドチェンジを示した（補図 2）．
図2：IF介入後の腸内細菌叢の分類学的組成の変化。
a 介入前後で濃縮されたメタゲノム集合ゲノム（MAG）のみが含まれる属の系統樹。外側のバープロット円は、MAGsの倍率変化を表す。マゼンタのバーは介入後の有意な濃縮を、青のバーは介入後の存在量の減少を示す（調整p < 0.05, paired Wilcoxon test）。木はPhyloPhlAn（v3.0.51）で構築し、gtree（v5.6.2）で可視化した。 b 介入前と介入後のいずれかに濃縮されたMAGsのフォールドチェンジ。フォールドチェンジが0未満のMAGはIF介入前に濃縮され、値が0以上のものは介入後に濃縮された。
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注目すべきは、IF介入後に存在量が増加したParabacteroidesおよびBacteroidesとアノテーションされたMAGの約3分の1は、エネルギー代謝および肥満の発症に有益な効果を発揮することが以前に示されている種であるP. distasonisおよびB. thetaiotaomicronに割り当てられました23、24、25。
IF介入後に濃縮された生物種は、豊富で多様な糖質活性酵素（CAZymes）を保有している。
種レベルでの分類学的注釈があり、介入前後で存在量が異なる147のMAGにおける糖質活性酵素の多様性を調査した。IF介入後に存在量が増加したMAGでは、より多くの種類の、より高いコピー数の糖質活性酵素をコードする遺伝子が見出された。これらの遺伝子の多くは、グリコシド加水分解酵素（GH）およびグリコシルトランスフェラーゼ（GT）として注釈されており、腸内細菌叢が多様な炭素源を利用する能力が向上していることが示唆された。(図3a）注目すべきは、Bacteroides属が主に多糖類リアーゼ（PL）の豊富さに寄与していることで、他の属のMAG、特に介入前に多く存在していたMAGでは、PLコード遺伝子はほとんど確認されませんでした。
図3：介入前後で濃縮されたMAGにおける炭水化物活性酵素の豊富さと多様性。
a IF介入前後で濃縮されたメタゲノム集合ゲノム（MAGs）で観察された糖質活性酵素サブファミリーの数および糖質活性酵素（CAZymes）コード遺伝子のコピー数の比較 b MAGsの相対存在量と参加者の臨床パラメータとの間の関連性のヒートマップ。赤は正の相関を、青は負の相関を表す。AIアテローム性動脈硬化指数；ALTアラニンアミノトランスフェラーゼ；BFR体脂肪率；DBP拡張期血圧；LDL-C低密度リポタンパク質コレステロール；UA尿酸。 c AIと負の相関を持つMAGの濃縮。倍率が0未満のMAGはIF介入前に濃縮され、値が0以上のMAGは介入後に濃縮された。
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IFによる腸内細菌叢の変化は、宿主の代謝および肥満の臨床パラメータと相関している
腸内細菌叢の変化が参加者の血液生化学的パラメータや介入後の臨床的改善と相関しているかどうかをさらに評価するために、MAGの相対存在量と宿主の臨床測定値の相関を決定しました。その結果、合計136個のMAGが少なくとも一つの臨床パラメータと有意な相関があることが判明しました（図3b、補足表3）。特に、B. thetaiotaomicronの8個のMAGとP. distasonisの17個のMAGを含む25種86個のMAGがAIと負の相関を示し、そのうち84個は血清低密度リポタンパク質コレステロール（LDL-C）とも負の相関を示した。
特に、P. distasonisとB. thetaiotaomicronとしてアノテーションされた25個のMAGのすべてを含む、AIと負の相関を示した86個のMAGのうち67個は、IF介入後に濃縮されたのに対し、介入前に高い相対量を示したMAGのほとんどは、Clostridium Q sp003024715とAgathobacter rectalisに割り当てられた（図3c）。
IF介入により、腸内細菌叢によるコハク酸合成の可能性が高まる
分類学的組成の変化に加えて、腸内細菌叢の機能的可能性の変化も判定した。クリーンリードを公開されている腸内細菌遺伝子カタログ26にマッピングし、機能的に注釈された遺伝子の存在量を算出した。
調整済みp < 0.01と｜fold-change｜> 1の閾値を用いると、25のKEGGオルソログ（KO）がIF介入後に有意に濃縮されたが、16のKOの相対存在量が減少した（図4a）。さらに、レポーターZスコアを算出し、機能パスウェイの濃縮度を判定した。その結果、炭素代謝、クエン酸サイクル、五炭糖リン酸経路が介入後に有意に強化され、腸内細菌叢による炭水化物変換率の向上と短鎖脂肪酸（SCFA）産生の増加につながる可能性があることがわかった（図4b）。
図4：IF介入は腸内細菌叢の機能的可能性を変化させる。
a ボルケーノプロットでは、各ドットはKEGGオルソログ（KO）を表し、色で区別されている。実験前に濃縮されたKOを赤、介入後に濃縮されたKOを青で示す。 b X軸はレポーターのZスコア、Y軸は機能パスウェイを示す。Zスコアが0未満の経路は介入前に濃縮され、0以上の値を持つ経路は介入後に濃縮された。バーの濃さは各パスウェイの完全性を示す。 c KOの相対的存在量と臨床パラメータとの関連性を示すヒートマップ。赤は正の相関、青は負の相関を表す。AI atherosclerosis index, AST aspartate aminotransferase; BFR body fat ratio, DBP diastolic blood pressure, γ-GT gamma-glutamyl transferase, LDL-C low-density lipoprotein cholesterol, TC total cholesterol, TG triglyceride.
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さらに、KOの相対的な存在量と臨床パラメータとの相関を解析した。その結果、少なくとも一つの臨床パラメータと相関する220個のKOが同定された（図4cおよび補足表4）。血清LDL-Cや血清トリグリセリド（TG）と負の相関を持つKOと、血清総コレステロール（TC）、AI、体脂肪と負の相関を持つKOの間には、高い均一性が観察された。特に、コハク酸の合成に関与するK00844（ヘキソキナーゼ）、K06859（グルコース-6-リン酸イソメラーゼ）、K15037（ビオチンカルボキシル担体タンパク質）、チアミン合成に関与するK03146（システイン依存性アデノシン二リン酸チアゾールシンターゼ）（補足図3）の三つのKO、（補足図3）。4）、胆汁分泌に関わるK05681（ATP-binding cassette, subfamily G）（補足図5）は介入後に有意に増加したが、高脂血症や動脈硬化性心疾患（ASCVD）に深く関わる5パラメータとは負の相関が見られた。最後に、ホペンの合成に関与するK06045（スクアレン-ホペン/テトラプレニル-β-クルクメンサイクラーゼ）は血清γ-グルタミルトランスフェラーゼ（γ-GT）と正の相関があり、未特定のK08087は血清アスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）と正の相関がありました。
考察
時間制限食（TRF）と代替日IF（ADF）は、高齢者や肥満者の減量に有効な手段であると報告されているが27,28、これらのプログラム、あるいは他のIFプログラムが、体重や体脂肪が正常な人にも有益な臨床変化をもたらすかどうかについて、詳しい情報は得られていない。本研究では、健康な普通体重（18.5kg/m2≦BMI＜24.0kg/m2）から過体重（24.0kg/m2≦BMI＜28.0kg/m2）、肥満（BMI≧28kg/m2）を含む72名のボランティアに対して、5：2 IFプログラムを3週間実施し、非断食日に追加の身体トレーニングや食事のコントロールは実施せず平均体重3.67 kgを減少させた。また、臨床パラメータも改善され、特に肥満、高脂血症、ASCVDに関連するパラメータが改善されました。さらに、一般的なカロリー制限を用いた減量研究23で得られた結論とは対照的に、ベースラインの腸内細菌叢は、本研究で適用したIFプログラムの性能に影響を与えなかった。したがって、本研究の結果は、IF介入は、幅広いBMI範囲内の集団において、腸内細菌叢の組成に関係なく、体重減少のための有望な戦略である可能性を示唆している。
以前のマウス研究では、腸内細菌叢が隔日絶食による白色脂肪組織の褐変に寄与している可能性が報告され、BacteroidesとParabacteroidesの相対量が同時に減少することが報告された21。しかし、ヒトや他のIFプログラムにおいても同様の相関が存在するかどうかは不明である。他のマウス研究では、異なる食事断食プログラムによって誘発される腸内細菌叢の変化を調査しているが、BacteroidesやParabacteroidesの相対存在量に有意な変化があることを報告したものはほとんどない29．IFによって誘発される腸内細菌叢の変化と体重減少や宿主の代謝との関係を評価するためのヒトの研究は比較的少なく、これらの少数の研究であっても、16S rRNA遺伝子アンプリコン配列のアプローチのみが適用されており、種レベルでの解析が妨げられている29,30。これらの研究では、多発性硬化症患者と健康な成人において、ADFとラマダンはそれぞれBacteroidaceaeとBacteroidesの相対存在量の増加をもたらすと報告した31,32が、他の報告では、IFによる腸内細菌叢の分類学的組成の変化は、発表論文に一貫性がなかった。本研究では、複数のBacteroidesとParabacteroidesの種、特に報告されている有益菌であるP. distasonisとB. thetaiotaomicronの相対存在量が、IF介入後に有意に増加することが観察された。この変化は、これまでのマウス研究で報告されたものとは異なり、マウスとヒトの腸内細菌叢の違いを強調し、IF介入に対する反応と関連する分子メカニズムが異なる可能性を示唆している。我々の解析では、IFに富むB. thetaiotaomicronとP. distasonisの相対存在量と血清LDL-CおよびAIとの間に有意な負の相関が見られ、これらの細菌がIF介入による有益な効果に役割を果たしている可能性を示唆した。なお、ASCVD患者では、Bacteroides属とP. distasonisの相対量がともに減少していることが報告されている33。
IF、IFが誘発する腸内細菌叢の変化、および参加者の臨床的改善との関連をさらに検討するために、腸内細菌叢の機能的潜在能力の変化を調査した。糖質活性酵素の豊富さと多様性を分析することで、IF介入後に濃縮された種の大半はBacteroides属とParabacteroides属であり、GH、GT、PLをコードする遺伝子の豊富さと多様性が顕著に高いことがわかった。多様な炭水化物や糖タンパク質を消化する微生物の存在量が大幅に増加したのは、IF介入によって引き起こされた断続的な炭素源の不足の結果であると考えられる。特に、Bacteroides属はPLをコードする遺伝子を多く持つことが判明したが、調査した他の種ではこのファミリーの遺伝子はほとんど観察されなかったことから、食事による絶食介入に対する微生物の反応においてBacteroides属が独自の役割を果たしていることが示唆された。
一方、B. thetaiotaomicronの濃縮は、グルタミン酸からγ-アミノ酪酸（GABA）への発酵を促進し、血漿中のグルタミン酸濃度を低下させると考えられている24、34。本研究では、介入後にコハク酸合成とグルタミン酸代謝に関連するKOの存在量が増加し、これらのKOと肥満、高脂血症、ASCVDの臨床パラメータとの間に負の相関があることが確認された。また、これらの菌種と機能性遺伝子の相対量が同時に増加したことから、IF介入により、P. distasonisやB. thetaiotaomicronなどのCAZymeに富む腸内細菌が濃縮され、コハク酸やGABAを生産して肥満や合併症を緩和することに寄与しているという仮説が導かれた。
本研究の主な目的は、断続的な絶食が腸内細菌叢と宿主の生理学的パラメータにどのような影響を与えるか、またこれらの要因の潜在的な関連性を調べることであるため、参加者の総数に伴う制約のもと、関連解析の統計力を高めることができるIF食事パターンを遵守した個人数を最大化するために、単一グループデザインを適用しました。しかし、対照群がないため、本研究ではIFと通常の食事パターンとの比較を行うことはできなかった。介入後に観察された顕著で統計的に有意な臨床的改善は、介入が十分であったことを示唆しているが、制御されていない共変量も寄与しているかもしれない。本研究で得られた知見を検証し、IF介入そのものによる効果と、参加者自身が気づかなかったプログラム中の行動の変化とをより明確に区別するためには、さらなる大規模ランダム化臨床試験が必要である。
IF、腸内細菌叢、宿主代謝の関係を明らかにするためには、さらなるin vitroおよびin vivoでの研究が必要であるが、本研究の結果は、IF介入によって直接引き起こされた改善の「副作用」ではなく、IFによって誘発された腸内細菌叢の変化が体重減少やその他の関連する臨床的改善に寄与することを示唆した。最後に、IF介入後に濃縮された他の細菌、特にFusicatenibacter saccharivoransの遺伝的および機能的特徴は、まだ十分に明らかにされていない。これらの微生物が果たしうる役割については、さらなる研究が必要である。
最近の総説では、IFとその腸内細菌叢への影響に関するヒトの臨床試験が要約されている29,30。本研究の大きな利点として、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスではなく、深いメタゲノムシーケンスとde novoアセンブリを実施し、種や株のレベルでも腸内細菌叢に関する情報、および機能的可能性に関する情報が得られた。さらに、詳細なメタゲノムデータに基づく関連解析により、臨床パラメータと特定の腸内細菌との相関が明らかになりました。また、35名以下の参加者を対象とした過去のヒト研究と比較して、参加者数が比較的多いため、BMIの幅が広い参加者の分析が可能であり、BMIに関係なく臨床症状が一様に改善する傾向が示唆されました。
しかし、本研究のいくつかの限界にも言及する必要がある。前述のように、本研究には対照群が含まれておらず、通常の自由食の厳格な遵守は医療従事者によって監督されなかった。参加者はすべての食事摂取を記録するよう指示され、3週間の介入期間中は普段の生活習慣を守るよう求められたが、コントロールされていない共変量も観察された変化に寄与している可能性がある。また、血漿のアテローム指数（AIP）はTGを考慮し、潜在的な心血管イベントの予測に優れた性能を発揮する可能性が報告されているが35,36、対数変換されているため、特定の回帰分析で問題を引き起こすかもしれない。そこで、本研究では、簡便性の利点から現在も多くの臨床医が使用しているAIを使用し、AIPは使用しなかった。さらに、本研究では腸管通過時間の測定は行わなかった。これまでの研究で、腸管通過時間が腸内細菌叢の構成に影響を与えることが報告されているため37,38,39、IFと腸内細菌叢の相互作用はこの因子によって調節されている可能性がある。最後に、IF、腸内細菌叢、宿主の代謝を結びつけるメカニズムを調査し検証するための実験は、本研究では行わなかった。
方法について
試験のデザインおよび参加者の登録について
介入は、中国湖南省のXiangya Hospitalで実施された。研究のデザインとプロトコルは、Xiangya Hospital、Central South Universityの医療倫理委員会、およびBGIのInstitutional Review Boardによって承認された。各参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。本研究は、承認されたガイドラインおよび規則に従って実施された。包含基準は以下の通りである： (i) 18-55歳、(ii) 18kg/m2＜BMI＜30.0kg/m2。除外基準は、（i）過去4週間の抗生物質治療、（ii）高血圧、糖尿病、その他の代謝性疾患の診断、（iii）妊娠、胃腸の異常や摂食障害、胃腸の手術歴、全身疾患、（iv）コルチコステロイド薬、β受容体ブロッカー、その他所見に影響を与える可能性のある薬の使用である。94名のボランティアが同意書に署名し、本研究の基準に従って評価された。そのうち81名が基準を満たし、全試験に参加した。参加者のうち72名は、必要なサンプルをすべて提供した。
介入、全身情報収集、血液生化学測定
IF介入は、若干の調整を加えながら、5：2プログラムに沿って3週間実施された。不連続の断食日2日間、エネルギー摂取量は500-600kCalに設定され、食事代替パウダーとプロテインスティックによって供給された。参加者は、断食日中、追加の食品にアクセスできないサナトリウムに滞在するよう求められた。他の週5日は、夕食の主食としてミールリプレイスメントパウダーを用意し、通常の食事を提供することで自由な食生活を送ってもらった。参加者は、絶食日の食事ごとに写真を撮り、毎日、襄陽病院の看護師と医師に送ってもらい、その遵守状況を評価してもらった。特に、写真を送らなかったり、明らかに摂取量が少なかったり、多かったりする参加者は、1回目に注目され、2回目には「分析対象外」と表示されることになる。参加者は、プログラム期間中、運動や社会活動において普段の習慣を守るよう求められ、インフォームド・コンセント用紙に署名することで、上記のすべてのルールに従うことを了承した。血液生化学検査と糞便サンプル採取は、介入開始の1日前と最終日に実施された。血液生化学検査と身体検査では、17項目の臨床パラメータを測定し、AIは（TC-HDL-C）/HDL-Cとして算出した。(補足表1)
糞便DNA抽出とショットガン・メタゲノミック・シーケンス
参加者の合計175個の糞便サンプルを、以前に評価した試薬に基づき、MGIEasy Stool Sample Collection Kit（商品番号1000003702、MGI Tech Co.Ltd、中国）を用いてIF介入前後で収集した40．DNAは、MagPure Fast Stool DNA KF Kit B (MD5115, Magen Biotechnology Co., Ltd, China)で抽出し、製造者の指示41に従ってChina National GeneBank (CNGB) に定量した。ショットガン・メタゲノミック・シーケンス・ライブラリーは、社内の方法によって構築した。具体的には、各サンプルの200 ng DNAをCovaris S220 (Covaris LLC., USA)でサイズ選択せずに約300 bpの断片にせん断し、MGIEasy Universal DNA Library Prep Set (Item No. 1000006985, MGI Tech Co., Ltd., China) を用いて下流反応を行った。その後、ライブラリーはCNGBのDIPSEQ-T1（BGI-Research, China）で塩基配列を決定した。合計で、1サンプルあたり25.96±12.17（平均±s.d.）GbpのPE150生データが得られた。シーケンスデータの品質管理は、総合精度のアルゴリズムに基づき、内部で開発したcOMG toolkitのモジュールを用いて行い、サンプルあたり25.12 ± 11.84 (平均± s.d.) Gbpのクリーンリードを生成した42。175個の糞便サンプルから得られたメタゲノミックシーケンスデータは、de novoアセンブルとビニングに使用されたが、必要なサンプルと情報をすべて提供した72人の参加者の144レコードのみが他の分析に含まれた。
デノボメタゲノミックアセンブルとコンティグビニング
MEGAHIT43（v1.1.3）を用いて、サンプルのクリーンリードを個別にアセンブルした。VAMB44 (v3.0.1) を用いて、-minfasta 10000 -e 400のオプションでメタゲノムのビニングを行った。メタゲノムのビンは、dRep45 (v3.2.0) で dereplicate -sa 0.99 -nc 0.3 -p 6 -comp 80 -con 10 のオプションで複製解除し、非冗長なMAGカタログを取得した。プロファイリングは、metaWRAP（v1.3.2）のquant_binsモジュールを用いてSalmonで行い、各サンプル中のMAGの存在量を算出しました。
MAGの分類学的アノテーション
Genome Taxonomy Database Toolkit (GTDB-Tk Release 95)を用いて、脱複製MAGの分類学的アノテーションを実施した。既知の種のゲノムと比較して平均塩基同一性（ANI）が95％未満のビンは、未知の種レベルのゲノムビン（uSGBs）とした。
MAGsの系統解析
MAGの遺伝子予測およびゲノムアノテーションは、それぞれProkka（v1.14.5）およびmetaWRAPのbins annotating module（v1.3.2）で実施した。さらに、2934個の代表的なMAGの系統樹をPhyloPhlAn（v3.0.51）で構築し、R（v3.6.2）のggtreeパッケージ（v2.3.3.993）を用いて可視化しました。
微生物叢の組成変化の解析と一般的統計量
72名の参加者から得た144の対の糞便サンプルのデータが解析に含まれた。各サンプルのMAGの相対存在量は、変換せずに使用した。パーミュテーショナル多変量分散分析（PERMANOVA）は、veganパッケージ（v2.5-7）のadonis()関数を使用して実行した。身体検査結果、血液生化学パラメータ、MAGの相対存在量の変化を統計的に検証するために、対の両側ウィルコクソン順位和検定を適用した（補足表11および補足表2）。多重比較の偽発見率を補正するために、Benjamini-Hochberg FDR調整を使用した。
微生物機能ポテンシャルの解析と比較
クリーンな糞便メタゲノムシーケンスリードをIGC26にマッピングし、上述のcOMGツールキットを用いてサンプル中の遺伝子の相対存在量を算出した。プロファイルのアノテーションには、IGCのオリジナルKOアノテーションを使用した。KOの相対存在量の変化は、ペアの両側ウィルコクソン順位和検定とBenjamini-Hochberg FDR調整を用いて、上記のように解析した。また、機能的経路の全体的な変化を評価するために、既述の46のように各KEGG経路のレポーターZスコアを算出した。
メタゲノム・ワイド・アソシエーション・スタディ
腸内細菌と臨床パラメータとの関連は、ℓ1-penalized robust regression method47を適用して解析した。身体検査の数値結果および血液生化学パラメータを応答変数とし、介入前または介入後のいずれかに濃縮されたMAGまたはKOの対数10変換相対存在量を予測変数行列とした。回帰は、ILAMMパッケージ（v1.0.0）を用いてR（v4.1.2）で実施した。tfNcvxHuberReg()関数は、intercept = Tというオプションで使用したが、他のパラメータやオプションはデフォルトで設定されていた。
データの入手方法
宿主除去メタゲノム配列データは、CNGB Sequence Archive (CNSA, https://db.cngb.org/cnsa/)にアクセッション番号CNP0002844で公開されています。身体検査と血液生化学測定の結果は、補足資料に掲載されています。
コードの入手方法
本研究のデータの解析と可視化に使用したコードは、本原稿に付随する補足情報に記載されています。
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謝辞
メタゲノム解析のパイプラインに関してZhongkui Xiaから示唆を受け、関連解析に関してQiang Sun博士の助力を得たことを感謝する。Xiangya Hospitalの臨床チームは、参加者のケアに貢献したことに感謝する。本研究は、以下の資金提供を受けている：北京機能性ステープルの革新的開発と慢性疾患のための栄養介入に関する重要な研究所 FF201901 (L.X.). Shenzhen Engineering Laboratory of Detection and Intervention of Human Intestinal Microbiome grant DRC-SZ [2015]162 (L.X., M.H.). 広東省ゲノム読み書き重点実験室 grant 2017B030301011 (X.X.)。北京市朝陽区科学技術計画プロジェクト助成金CYSF2216 (K.X.)。
著者情報
著者ノート
これらの著者は均等に貢献した： Hu Xiangwei、Kai Xia、Minhui Dai。
著者と所属
BGI-Shenzhen、深セン、518083、中国
胡香偉、陳嘉佑、姜芳芳、于潔瑶、楊煥明、王健、徐迅、金新、Karsten Kristiansen、蕭亮、潘茂翰
鄭州大学BGIカレッジ＆河南医学薬学研究所鄭州市 450001, China
胡祥威（こしょうい
中国食品発酵工業研究院（北京）有限公司機能性主食の革新的開発と慢性疾患への栄養介入に関する北京重要研究室（中国、100015
Kai Xia, Xiaofeng Han, Peng Yuan, Jia Liu, Shiwei Liu & Shenglin Duan
中南大学湘雅病院臨床栄養科、410008、中国長沙市
戴敏慧
寧波玉芳堂生物技術有限公司寧波市 315012 中国
賈福慧
中国国立遺伝子バンク、BGI-Shenzhen、深セン、518120、中国
陳嘉瑜、姜芳芳、于潔瑶
青島欧州生命科学研究所メタゲノミクス研究所（BGI-Qingdao, 266555, Qingdao, China
ヤン・フアンミン & カーステン・クリスチャンセン
ジェームズ・D・ワトソン・ゲノム科学研究所（杭州市、310058、中国
ヤン・ファンミン＆ワン・ジエン
ゲノム読み書き広東省重点実験室、BGI-Shenzhen、深セン、518120、中国
シュン・シュー
コペンハーゲン大学生物学部ゲノム・分子生物医学研究室（デンマーク、コペンハーゲン、DK-2100)
Karsten Kristiansen & Mo Han
BGI-Shenzhen、深セン、518083、中国、ヒト腸内細菌叢の検出と介入に関する深セン工学実験室
リャン・シャオ＆モー・ハン
中国医学科学院・北京ユニオン医科大学病院臨床栄養科、北京、100730、中国
ウェイ・チェン
貢献度
概念化： S.D., W.C., L.X. Data curation： M.D.、X.H.‡. 方法論： K.X., M.D., M.H., F.J. Investigation（調査）： X.H.§, M.D., X.H., P.Y., J.L., S.L., J.C., F.J., J.Y. 形式的分析： X.H.‡、M.H. 可視化： X.H.‡, M.H. プロジェクト管理： K.X., L.X. Resources： H.Y., J.W., X.X., W.C. Supervision： X.J.、S.D. 執筆-原案：原案執筆：X.H.‡、M.H.、K.X. 執筆・校閲・編集：M.H., K.K： M.H.、K.K. これらの著者は、本作品に等しく貢献した： X.H.‡、K.X.、M.D. ‡Xiangwei Hu. §Xiaofeng Han.
対応する著者
Wei Chen、Mo Han、Shenglin Duanに対応します。
倫理に関する宣言
競合する利益
著者は競合する利害関係がないことを宣言している。
倫理的承認と参加への同意
研究のデザインとプロトコルは、中央南大学Xiangya病院の医療倫理委員会、およびBGIの施設審査委員会の承認を得た。各参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。本研究は、承認されたガイドラインおよび規則に従って実施された。
追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や所属機関の管轄権の主張に関して、中立を保っています。
補足情報
補足図・表
補足コード
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Hu, X., Xia, K., Dai, M. et al. 間欠的絶食は腸内細菌叢を修飾し、肥満と宿主のエネルギー代謝を改善する npj Biofilms Microbiomes 9, 19 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00386-4
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2022年11月15日受理
2023年3月23日受理
2023年4月07日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41522-023-00386-4
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