腸内細菌叢の切除は高メチオニン食誘発高ホモシステイン血症および耐糖能異常を軽減する。

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出版：2023年7月17日
腸内細菌叢の切除は高メチオニン食誘発高ホモシステイン血症および耐糖能異常を軽減する。

https://www.nature.com/articles/s41538-023-00212-3

李文強
Yiting Jia、
...
魏 康
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食品科学 第7巻 記事番号：36 (2023) この記事を引用する
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指標詳細
要旨
高メチオニン（HM）食は高ホモシステイン血症（HHcy）を引き起こすが、消化管組織はホモシステイン（Hcy）の純生産の重要な部位である。しかし、宿主の高ホモシステイン血症における腸内細菌叢の役割は不明なままである。本研究では、腸内細菌叢を切除することで宿主のHHcyと耐糖能異常が緩和されるかどうかを明らかにし、その根本的なメカニズムを明らかにすることを目的とした。その結果、HM食はマウスのHHcyと耐糖能異常を誘発したが、抗生物質投与はHcyの血漿中濃度を低下させ、耐糖能異常を回復させた。HM食は腸上皮ホモシステイン濃度を上昇させたが、抗生物質投与はHM食下で腸上皮ホモシステイン濃度を低下させた。腸内細菌叢の減少は、HM食マウスの肝臓におけるCBSおよびBHMTの遺伝子発現および酵素活性に影響を及ぼさなかった。HM食は腸内細菌叢の組成を変化させ、FaecalibaculumとDubosiellaの存在量が著しく増加し、血漿中Hcy濃度とも正の相関を示した。細菌のシステインおよびメチオニン代謝経路を詳細に解析した結果、HM食マウスの腸内細菌叢では、ホモシステイン生合成に関連する2つのKEGGオーソロジー（KO）の存在量が著しく増加していた。Hcyは、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS）分析により、Dubosiella newyorkensis培養上清から検出された。これらの結果から、HM食は腸内細菌叢の組成を変化させることにより、Hcyを産生・分泌する可能性が示唆された。
はじめに
高ホモシステイン血症（HHcy）は、血漿中のホモシステイン濃度が15μmol/L以上1,2上昇したものと定義される。多くの臨床研究により、HHcyは動脈硬化、高血圧、血管石灰化、動脈瘤などの心血管疾患の独立した危険因子であることが示されている4,5,6,7,8,9,10。以前の研究では、HHcyがマウスにおいて耐糖能異常、インスリン抵抗性11,12、肝脂肪症を促進することも示されている13。血漿中のホモシステイン（Hcy）濃度は、遺伝的欠乏、メチオニンの大量摂取、ビタミンB6/B12や葉酸の不足、特定の薬物の投与など、さまざまな要因によって影響を受ける14,15,16,17。ヒトでは、1回のメチオニン摂取量（100mg/kg体重）で血漿中Hcy濃度が上昇する18。さらに、高メチオニン（HM）食は、実験動物においてHHcyを誘導するために広く採用されている19。過剰なメチオニンからホモシステインへの代謝は、肝臓に多く発現するMATやAHCYなどの代謝酵素によって触媒される一連の反応からなる重要な生物学的プロセスである20,21,22。したがって、肝臓はメチオニンおよびホモシステイン代謝の主要部位と考えられている23。興味深いことに、同位体標識法を用いた子豚の最近の研究では、食餌性メチオニン摂取量の20％が消化管組織（GIT）で代謝され、GITでホモシステイン（31％）、組織タンパク質（29％）、またはCO2（40％）に代謝されることが示された。GITはホモシステインの純生産に寄与していた24。しかし、HHcyにおけるGITの役割はまだ不明である。
消化管には腸内細菌叢が存在し、宿主の健康や疾病に影響を与えている25。宿主のゲノムとは異なり、腸内細菌叢は可塑性を示し、多くの環境因子に反応する。これらの環境因子のうち、食事は腸内細菌叢の組成と機能を決定する重要な因子として浮上している。例えば、マウスでは高脂肪食によってバクテロイデーテスの割合が減少し、ファーミキューテスとプロテオバクテリアの両方が増加した26。腸内細菌叢は、アミノ酸代謝を含む宿主の代謝においても重要な役割を果たしている。例えば、腸内ではインドール、セロトニン、キヌレニン誘導体を産生する3大トリプトファン代謝経路が、微生物叢の影響を直接的または間接的に受けている27。無菌マウスや抗生物質投与マウスの腸内内容物には、ある種のトリプトファン代謝産物が欠乏していたが、これはおそらく、いくつかの腸内細菌がトリプトファン代謝酵素をコードしているためであろう28,29。しかし、腸内細菌叢が他のアミノ酸の代謝に関与しているかどうかはまだ不明である。
本研究では、腸内細菌叢を切除することで、HM食誘発マウスにおける高ホモシステイン血症および耐糖能異常が緩和されることを明らかにした。我々は、HM食下で腸内細菌叢の組成が変化し、ホモシステインがより多く産生・分泌され、宿主の高ホモシステイン血症および耐糖能異常が誘導されたことを提唱した。
結果
腸内細菌叢の切除により、HM食摂取マウスにおける高ホモシステイン血症が緩和された。
雄性C57BL/6Jマウス（8週齢）に、一般的に高ホモシステイン血症モデルマウスとして用いられているチョウ飼料または高メチオニン（HM）飼料を4週間摂取させた。HM食誘発性高ホモシステイン血症における腸内細菌叢の重要性を明らかにするため、非吸収性広域抗生物質（ABX）処理を飲料水中で行い、腸内細菌叢を破壊した（図1a）。ABX処理により、腸内細菌叢は著しく減少した（P < 0.0001；補足図1）。食物摂取量や体重には4群間で有意差はなかった（補足図2および図1b）。HM飼料投与マウスの血漿中ホモシステイン濃度は、チョウ飼料投与マウスに比べて有意に上昇した（23.04対10.04μM、P < 0.0001；図1c）。さらに、ABX投与は血漿中のホモシステイン濃度を有意に低下させ（13.67 vs. 23.04 μM、P < 0.0001；図1c）、HM食誘発高ホモシステイン血症には腸内細菌叢が必要であることが示された。HM食はチョウ食に比べて血漿メチオニン濃度を上昇させたが（364.7対63.6μM、P < 0.0001；図1d）、HM群とHM + ABX群の間には有意差はなかった（図1d）。HM飼料はチョウ飼料に比べて腸管上皮のメチオニン濃度を増加させた（37.58 vs. 23.64 μg/g、P < 0.0001；図1e）が、HM群とHM + ABX群との間に有意差は認められなかった（図1e）。HM食はチョウ食に比べて腸上皮のホモシステイン濃度を上昇させたが（1.664 vs. 1.007 μg/g、P < 0.0001；図1f）、ABX投与はHM食下で腸上皮のホモシステイン濃度を低下させた（1.360 vs. 1.664 μg/g、P = 0.0014；図1f）ことから、ABX投与により腸上皮組織のホモシステイン輸出が減少することが示唆された。
図1：HM飼料を与えたマウスでは、抗生物質投与により血漿中のホモシステイン濃度が低下した。
a 実験の模式図。c 血漿中ホモシステイン濃度 d 血漿中メチオニン濃度 e 腸管上皮中メチオニン濃度 f 腸管上皮中ホモシステイン濃度。HM高メチオニン，ABX抗生物質，GTTブドウ糖負荷試験，ITTインスリン負荷試験，HCYホモシステイン。値は平均値±SEMで表し、各群n＝6（b）、各群n＝12（c-f）。有意性は、無対両側Student's t-test（b）および無対一元配置分散分析（Tukey's post hoc test付き）（c-f）により決定した。*P < 0.05, ns: 有意でない。
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腸内細菌叢の切除はHM食マウスの耐糖能異常を緩和した
HM食下での腸内細菌叢がグルコース代謝に及ぼす影響を調べるため、4群のマウスでグルコース負荷試験（GTT）とインスリン負荷試験（ITT）を行った。GTTの結果、HM飼料を与えたマウスでは顕著な耐糖能異常が認められ、血糖曲線下面積が増加した（P = 0.0326）が、HM飼料はインスリン抵抗性に明らかな影響を及ぼさなかった（P = 0.5915；図2a-c）。ABX投与は耐糖能を有意に改善し（P < 0.0001；図2aおよびc）、腸内細菌叢がHM食誘発耐糖能の低下に必要であることを示した。血漿中インスリン、トリグリセリド（TG）、総コレステロール（TC）値には群間で有意差はなかった（図2d）。
Fig.2：抗生物質投与はHM食マウスの耐糖能異常を緩和した。
a 4群のGTT b 4群のITT c GTTの曲線下面積（AUC）とITTのAUC d 4群の血漿インスリン値、血漿TG値、血漿TC値。GTTブドウ糖負荷試験，ITTインスリン負荷試験，TGトリグリセリド，TC総コレステロール。数値は平均値±SEM、各群n＝6で表した。有意性は、Tukeyのポストホックテストを用いた非対一元配置ANOVAによって決定した。*P < 0.05, ns: 有意でない。
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抗生物質投与はHM食マウスの肝臓におけるホモシステイン代謝に影響を与えなかった
HM食による高ホモシステイン血症における腸内細菌叢の機序はまだ不明である。我々はまず、HM食下での腸内細菌叢が、未発見の代謝産物を生成することによって宿主のホモシステイン代謝を変化させるのではないかという仮説を立てた。メチオニンはS-アデノシルメチオニン（SAM）を介してホモシステインに変換される。ホモシステインは、ベタイン-ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（BHMT）により再メチル化されてメチオニンを合成するか、シスタチオニンβ-シンターゼ（CBS）によりトランスサルフェーションを受けてシステインを形成する。肝臓はメチオニンとホモシステイン代謝の主要部位であり30、BHMTとCBSは肝臓で主に発現している31。我々は肝臓のホモシステイン代謝酵素の遺伝子発現レベルと酵素活性を評価した。HM食は、CBS、BHMT、およびメチオニルtRNA合成酵素（MetRS）、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ1A（MAT1A）、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ2A（MAT2A）、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（MTHFR）を含む他のホモシステイン代謝関連遺伝子の肝mRNAおよびタンパク質発現レベルに影響を及ぼさなかった（図3a）。抗生物質投与により、CBS、BHMT、MAT1A、MAT2AのmRNA発現レベルは、チョウ食群と比較して上昇し、これは、チョウ＋ABX群とチョウ食群の血漿中ホモシステインレベルの低下と一致していた（7.92対10.04μM、P = 0.0566；図1d）。HM + ABXはHMと比較してCBSのmRNA量を増加させたが（P = 0.0017；図3a）、肝臓におけるCBSおよびBHMTのタンパク質量は変化しなかった（P = 0.9236, P = 0.6450；図3bおよびc）。さらに、CBSの酵素活性はHM食下で上昇し（P = 0.0017）、これは先行研究32と一致した（図3d）。しかし、CBSの酵素活性は、マウスの腸内細菌叢を欠失させても変化しなかった（P = 0.0701；図3d）。以上より、今回のデータから、腸内細菌叢の切除は、HM食マウスの肝臓におけるホモシステイン代謝酵素の遺伝子発現レベルおよび酵素活性に影響を及ぼさないことが示された。
図3：腸内細菌叢の切除はHM食マウスの肝臓におけるホモシステイン代謝酵素の遺伝子発現および酵素活性に影響を及ぼさなかった。
a 4群の肝臓組織におけるCBS、BHMT、MetRS、MAT1A、MAT2A、MTHFRのmRNAレベル b, c 4群の肝臓組織におけるCBSとBHMTのウェスタンブロット解析 d 4群の肝臓CBS酵素活性 e 肝臓SAMレベル f 肝臓SAHレベル。SAM S-アデノシルメチオニン、SAH S-アデノシル-L-ホモシステイン。値は平均値±SEM、各群n＝6で表した。有意性はTukeyのポストホックテストを用いた非対一元配置ANOVAによって決定した。*P < 0.05, ns: 有意でない。
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その結果、HM食は肝臓のSAM濃度を増加させ（300.6 vs. 258.8 ng/g, P = 0.0033）、HM + ABXはHMに比べて肝臓のSAM濃度を減少させた（254.1 vs. 300.6 ng/g, P = 0.0012；図3e）ことから、ABX投与が肝臓のメチオニン過剰負荷を緩和したことが示唆された。肝臓のS-アデノシル-L-ホモシステイン（SAH）レベルには群間で有意差はなかった（図3f）。MetRS、MAT2A、BHMTおよびSLC1A5（solute carrier family 1 member 5）の腸管上皮mRNA発現レベルも検出した。ホモシステイン代謝関連遺伝子およびホモシステイントランスポーターのmRNA発現量には4群間で有意差はなかった（補足図3）。補足図4に示すように、HM食は正常な大腸構造に影響を与えなかった。しかし、HM + ABX群では、HM群と比較して、大腸腺構造の乱れ、陰窩構造の萎縮、リンパ球浸潤が認められた（補足図4）。大腸粘液層構造の変化が血漿中ホモシステイン濃度の低下に関係しているかどうかはまだ不明である。
HM食は腸内細菌叢組成を変化させた
腸内細菌叢の組成シフトを評価するために、28日目にチャウ食を与えたマウス（n = 6）とHM食を与えたマウス（n = 6）から得た糞便サンプルのメタゲノムショットガンシーケンスを行った。希薄化曲線で示すように、これらの曲線はかなり平坦になり、各群で遺伝子の豊かさが飽和に近づいていることが示された（補足図5）。ACE、Chao1、Shannonの各指数で示されるα多様性には、2群間で有意な差は見られなかった（図4a）。主座標分析（PCoA）によるBray-Curtis非類似度の順序付けにより、2群の腸内細菌叢組成のシフトが確認された（P = 0.004；図4b）。HM食が誘発した微生物叢組成の違いを図4cに示す。HM食下では、LachnospiraceaeとRikenellaceaeの細菌ファミリーが減少し、Prevotellaceaeが増加した（図4c）。次に線形判別分析の効果量（LEfSe）分析を行い、チョウ群とHM群で有意差のある細菌属・種をいくつか同定した。Erysipelotrichales属は、HM群ではチョウ群よりも多かった（図4dおよびe）。HM飼料を与えたマウスでは、Erysipelotrichaceaeの相対存在量が高かったが（P = 0.0022）、Rikenellaceaeの相対存在量は低かった（P = 0.0411）。さらに、Erysipelotrichaceae科のFaecalibaculum属（P = 0.0022）とDubosiella属（P = 0.0043）はHM群で増加し、Rikenellaceae科のAlistipes属（P = 0.0411）はHM群で減少した。種レベルでは、HMはFaecalibaculum rodentiumとDubosiella newyorkensisの相対量を増加させた（P = 0.0022, P = 0.0043；図4f）。これらのデータを総合すると、HM食によって腸内細菌叢の構造が変化し、マウスの循環ホモシステイン高値の一因となっている可能性が示唆された。
図4：HM食はマウスの腸内細菌叢構造を変化させた。
b Bray-Curtis距離行列のPCoA。 c ファミリーレベルでの微生物相組成。 d, e メタゲノムシーケンスデータのLEfSeから作成した分類学的クラドグラム。緑色はHM群に濃縮された分類群。f f_Rikenellaceae、f_Erysipelotrichaceae、g_Alistipes、g_Faecalibaculum、f_Dubosiella、s_Faecalibaculum rodentium、s_Dubosiella newyorkensisの相対量。箱ひげ図では、中央線は中央値、箱は第1四分位値と第3四分位値の間の四分位範囲（IQR）、ひげは第1四分位値または第3四分位値からIQRの1.5倍以内の最低値または最高値を表す。有意性はMann-Whitney検定により決定した。*P < 0.05.
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HM食が誘発した腸内細菌叢の機能的シフトは細菌のホモシステイン産生を増加させた
HM食に応答した腸内細菌叢の機能的変化をさらに調べるために、遺伝子をKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）パスウェイにアノテーションした。システインおよびメチオニン代謝経路はHM群で発現が増加した（P = 0.0371；図5a）。システインおよびメチオニン代謝には、メチオニン分解とメチオニン生合成が含まれる。de-novoメチオニン生合成経路は原核生物全体に存在するが33、脊椎動物には存在しない。細菌のシステインおよびメチオニン代謝経路を詳細に解析した結果、2つのメチオニン生合成関連KEGGオーソロジー（K01739およびK14155）が、HM飼料を与えたマウスの腸内細菌叢で顕著に増加していた（P = 0.0235, P = 0.0260；図5b）。シスタチオニンγ-シンターゼ（CGS；EC 2.5.1.48）とシステイン-S-抱合体β-リアーゼ（CCBL；EC 4.4.1.13）は、de novoメチオニン生合成経路における細菌のホモシステイン産生に関与していた（図5bおよびc）。これらの結果を総合すると、HM食は腸内微生物のホモシステイン産生を亢進させることにより、マウスの高ホモシステイン血症を誘発するという結論が支持された。
図5：HM食下では腸内細菌のホモシステイン産生能が亢進した。
b, c HM食下で有意に増加したKOを示す細菌のメチオニン分解およびメチオニン生合成経路。箱ひげ図では、正中線は中央値、箱は第1四分位値と第3四分位値の間のIQR、ひげは第1四分位値または第3四分位値からIQRの1.5倍以内の最低値または最高値を表す。有意性はMann-Whitney検定により決定した。*P < 0.05.
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糞便とデュボシエラはホモシステインを産生する可能性がある
次に、チャウ食を与えたマウスとHM食を与えたマウスの腸内細菌叢組成の変化と血漿中ホモシステイン濃度との相関を調べた。血漿中ホモシステイン濃度は、Faecalibaculum属（P = 0.0035、r = 0.7684）およびDubosiella属（P = 0.0187、r = 0.6632；図6a）の存在量と正の相関を示した。さらに、腸内細菌叢組成の変化と、de novoメチオニン生合成経路における細菌のホモシステイン産生に関与するCGSおよびCCBLの遺伝子量との相関を解析した。Faecalibaculumの存在量はCCBLの遺伝子存在量と正の相関があり（P = 0.0019、r = 0.7972）、Dubosiellaの存在量はCGSの遺伝子存在量と正の相関があった（P = 0.0168、r = 0.6713；図6a）。Faecalibaculum属とDubosiella属は、HM飼料下でホモシステインの推定生産者として同定された。Dubosiella属がin vitroでホモシステインを産生できるかどうかを調べるため、Dubosiella newyorkensis培養上清からホモシステインを検出するLC-MS分析を行った。その結果、培養上清からD,L-ホモシステイン標準物質と同じピーク保持時間（〜3.47分）が検出された（図6b）。以上のことから、FaecalibaculumとDubosiellaはホモシステインを産生する可能性がある。
図6：FaecalibaculumとDubosiellaはホモシステインを産生する可能性がある。
a 腸内細菌叢の存在量とホモシステインのマウス血漿レベルとCGSおよびCCBLの細菌量の間のスピアマンの相関のヒートマップ。c HM食下での宿主の高ホモシステイン血症および耐糖能異常における腸内細菌叢の重要な役割を示す模式図。HM食下では、腸内細菌叢はより多くのホモシステインを産生・分泌したが、これはおそらくFaecalibaculumとDubosiellaの存在量が増加したためであろう。さらに、腸内細菌叢由来のホモシステインは、マウスにおいて高ホモシステイン血症と耐糖能異常を誘発した。Hcyホモシステイン、CGSシスタチオニンγシンターゼ、CCBLシステイン-S-抱合体βリアーゼ。
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考察
本研究では、HM食誘発高ホモシステイン血症（HHcy）と耐糖能異常における腸内細菌叢の重要な役割を明らかにした。抗生物質による腸内細菌叢の破壊とメタゲノム解析の組み合わせにより、FaecalibaculumとDubosiellaがHM食下でホモシステイン（Hcy）を産生する可能性があることを見出した。腸内細菌叢をターゲットにすることで、HHcy関連疾患の予防と治療に光が当たるかもしれない。
本研究の主要な発見は、ホモシステイン代謝における腸内細菌叢の重要な役割である。肝臓がメチオニンおよびホモシステイン代謝の主要な部位であることは長い間認識されてきた。しかし、以前の研究では、非経口摂取よりも経腸摂取の子豚の方が血漿中のHcy濃度が顕著に高いことから、消化管組織（GIT）が大量のHcyを輸出していることが示唆された34。同位体標識法を用いた最近の研究では、食餌性メチオニン摂取量の20％がGITで代謝されることが示された24。メチオニンは子豚のGITでHcy（31％）、CO2（40％）、組織タンパク質（29％）に代謝されたが、全身のメチオニン摂取量の大部分（80％）はタンパク質の合成に使用され、トランスメチル化とトランス硫酸化によって代謝されたのはわずか20％であった24。したがって、消化管はHcy純生産の重要な部位である。消化管には多数の微生物叢が存在し、恒常性維持や疾病の際に宿主に重要な影響を及ぼす。しかし、メチオニンとホモシステインの代謝における腸内細菌叢の役割については、いまだ不明な点が多い。我々の研究では、抗生物質を投与して腸内細菌叢を枯渇させ、HM食誘発性HHcyにおける腸内細菌叢の重要な役割を明らかにした。メタゲノム解析の結果、HM食下では2種類のホモシステイン生合成関連KOの存在量が上昇し、腸内細菌のホモシステイン産生能の亢進が示唆された。さらに、Dubosiella newyorkensis培養上清からLC-MS分析でホモシステインが検出された。最近、Rosarioらは、パーキンソン病患者において、Akkermansia muciniphila、Eubacterium sp.、Subdoligranulum sp.およびClostridiales Family XIII細菌が血漿ホモシステイン値と正の相関があることを見出した35。ここで我々は、腸内細菌叢とHM食誘発性高ホモシステイン血症との関係について、直接的な因果関係を証明した。我々の研究では、ABX投与はHM食下での血漿および腸上皮のメチオニン濃度に影響を与えなかった。その理由として考えられるのは、腸内細菌叢が部分的にメチオニンを代謝するのに対して、メチオニンの大部分は肝臓で代謝されるということである。つまり、ABX投与はメチオニン濃度には影響を与えなかったが、腸内細菌叢がメチオニンを利用してホモシステインの割合を産生したため、ホモシステイン濃度には影響を与えたのである。ABX投与はHM食下で腸上皮のホモシステインレベルを低下させたが、これは腸上皮組織が腸内細菌叢によって産生されたホモシステインをより少なく輸出していることを示唆している。
本研究のもう一つの興味深い発見は、FaecalibaculumとDubosiellaがHM食下でホモシステインを産生する可能性があるということである。食事は腸内細菌叢の構造と機能を決定する重要な要素である。高脂肪食を与えたマウスでは、FaecalibaculumとDubosiellaが豊富であった36,37。最近の研究では、Faecalibaculum rodentiumがリン脂質と正の相関があることが示され、リン脂質の合成においてFaecalibaculum rodentiumが重要な役割を果たしていることが示された38。さらに、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発大腸炎モデルマウスにおいて、ホスファチジルコリンとスフィンゴミエリンを食事から補充すると、FaecalibacteriumとDubosiellaの存在量の減少が逆転した39。Laiらは、Lycium barbarum polysaccharide（LBP）の介入により、メチオニン代謝産物であるS-アデノシルメチオニン（SAM）を生成する可能性のあるFaecalibacteriumとDubosiellaの存在量が増加することを、関節リウマチモデルラットにおいて見出した40。我々の研究では、HM食がFaecalibacteriumとDubosiellaを増加させ、ホモシステインを産生・分泌し、宿主の高ホモシステイン血症と耐糖能異常を誘発する可能性を示唆した（図6c）。メチオニンのデノボ生合成経路は、腸内細菌には保存されているが、哺乳類宿主には存在しない41。de-novoメチオニン生合成経路では、システインがホモセリンに転移されてシスタチオニンとなり、これが切断されてホモシステインが生成される。これらの反応はCGSとCCBL42という酵素によって触媒される。我々の研究では、Faecalibaculumの存在量はCCBLの細菌遺伝子の存在量と正の相関を示し、Dubosiellaの存在量はCGSの細菌遺伝子の存在量と正の相関を示した。腸内微生物のホモシステイン生合成におけるCGSとCCBLの役割を探るためには、今後CGSとCCBLの変異株を構築する必要があるかもしれない。
我々の研究は、腸内細菌叢がグルコースホメオスタシスの制御に関与していることを示す、さらなる証拠を提供するものである。耐糖能異常は、ブドウ糖負荷後に高血糖が持続する状態を特徴とする。耐糖能異常のほとんどの人は、最終的に糖尿病を発症する43。チョウ食下において、腸内細菌叢欠損マウスは、褐色脂肪組織によるグルコースクリアランス能力の促進を示した44。以前の研究では、抗生物質を用いた腸内細菌叢の切除により、高脂肪食誘発性の耐糖能異常が緩和されることが示されている45,46。ある横断研究では、耐糖能異常の患者は血漿ホモシステイン値が高い（OR = 1.508、P = 0.007）47。マウスでは、血漿ホモシステイン値の上昇が耐糖能異常の一因であることが報告されている11,12。我々の研究では、腸内細菌叢の減少が高メチオニン食下で耐糖能を改善することを見出したが、これはおそらく血漿ホモシステイン濃度を低下させることによるものであろう。
まとめると、我々は、高メチオニン食下で腸内細菌叢がホモシステインを産生し、抗生物質の投与が血漿中のホモシステイン濃度を低下させることを発見した。高ホモシステイン血症患者にとって、腸内細菌叢を標的とすることは血漿中ホモシステイン濃度を低下させる戦略の可能性がある。しかし、今回の研究では、高ホモシステイン血症患者における腸内細菌叢の構造的・機能的変化に関する臨床的証拠は不足していた。したがって、今後さらに関連した研究が必要である。
方法
マウス
雄性C57BL/6Jマウス（8週齢）に標準食または高メチオニン食（2％、20 g/kg L-メチオニン）（HFK Biosciences、中国、北京）を4週間摂取させ、高ホモシステイン血症モデル動物を作製した19。すべてのマウスは、12時間明期／12時間暗期サイクルで飼育され、餌と水は自由に摂取できた。実験中、マウスは1ケージあたり3匹ずつの群に分けられた。1日の餌の消費量は、餌を投与する前に毎日記録した。すべてのマウスは、15μL/g体重の1.25％アベルチンで腹腔内麻酔してから犠牲にした。すべての動物実験は、実験動物資源研究所のガイドラインに従って行われ、北京大学動物飼育使用委員会の承認を得た。
抗生物質投与
ネオマイシン（1 mg/mL、最終濃度：飲料水）、ストレプトマイシン（1 mg/mL、最終濃度：飲料水）、バシトラシン（1 mg/mL、最終濃度：飲料水）（Sigma-Aldrich社製）を含む抗生物質溶液（ABX）を滅菌飲料水に添加して、マウスを28日間処理した48。
マウスの糞便サンプルの採取とDNA抽出
マウスの糞便サンプルを滅菌遠心分離機に採取するため、マウスを寝具のない空のケージで15分間飼育した。チューブは分析まで-80℃で保存した。TIANamp stool DNA Kit (TIANGEN Biotech, Beijing, China)を用い、製造者の指示に従って糞便DNAを抽出した。総細菌量を定量するため、定量的リアルタイムPCRアッセイには、デュアルプライミングオリゴヌクレオチド（DPO）の原理に基づく16S rRNA遺伝子プライマー（16SDPO-フォワード5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCA-I-I-I-AACGCT-3'；16SDPO-リバース5'-CGCGGCTGCTGCAI-I-I-A-I-TRGC-3'）を使用した49,50。
ブドウ糖負荷試験（GTT）およびインスリン負荷試験（ITT）
ブドウ糖負荷試験（GTT）では、マウスを12時間絶食させてからブドウ糖（3g/kg、i.p.）を投与した51。インスリン負荷試験（ITT）では、マウスを4時間絶食させてからインスリン（1 IU/kg、i.p.）を投与した51。0、15、30、60、90、120分後にマウスの尾の先端の切り口から採血し、グルコースメーター（Accu-Chek, Roche, Switzerland）を用いて直ちに血糖値を検出した。血糖曲線下面積（AUC）を用いて、GTTとITTの差を定量した。
血漿代謝物測定
血漿ホモシステイン濃度は、市販の酵素サイクリング法を用いて推定し、日立7600生化学自動分析装置（日立、東京、日本）で読み取った。血漿インスリンはELISAキット（Dogesce, Beijing, China）で測定した。血漿トリグリセリド（TG）および総コレステロール（TC）は、Biosino Biotechnology and Science社（中国、北京）の市販キットで測定した。血漿トリグリセリド値はGPO-PAP法で測定した。トリグリセリドGPO-PAP法は、リポ蛋白リパーゼがトリグリセリドをグリセロールと遊離脂肪酸に分解することに基づく。この測定法ではグリセロール成分濃度を測定し、これはトリグリセリド濃度に比例する。血漿中の総コレステロール濃度はCHOD-PAP法で測定した。最初のステップでは、コレステロールエステラーゼがコレステロールエステルを加水分解し、コレステロールと遊離脂肪酸を生成する。次のステップでは、コレステロールオキシダーゼがコレステロールの酸化を触媒する。ペルオキシダーゼの触媒作用により、前の反応で生成した過酸化水素が発色団である4-アミノフェナゾンを酸化し、赤色色素キノンイミドを生成する。赤色色素生成物の色強度は500nmで光度測定され、総コレステロール濃度に比例する。
肝酵素活性測定
肝CBS酵素活性は、Cystathionine β-Synthase Activity Assay kit (BioVision, San Francisco, USA)を用い、製造者の指示に従って測定した。BioVision's Cystathionine β Synthase Assay kitは、システインとホモシステインを基質としてH2Sを生成する。硫化水素は蛍光プローブのアジド官能基と反応し、蛍光アミノ基を生じる（Ex/Em = 368/460 nm）。
$${\rm{Cysteine}},{+},{\rm{Homocysteine}},\mathop{\longrightarrow}\limits^{{\rm{CBS}}}{\rm{Cystathionine}}, {+},{{\rm{H}}}_{{2}}{\rm{S}},\mathop{\longrightarrow}\limits^{{\rm{CBS}},{\rm{Probe}}}{\rm{Fluorescence}}$$
肝臓SAMおよびSAHレベル測定
肝SAMレベルはELISAキット（Meimian, Jiangsu, China）で調べた。肝臓SAHレベルはELISAキット（Meimian, Jiangsu, China）で調べた。
RNA抽出および定量的リアルタイムPCR分析
マウス肝組織からの全RNAは、TRIzol試薬（Vazyme Biotech Co.） 逆転写システム（Vazyme Biotech社、南京、中国）を用いて全RNA（1μg）をcDNAに逆転写した。定量的リアルタイムPCR増幅にはSYBR Green 2× polymerase chain reaction (PCR) mix (Vazyme Biotech Co., Nanjing, China)を用いた52。すべてのサンプルはβ-アクチンで標準化した。定量的リアルタイムPCRのプライマー配列は以下の通りである： β-アクチン、5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3'（センス）および5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'（アンチセンス）； CBS、5'-GGCCTGATACCCCAAGCAG-3'（センス）および5'-GGTGTTCCCAATTTTCCTCAGAA-3'（アンチセンス）；BHMT、5'-AATGCCGAGAAGTTGTGATT-3'（センス）および5'-ACTCCCGATGAAGCTGACGA-3'（アンチセンス）； MetRS、5'-CTTGAGTCGTCAAAACTGTCCT-3'（センス）および5'-GTCTGGAACCAACTTTGCAGG-3'（アンチセンス）；MAT1A、5'-GTGCTGGATGCTCACCTCAAG-3'（センス）および5'-CCACCCGCTGGTAATCAACC-3'（アンチセンス）； MAT2A、5'-GCTTCCACGAGGCGTTCAT-3'（センス）および5'-AGCATCACTGATTTGGTCACAA-3'（アンチセンス）；MTHFR、5'-GGCAGCGAGAGTTCCAAGG-3'（センス）および5'-CAGGGAGAACCACTTGTCACC-3'（アンチセンス）。
ウェスタンブロッティング
マウス肝組織溶解物をウェスタンブロット分析のために10% SDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜に転写した。TBST中5％牛乳でブロックした後、ブロットを一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートし、続いて二次抗体を1時間インキュベートした： GAPDH（60004-1-Ig、1:1000、Proteintech）、CBS（14787-1-AP、1:1000、Proteintech）、BHMT（15965-1-AP、1:1000、Proteintech）。免疫蛍光画像はOdyssey infrared imaging (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE)により得られた。
メタゲノム配列決定
DNA 濃度は Qubit® 2.0 Fluorometer（Life Technologies, CA, USA）で Qubit® dsDNA Assay Kit を用いて測定した。DNAサンプル調製のためのインプット材料として、サンプルあたり合計1 µgのDNAを使用した。シーケンスライブラリーは、NEBNext® Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB、米国）を用いてメーカーの推奨に従って作成し、インデックスコードを付加して各サンプルの配列を決定した。簡単に説明すると、DNAサンプルを超音波処理で350 bpのサイズに断片化し、DNA断片を末端研磨し、A-tailし、さらにPCR増幅を行いイルミナシーケンス用の全長アダプターとライゲーションした。最後にPCR産物を精製し（AMPure XPシステム）、Agilent 2100 Bioanalyzerでライブラリーのサイズ分布を解析し、リアルタイムPCRで定量した。
メタゲノム解析
イルミナHiSeqシーケンスプラットフォームから得られた生データをReadfqを用いて前処理し、その後の解析のためのクリーンデータを取得した。クリーンデータは、Bowtie2.2.4ソフトウェアを用いてデフォルトで宿主データベースにブラストし、宿主由来のリードをフィルターした。全サンプルのforward stepで使用されなかったリードをすべて結合し、SOAPdenovo (V2.04)/MEGAHIT(v1.0.4-beta)ソフトウェアを用いて、単一アセンブルと同じパラメータで混合アセンブルを行った。混合アセンブルしたスキャフォールドをN接続部で切断し、スキャフィグを得た。シングルアセンブリーまたはミックスアセンブリーから生成されたすべてのスキャフティグ中の500 bpより短いフラグメントは、統計解析のためにフィルタリングされた。NCBIのNRデータベースから抽出した細菌、真菌、古細菌、ウイルスの配列に、DIAMONDソフトウェアを用いてブラストした。各配列の最終的なアラインメント結果については、各配列が複数のアラインメント結果を持つ可能性があるため、e値が≦最小のe値10となる結果をLCAアルゴリズムに選択し、MEGANソフトウェアを用いてシステム分類に適用し、配列の生物種アノテーション情報を確保した。LCAのアノテーション結果と遺伝子存在量表から、各分類階層（王国、門、綱、目、科、属、種）における各サンプルの遺伝子数と存在量情報を含む表を得た。あるサンプルにおけるある種の存在量は、その種についてアノテーションされた遺伝子存在量の合計に等しく、あるサンプルにおけるある種の遺伝子数は、存在量が0でない遺伝子の数に等しい。クローナ解析、相対存在量、クラスター ヒートマップ、PCA、NMDSの減少次元解析は、各分類階層の存在量表に基づいて行った。グループ間の差はANOSIMで検定した。メタスタットとLEfSe分析は、グループ間の異なる種を同定するために用いた。Metastats分析では、各分類群についてグループ間の並べ替え検定を行い、P値を求めた。その後、Benjamini and Hochberg偽発見率を用いてP値を補正し、q値を取得した。LEfSe解析はLEfSeソフトウェアで行った。DIAMONDソフトウェア(V0.9.9)を用いて、機能データベースに対するユニゲンのブラストを行った。各配列のブラスト結果について、最良のブラストヒットをその後の解析に使用した。
菌株と培養
Dubosiella newyorkensisはATCCから購入した。Dubosiella newyorkensisを50 mLのchopped meat carbohydrate (CMC) broth中、37 ℃の嫌気チャンバーで24時間培養し、8000×g、10分間、4 ℃で遠心分離して培養上清を得た。
ホモシステインおよびメチオニンの液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（LC-MS）測定
腸を十二指腸から回腸まで腸間膜から切り離し、正中線に沿って切断した。腸は内側を上にして置き、セルスクレーパーで上皮を直接採取した。その後、ガラス管ホモジナイザーで腸上皮を適量のリン酸緩衝生理食塩水（PBS、5 mL/g組織）でホモジナイズした。腸上皮上清は、13,000×g、10分間、4℃で遠心後回収し、LC-MS測定に用いた。
血漿メチオニン、腸上皮メチオニン、腸上皮ホモシステイン、培養上清ホモシステインをLC-MSで測定した。D,L-ホモシステインとL-メチオニンの標準物質はSigma-Aldrich（米国）から購入した。内部標準物質として使用した同位体標識化合物は、Toronto Research Chemicals社（カナダ）のD,L-ホモシステイン-d4およびISOREAG社（中国、上海）のH3-L-メチオニンであった。アセトニトリル(ACN)や1,4-ジチオスレイトール(DTT)を含む標準品やサンプル調製用の試薬は、Merck社(ドイツ)から購入した。ギ酸（FA）はSigma-Aldrich（米国）から購入した。実験では、上清20μLを使用し、水20μL、同位体標識化合物20μL、DTT（500mM）40μLも加えた。溶液を混合し、室温で15分間保存した。その後、300μLのACN（0.1％FA）を加えた。混合物を14,000rpmで20分間遠心した。LC-MS分析には、100μLの上清を使用した。LC-MSは、AB Sciex TripleTOF 5600TM質量分析システム（AB SCIEX、米国）で行った53。ホモシステインとメチオニンは、それぞれサンプルピークの保持時間を標準物質と比較することで同定した。濃度は外部標準検量線法により決定した。
統計分析
データは平均値±SEMで示し、GraphPad Prismソフトウェアを用いて分析した。Shapiro-Wilk正規性検定を用いて、データが正規分布しているかどうかを判定した。正規分布の比較には、対応のない両側Student's t-testまたはTukeyのpost hoc分析を伴う対応のないone-way ANOVAを行った。正規分布でないデータの比較にはMann-Whitney検定を用いた。データは平均値±SEMで表した。P < 0.05を統計的に有意とみなした。
データの利用可能性
本研究で得られたメタゲノムシーケンスデータは、NCBI Sequence Read Archiveにアクセッション番号PRJNA892228で寄託された。
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また、このような研究は、日本学術振興会特別研究員（PD）、日本学術振興会特別研究員（PD）、日本学術振興会特別研究員（PD）、日本学術振興会特別研究員（PD）、日本学術振興会特別研究員（PD）、日本学術振興会特別研究員（PD）、日本学術振興会特別研究員（PD）、日本学術振興会特別研究員（PD）、日本学術振興会特別研究員（PD）の5名で行った。NPJ科学食品6、34（2022）。
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謝辞
本研究は、中華人民共和国国家自然科学基金（NSFC、81730010、91539203、81921001、91839302、31930056、81900261）からの資金援助を受けている。
著者情報
著者および所属
北京大学健康科学センター基礎医学院生理学・病態生理学部門、中国、北京
李文強（Wenqiang Li）、賈益廷（Yiting Jia）、賈建（Ze Gong）、趙東（Zhao Dong）、兪芳（Fang Yu）、傅毅（Yi Fu）、江長濤（Changtao Jiang）、孔偉（Wei Kong
北京大学血管恒常性・リモデリング国家重点実験室（中国・北京
李文強、賈益廷、邓公、趙東、兪宇、傅毅、江長濤、孔維
北京大学第三病院医学創新研究院基礎医学研究センター、中国、北京
姜昌涛
中国・北京大学基礎医学院肥満・代謝疾患研究センター
姜昌涛
貢献
W.L.はコンセプトの立案、すべての実験の計画と実施、すべてのデータの解析、原稿の執筆を行った。Y.J.はデータ解析を手伝った。Y.F.、F.Y.、C.J.は原稿の修正を手伝った。Y.F.、F.Y.、C.J.は原稿の修正に協力した。
執筆者
Changtao JiangまたはWei Kongまで。
倫理申告
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。
追加情報
出版社注：Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。
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Li, W., Jia, Y., Gong, Z. et al. Ablation of the gut microbiota al mitiates high-methionine diet-induced hyperhomocysteinemia and glucose intolerance in mice. npj Sci Food 7, 36 (2023). https://doi.org/10.1038/s41538-023-00212-3
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2022年12月13日受領
2023年7月12日受理
2023年7月17日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41538-023-00212-3
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