β細胞機能と耐糖能が低下したヒト被験者では、島内インタクトGLP-1のレベルが高い

哉百名

2024年12月8日 22:00

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研究論文163156087巻2月2025

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β細胞機能と耐糖能が低下したヒト被験者では、島内インタクトGLP-1のレベルが高い

https://www.metabolismjournal.com/article/S0026-0495(24)00315-9/fulltext

Teresa Mezza ∙ Nicolai J. Wewer Albrechtsen ∙ Gianfranco Di Giuseppe ∙ ... ∙ Alfredo Pontecorvi ∙ Andrea Giaccari andrea.giaccari@unicatt.it ∙ Jens J. Holst. Jens J.Holst jjholst@sund.ku.dk... Show more

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Highlights

糖尿病前症および初期糖尿病において、島内インタクトGLP-1が上昇し、グルコースコントロールにおける代償的役割が示唆される。

- 膵島内GLP-1とβ細胞機能の逆相関は

2型糖尿病の進行に影響する。

- 膵

GLP-1は、腸内ソースとは無関係に、インスリン分泌の調節に新たな役割を果たしている。

要旨

多くの研究から、膵α細胞はインタクトなGLP-1を産生し、それによって腸に依存しないパラクリンインクレチン系を構成していることが示唆されている。しかし、ヒトのα細胞にインタクトなGLP-1が存在するかどうか、またそれが糖尿病の有無に関係するかどうかについては、まだ議論が続いている。本研究の目的は、代謝プロファイリングされたヒトドナーの膵部分切除時に得られた膵生検におけるGLP-1アイソフォームを含むプログルカゴン由来ペプチドの存在を、術前の耐糖能によって層別化した上で明らかにすることである。

方法

2型糖尿病の既往のない61人（31F/30M、年齢64.6±10.6歳、BMI24.2±3.68kg/m2）を登録し、膵臓周囲腫瘍に対する膵部分切除術を予定した。耐糖能とインスリン分泌/感受性の差は、術前2時間OGTT、4時間混合食試験、高インスリン血症Euglycemic Clampを用いて評価した。被験者はその後、正常耐糖能（NGT、n＝19）、耐糖能障害（IGT、n＝20）、または新たに糖尿病（DM）と診断された（n＝22）に分類された。これらの被験者の膵臓生検および血漿中の総GLP-1、インタクトGLP-1、グルカゴン、インスリン、C-ペプチドを測定し、その結果を分泌および代謝パラメータと相関させた。

結果

総GLP-1の抽出可能レベルは23.9±2.66pmol/g、インタクトGLP-1レベルは1.15±0.18pmol/gであった。プログルカゴン由来ペプチド（グルカゴン濃度で調整）を、耐糖能で分類した被験者で調べたところ、総GLP-1濃度は同程度であったが、インタクトGLP-1はIGT群とDM群で有意に増加し、in vivoでのβ細胞のグルコース感受性およびインスリン分泌と逆相関していた。

結論

我々のデータは、耐糖能異常の発症とβ細胞機能障害は、島内インタクトGLP-1レベルの上昇と有意に関連しており、2型糖尿病におけるインスリン分泌のパラクリン制御の有益な適応である可能性を示している。

キーワード

2型糖尿病

膵島生物学

グルカゴン様ペプチド-1

α細胞

1 はじめに

腸由来のインクレチンホルモンであるグルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）が発見されて以来、GLP-1は摂食に応答して腸でのみ産生・分泌され、膵β細胞のGLP-1受容体（GLP-1 R）に作用してグルコース刺激によるインスリン分泌を増加させるという考えが一般的であった[1]。GLP-1受容体作動薬は、そのグルコース低下作用により、2型糖尿病の治療に広く使用されている。しかし、GLP-1はβ細胞に対しても他の作用を示す可能性があり、例えば、膵管上皮の前駆細胞からβ細胞への分化を促進したり、膵島のアポトーシスを抑制したりする [2,3]。

GLP-1は、グルカゴンとGLP-1の両方を含む前駆体タンパク質であるプログルカゴンの酵素的切断によって生成される。プログルカゴン遺伝子は、主に腸の腸内分泌L細胞で発現しているが、膵島のα細胞でも発現している。ここで、プログルカゴンは組織特異的な翻訳後切断を受け、主に膵島ではグルカゴンが、腸ではGLP-1（およびGLP-2）が生じる[4]。しかしながら、多くの研究から、GLP-1は膵島でも産生され、β細胞のインスリン分泌、細胞増殖、アポトーシスの抑制を直接刺激するパラクリンの可能性が示唆されている[5-7]。膵島内GLP-1の供給源はα細胞である可能性が高く、α細胞は膵島の機能に局所的なパラクリン作用を及ぼすことがすでに知られている[8-11]。

膵島内GLP-1の存在と可能性のある機能に関する情報は、主にげっ歯類モデルから得られているが [12,13]、単離されたヒト膵島に関する研究では、ヒトのα細胞もGLP-1を産生および分泌できる可能性が示唆されている [14]。グルカゴン受容体ノックアウトマウス[15-17]とその結果としての膵島過形成、およびα細胞特異的GLP-1欠損を伴うα細胞切除マウスモデルにおける観察結果は、インスリン分泌の膵島内パラクリン制御の仮説を支持している[18]。さらに、これらの研究は、インタクトなGLP-1が局所的に産生され、おそらく糖尿病前症および糖尿病の両方で変化する可能性のある膵島機能の調節に寄与している可能性を示唆している [12,19,20]。Chambersら[21]は、グルコース代謝に関しては、膵GLP-1産生が腸由来GLP-1よりも重要であることを明らかにした。対照的に、Songら[22]は、循環GLP-1レベルを維持し、胃排出とグルコースホメオスタシスを制御するためには、腸由来のプログルカゴン産物が不可欠であることを示した。Galsgaardら[23]とSvendsenら[24]は、正常マウスの膵臓におけるインタクトなGLP-1の含量と分泌量を測定することができなかったが、グルカゴン受容体ノックアウト動物の膵臓からは有意な分泌が認められた。

ヒトの場合、データは一貫していないが、これはおそらくサンプルの組成の違いや、採用した分析技術や抗体の違いによるものであろう。主な交絡因子は、GLP-1のN末端が延長された不活性型GLP-1 1-36amideの存在が報告されていることである [25]。GLP-1に対する多くの抗体はこのペプチドと交差反応し、移植ドナーのヒト膵臓を質量分析法で調べた過去の研究では、インタクトなGLP-1の測定可能なレベルを示すことができなかった [25]。しかし、他の研究では、特定の状況下では、α細胞にGLP-1免疫反応性が存在し、生理活性GLP-1の発現も認められると報告している [9,26]。

我々のグループが以前に報告したように[27]、ヒト膵島の生物学的研究における主要な課題は、研究対象者の正確なin vivo代謝およびホルモンのプロファイリングと分析に適した質の組織サンプルがないことである。実際、経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）に基づいて、以前は正常耐糖能と分類された被験者から手術中に膵臓サンプルを採取した研究によると、明らかな糖尿病がない場合でも、膵島のリモデリングは「正常、インスリン感受性」から「糖尿病前症、インスリン抵抗性」への移行過程における連続的なプロセスであることが示されている［26,28-31］。したがって、全患者の同じ膵臓領域から採取したex vivo膵島形態学と、最先端の方法で採取したin vivo膵島分泌機能マーカーとの間のポイント・ツー・ポイントのマッピングのみが、分子的・形態学的変化がin vivoでの膵島の挙動にどのように影響するかを明確に説明することができる[28,32]。

本研究の目的は、膵臓生検における完全に処理された無傷のGLP-1 (7-36)アミドおよびN末端に拡張されたGLP-1 (1-36)アミドの存在を調査し、（より高い感度と正確さで）優血症から糖尿病への進行中にヒト膵島で起こりうるGLP-1形成の変化をプロファイリングし、この知識を同じ個人の代謝形質と統合することであった。

2 研究デザインと方法

幽門温存膵頭十二指腸切除術を受けた患者61例（女性31例、男性30例、平均年齢64.6±10.6歳）を2015年1月から2021年11月まで消化器外科病棟で募集し、内分泌・代謝疾患センター病棟（いずれもイタリア・ローマのアゴスティーノ・ジェメッリ大学病院）で研究した。研究プロトコール（ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02175459）は、地元の倫理委員会（P/656/CE2010および22573/14）（イタリア、ローマ）により承認され、すべての参加者が書面によるインフォームドコンセントを提供し、それに続いて包括的な医学的評価が行われた。

手術適応は、膵管周囲腫瘍（20例）、膵管内乳頭状腫瘍（24例）、膵粘液嚢胞性腫瘍（10例）、非機能性膵神経内分泌腫瘍（7例）であった（補足表1参照）。登録された患者で糖尿病の既往があるものはいなかった。病歴、身体所見、心電図、推算糸球体濾過量、尿検査によって心肺機能、肝機能、腎機能が正常である患者のみが登録された。除外基準は、手術前の血清リパーゼ値およびアミラーゼ値の変化、膵炎の形態学的基準、オークレオチドまたはステロイドによる治療歴などであった。重度の肥満（BMI > 40kg/m2）、HbA1c値が53mmol/molを超える患者、または糖尿病治療薬を服用している患者。コントロールされていない高血圧および/または高コレステロール血症も除外された。図1に示すように、61人の被験者全員に、術前2週間のインスリン、C-ペプチド、グルカゴン、（総）GLP-1分泌およびインスリン感受性を評価するために、OGTT、血糖-高インスリン血症クランプ（EUC）および混合食試験（MMT）が行われた。被験者の臨床的および代謝的特徴を表1に示す。

図1

図1 試験デザイン。

被験者の特徴 NGT（n

. 19） IGT（n

. 20） DM（n

. 22） P値

平均年齢（歳） 62.0 ± 2.50 62.9 ± 2.63 68.4 ± 1.96 0.13

性別（M/F） 8/11 11/9 12/10 0.32

ブドウ糖摂取量（mg-kg-1/min-1） 5.33 ± 0.87 4.35 ± 0.64 2. 90 ± 0.38 0.04

空腹時グルコース（mg/dl） 87.2 ± 2.51 91.9 ± 2.46 118 ± 6.46 < 0.01

空腹時Cペプチド（ng/ml） 1.34 ± 0.11 1.62 ± 0.16 1.74 ± 0.18 0.17

OGTT由来のグルコース感受性 96.8 ± 17.3 82.4 ± 8.65 39.1 ± 5.60 0. 03

OGTT後2時間グルコース 108 ± 5.92 169 ± 3.92 282 ± 16.5 < 0.01

平均グルコース（mg/dl） 126 ± 4.20 160 ± 6.36 226 ± 11.9 < 0.01

BMI（kg-m-2） 24.2 ± 0.85 24.4 ± 1.01 25.4 ± 1.01 0.60

HbA1c（mmol/mol） 36.6 ± 8.35 40.5 ± 1. 70 41.25 ± 1.28 0.74

表1

耐糖能によって正常耐糖能、耐糖能障害および2型糖尿病に分類した手術前の非糖尿病被験者の臨床的および代謝的特徴。データは平均値±SE、*p値＜0.05は統計学的に有意とみなされる。

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2.1 経口ブドウ糖負荷試験

標準的な75g経口ブドウ糖負荷試験を行い、ブドウ糖負荷後0、30、60、90、120分にブドウ糖、インスリン、C-ペプチドを測定した。術前のOGTTの結果に基づいて、ADA分類[33]に従って患者を分類した：負荷後2時間のグルコースが140mg/dl未満の被験者を正常耐糖能（NGT、n=19）、負荷後2時間のグルコースが140～199mg/dlの被験者を耐糖能障害（IGT、n=20）、負荷後2時間のグルコースが200mg/dl以上の被験者を糖尿病（DM、n=22）と定義した。

2.2 ミックスミール試験

ミックスミール試験(MMT)は、以前に記載されたように実施された[34,35]。患者には15分以内に830kcal（蛋白質から107kcal、脂肪から353kcal、炭水化物から360kcal）の食事を摂取するよう指示した。血漿グルコース、インスリン、C-ペプチドの測定のために、絶食状態で2回、その後240分間にわたり30分間隔で採血した（採血時間0′、30′、60′、90′、120′、150′、180′、210′、240′）。GLP-1およびグルカゴン分析用の血液は、EDTAおよびジペプチジルペプチダーゼ-4阻害剤（ミリポア社製）を含むチューブに採取した；遠心分離（1000rpm、10分間、4℃）後、血漿は分析まで-80℃で保存した。インスリン濃度は市販のRIAキット（Medical System, Immulite DPC, Los Angeles, CA）を用いて測定した。血漿グルコース濃度は、グルコースアナライザー（Beckman Instruments, Palo Alto, CA, USA）を用いて、グルコースオキシダーゼ法により測定した。血漿C-ペプチドは、autoDELPHIA automatic fluoroimmunoassay（Wallac, Turku, Finland）により、検出限界0.051ng/ml（17pmol/L）で測定した。免疫反応性グルカゴンは、エタノール抽出血漿中で、抗体コードNo. 4305はグルカゴンのCOOH末端に対する抗体であり、膵グルカゴンと特異的に反応する[36]。総 GLP-1 濃度は抗血清番号 89390 を用いて測定され、インタクトな GLP-1 (7-36)amide とその NH2 末端一次切断代謝物 GLP-1(9-36) amide [37]、および N 末端に伸長した GLP-1 (1-36)amide [38]と同様に反応します。

2.3 Euglycemic hyperinsulinemic clamp (EUC)

EUC試験は、DeFronzoら[39]に従い、体表面で40mIU・min-1・m-2インスリンを用いて12時間の一晩絶食後に実施した。インスリンのプライム一定注入が行われた（アクトラピッドHM、Novo Nordisk）。インスリン注入の一定速度は、定常状態のインスリン濃度を達成するために10分以内に到達した。その間に、20％のブドウ糖の可変注入が別の注入ポンプを介して開始され、血漿グルコース濃度を空腹時レベルに維持するために、5分ごとに測定された血漿グルコース濃度に基づいて速度が調節された。クランプ法の最後の20分間は、5～10分間隔で採血した血漿サンプルを用いてグルコースおよびインスリン濃度を測定した。全身末梢グルコース利用率は、定常状態インスリン注入の最後の30分間の間に計算され、平均グルコース注入速度（mg-kg-1-min-1として）として測定された。

2.4 手術手順

膵頭十二指腸切除は幽門温存法 [40] に従って行った。頭部領域の膵臓サンプルは、手術中に外科的切開の端から採取した。膵臓サンプルは液体窒素で凍結し、分析まで-80℃で保存した。

2.5

OGTT中の計算

インスリン分泌は、デコンボリューションによりC-ペプチドレベルから導き出された。複数のβ細胞機能パラメータは、以前に記述されたモデル [41-43]を用いて決定された。このモデルの重要な構成要素は、インスリン分泌とグルコース濃度とを関連付ける準線形関数であり、そこから2つのパラメータが決定された：グルコース感受性（βCGS）、すなわち関数の傾き、および固定グルコース値5.5mMにおけるインスリン分泌率（ISR@5.5）である。これは、標準化された基礎（非刺激）インスリン分泌を反映し、各個体においてグルコース5.5mMで生じるインスリン分泌の値を表す[41]。インスリン分泌とグルコース濃度との関連関数は、いくつかの因子（すなわち、非グルコース基質、消化管ホルモンおよび神経伝達物質）によって調節される可能性があり、これらの因子は、OGTT中の平均値を1とする時間依存性の増強因子として一括してモデル化される。増強因子は通常、ベースラインからOGTT終了時まで増加し[41,43]、その増加は120分後の値とベースライン値との比（PFR1）として定量化される。

2.6 膵臓組織の処理と測定

2.6.1 組織のホモジナイズとペプチドの抽出

組織はドライアイス上で保存し、重量を測定した。トリフルオロ酢酸（水中1%）を加えて抽出し、ビーズミルを用いてホモジナイズした。遠心分離後、上清を得、pH耐性のあるtc18カートリッジ（Waters, MA, USAのWAT036810）を用いて精製した。次に、エタノール溶出液を緩やかな気流下で一晩乾燥させ、1 mLのTRIS緩衝液に再溶解した： 100 mmol/l TRIS緩衝液（Cat.No.T-3253およびT1503、Sigma Aldrich）に、0.1 %（w/v）ヒト血清アルブミン（Cat.No.12666、Merck KGaA、Darmstadt、Germany）、20 mmol/l EDTAおよび0.6 mmol/l チメロサール（Cat.No.T-5125、Sigma Chemical Co、 St. Louis, MO, USA）（pH = 8.5）で希釈し、測定濃度が各アッセイの検出範囲内に収まるようにアッセイバッファーでさらに希釈した。

2.6.2 組織抽出液の生化学的分析

血漿サンプル中のグルカゴンおよび総GLP-1は、前述の方法で測定した。不活性型GLP-1は、酵素結合免疫吸着法を用いて測定した。このアッセイは、2種類のモノクローナル抗体、GLP-1F5を捕捉抗体（C末端指向性）、Mab26.1を検出抗体（N末端指向性）とする2部位サンドイッチアッセイである。バッファー中の検出限界は1 pmol/l以下であり、アッセイ内変動係数は20 pmol/lで5 %以下であった。

インスリンとC-ペプチドの抽出レベルは、Roche E-module (electrochemiluminescence) (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)を用いて測定し、総クロモグラニンAは、以前に記載された自社開発法を用いて測定した[45]。

パイロット研究では、既知量のインタクトGLP-1を外来投与した肝生検（GLP-1を保有していない）を用いて、インタクトGLP-1の検出下限を決定した。これは10回のテクニカルレプリケートで行った。これらの実験に基づき、インタクトGLP-1の定量レベルを0.1pmol/gとした。

2.7 統計

連続変数は平均値±SEM、カテゴリー変数は度数およびパーセンテージでまとめた。分布の正規性は、ヒストグラムおよび分位-分位プロットを作成することで評価した。標本が正規分布から有意に逸脱していなかったため、ベースライン時の群間の平均値の差をANOVAで検定した。Pearsonの相関分析は、研究された変数と参加者の年齢および性別との間の線形関係を評価するために実施された。変数間の関係は、線形回帰分析によって導き出された。組織測定から得られた変数は、耐糖能状態に対して回帰した。各パラメーターを従属変数とし、時間（カテゴリー変数として分析）と時間×耐糖能の積項を用いた反復測定の線形混合モデルを用いて、グルコース、インスリン、C-ペプチド、GLP-1、グルカゴンの循環レベルに対する時間、耐糖能、およびそれらの相互作用の影響を比較した。線形適合を用いて変数間の関係を探索した。両側p値＜0.05を統計的に有意とみなした。解析にはStata 15.1（StataCorp, TX, USA）を用いた。本研究では、包含基準および除外基準を満たす前向きに登録されたすべての患者を対象とし、マッチングや大規模コホートからのサンプリングは行わなかった。同じ理由で（解析時点までに得られた全サンプルの解析）、正式なサンプルサイズ解析は行わなかった。

3 結果

3.1 膵部分切除候補者における代謝評価と循環ホルモン値

耐糖能とインスリン分泌の差は、手術前に実施した2時間OGTTと4時間 MMTで評価し、その後、対象者をNGT（n＝19）、IGT（n＝20）、DM（n＝22）に層別化した。その結果、DM群ではOGTT中の空腹時グルコース値と平均グルコース値が有意に高く（空腹時グルコース値、平均グルコース値ともにp＜0.01、表1）、この分類が確認された。さらに、高インスリン血糖クランプによるグルコース取り込みとして測定されるインスリン感受性は、IGTおよびNGTの被験者と比較して、DMの被験者で有意に低かった（表1、p＜0.05）。予想されたように、糖尿病の被験者はNGTおよびIGTの被験者と比較して、MMT中の平均グルコース値が有意に高かった（交互作用についてp＜0.01、図2A）。インスリンとC-ペプチドの平均値は、NGT群とDM群と比較してIGT群で有意に高く（それぞれp＜0.05の交互作用、図2B、p＜0.01の交互作用、図2C）、OGTT由来のグルコース感受性はDM群で有意に低下していた（表1、p＝0.03）。空腹時グルカゴン濃度およびMMT中のグルカゴン濃度は3群間で同程度であった（交互作用についてはp＝0.41、図2D）。また、MMT中の循環総GLP-1濃度も調べたところ、3群間で同程度であった（交互作用のp = 0.70、図2E）。

図2

NGT（丸）、IGT（四角）、DM（菱形）被験者における混合食試験中のグルコース（A）、インスリン（B）、C-ペプチド（C）、グルカゴン（D）および総GLP-1（E）レベル。N = 61.

3.2 ヒト膵臓生検における抽出可能なプログルカゴン由来ペプチドおよびその他のペプチドの絶対濃度

61名の被験者の膵臓生検におけるプログルカゴン由来ペプチドおよびその他のホルモンの抽出可能な濃度を調べた。未希釈の粗抽出物は、（pHや妨害溶媒のために）すべてのアッセイにおいて非特異的に妨害するため、内容物を確実に測定できるのは、さらに精製（pH耐性のあるSepPak精製で実施）し、その後エタノールで溶出し、蒸発させて様々なアッセイバッファーに再構成した後のみである。ホモジナイズ段階で既知量のGLP-1を組織生検に添加した以前の実験では、組織濃度が0.1pmol/g組織以上であれば、抽出物中に存在するホルモンペプチドは確実に測定できると判断された。この検出限界以下の値は、ゼロと区別できないと考えなければならない。29/61検体で測定された抽出可能なクロモグラニンA、インスリン、C-ペプチドの絶対濃度は、血糖値の悪化とともに減少する傾向があった（それぞれ、補足図1A、p＝0.08；図1B、p＝0.20；図1C、p＝0.16）。図3A、BおよびCは、すべてのサンプルにおけるグルカゴン、総GLP-1およびインタクトGLP-1のレベルを示している。全サンプルのグルカゴン濃度の平均値は157±26.5pmol/g、総GLP-1濃度は23.9±2.66pmol/g、インタクトGLP-1濃度は1.15±0.18pmol/gであった。測定値に基づいて計算すると、インタクトGLP-1レベルは総GLP-1レベルの10％未満であり、グルカゴンレベルの約6％であった。しかし、生データの分析では、3群間に有意差は認められなかった。

図3

図3 ヒト膵臓サンプル中の絶対ホルモンレベル。NGT（緑の棒グラフ）、IGT（黄色の棒グラフ）、DM（赤の棒グラフ）におけるグルカゴン（A）、総GLP-1（B）、不活性GLP-1（C）（0.1pmol/gの線はこの測定の検出限界を示す）。箱ひげ図は中央値と四分位範囲、ひげは2.5-97.5パーセンタイル、＋は平均値。N = 61. (この図の凡例における色の解釈については、この論文のウェブ版を参照されたい)

生検で測定されたインタクトなGLP-1が、インタクトなGLP-1から主要なGLP-1代謝物である9-36NH2への分析前分解の影響を受けるかどうかを評価するために、不活性な9-36 GLP-1（酵素ジペプチジルペプチダーゼ-4による分解後に形成される代謝物）のレベルも測定した。その結果、レベルは非常に低く、3群間で同程度であった（p = 0.94、補足図2）。

3.3 ヒト膵臓生検における抽出可能なプログルカゴン由来ペプチドの相対レベル

様々な生検における内分泌組織の量が異なるため、3群間のホルモンレベルの差が隠されている可能性があるため、総GLP-1およびインタクトGLPの発現レベルを生検で検出されたクロモグラニンAのレベルに調整した。その結果、インタクトGLP-1（補足図3、r＝0.41、p＝0.02）レベルは、膵臓生検におけるクロモグラニンAレベルの上昇と直接相関することがわかった。

さまざまな生検におけるα細胞の量が異なると、3群間のホルモンレベルの潜在的な差を誤って表現する可能性があるため、総GLP-1およびインタクトGLP-1の発現レベルをグルカゴンレベルで調整した。ホルモンレベルはグルカゴンレベルに対するパーセンテージ、すなわちホルモン*100/グルカゴンレベルで表した。

膵臓生検において、グルカゴン値で調整した総GLP-1のレベルには、群間で有意差は認められなかった（それぞれ図4A、p = 0.15）。一方、グルカゴン値で調整したインタクトGLP-1（図4B、p=0.01）は、IGT群およびNGT群に比べ、DM群で有意に高かった。同様に、膵臓生検におけるクロモグラニンA値で調整した総GLP-1値（それぞれ補足図4A、p = 0.25）には、各群間で有意差は認められなかった。一方、クロモグラニンA値で調整したインタクトGLP-1（補足図4B、p＝0.03）は、IGT群およびNGT群に比べ、DM群で有意に高かった。さらに、クロモグラニンA発現とグルカゴンで調整したインタクトGLP-1レベルとの間には有意な負の関係が認められた（補足図5、p = 0.03）。

図4

グルカゴンで調整したヒト膵臓サンプル中のプログルカゴン由来ペプチド。グルカゴン濃度に対するパーセンテージで表した。NGT（緑の棒グラフ）、IGT（黄色の棒グラフ）、DM（赤の棒グラフ）被験者における総GLP-1（A）およびIntact GLP1（B）。箱ひげ図は中央値と四分位範囲、ひげは2.5-97.5パーセンタイル、＋は平均値。N = 61. (この図の凡例における色の解釈については、本論文のウェブ版を参照されたい）。

膵内ホルモン含量と年齢または性別との相関も調べたが、有意な変化は見られなかった（補足表2）。

3.4 β細胞機能パラメータは、膵島内インタクトGLP-1発現の増加と負の相関がある

生体内β細胞機能パラメータと膵島内インタクトGLP-1発現との関連を調べるため、OGTTから得られたβ細胞機能のモデルベース指標としてβ細胞グルコース感受性を測定したところ、膵島内インタクトGLP-1との間に逆相関が認められた（r = -0.31, p = 0.02）（図5A）。

図5

グルカゴンで調整したインタクトGLP1レベルとOGTT由来のβ細胞グルコース感受性との相関（A）；グルカゴンで調整したインタクトGLP1レベルと5.5mMグルコースで測定したインスリン分泌との相関（B）。

我々はまた、モデルに基づいた5.5mmolのインスリン分泌パラメータ（IRS@5）も評価した。その結果、IRS@5のレベルはインタクトGLP-1のレベルと逆相関しており（r = -0.38、p < 0.01）（図5B）、インタクトGLP-1の島内産生が、基礎β細胞機能の低下とグルコース変化に対するβ細胞の反応性の低下に関係していることが示唆された。

島内インタクトGLP-1の発現が腸管インクレチンホルモンや他の分泌現象、例えば概日リズムやインスリン分泌の脈動性に依存しているかどうかを調べるために、OGTT由来の増強因子（PFR1）も計算し、それを島内インタクトGLP-1のレベルに対して回帰した。増強因子と膵島内インタクトGLP-1発現レベルとの間に相関はみられず（補足図6、r = 0.05 p = 0.71）、膵島内インタクトGLP-1発現の変化は、腸管インクレチン効果の変動とは無関係であることが示唆された。

4 考察

我々の知見は、ヒトにおけるプログルカゴン由来ペプチド処理の局所適応は耐糖能障害／糖尿病状態から始まり、この分子的特徴は生体内のβ細胞機能障害を反映していることを示唆している。本研究では、分析したすべてのヒト膵臓生検において、インタクトなGLP-1とN末端拡張GLP-1の存在を検出することができた。興味深いことに、β細胞機能の悪化、耐糖能の低下、内分泌量の減少は、インタクトGLP-1の有意な増加（グルカゴンで標準化）によって特徴づけられた。この研究は、手術中に得られた膵臓サンプルと、代謝的にプロファイリングされた生存患者コホートから得られた食後血漿サンプルから見出された、プログルカゴン由来のペプチドホルモンに関する広範かつ包括的な分析を提供するものである。さらに、膵切除の非糖尿病候補者で行われた綿密な代謝プロファイリングを利用して、正常耐糖能の被験者から新たに2型糖尿病と診断された被験者までの研究コホートにおけるプログルカゴン由来ペプチドの膵レベルの変化を検出した。

これまでの研究で、単離されたヒト膵島のα細胞はGLP-1を処理し分泌する能力があることがわかっている [9,14,46-48]。Campbellら[14]は最近、培養単離されたヒト膵島は、マウス膵島の約3-4倍のα細胞しか持たないにもかかわらず、インタクトなGLP-1をマウス膵島の約50倍分泌すると報告した。しかし、そのレベルは非常に低く、単離や培養の手順に影響されている可能性があった。今回、分解能を向上させるために、手術中に採取した適切な大きさ（約0.2g）の生体膵臓標本を分析し、死体膵島の分離とその後の膵島培養を避けてGLP-1のレベルを直接測定した。これまでの報告と一致するように、インタクトGLP-1レベルは総GLP-1レベルの10倍以上低く、グルカゴンレベルの15倍も低いことから、N末端に伸長した不活性型GLP-1が代謝状態の異なる患者の膵臓から検出される主要なGLP-1アイソフォームであることが示された。

重要なことは、本研究において、新たに2型糖尿病と診断された患者の膵臓サンプルでは、耐糖能障害および耐糖能正常の被験者と比較して、グルカゴン含量で標準化したインタクトGLP-1の有意な増加が観察されたことである。このことは、インタクトGLP-1の増加は、グルカゴン分泌細胞数に関連しており、おそらくグルカゴン発現レベルに関係なく、プログルカゴン由来ペプチドのプロセッシングが変化したことに起因していることを示唆している。この点に関して、Wangら[49]は最近、α細胞におけるFam3aの欠損がプログルカゴンのプロセッシングを調節し、GLP-1の産生を増加させ、パラクリン的にβ細胞の機能を改善することを示唆した。さらに、糖尿病マウスでは、グルカゴンがグルカゴン受容体ではなくGLP-1受容体を介してインスリン分泌を刺激することが示唆されている。このシグナル伝達経路は、β細胞機能が低下している状況において、インスリン分泌を代償するメカニズムとして働く可能性がある。我々の研究では、グルカゴンレベルはNGT、IGT、DMの各群で同程度であったが、α細胞量が減少した個体で観察されたインタクトなGLP-1の代償的増加は、理論的には、特に糖尿病が発症した場合に、この代替シグナル伝達経路のアップレギュレーションを反映している可能性がある。

これまでの研究では、2型糖尿病発症の時間経過における島内GLP-1の機能については、主にGLP-1発現の測定やヒトにおける機能パラメータの定義が困難であったため、結論が出ていない。逆に、糖尿病モデルげっ歯類を用いた研究では、高血糖がα細胞PC1/3の発現と関連していることが示唆されており [19] 、プログルカゴンのGLP-1へのプロセッシングの程度が高くなることが予想される。

ヒトにおける膵島内GLP-1の増加の原因と影響については、まだはっきりしたことは分かっていない。しかし、膵島内GLP-1発現の変化は、β細胞機能が低下している間、パラクリン的に膵島のホメオスタシスを改善する可能性があるという仮説は立てられる。GLP-1由来の治療薬は、生理的循環濃度を超えてインタクトなGLP-1の利用可能性を増加させることによってその効果を発揮することは注目に値する[51,52]。しかし、膵島に到達して直接影響を及ぼす循環GLP-1またはGLP-1 RAの量については、まったくわかっていない。膵島に到達する量は動脈レベルに相当するが、α細胞由来ペプチドの膵島内レベルは、初期分布量が大きく異なるため、はるかに高い可能性がある。逆に、循環で測定できる膵島内GLP-1の量は非常に少ないと考えられる。パラクリン効果であることから、インタクトなGLP-1と膵島内のGLP-1受容体との間に重要な相互作用があり、循環レベルとは無関係に、GLP-1のβ細胞に対する有益な効果に関係していると推測できる。

我々の研究では、耐糖能やインスリン分泌に差があるにもかかわらず、血漿中GLP-1濃度は3群で同程度であった。もう一つの重要な観察は、循環GLP-1の基礎レベルも刺激レベルも、GLP-1産生における膵島内の変化を反映していなかったことである。具体的には、非糖尿病から新たに診断された2型糖尿病への移行は、基礎インスリン分泌とグルコース感受性の低下によって特徴づけられるが、MMT中のインスリン分泌は糖尿病患者で高く、インタクトなGLP-1/グルカゴン発現の増加と関連していた。実際、インタクトなGLP-1発現の増加は、膵島のホメオスタシスを維持し、高いインスリン需要および/またはインスリン分泌の欠損を克服する機能を担っている可能性があり、in-vitro実験やげっ歯類モデルで以前に示されている [5,7,9,11]。さらに、糖尿病前症および新たに2型糖尿病と診断された被験者におけるインタクトなGLP-1/グルカゴンの発現の増加は、空腹時に得られた膵臓サンプルで測定された。これまでのところ、膵島内インタクトGLP-1のレベルが食事に反応して上昇するかどうかについての研究はない。さらに、膵島内インタクトGLP-1が高血糖や膵島生理に影響を及ぼす他の刺激に反応して有意に増加する可能性も排除できない。

我々の研究デザインにはいくつかの長所がある。第一に、生検に含まれるペプチドの抽出と特性解析を可能にするのに十分な量の新鮮な膵臓組織生検を採取できたことで、死後の分離手順による可能性のある干渉を避けることができた。検出に用いるアッセイは極めて高感度（1pmol/l以下）であるが、信頼性の高い検出には、抗原抗体反応がアッセイバッファーと同様の方法で起こるのに適した溶液が必要である。これを容易にするため、抽出物はSepPak技術を用いて精製された。我々の研究室での回収実験によると、この手順で確実に検出できる最小量は約0.1pmol/g組織（湿重量）である。つまり、組織には、抽出物中の妨害物質と区別できない、さらに少量のペプチドが含まれている可能性がある。第二に、我々は同じ被験者のGLP-1アイソフォームの組織レベルと循環レベルの両方を測定し、グルコースホメオスタシスと食後のインスリン分泌におけるGLP-1の生理的役割を反映して、MMTのような栄養チャレンジに対するGLP-1を測定した。第三に、すべての人が病歴とHbA1cだけでなく、OGTTと4時間MMTを用いて評価されたので、インスリン、グルカゴン、GLP-1の分泌をin-vivoでも測定することができた。被験者の中には、長期にわたる糖尿病やコントロールされていない糖尿病はなく、HbA1c値が53mmol/molを超える人や糖尿病治療薬を服用している人はすべて除外した。参加者の中には、以前に一般的な生活習慣のアドバイスを受けていた人もいたかもしれないが、登録時には正式な生活習慣介入プログラムは実施されていなかったため、高血糖によるストレスや併用治療による潜在的な干渉を除外することができた。

基礎にある膵周囲新生物や膵病変が所見に及ぼす潜在的影響を考慮することは重要である。サンプル採取の時点で、本研究に組み入れられた患者はすべてそのような病態のために手術を受けていたが、進行性または転移性の病変を有する患者はいなかった。局所腫瘍の影響を最小限にするため、膵臓サンプルは一貫して病変から最も遠い手術断端から採取された。さらに、病変の大部分は膵外あるいは悪性度の低いものであり、有意な代謝障害の可能性は低かった。悪性腫瘍はグルコース代謝と膵島機能を変化させる可能性があるが、病変が軽度であることと組織採取部位を注意深く選択したことが、この影響を軽減したと考えられる。

本研究では、ヒト膵臓生検における総GLP-1とインタクトGLP-1のレベルを測定した。膵臓組織ではN末端に伸長した不活性型GLP-1が主に検出されたが、インタクトなGLP-1も存在し、膵島細胞にパラクリン的に作用して、その機能および/または運命に関連した利益をもたらしている可能性がある。この仮説を確認し、インタクトなGLP-1の実際の産生または分泌、およびグルコースの悪化およびβ細胞の機能障害と相関するパラクリン機能に対するGLP-1の変化の意義（空腹時または食後状態のいずれか）を明らかにするためには、さらなる研究が必要である。要約すると、2型糖尿病への進行におけるβ細胞機能の低下は、インタクトなGLP-1へのプログルカゴン処理の増加と関連している。

CRediT authorhip contribution statement

Teresa Mezza：執筆-総説・編集、執筆-原案、構想。Nicolai J. Wewer Albrechtsen：バリデーション、方法論、データキュレーション。Gianfranco Di Giuseppe: 執筆 - 査読 & 編集, 方法論, 調査, 形式分析, データキュレーション. Pietro Manuel Ferraro: 執筆-校閲・編集、形式分析、データキュレーション。Laura Soldovieri: 執筆-校閲、調査。Gea Ciccarelli：方法論、調査、データキュレーション。Michela Brunetti：調査、データキュレーション。ジュゼッペ・ケーロリソース、調査、データキュレーション。Sergio Alfieri：執筆、校閲、監修。エンリコ・チェレスティーノ・ニスタ監修、調査アントニオ・ガスバリーニバリデーション、監修、データキュレーション。ヴィンチェンツォ・トンドロ監修。Andrea Mari: 監修、方法論、形式分析、データキュレーション。Alfredo Pontecorvi：監修。Andrea Giaccari: 執筆-校閲・編集, 監修, 方法論, データキュレーション, コンセプト作成. イェンス・J・ホルスト執筆-校閲・編集、バリデーション、監修、方法論、データキュレーション、概念化。

利益相反宣言

著者らは、利益相反を宣言することはない。

謝辞

本研究は、Università Cattolica del Sacro Cuoreからの助成金（Fondi Ateneo Linea D.3.2, Fondi Ateneo Linea D.1, anno 2020 and Fondi Ateneo Linea D.1、 Fondi Ateneo Linea D.1, anno 2020 and Fondi Ateneo Linea D.1, 1, anno 2021）をT.M.に、（Fondi Ateneo Linea D.1 2019 and Linea D.1 2021）をA.G.に、イタリア保健省（The study of human islet cell plasticity to predict diabetes onset, progression and personalize therapy. CUP C54I19002210001 com. 5900039 COD．GR-2018-12365577）（T.M.へ）；欧州アストラゼネカ研究財団賞（T.M.へ）。NJWAは、NNF Excellence Emerging Investigator Grant - Endocrinology and Metabolism（申請番号NNF19OC0055001）、EFSD Future Leader Award（NNF21SA0072746）、DFF Sapere Aude（1052-00003B）の支援を受けている。筆者らは矛盾を申告する必要はない。JJHはノボノルディスク財団（NNF 18 CC0034900）の助成を受けた。著者らは、ホルモン測定の技術的援助をChristine Rasmussen（Department of Clinical Biochemistry, Bispebjerg Hospital）、編集の援助をSerena RotunnoとGiulia Gliozzo（Università Cattolica del Sacro Cuore）に感謝したい。

付録A 補足資料(1)

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β細胞機能と耐糖能が低下したヒト被験者では、島内インタクトGLP-1のレベルが高い

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