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納豆ではRBDの分解も担う。
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日本の発酵大豆食品である納豆抽出物は、invitroでSARS-CoV-2を含むウイルス感染を直接阻害します
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概要
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https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2021.07.034
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ハイライト
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日本の伝統的な大豆発酵食品である納豆抽出物は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）およびウシヘルペスウイルス1（BHV-1）の細胞への感染を完全に抑制しました。
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SARS-CoV-2のスパイクタンパク質（受容体結合ドメイン; RBD）のUK変異体およびBHV-1の糖タンパク質Dは、納豆抽出物によってタンパク質分解されました。
•納豆抽出物中のセリンプロテアーゼは、抗ウイルス薬としてさらに調査する価値があります。
概要
日本の伝統的な大豆発酵食品である納豆は、栄養価が高く、健康に良いことでよく知られています。 この研究では、納豆が重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）やウシヘルペスウイルス1（BHV-1）などのウイルスによる感染を損なうかどうかを調べました。 興味深いことに、私たちの結果は、納豆抽出物で処理されたSARS-CoV-2とBHV-1の両方が細胞への感染を完全に阻害したことを示しています。 また、BHV-1の糖タンパク質Dがウエスタンブロット分析によって分解されることが示され、組換えSARS-CoV-2受容体結合ドメイン（RBD）が納豆抽出物とインキュベートするとタンパク質分解的に分解されることもわかりました。 さらに、点突然変異を有するRBDタンパク質（UKバリアントN501Y）も納豆抽出物によって分解されました。 納豆抽出物を100°Cで10分間加熱すると、SARS-CoV-2とBHV-1の両方が細胞に感染する能力が回復しました。 熱不活化の結果と一致して、セリンプロテアーゼ阻害剤は納豆抽出物によって引き起こされる抗BHV-1活性を阻害した。 したがって、我々の発見は、納豆抽出物がウイルスタンパク質のタンパク質分解を通じてウイルス感染を阻害するプロテアーゼを含むという最初の証拠を提供します。
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キーワード
BHV-1糖タンパク質DSARS-CoV-2受容体結合ドメインBacillussubtilis抗ウイルス効果
1.はじめに
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）によって引き起こされる進行中のパンデミックに終止符が打たれる兆候はありません。 最初の感染が1年以上前に報告されて以来、それに関する報告は世界中で劇的に蓄積されています[1]。 最近の技術進歩により、ワクチンはかつてない速さで展開されています。 ただし、ワクチンを必要とするすべての個人に免疫を与えることは、遅いプロセスになります。 さらに、ワクチンの標的エピトープが変異している株が報告されています[2]。 予防接種だけでは完全な保護が保証されない場合があります。 したがって、SARS-CoV-2感染に対する他の対策と治療法を開発することが重要です。
この研究の目的は、納豆がSARS-CoV-2やウシヘルペスウイルス1型（BHV-1）などの抗ウイルス活性を持っているかどうかを調査することでした。 BHV-1は牛に呼吸器疾患を引き起こします。 納豆は日本で最も伝統的でユニークな食品のひとつとして知られており、蒸した大豆を枯草菌で発酵させて作られています。 伝統的に、日本人は納豆が健康に有益であると考えていました、そして近年、調査研究はこの信念の科学的証拠を明らかにしました[3]、[4]、[5]。 しかし、納豆の抗ウイルス特性は、環状リポペプチド抗生物質であるサーファクチンを除いて十分に研究されていませんでした[[6]、[7]、[8]]。 この研究では、納豆抽出物のプロテアーゼ活性がSARS-CoV-2受容体結合ドメイン（RBD）とBHV-1の糖タンパク質Dを分解し、細胞へのウイルス感染を阻害することを示しました。
2。材料と方法
2.1。 納豆エキスの調製
納豆エキスは以下の方法で調製しました。 10グラムの市販のS903納豆（タカノフーズ株式会社、茨城県、日本）を50 mLの遠心分離管に入れ、ガラス棒で室温で5分間撹拌しました。 次に、10 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を添加しました。 反転50回混合した後、混合物を3500rpmで10分間遠心分離し、上澄みをφ0.45μmフィルター、続いてφ0.22μmフィルターで濾過した。 得られた可溶性画分（以下、本研究では「納豆抽出物」と呼ぶ）は、使用するまで-30℃に保った。 納豆抽出物は、100°Cで10分間加熱する場合としない場合で処理しました。 したがって、2つの異なるサンプル、すなわち、加熱納豆抽出物、非加熱納豆抽出物を調製した。
2.2。 ウイルスと細胞
BHV-1、石川株（ウシ/日本/ 1988）は、MDBK細胞を使用して培養されました。 2020年2月に日本のクルーズ船ダイアモンドプリンセスでCOVID-19を発症した患者から分離されたSARS-CoV-2株は、神奈川県公衆衛生研究所（SARS-CoV-2 / Hu / DP / Kng）から入手しました。 / 19-027、LC528233）[9]。 SARS-CoV-2は、膜貫通プロテアーゼセリン2（TMPRSS2）を発現するVeroE6細胞を使用して培養されました。
2.3。 プラーク形成アッセイ
上記の2種類の納豆抽出物それぞれ90μLとBHV-1またはSARS-CoV-2ストック溶液10μLを混合し、37°Cで1時間インキュベートしました。 次に、混合物を最小必須培地（MEM）で10,000倍または5000倍に希釈し、それらの500μLをBHV-1の場合はMDBK細胞に、SARS-CoV-2の場合はVeroE6 / TMPRSS2細胞に12または 6ウェルプレート。 吸着の1時間後、細胞を滅菌PBSで1回洗浄し、カルボキシメチルセルロースを含むMEMで層状にしました。 37°Cで3日間培養した後、クリスタルバイオレットを使用してプラーク形成アッセイを行い、感染力を視覚化しました。 基本的に、各テストでは、少なくとも2つの独立した実験が実行されました。 試験した納豆抽出物だけでは、細胞に細胞毒性効果は生じませんでした（データは示していません）。
2.4。 プロテアーゼ阻害剤
PBSで10倍に希釈した80μLの納豆抽出物を、1μLのHalt Protease Inhibitor Cocktail、EDTAフリー（Thermo Fisher Science K.K.、東京、日本）および19μLのPBSと37°Cで1時間インキュベートしました。 １０μＬのＢＨＶ－１を溶液に加え、プラーク形成アッセイを上記のように実施した。 抑制剤カクテルには6種類の抑制剤が含まれています。 アプロチニン（Cayman Chemical、Michigan U.S.A。）、AEBSF。 塩酸塩（AdipoGen Life Sciences、Inc。、米国サンディエゴ）、ペプスタチンA（Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ）、ロイペプチン（ペプチド研究所、大阪、日本）、E-64（ケイマンケミカル）、塩酸ベスタチン（ Sigma-Aldrich、東京、日本）を使用しました。
2.5。 ウイルスタンパク質の分解分析
2.5.1。 BHV-1の糖タンパク質D
67.5μLのBHV-1ストック溶液を7.5μLの納豆抽出物とともに37°Cで1時間インキュベートしました。 ウエスタンブロット分析は、抗BHV-1糖タンパク質Dモノクローナル抗体（1B8-F11 BHV-1 / IBR gD-gIV; Veterinary Medical Research and Development、WA、U.S.A）を使用して実施しました。
2.5.2。 SARS-CoV-2の受容体結合ドメイン（RBD）
この研究では、C末端でHisタグと結合した組換えSARS-CoV-2（S1サブユニットタンパク質）宿主細胞受容体結合ドメイン（RBD）を使用しました（RayBiotech Life、GA、USA）。 RBDタンパク質は、Wuhan-Hu-1分離株（GenBankアクセッション番号QHD43416）に基づいて合成されました。 また、英国のバリアントN501Y RBD-His組換えタンパク質（Sino Biological、PA、USA）も使用しました。 各タイプの納豆抽出物4.5μLとSARS-CoV-2RBDタンパク質約2μLの混合物を37°Cで1時間インキュベートしました。 コントロールとして、PBSを適宜使用しました。 SDS-PAGEは還元条件下で行い、電気泳動後、ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色しました。
3。結果と考察
納豆抽出物に抗ウイルス活性があるかどうかを調べるために、BHV-1を納豆抽出物とインキュベートし、プラーク形成アッセイを実施しました。 図1Aに示すように、納豆抽出物の1倍、10倍、および20倍希釈は、MDBK細胞へのBHV-1感染を阻害しました。 納豆抽出物をさらに50倍、75倍、100倍に希釈すると、用量依存的にプラークが明らかに生成されました。 この結果は、納豆抽出物が用量依存的な抗ウイルス活性を含むことを示した。 興味深いことに、納豆抽出物を100°Cで10分間加熱すると、そのような抗ウイルス活性が失われ（図1B）、抽出物中の阻害因子が熱に敏感であることを示唆しています。 枯草菌が界面活性剤として産生するサーファクチンは、抗ウイルス作用があることが知られています[6]、[7]、[8]。 予想通り、追加の実験では、BHV-1を非加熱サーファクチンとインキュベートしたときに0.1 mg / mLのサーファクチンがBHV-1感染を阻害することが示されました（データは示していません）。 しかし、ウイルスを100°Cで10分間加熱した加熱サーファクチンとインキュベートした場合、BHV-1はMDBK細胞に感染し続けました（データは示していません）。 したがって、私たちの手に抗ウイルス活性を持っているサーファクチンは耐熱性ですが、この研究で発見された納豆抽出物の推定阻害因子は熱に敏感です。 さらに、納豆抽出物を4°CでBHV-1とインキュベートした場合、抗BHV-1活性は観察されませんでした（データは示していません）。 したがって、これらの結果を総合すると、納豆抽出物の抗ウイルス活性は、おそらくプロテアーゼなどの酵素によるものであるが、サーファクチンによるものではないという仮説が立てられました。
図1
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図1.納豆エキスのBHV-1感染抑制効果。 （A）BHV-1を、1倍から100倍に希釈した一連の希釈納豆抽出物とインキュベートし、プラーク形成アッセイを実施しました。 （B）BHV-1は、加熱または非加熱納豆抽出物の1倍希釈液とインキュベートしました。 次に、プラーク形成アッセイを実施し、プラークの数をグラフに示した（平均±SE、n = 3）。
私たちの仮説を確認するために、納豆抽出物をプロテアーゼ阻害剤で処理しました。 図2に示すように、納豆抽出物をプロテアーゼ阻害剤カクテルで処理した場合、BHV-1は明らかに細胞に感染することができました。 この結果は、納豆抽出物中のプロテアーゼが熱感受性阻害因子であることを強く示唆している。 さらに、プロテアーゼ阻害剤の1つである不可逆的なセリンプロテアーゼ阻害剤であるAEBSF HCl（4-（2-アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩）を処理すると、プラークが観察されました（図2）。 したがって、この結果は、納豆抽出物中のセリンプロテアーゼが抗ウイルス活性の候補の1つであることを明らかにしています。
図2
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図2納豆抽出物による抗BHV-1活性に対するプロテアーゼ阻害剤の効果。 BHV-1は、プロテアーゼ阻害剤カクテル、アプロチニン、AEBSF HCl、ペプスタチンA、ロイペプチン、E-64、またはベスタチンHClで処理した後、10倍希釈の加熱または非加熱納豆抽出物とともにインキュベートしました。 次に、プラーク形成アッセイを実施し、プラークの数をグラフに示した（平均±SE、n = 3）。
推定プロテアーゼがインビトロでBHV-1粒子の表面タンパク質を消化するかどうかを調査するために、抗BHV-1糖タンパク質Dモノクローナル抗体を使用したウエスタンブロット分析を行った。 糖タンパク質Dはウイルスエンベロープ-細胞膜融合において重要な役割を果たします[10]。 糖タンパク質Dは、BHV-1を加熱した納豆抽出物とインキュベートした場合、約45〜77 kDaに広いバンドとして現れます（図3、レーン2）。 対照的に、BHV-1を非加熱納豆抽出物とインキュベートすると、糖タンパク質Dのタンパク質分解が誘導されました（図3、レーン3）。 糖タンパク質D抗体によって検出されたバンドは、レーン3のバンドと比較して明らかに低かった（約30 kDa）。したがって、これらの結果は、推定プロテアーゼが糖タンパク質Dの消化によってBHV-1感染を阻害することを意味します。
図3
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図3納豆エキスで処理したBHV-1の糖タンパク質Dの分解。 BHV-1は、加熱または非加熱の納豆抽出物とともにインキュベートされました。 ウエスタンブロット分析は、抗糖タンパク質Dモノクローナル抗体を使用して実施されました。 レーン1：タンパク質マーカー、レーン2：PBSで処理されたBHV-1、レーン3：非加熱納豆抽出物で処理されたBHV-1、レーン4：加熱納豆抽出物で処理されたBHV-1、レーン5：非加熱で処理されたPBS- 納豆エキス、レーン6：加熱納豆エキスで処理したPBS。
次に、納豆抽出物がSARS-CoV-2のVeroE6細胞への感染を阻害できるかどうかをテストしました。 SARS-CoV-2を非加熱納豆抽出物と混合した後、プラーク形成アッセイを実施しました。 図4Aに示すように、SARS-CoV-2を非加熱納豆抽出物とインキュベートするとプラークが形成されましたが、加熱納豆抽出物はそのような能力を失いました（図4A）。 これらの結果はBHV-1の結果と一致しており（図1B）、納豆抽出物中の推定阻害因子が熱感受性プロテアーゼであることを示唆しています。 SARS-CoV-2のスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（RBD）は、感染の初期段階で宿主細胞のACE2受容体に付着するために重要な役割を果たします[11]。 図4Bに示すように、33 kDaの組換えRBDタンパク質は、非加熱納豆抽出物とのインキュベーションによって明らかに分解されました（レーン3）。 一方、加熱納豆抽出物を使用した場合、RBDタンパク質は無傷でした（レーン4）。 まとめると、これらの発見は、図4Aに示されている細胞に対するSARS-CoV-2の阻害が納豆抽出物によるRBD分解によるものであるという考えを支持している。 最近、変異型SARS-CoV-2の出現は大きな脅威です。 RBDのN501Y変異体はイギリスで優勢になっています[12]。 図４Ｃは、点突然変異を有するＲＢＤタンパク質、Ｎ５０１Ｙが分解されたことを示した。 さらに、SARS-CoV-2 RBDタンパク質の進化的分析は、V367FがACE2受容体に対するより高い結合親和性の重要な変異の1つであることを示しました[13]。 V367Yを運ぶRBDタンパク質も、納豆抽出物で処理することによって分解されます（データは示していません）。 これらの結果は、納豆抽出物が現在発生している、そして将来発生するであろう多くの種類の突然変異を消化する可能性があることを強く示唆しました。
図4
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図4納豆エキスによる抗SARS-CoV-2活性。 （A）SARS-CoV-2を加熱および非加熱納豆抽出物とインキュベートしました（1倍希釈）。 プラークアッセイを3回実施した（実験1、2および3）。 各プラークアッセイは2回行った。 実験1および2はパネルAに示されました。同様の結果が実験3で得られました（データは示されていません）。 各検査のプラークの数は、重複の平均でした。 （B）SARS-CoV-2の組換えRBDタンパク質を加熱または非加熱納豆抽出物とインキュベートした。 サンプルをSDS-PAGE用のゲルにロードしました。 レーン1：タンパク質マーカー、レーン2：PBSで処理したRBDタンパク質、レーン3：非加熱納豆抽出物で処理したRBDタンパク質、レーン4：加熱納豆抽出物で処理したRBDタンパク質、レーン5：非加熱納豆抽出物で処理したPBS、 レーン6：加熱納豆抽出物で処理したPBS。 （C）点突然変異を有するSARS-CoV-2の組換えRBDタンパク質（N501Y）を加熱または非加熱納豆抽出物とインキュベートした。 サンプルをSDS-PAGE用のゲルにロードしました。 レーン1：タンパク質マーカー、レーン2：PBSで処理したRBDタンパク質（N501Y）、レーン3：非加熱納豆抽出物で処理したRBDタンパク質（N501Y）、レーン4：加熱納豆抽出物で処理したRBDタンパク質（N501Y）、レーン5 ：非加熱納豆抽出物で処理したPBS、レーン6：加熱納豆抽出物で処理したPBS。
この研究では、納豆抽出物がBHV-1およびSARS-CoV-2の細胞への感染能力を阻害し、BHV-1の糖タンパク質DおよびSARS-CoV-2のRBDタンパク質を分解することを示しました。 しかしながら、納豆抽出物のこの阻害効果は、加熱およびセリンプロテアーゼ阻害剤での処理により損なわれた。 したがって、この阻害効果は、推定される熱感受性セリンプロテアーゼによるものであると考えられる。 これは、プロテアーゼが糖タンパク質DおよびRBDタンパク質のマルチサイトを消化できたという証拠によってさらに裏付けられています。 したがって、私たちの研究は、納豆の推定セリンプロテアーゼが、おそらくそれぞれその糖タンパク質Dとスパイクタンパク質のタンパク質分解を通じて、BHV-1とSARS-CoV-2の感染機能を損なう可能性があることを示唆しています。 今後の研究では、プロテアーゼの特定と切断部位の特定に焦点を当てる必要があります。 納豆抽出物中の精製プロテアーゼは、抗ウイルス薬としてさらに調査する価値があります。 最後に、私たちの発見は、納豆の原料としての新たな応用に向けた将来の道を開きます。
競合する利益の宣言
この研究は、株式会社タカノフーズによって資金提供されました。この研究では、同社のS903納豆を使用しました。
謝辞
この研究は、高野食品株式会社からの資金によって支援されました。
付録A.補足データ
以下は、この記事の補足データです。
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