【日本酒学】第6回「微生物：酵母」
今回は前回に引き続き，日本酒の原料の中枢ともいえる微生物のうち「酵母」についてまとめていきます．
日本酒検定なんて興味ないという方は「今回のコラム」だけでも読んでいただけると嬉しいです🙇🏻
＜本シリーズの基本コンセプト＞
・読むだけで日本酒検定1級の合格に必要な知識を得ることができる
・Why/Howに関する補足を入れることで日本酒検定に興味がない方にとっても面白いと感じてもらえる読み物にする
・検定対策とそれ以外を切り分けるため，記事は以下の構成とする
①トピックス ・・・ 日本酒検定に出題される内容を抽出した解説
②演習問題 ・・・ 過去の日本酒検定問題を紹介
③今回のコラム ・・・ （検定とは無関係な）補足や関連情報など
以下は前回の投稿です．
こちらも是非お読みいただけますと幸いです．
それではやっていきましょう♬
1. トピックス：微生物「酵母」
(1) 清酒用酵母とは
「酵母」は糖分をアルコールと炭酸ガスに変換するため，日本酒の製造において極めて重要な役割を果たします．
食品や酒類に用いられる主な酵母はサッカロマイセスセレビジエ（$${\textit{Saccharomyces cerevisiae}}$$）と呼ばれ，パン用酵母，味噌用酵母，醤油用酵母，酒類用酵母などがあります．
酒類用酵母はさらにビール用酵母，ワイン用酵母，ウイスキー用酵母，清酒用酵母などに分けられ，清酒用酵母としては低温・高濃度アルコール環境下でも活動でき，華やかな香気成分を生成する酵母が多数開発されています．
(2) 協会酵母（きょうかい酵母）
清酒用酵母は1904（明治37）年に設立された国立醸造試験所（現在の酒類総合研究所）が全国新酒鑑評会で上位となった酒蔵の酵母を採取・分離・培養して「きょうかい酵母」として頒布を始めたことにより大きな発展を遂げます．（現在は日本醸造協会が頒布）
これにより従来は自然界の酵母に頼らざるを得なかった日本酒製造の安定化を果たし，国家に安定した酒税徴収をもたらすことにも繋がりました．
末尾に「01」が付く酵母は「泡なし酵母」と呼ばれ，アルコール発酵で発生する二酸化炭素によって形成される泡が発酵タンクから溢れることを防ぎ，発酵タンクを効率的に使用できることで衛生面・生産性に優れるというメリットがあります．
(3) 試験研究機関で開発された酵母
現在では各都道府県の試験研究機関においても様々な酵母の開発が進められており，また，酒蔵自身が蔵内に生息する酵母を独自に分離・選抜した「蔵付き酵母」を用いる酒蔵も増えてきており，酵母の開発は多様化し様々な選択ができるようになっています．
以下に試験研究機関で開発された代表的な清酒用酵母をまとめました．
ここには記載していませんが，秋田県で開発されたAK-1酵母は協会酵母として採用され，1501号酵母として全国に頒布されています．
宮城県で開発されたほの複などのセルレニン耐性酵母はリンゴ様の香りを呈するカプロン酸エチルを生成する能力に優れた酵母であり，「香り酵母」とも呼ばれます．（詳しくは後述の「今回のコラム」で！）
日本酒の香りのうち果実や花などに例えられる「吟醸香」は主に酵母が発酵中に産生する化合物に由来し，リンゴや洋ナシのような甘味と酸味を持った果実に例えられるカプロン酸エチルや，メロンやバナナなど濃厚な甘味を持つ果実に例えられる酢酸イソアミルなどに代表されます．
代表的な吟醸香成分を生成する酵母をまとめました．
中にはカプロン酸エチルと酢酸イソアミル両方の生成能に優れた酵母もあり，求める酒質設計に応じて使い分けられています．
(4) 野生酵母
自然界に存在する酵母から日本酒用に適した酵母を選抜したものを野生酵母と呼びます．
東京農業大学醸造科で花の蜜に集まる酵母から分離した花酵母や，奈良県工業技術センターが菩提酛を復活させる目的で正暦寺で採取・分離した正暦寺酵母などがあります．
2. 演習問題
それでは，実際に日本酒検定に出題された過去問を見てさらに理解を深めましょう．
特に日本酒検定1級において酵母に関する問題は頻出のため，しっかり押さえておくとよいでしょう．
問6-1（準1級）
東京農業大学で開発され，日本酒造りに実用化された花酵母の数を選択肢より一つ選べ．
1：6種類 2：10種類 3：14種類 4：18種類
問6-2（1級）
秋田流花酵母の登録番号を選択肢より一つ選べ．
1：1401号 2：1501号 3：1701号 4：1901号
問6-3（1級）
佐浦（宮城県）からきょうかい12号酵母が分離された年を選択肢より一つ選べ．
1：1955年 2：1960年 3：1965年 4：1970年
問6-4（1級）
三重県で開発された酵母を選択肢より一つ選べ．
1：MI-1 2：MK-1 3：MA-1 4：MY-1
問6-5（1級）
カプロン酸エチルの生成が多い酵母を選択肢より一つ選べ．
1：宮城A酵母 2：うつくしま夢酵母 3：FK501 4：M310酵母
問6-6（1級）
正暦寺酵母と同じ分類の酵母はどれか．
1：京の華 2：やまぐち・桜酵母 3：広島もみじ酵母 4：まほろば華酵母
解答・解説
問6-1 3：14種類
東京農業大学ではナデシコやコスモスといった14種類を実用化しています．
問6-2 2：1501号
秋田流花酵母（AK-1）は1501号酵母として頒布されています．
・1401号は通称「金沢酵母」
・1701号は通称「高エステル生成酵母」
問6-3 3：1965年
正直，捨て問でいいと思います 笑
図6-2の通り，ざっくり戦前・昭和・平成の区分を覚えておけば，何となくのアタリは付けられるかもしれませんね．
問6-4 2：MK-1
「三重県の酵母はMから始まる」と覚えていると足元を掬われる問題かもしれません．
問6-5 4：M310酵母
茨城県の明利酒類㈱で開発されたM310酵母はカプロン酸エチル生成能が極めて高い代表的な酵母です．
問6-6 2：やまぐち・桜酵母
正暦寺酵母とやまぐち・桜酵母は野生酵母の一種です．
3. 今回のコラム
さて，今回は日本酒製造に関わる重要な微生物のうち「酵母」について見てきました．
前回の「麹菌」と合わせると，日本酒ができあがるまでには多くの微生物の緻密な働きが介在していることがお分かりいただけたのではないかと思います．
日本酒のラベルに酵母の情報まで記載されていることは少ないのですが，酵母は日本酒の味わいに非常に強く関係するため，酵母について知識を持っておくと日本酒を飲んだ時の香りや味わいに対する解像度が上がるかもしれません．
今回のコラムでは日本酒の世界の中でもまだまだ謎の多い酵母について深堀りするため，清酒用酵母のアルコール耐性，泡なし酵母，吟醸香成分の産生に関する話をしたいと思います．
(1) 清酒用酵母のアルコール耐性
清酒用酵母やワイン酵母，焼酎酵母などは分類学的にはいずれも$${\textit{Saccharomyces cerevisiae}}$$に属しますが，それぞれに特異的な性質を持ち，それは遺伝子の違いによる部分があります．
現在用いられている清酒用酵母の大半は，遺伝的に元を辿ると協会6号，7号，9号，10号のいずれかより派生したものであり，発酵力が高く，高いアルコール生成能力を示し，並行複発酵によって醪の段階で20%を超える高濃度のアルコール生産が可能であることが特徴です．
これはワインやビールなど同じ醸造酒と比較しても非常に高いアルコール濃度です．
では，この高いアルコール生産性はどこから来るのでしょうか．
一般的に発酵力の高い酵母とは，自ら生成する高濃度のエタノール存在下でも発酵を継続でき，さらに温度やpH，グルコース濃度等の様々な発酵阻害要因にも打ち勝つ耐性が必要と考えることが普通です．
実際，以前は清酒用酵母もストレス耐性が高いために発酵力が高いと記されていた教科書も多かったと聞きます．
しかし，2011年のUrbanczykら（醸造研究所）の研究報告により，驚くことに，清酒用酵母は高温や高エタノールなどのストレスに弱いことが明らかになりました．
また，続く研究により，清酒用酵母ではストレス応答において重要な役割を果たす遺伝子発現が抑制されていることがわかり，これが発酵力の向上に寄与していることが見出されました．
この変異はワイン酵母やビール酵母などには存在せず，主に昭和以降に分離された清酒用酵母に特異的に分布しており，まさに清酒用酵母らしさと言えます．
若干の語弊はあるかもしれませんが，簡単に言うと，通常の酵母であればこれ以上アルコール生成すると自滅してしまうため防衛的に発酵が休止されるところ，清酒用酵母はそれを感知するセンサーが欠落しているために継続してアルコールを生成し続けてしまうことにより，結果的に高いアルコール生産能力を発現している，ということになります．
これは自然界の生存競争では望ましいものとは言えないものの，清酒用酵母は長らく日本人の手で育てられ，日本人や日本酒にとって有益な微生物として進化を遂げてきたのだと感じます．
私はこれを初めて知ったとき，ワーカーホリック的な日本人の働き方と同じと感じ，妙な感動を覚えました 笑
酵母が日本人に似てきたのか，逆に日本酒と付き合ううちに日本人が酵母に似てきたのか，それともただの偶然か…．
(2) 泡なし酵母
アルコール発酵工程では酵母が生きるためのエネルギーを得るために糖化酵素により生成したグルコースを分解し，グルコース1分子あたりエネルギーに代わるアデノシン三リン酸（ATP）2分子を得るとともに2分子のエタノールと2分子の二酸化炭素を生成します．
生成した二酸化炭素（炭酸ガス）は大部分が放散されますが，その際にガスが気泡となって醪の液面全体に広がり，発酵の進行によって泡がどんどん立ち上がることで「高泡」と呼ばれる泡の層を形成します．
このように生み出された泡は醪の発酵状態を見極めるための指標として古くから用いられてきました．
一方で高泡が形成されると最終的にタンクから醪が溢れてしまい，泡の表面に吸着した酵母が流出することで醪中の酵母量が減少し，発酵が進まなくなる不具合にも繋がります．
このため，昔は醪の泡状態を夜通し監視して定期的に泡消しの作業を行う泡番を交代で置いていました．
アルコール発酵においてこの高泡を形成しない酵母が「泡なし酵母」です．
昔から泡なし現象は知られており，1916年（大正5年）に広島税務監督局の高橋源次郎と大蔵省醸造試験所の善田猶蔵の両氏によって広島県の酒造場で泡なし酵母が分離されたものの，まだ微生物に関する十分な知見がない当時において泡立ちは醪の状態を見極める重要な要素であったとともに，泡なし現象は異常として考えられていたため，分離された酵母の菌株は保存されることもなく失われてしまいました．
それから月日が流れ，清酒の消費量が急速に伸びていた1963年（昭和38年），醸造試験所の秋山裕一が島根県の酒造場で泡なし酵母A-63を分離して研究を重ね，泡あり酵母と泡なし酵母の性質の違いを明らかにしました．
残念ながらA-63酵母は実用化には至りませんでしたが，1968年に協会7号酵母から泡なし変異株が分離され，2年間にわたる試験醸造により生成酒の品質が7号とほぼ同等であることを示し，協会701号として頒布されるに至りました．
その後，他の協会酵母や各県で開発された酵母などからも次々に泡なし変異株が分離され，今や国内外の日本酒醸造のほとんどが泡なし酵母によって行われています．
泡なし酵母といっても発酵による反応は同じく二酸化炭素を発生します．
それなのに何故泡なし酵母では高泡が形成されないのかは，"AWA1"と命名された清酒酵母に特有の遺伝子によります．
高泡形成能を有する清酒酵母が有するAWA1遺伝子は疎水性のドメインを有するAwa1タンパク質を発現し，酵母細胞の表層に結合します．
この疎水性の表面特性を持った酵母細胞が発酵で生じた二酸化炭素の気泡に吸着することで気泡を安定化させ，高泡を形成すると考えられています．
一方，泡なし酵母ではこのAWA1遺伝子が変化しており，発現するAwa1タンパク質が酵母細胞の表層に結合するGPIアンカーが欠失していることによって酵母細胞の表面は親水性のままで気泡に吸着することはなく，醪表面で発生した泡は崩れ，高泡の形成が抑制されると考えられています．
（引用：日本醸造協会, 酒造りの小さな主役－清酒酵母の話－「Part7 泡なし酵母物語」）
この性質からも，高泡中には多くの酵母が存在していることがわかります．
そのため，泡なし酵母では従来高泡中に取り込まれていた酵母が醪中に維持されるため，泡あり酵母と比較して醪中の酵母濃度が若干上昇し，発酵速度が上がることがわかっています．
このように原理を理解すると，目に見える現象と微生物の世界で起きていることがしっかりと繋がるというのは非常に面白いところではないでしょうか．
(3) 吟醸香の生成における酵母の役割
日本酒における酵母のもう一つの重要な役割として，吟醸香成分の生成は外せません．
同じく醸造酒であるワインはブドウの香り，ビールはホップの香りなど，原材料に由来する香りが特徴的ですが，日本酒の原料である米や米麹には特徴的な香りがほとんどありません．
しかし，日本酒の中にはまるで果実のような香り，即ち吟醸香がはっきりと確認されるものがあります．
これは発酵過程で醪中の酵母の働きによって生み出される香り成分が主な由来です．
代表的な吟醸香にはリンゴや洋ナシに例えられるカプロン酸エチルとメロンやバナナに例えられる酢酸イソアミルがありますが，長年，これらのエステル類の生産性を向上させる酵母の開発が行われてきました．
エステル（ここではカルボン酸エステルを指します）はアルコールとカルボン酸の縮合化合物であり，エステルを多く生産するためには前駆体となるアルコールまたはカルボン酸の生成能の向上を図ることが重要です．
例えば，カプロン酸エチルはカプロン酸とエタノールのエステル化により生成しますが，エタノールは醪の中に大量に存在するため，カプロン酸エチルの生産性を向上しようとすれば，必然的にカプロン酸を高生産させることが求められます．
カプロン酸は酵母の脂肪酸合成酵素（Fatty Acid Synthase：FAS）によって生成されますが，通常，カプロン酸のような短鎖脂肪酸は少量しか合成されません．
しかし，1991年（平成3年）に月桂冠総合研究所が抗生物質の一種であるセルレニンに耐性を示す酵母において，FASの働きが変異して長鎖脂肪酸が減少し，カプロン酸が多量に生成されることを発見しました．
この発見によってセルレニン耐性酵母はカプロン酸エチル高生産性酵母として大きく広がり，華やかな香りを持つ日本酒が多く作られるきっかけとなりました．
（引用：E.Ichikawa, et al., Agric. Biol. Chem., 55(8), 2153(1991)）
一方，酢酸イソアミルはイソアミルアルコールと酢酸のエステル化合物ですが，日本酒の発酵過程では酢酸はそれほど多く生成せず，酢酸イソアミルは主にアルコールアセチルトランスフェラーゼ（AATFase）によるイソアミルアルコールの酵素的エステル化によって生成します．
このため，酢酸イソアミルの生産性を向上しようとすれば，前駆体となるイソアミルアルコールを高生産することが求められます．
イソアミルアルコールは必須アミノ酸の一つでもあるロイシンの生合成経路から分岐して合成されますが，ロイシンが十分に生成されると合成は停止（フィードバック阻害）され，イソアミルアルコールの生成量も一定程度に調節されてしまいます．
そこで，このフィードバック阻害が解除された変異株を得ることでイソアミルアルコールの生産性が向上した酵母が開発されました．
しかし，イソアミルアルコール（高級アルコール）自体は溶媒様臭やホワイトボードマーカー様の匂いを呈し，また，日本酒セラーの投稿で記載した通り，酸化によりイソバレルアルデヒド等に変化してムレ香の原因ともなります．（詳しくは以下の過去記事にて）
したがって，オフフレーバーを抑制するためにイソアミルアルコールをAATFaseにより上手く酢酸イソアミルまで誘導する一方，酢酸イソアミルが増加しすぎると加水分解により酢酸が生成して酢酸エチル（過剰に含まれると接着剤や除光液の匂い）の増加要因にもなることから，高度な発酵制御が求められることになります．
これらの吟醸香成分の生成能に優れた「香り酵母」が開発されるまでは勘と経験に基づき麹の破精や発酵条件の高度な管理によって清酒酵母に掛けるストレスを適切に制御する醸造管理を行っていましたが，香り酵母の開発によって香り高い日本酒を比較的容易に造ることができるようになりました．
これによって似たような香りや味わいの日本酒が多く見られるようになった面も否定はできませんが，大きな技術革新であることは間違いなく，選択肢が広がったことも事実ですので，今後も様々な日本酒が見られることを期待していきたいです．
今回のコラムは以上にしたいと思います．
酵母は日本酒の香りや味わいにも非常に深く関わっているとともに，化学的にも深堀りしがいのあるテーマであり，いつも以上に長くなってしまいました．
間違っている部分もあるかもしれませんが，もしお気づきの点がありましたらお知らせいただけると助かりますm(_ _)m
さて，第2回から今回まで，日本酒の原料である米，水，麹菌，酵母について見てきました．
次回からはいよいよこれらの原料を用いた日本酒の「造り」についてまとめていきたいと思います．
今後の更新も是非チェックしていただければ幸いです．