肝脂肪症に対する菜食主義者の微生物叢の保護効果は食物繊維によって伝えられる：糞便微生物叢移植療法への示唆
肝脂肪症に対する菜食主義者の微生物叢の保護効果は食物繊維によって伝えられる：糞便微生物叢移植療法への示唆
https://www.mdpi.com/2072-6643/15/2/454
by Nikola Daskova 1,2ORCID,Marie Heczkova 1,Istvan Modos 1,Jaromir Hradecky 3ORCID,Tomas Hudcovic 4,Marek Kuzma 4,Helena Pelantova 4ORCID,Irena Buskova 1.1, Eva Sticova 1、David Funda 4ORCID、Jaroslav Golias 4、Barbora Drabonova 5、Jarmila Jarkovska 4、Maria Kralova 6、Ivana Cibulkova 7、Jan Gojda 7ORCID、Monika Cahova 1,*ORCID
1
14021プラハ、チェコ共和国、臨床・実験医学研究所
2
カレル大学第一医学部、カテリンスカ1660/32、12108プラハ、チェコ共和国
3
チェコ生命科学大学森林・木材科学部，チェコ共和国，16500プラハ
4
CAS微生物学研究所，チェコ共和国，プラハ市，14220
5
チェコ生命科学大学農業生物学・食品・天然資源学部，チェコ共和国，16500プラハ
6
マサリク大学応用数学・コンピュータサイエンス学部，チェコ共和国，60177ブルノ
7
クラロフスケ・ヴィノフラディ大学病院およびカレル大学第三医学部内科、10000プラハ、チェコ共和国
*
著者宛先
Nutrients 2023, 15(2), 454; https://doi.org/10.3390/nu15020454
受理されました。2022年11月17日 / 改訂：2023年1月12日 / 受理：2023年1月13日 / 掲載：2023年1月13日 2023年1月13日 / 掲載：2023年1月15日
(本論文は、特集「インスリン抵抗性と脂質代謝の栄養学的制御」に属しています）。
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要旨
糞便微生物叢移植は肥満および関連疾患の治療手段となり得るが、現在、最適なドナーの特性に関するコンセンサスは得られていない。我々は、非伝染性疾患の発症率が低い菜食主義者のドナーの微生物叢が、肥満誘発性食事の代謝効果にどのような影響を与えるか、またこれらの効果を媒介する食事性イヌリンの潜在的役割について検討した。無胚乳動物にヒト・ヴィーガンマイクロバイオティクスを接種し、標準食または西洋型食事（WD）を、イヌリンを添加したものと添加していないものを与えた。WDは、ヴィーガン微生物群のコロニー形成にもかかわらず、過度の体重増加、グルコース代謝障害、インスリン抵抗性、肝脂肪症を誘発した。しかし、イヌリンの補給は、脂肪沈着を逆転させ、グルコースホメオスタシスを改善した。一方、非ヒト化従来型マウスでは、イヌリンはWD誘発の代謝性変化に影響を与えなかった。ヴィーガン・マイクロバイオータコロニー化マウスでは、イヌリン補給により腸内細菌叢組成とその代謝性能が大きく変化し、タンパク質分解性発酵から糖類分解性発酵へのシフト（含硫化合物の減少、SCFAの増加）が誘導された。その結果、（i）ビーガン微生物叢だけではWDの悪影響から保護されないこと、（ii）イヌリンを補充することで脂肪症が逆転し、グルコース代謝が正常化することを見いだした。この現象は、微生物叢の組成が変化し、タンパク質分解発酵を犠牲にして糖類分解発酵が強調されたことと関連している。
キーワード：糞便微生物叢移植、ビーガン微生物叢、肝脂肪症、イヌリン、タンパク質分解性発酵
はじめに
精製糖、動物性脂肪、加工食品の大量摂取を特徴とする欧米型の食事は、肥満や非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）、世界で最も一般的な肝臓疾患の有病率の急増と関連しています[1,2]。腸内細菌叢は、食事と肥満リスクの間の最も重要なメディエーターの一つであることが繰り返し示されている[3,4]。いくつかのメカニズムが提案されました：エネルギー収穫の促進、満腹感の中枢への影響、腸管バリア機能の障害、および慢性炎症の促進です[5]。肥満と関連する特定のメタゲノムパターンが文献に記載されていますが[6,7]、それらは年齢、民族、地理などの要因に大きく影響されています[8]。
現在までのところ、NAFLDに対する証明された薬理学的治療法はなく、治療戦略は主にライフスタイルへの介入、すなわち食事療法に基づいています[9]。減量と代謝の健康増進を目的とした多くの食事療法がある [10,11] 。栄養摂取量の調節は、栄養負荷などを通じて宿主の生理機能にいくつかの直接的な影響を及ぼします。さらに、宿主生理学におけるヒトマイクロバイオームの本質的な役割に関する研究が急速に進み、様々なダイエットの有益な効果は、ある側面では、腸内細菌叢を形成し、その代謝プログラミングを変えることによって媒介できるのではないかという疑問が生まれました。プレバイオティクス基質の送達やプロバイオティクスの介入に加えて、現在Clostridioides difficile感染症の治療法として承認されている糞便微生物叢移植（FMT） [12] が、肥満やメタボリックシンドロームを含む他の非感染性疾患の治療という文脈でも注目を集めている [13]．微生物叢の組成に変化をもたらさないプロバイオティクス治療とは対照的に[14]、FMTは腸内細菌群集全体の構造変化を引き起こすため[12]、複雑な有益な効果をもたらす可能性がある。現在までに、肥満およびメタボリックシンドローム患者における除脂肪雑食動物ドナーからのFMTの使用を評価した6件の無作為化臨床試験が報告されている[13,15,16,17,18]。データのメタアナリシスでは、肥満関連疾患に対するFMTの効果は部分的なものに過ぎないことが示された。FMT受診者において、HbA1c、HDL、LDLコレステロール値の有意な低下が認められたものの、体重、血清TAG量、血糖値の低下は認められませんでした[19]。しかし、これらの研究のいずれにも、FMT後の食事に関する推奨事項は含まれていなかった。
FMTの効果的な使用は、最適なドナーの定義が不十分であるために制限されている。現在の文献によると、ビーガン食は代謝健康促進アプローチと考えられており［20,21,22,23,24］、食事は腸内細菌叢の構成を調節する主な環境要因の1つである［25］。したがって、菜食主義者は、はっきりしない結果ではあるが、適切なドナーとして暗示された。菜食主義者のFMTは、脂肪性肝炎の治療において適度な有益性を持つことが示されたが [26]、メタボリックシンドロームの患者においてトリメチルアミン-N-オキシドの産生の変化を誘発することはできなかった [17]。受信者が食習慣を変えなかったので、菜食主義者の微生物叢自体は、おそらく不健康な肥満誘発性食の効果を打ち消すことができなかったのであろう。この観察と一致するように、我々の以前の研究は、ヒトにおけるビーガン食への強い固執は、微生物叢の組成に比較的穏やかな影響しか及ぼさないことを示した[27]。一方、菜食主義は、有益な代謝物スペクトルに向けた微生物叢の性能の著しい修正と関連していたが、この側面は、植物性食品を豊富に含む食事との組み合わせでのみ現れることができた。
これらの予備的なデータにもかかわらず、移植された微生物叢が宿主の腸内環境や提供された基質によってどのような影響を受けるかについては、これまで明らかにされていない。そこで、我々はビーガン由来のFMTの代謝効果が食事、特に食物繊維によって媒介されるかどうかを追求することを目的とした。ヒト・ヴィーガン微生物叢をコロニー形成した無菌マウスをモデルとして、（i）ヴィーガン微生物叢がどのように肥満原性（欧米型）食事から保護するか、（ii）微生物叢/メタボローム組成におけるメカニズム的関係、（iii）食物繊維（イヌリン）が肥満原性の環境下でヴィーガン微生物叢の治療能力を強化する能力について探索した。材料と方法
2.1. 腸内細菌叢ドナー
倫理的理由から動物実験に反対しない4名のビーガン提供者を、我々の以前の研究[27]で詳述したビーガンコホートより募集した。彼らの臨床的特徴は、表1および補足ファイルS1に示されている。
表1. 便提供者のベースライン臨床特性。HDL-ch、HDL-コレステロール；LDL-ch、LDL-コレステロール；TC-ch、総コレステロール；TAG、血清トリアシルグリセロール。
表
全員が少なくとも3年間、すべての動物性食品を厳格に避けた。除外基準は、代謝に関連する慢性疾患、消化管の疾患、過去3ヶ月間の抗生物質治療、妊娠、慢性的な投薬（ホルモン避妊を除く）、日常的にアルコールを摂取していることと定義した。参加者は新鮮な便を提供するよう求められ、その便は直ちに処理された[28]。各サンプル中の総菌数は、定量的汎細菌リアルタイムPCR（フォワードプライマーACACTGACGATGTTCTACAGTTGATCNTGGCTCAG、リバースプライマーTACGGTAGCAGACTTGTCTGTNTTANGCGCKGCTG）により評価し、各接種物はほぼ同じ細菌数（3.9×106CFU/μL）に希釈された。各サンプルを等量ずつ混合し、混合VG接種液を調製した。このアリコートは、移植まで緩衝グリセロールとともに-80℃で凍結保存した。
2.2. 動物
無菌 C57Bl6 マウスは、Novy Hradek, CR にある CAS の微生物学研究所で飼育されているコロニーから得た。マウスは、トレクスラー型プラスチック製アイソレーターで無菌状態で飼育し、12：12時間の明暗サイクルにさらし、オートクレーブ滅菌した水道水と50 kGy照射した無菌ペレット（飼育飼料：Altromin 1414, Altromin, Germany）を自由摂取させた。軸性は2週間ごとに、マウスの糞や綿棒の好気的・嫌気的培養により細菌、カビ、酵母がいないことを確認して評価した。雌マウスは，皮膚投与，浣腸，経口投与により，菌量≧1×109の混合VG接種でコロニー形成させた。コロニー形成された雌は無菌の雄と交配された。その雄をVGと呼び、gnotobiotic isolatorで飼育し、実験に使用した。我々は、ヒトの腸内細菌叢をコロニー化した「生理的に正常な」マウスモデルを作製することを目的として、このデザインを採用することにした。最近の証拠によれば、母体が腸内微生物に曝露されると、子孫に様々な適応が誘発され、コロニー化した母体から生まれた仔は、生涯の後半にコロニー化した無菌マウスとは異なる[29,30]。もう一つの理由は、母親のコロニー化により、子孫のコロニー化の高い均質性が達成されるからである。離乳後、全ての動物に3週間飼育食を与えた。従来型C57Bl6マウス（CV）は、CASの微生物学研究所（プラハ、CR）の飼育施設より入手した。主要な結果変数である肝臓TAG含量に従って、1群あたりの最小動物数を推定するために、検出力分析を計算した（0.8の確率でp ˊ0.05に対してmin n = 5）。時点Aで、マウスを無作為に4群に分け、それぞれ特定の餌をさらに8週間摂取させた。SD（標準食）、SD＋I（標準食＋10％イヌリン）、WD（西洋食）、WD＋I（西洋食＋10％イヌリン）。実験デザインはFigure 1に示す。8週間後（タイムポイントB）、経口ブドウ糖負荷試験を行い、動物を麻酔の過量投与により殺し、さらなる分析のために組織サンプルを収集した。実験食である西洋食（脂肪42kJ％、炭水化物43kJ％、タンパク質15kJ％、番号TD88137 mod.）と西洋の標準食コントロール（脂肪13kJ％、炭水化物69kJ％、タンパク質15kJ％、番号CD88137）はSsniff（ドイツ、ソエスト）より購入した。イヌリン添加飼料(10% wt/wt)はSsniff社で特注した。飼料は放射線照射により滅菌した。すべての動物実験は、Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (2011)に準拠して実施した。
Nutrients 15 00454 g001 550Figure 1. 実験デザイン。CV、コンベンショナルマウス；GF、ジャームフリー；OGTT、経口ブドウ糖負荷試験。(A)、タイムポイントA（食事介入前）、(B)、タイムポイントB（食事介入後）。
2.3. 経口ブドウ糖負荷試験
一晩絶食させたマウスにグルコース（1 mg. g-1 体重）を投与し、経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）および血清中のC-ペプチド濃度のアッセイを並行して実施した。血液は尾静脈からヘパリン処理した毛細血管に採取した。血糖値はグルコメーター（Roche, Basel, Switzerland）で、C-ペプチド濃度はELISAキット（Mercodia, Uppsala, Sweden）で測定した。サンプリングは、各マウスについて0分、30分、60分、120分に実施した。
2.4. 便および盲腸内容物のバクテリオーム解析
QIAmp PowerFecal DNA Kit (Qiagen, Hilden, Germany) を用いてDNAを抽出し、細菌16S rRNA遺伝子のV4領域をPCRで増幅するまで-80℃にて保存した。配列決定は、MiSeq装置（Illumina, Hayward, CA, USA）を用いてMiSeq reagent kit v2を用いて実施した。生配列はDADA2アンプリコンデノイザー[31]を用いて処理された。DADA2 RパッケージのassignTaxonomy関数により、Silva 138.1参照データベース[32]を用いて、L_1 (Phylum), L_2 (Class), L_3 (Order), L_4 (Family), L_5 (Genus) and L_6 (Species) レベルで分類を行った。
2.5. 糞便中の揮発性化合物（VOC）分析
盲腸をホモジナイズし、乾燥質量1%(wt/wt)に相当する量に希釈した。Agilent 7890B ガスクロマトグラフ (Agilent Technologies, Canta Clara, CA, USA) と Pegasus 4D time of flight mass spectrometer (LECO, USA) を組み合わせ、糞便サンプルの揮発性フィンガープリントを実施した。揮発性物質は，Supelco（米国）製のジビニルベンゼン/カルボキセン/ポリジメチルシロキサンコーティングを施した固相マイクロ抽出（SPME）ファイバを用いて収集した。データ取得と初期データ処理は、LECO社製の装置SW ChromaTOFを用いて行った。
2.6. NMR分析
血清サンプル（タンパク質沈殿後）を、5mm TCI低温プローブヘッドを備えた600MHz Bruker Avance III分光計（Bruker BioSpin, Rheinstetten, Germany）で測定した。1D-NOESY、CPMG、J分解実験は、メーカー標準のソフトウェアTopspin 3.5を使用して実施した。プロトンと炭素の化学シフトをHMDBデータベースと比較して同定した個々の代謝物の濃度は、CPMGスペクトルの対応するシグナルのPQN [33] 正規化強度として表現された。定量された代謝物のリストと対応する1Hおよび13C化学シフトは、Supplemental Methodsに記載されています。
2.7. 肝臓中のトリグリセリド（TAG）含量
100 mg の新鮮な肝臓組織を 2 mL の 5%NP40 in deionized H2O でホモジナイズし、脂質を抽出した (95 ℃、5 分; 室温、10 分; 95 ℃、5 分)。この混合物は、ステップの間にボルテックスした。抽出後、50μLをタンパク質濃度の測定に使用し、残りのホモジネートを14,000×gで3分間遠心分離し、透明な上清を脱イオンH2Oで1：9に希釈した。トリグリセリド濃度は、市販のキット（ERBA-Lachema Diagnostics、チェコ共和国）を用いて測定し、μmol TAG mg prot-1として表現した。
2.8. 統計解析
統計解析は、R ソフトウェアパッケージおよび社内スクリプトを使用して行った[34]。すべての統計解析の前に、便および盲腸の分類子はフィルタリングされた。サンプルの少なくとも5%に出現する分類群のみを保持した。便および盲腸の微生物叢の一変量解析は、生のリードカウントに対してDESeq2 Rパッケージ[35]を用いて実施した。複数のグループを比較する場合、尤度比検定とペアワイズWald検定によるp値の両方を報告する。p値はBenjamin-Hochberg補正を用いて調整した。便および盲腸の微生物叢について報告された効果量は、DESeq2によって得られた対数2倍変化である。NMRおよびVOCデータの一変量解析における有意性は、Benjamin-Hochberg補正を用いたKruskal-Wallis検定およびDunnのポストホック検定によって得られた。これらのデータセットについて報告された効果量は、Cliffのデルタである。便および盲腸の微生物叢におけるアルファ多様性は、ビーガンRパッケージ（https://CRAN.R-project.org/package=vegan、2022年11月16日にアクセス）を用いて解析された。生のカウントを10,000リードに希釈し、Shannon indexを計算した。統計的有意性は、Kruskal-Wallis検定およびBenjamin-Hochberg補正を用いたDunnのポストホック検定によって計算された。多変量解析には主成分分析（PCA）とPermutational MANOVA（PERMANOVA、Rパッケージveganのadonis関数）を使用した。すべてのデータセットは、分析前に中心を合わせ、スケーリングを行った。さらに、さらなる分析の前に、便と盲腸のデータセットは、分散安定化変換によって変換された。統計的有意性を評価するために、PERMANOVAを10,000回の反復で実行した。PCAとPERMANOVAの両方でユークリッド距離を使用しました。PERMANOVAのペアワイズ比較には、RパッケージのpairwiseAdonisを使用した。各データセットの識別能力を判断するために、Lassoを使用して分類モデルを作成した。分類指標は、10回繰り返しの3回クロスバリデーションを用いて求めた。モデル中の最小の変数数を選択するために、我々はλ=1 se、すなわちクロスバリデーション誤差が最小誤差の1標準誤差以内になるような最も正則化されたモデルになるλを報告した。肝臓のTAG量とマイクロバイオームの相関ネットワークは、以下のように作成した。まず、一変量解析から有意に変化した分類群を同定した。これらの分類群について、肝臓のTAG含有量に対するスピアマンの相関係数を計算した。相関係数に対応するp値はBenjamin-Hochberg補正を用いて調整し、調整後のp値≦0.1の相関関係で相関ネットワークを作成した。L_5、L_6レベルの便のデータセットについては、絶対値が0.6より大きい相関関係のみを示す。結果
3.1. 体組成とグルコースホメオスタシス
体組成パラメータ、すなわち総体重、肝臓重量、肝臓中のトリアシルグリセロール（TAG）含量に応じた表現型に対する実験食の影響を、元胚葉除去ヒト化マウス（VG）および従来型マウス（CV）において評価した（図2）。
栄養素 15 00454 g002 550Figure 2. 体組成およびグルコースホメオスタシスに対する食事およびイヌリン補給の影響。(A）：総体重（g）；（B）：肝臓重量（g）；（C）：肝臓TAG含量（nmol TAG. mg-1 protein）；（D）：血漿中の空腹時C-ペプチド濃度（pg. L-1）；（E）：OGTT30分の血漿中のC-ペプチド濃度（pg. L-1）；（F）：OGTT30分のグリセミア（mM）；（G）：肝臓スライスの組織学評価。データは箱ひげ図（第1、第3四分位値、中央値）とひげ図（最小、最大値）で示した。OGTT, oral glucose tolerance test; CV, conventional mouse; VG, humanized mouse; SD, standard diet; SD + I, standard diet supplemented with inulin; WD, Western diet; WD + I, western diet supplemented with inulin.の各データを箱ひげ図にて示す。CV_WD vs CV_SD; x p ˊᵕˋ CV_WD vs CV_SD + I; ‡ p ˊᵕˋ vG_WD vs VG_SD; - p ˊᵕˋ 0.05, - p ˊᵕˋ 0.01, - p ˋᵕˋ 0.001 VG_WD vs VG_SD; † P 0.05, - p ˊᵕˋ 0.01, - P P P P 0.05, - P P P P P P P P - 0.01, - p p p p p p p - 0.003, 0.003, 0.003, 0.003, 0.02 05, -- p ˊ 0.01, --- p ˊ 0.001 VG_WD vs VG_SD + I; # p ˊ 0.05, ## p ˊ 0.01 VG_WD + I vs VG_WD; ++ p ˊ 0.01 VG_WD vs CV_WD; f p ˊ 0.05 VG_WD + I vs CV_WD + I.であった。
予想通り、西洋料理は両モデルにおいて、総体重および肝臓重量、肝臓TAG含量の有意な増加を引き起こし、後者2つのパラメータはCVマウスと比較してVGでより顕著に影響を受けた。イヌリン添加は、CVマウスではWD誘発の変化に影響を与えなかったが、VGマウスでは肝TAG含量の減少および肝重量の正常レベルへの到達に関連した。また、VG_WD + I群では、p ˊ0.05で統計的有意差には至らなかったものの、精巣上体脂肪パッド重量が正常化する傾向が認められた（図らずも）。欧米食投与は、VGマウスにおいてのみ、空腹時およびグルコース刺激時のC-ペプチド血清濃度として評価されるインスリン分泌の悪化と関連していた。VG_WD + I群では両パラメーターが正常化し、WDの影響はイヌリン投与により補償された。むしろ驚くべきことに、30分OGTTでの血糖値はCVマウスで高い傾向にあり、VG_WD + I群ではCV_WD + I群と比較してさらに有意に低かった。イヌリンがCVマウスの代謝表現型に影響を与えないことから、我々はさらにVGモデルに着目し、有益な結果に関連するマイクロバイオームおよびメタボロームの構成要素を同定することを目指した。
3.2. ヒト化マウスにおける食事およびイヌリン介入後の盲腸内細菌叢の組成
介入前（タイムポイントA）、糞便中のマイクロバイオームの多様性と組成は、実験群にランダムに割り当てられたマウスで差がなかった（図S1およびS2）。介入後（タイムポイントB）の実験群間の微生物叢組成の比較を目的として、遠位腸の微生物叢の最も代表的なサンプルであると考えられる盲腸の内容を分析した。分散のみによるグループの教師なし分離を、PCAを用いて可視化した（図3A,C）。門レベルでは、微生物相の構成に差はなく、PERMANOVA p = 0.025であったが、分散検定が有意であり、結果に影響を及ぼしていた。種レベルでは、PERMANOVA p ˊ 0.001、分散検定は有意ではなく、ペアワイズ検定で全群間の差が証明された（SD vs SD + I p = 0.0011, SD vs WD p = 0.0011, SD vs WD + I p = 0.0011, WD vs WD + I p = 0.0042).
栄養成分 15 00454 g003 550図3. ヒト化マウスにおける盲腸内細菌叢の構成。(A,C)。2次元PCAスコアプロット。各成分の説明される分散は、軸のラベルに含まれている。大きな点は各グループの中心を表している。(B,D): Lassoロジスティック回帰モデルにおけるheld-out特性。(E,F): 盲腸内細菌叢のα多様性をShannon指数で評価した。~~~ VG_SD + I vs VG_SD; °°° p ˊ 0.001 VG_WD + I vs VG_SD; # p ˊ 0.05, p VG_WD + I vs VG_WD. データは箱ひげ図（第1、第3四分位値、中央値）とひげ図（最小、最大値）で表示した。
次のステップとして、機械学習アプローチ（Lassoロジスティック回帰）を採用し、2組のグループごとの識別を定量化した（図3B,D）。L_1レベルでは、VG_SD + I vs VG_SD、VG_WD vs VG_SD群のみを確実に識別することができたが、その他の群間の識別は満足できるものでなかった。分離の精度は、下位の分類群に到達するにつれて向上した。L_6レベルでは、すべてのグループのペアが90%以上の精度、感度、特異性で分離できた。アルファ多様性は、シャノン指数によって評価された。欧米食はL_1（門）レベルの多様性を増加させたが、他の分類群には影響を与えなかった。イヌリン処理は、バックグラウンド食（VG_SDまたはVG_WD）とは無関係に、すべてのレベルで多様性にマイナスの影響を与えた（図3E、Fおよび図S3）。
群間を識別する特定の細菌分類群を、DESeq2を用いて実施した単変量解析により同定した。すべての操作により、すべての分類レベルで微生物相組成に影響があることが観察された。L_1レベルでは、VG_WD群はVG_SD群と比較して、Bacteriodota、Actinobacteriota、Verrucomicrobiotaの存在量が高く、Firmicutesの存在量が減少していることが特徴的であった。イヌリン投与はFirmicutesに対するWD効果を打ち消すとともに、Verrucomicrobiaの増加を増強させた。さらに、イヌリン投与により、SD-WDマウスとWD-SDマウスの両方でDesulfobacterototaが減少した（Table S1）。
L_6レベル（種）では、一変量解析により76の分類単位、すなわちFDR ≦0.1で群間有意差のあるものの64％が解明された（Table S2）。食餌とイヌリンの影響を考慮すると、これらの細菌はいくつかのグループに分けられる（図4）。40の細菌分類群はイヌリンのみの影響を受けていた。18の細菌において、イヌリンの効果は食餌依存的であった。7つの細菌はSDとの組み合わせでのみ（図4A）、11つはWDとの組み合わせでのみ（図4B）、イヌリンによって有意に刺激された。22の細菌は、バックグラウンドの食餌とは無関係にイヌリンの影響を受けた。そのうち、イヌリン処理により9種類の細菌が活性化され、13種類の細菌が減少した（図4C）。8種はWDによってのみポジティブ（n = 3）またはネガティブ（n = 5）な影響を受けた（図4D）。5つの分類群では、WDの効果はイヌリンによって増強された。WDとイヌリンの両方から正の影響を受けた唯一の細菌はAkkermansia muciniphilaであり、イヌリンの効果は食餌の効果よりも一桁以上強かった。4つの細菌は負の影響を受けた（図4E）。最後に、14の細菌において、イヌリンはWDの影響を打ち消した。11の細菌（Alistipes putredinis, Parabacteroides merdae, Sellimonas sp., Collinsella stercosis, Suterella sp., Hungatella sp., Flavonifractor sp., Lachnospiraceae NK4A136 group, Angelakisella sp., Oscillibacter sp., Bilophila sp.) はWDにより刺激され、イヌリンはそれらの存在量に対して負の影響を与えた。3つの細菌（Parasutterella sp., Alistipes shahii, Lachnospiraceae_NA_NA）はWDによって抑制されたが、イヌリンはこの効果を部分的に補償した（図4F）。9 種の分類群については、食餌やイヌリンの効果のパターンは確認されなかった。
栄養成分 15 00454 g004 550図4. 食事および/またはイヌリンの影響を有意に受けた細菌分類群。(A): SDとの組み合わせでイヌリンのみに影響を受ける分類群（adj_pval VG_SD + I vs VG_SD ˊ 0.1）；(B): WDとの組み合わせでのみイヌリンの影響を受けるTaxa (adj_pval VG_WD + I vs VG_SD ˊᵕˋ); (C): 食事で独立してイヌリンの影響を受けるTaxa (adj_pval VG_SD + I vs VG_SD ˋ 0. 1およびadj_pval VG_WD + I vs VG_SD ˊᵕˋ); (D): WDのみの影響を受ける分類群 (adj_pval VG_WD vs VG_SD ˊᵕˋ); (E) WDとイヌリンの両方の影響を受ける分類群：相加効果 (adj_pval VG_WD vs VG_SD ˊᵕˋ); (D): WDの影響を受ける分類群：相加効果 (adj_pval VG_WD vs VG_SD ˋ); (E) WDとイヌリアの両方の影響を受ける分類群：相加効果(vs VG_SD ˋ) 1およびadj_pval VG_WD + I vs VG_WD ˊᵕˋ ;効果量 VG_WD vs VG_SD および VG_WD vs VG_WD + I は同じ方向）; (F) WDとイヌリンの両方の影響を受ける分類群：反対効果（adj_pval VG_WD vs VG_SD ˊᵕˋ ;効果量 VG_WD vs VG_WD ˋ :0. 1およびadj_pval VG_WD + I vs VG_WD ˊᵕˋ, effect size VG_WD vs VG_SD and VG_WD vs VG_WD + I in the opposite direction)．一変量統計量検定（Kruskal-Wallis）の結果によって分類群を選択し、omnibus adj_pval ≈ 0.1.とした。グラフはlog2FCとして計算された効果量を示す。 adj_pval, 調整後p値; FC, fold change.
3.3. ヒト化マウスにおける食事およびイヌリン投与後の盲腸 VOCs 組成
盲腸内容物から合計 61 種類の VOC を同定し、そのうち 17 種類は群間で有意な差があった（表 S3）。群分けを図5に示すが、PERMANOVA検定により、少なくとも一部の群のVOCs組成が異なることが確認された。SDにイヌリンを補給しても盲腸揮発性の有意なシフトは見られなかったが（pairwise PERMANNOVA p ˃ 0.1）、Lassoロジスティック回帰モデルを用いて、VG_SD群とVG_SD + I群を89%の正確さと86%の特異度で識別することが出来た。
Nutrients 15 00454 g005 550Figure 5. 盲腸のVOCs組成。(A)2次元PCAスコアプロット。各成分の説明される分散は軸のラベルに含まれている。大きな点は各グループの中心を表す。(B）Lassoロジスティック回帰モデルのヘルドアウト特性。
単変量解析では、両群間で有意に異なる5つの化合物が同定された。インドールおよび1,2-ベンズイソチアゾールはVG_SD群と比較して有意に減少し、テトラデカナル、1-ブタノールおよびブタン酸はVG_SD + Iで増加した（Figure 6A）。盲腸のVOCsスペクトルに対するWD単独の効果は、かなり控えめであった。PERMANOVAペアワイズ検定は有意ではなく（p = 0.374）、Lassoロジスティック回帰モデルの精度は0.78、特異度は0.67で、UDAAによる代謝物濃度の差は確認されなかった。WDとイヌリン補給の組み合わせは、PCA（図5A）、ペアワイズPERMANOVA結果（p＝0.005）、Lassoロジスティック回帰モデルのホールドアウト特性（図5B）により明らかになったように盲腸VOCsスペクトルに深いシフトをもたらした。7つの化合物はWDとの組み合わせでイヌリンのみに影響を受け（図6B）、すべて陽性であった。未知RI 1703（増加）およびジメチルトリスルフィド（減少）の2つの化合物は、両方の飼料と組み合わせたイヌリン補給によって影響を受けた（図6C）。2-ペンタデカノンの盲腸含有量はWDとイヌリン補給の両方によって増加し、その効果は相加的であった（図6D）。2-トリデカノンの場合のみ、イヌリンとWDの効果が逆であった（図6E）。
栄養成分 15 00454 g006 550Figure 6. 食事および/またはイヌリンが有意に影響するVOCs。(A): SDとの組み合わせでイヌリンのみに影響を受けるVOC（adj_pval VG_SD + I vs VG_SD ˊ 0.1）；(B): WDとの組み合わせでイヌリンのみに影響を受けるVOC（adj_pval VG_WD + I vs VG_SD ˊᵕˋ）； (C)．イヌリンが食事に独立して影響を与えるVOC（adj_pval VG_SD + I vs VG_SD ⑅ 0.1, adj_pval VG_WD + I vs VG_SD ⑅ 0.1）; (D): WDとイヌリンが共に影響を与えるVOC：相加効果（ adj_pval VG_WD vs VG_SD ⑅0.1 and adj_pval VG_WD + I vs VG_WD ⑅ 0.1) 1、効果量 VG_WD vs VG_SD および VG_WD vs VG_WD + I は同方向）；（E）：WD およびイヌリンの両方から影響を受ける VOC：反対効果（adj_pval VG_WD vs VG_SD ˊ 0.1 and adj_pval VG_WD + I vs VG_WD ˊ 0.1, 効果量VG_WD vs VG_SD およびVG_WD vs VG_WD + Iは逆方向）であった。一変量統計量検定（Kruskal-Wallis）の結果に応じてVOCを選択し、omnibus adj_pval ≈ 0.1. グラフは、log2FCとして計算された効果量を示す。 adj_pval, 調整後p値; FC, fold change; RI, retention index.
3.4. ヒト化マウスにおける食餌療法およびイヌリン投与後の血清メタボローム組成について
NMRスペクトロスコピーで評価した血清メタボロームは、いずれの治療法においても有意な影響を受けなかった。PCAでは群間の差は見られず（すべてのペアワイズPERMANOVA検定 ˃ 0.15）、Lassoロジスティック回帰モデルに基づく群間の識別も満足のいくものではありませんでした（図S4）。単変量解析を用いても、群間で有意に異なる代謝物を同定することはできなかった。
3.5. 統合的解析
最後に、マイクロバイオームまたはVOCsの組成とWD誘発肝脂肪症の抑制との間の関係の可能性を検討した。この目的のために、VG_WD群とVG_WD + I群における肝臓TAG量と盲腸細菌またはVOCs存在量とのスピアマン相関に基づいてネットワークを構築した（図7）。盲腸内細菌叢と肝TAG量の関係を見ると、肝脂肪症は、イヌリンですべて正の刺激を受ける4つの細菌（Agathobacter、Lactonifractor、Bacteroides ovatus、Bacteroides uniformis）の存在量と負の相関があることが判明した。WDによって存在量が正の影響を受け、イヌリンによって負の影響を受ける9つの細菌と、イヌリンによって負の変調を受ける12の細菌を含む37の分類群が、肝臓TAG量と正の相関を示した（図7A）。肝臓のTAG量と盲腸で同定されたVOCs化合物の相関ネットワークを図7Bに示す。肝臓TAG量と三硫化ジメチルまたはプロパン酸プロピルとの間には、2つの正の相関関係しか確認されなかった。肝臓のTAG量は、食物繊維の発酵のマーカーである酢酸を含む9つの化合物と負の相関があった。
Nutrients 15 00454 g007 550Figure 7. 肝臓のTAG量と盲腸のマイクロバイオーム（A）およびVOCs（B）組成との相関ネットワーク。エッジの幅と色は相関の値に比例する（赤：正、青：負）。RI、リテンションインデックス。4.考察
我々は、動物モデルにおいて、菜食主義者の微生物叢は、それ自体では西洋型食生活の代謝的有害作用を打ち消すことはできないが、プレバイオティクスであるイヌリンをさらに補充することにより、NAFLDおよび血糖値の悪化から保護する能力を示すことを証明した。イヌリンの効果は、ヒト化マウスのヴィーガン微生物叢との組み合わせでのみ発現し、従来のマウスの微生物叢との組み合わせでは発現しませんでした。ヒト化マウスにイヌリンを補給すると、タンパク質分解性発酵を犠牲にして糖類分解性発酵が強調され、盲腸内細菌叢の組成に有意な変化が見られた。
4.1. 食事と微生物叢の相互作用がFMT治療の結果に影響する
Backhedらの研究[3,4]は、マウスモデルにおいて、肥満の表現型が腸内細菌叢の移植により伝達されることを示した画期的な研究である。病的な微生物叢」を移植する可能性は、「健康な微生物叢」を移植して治療目的に使用することが可能かどうかという問題を提起するものである。しかし、健康な微生物叢とは何かという定義がないことが、この概念の普及を阻む大きな欠点となっている。ヒトの腸内では、健康なマイクロバイオームの普遍的に適用可能な構成を定義することは不可能である [36]。代謝的健康との関連では、植物ベースの食事（ベジタリアンまたはビーガン）の遵守が潜在的な健康上の利益と関連することが示され [37]、したがって、ビーガン微生物叢は有益と見なされる可能性があります。一方、欧米諸国では、ビーガン食は腸内細菌叢組成にわずかな影響しか及ぼさず [27,38,39] 、利用可能な2件のビーガンFMT試験の結果は極めて控えめであった。Ridauraらは、移植された微生物叢の侵入およびコロニー形成の可能性が食事に強く依存することを証明した [40]。肥満（Ob）と痩せ（Ln）の不和双生児ペアの腸内細菌叢をコロニー形成した無菌マウスは、標準的なマウス食でドナーの表現型を繰り返した。低飽和脂肪・高果物・野菜食を与えたところ、Ln微生物が優勢となり、Ob微生物にコロニー形成されたケージメイトの腸に侵入し、肥満の発生を抑制した。一方、高飽和脂肪／低果物・野菜食を与えたマウスでは、Ln微生物叢の優位性と保護作用は消失した。この研究は、肥満誘発性の食事が、痩せ型に関連するヒト腸内細菌分類群に対していかに選択的であるかを示している[40]。
同様に、背景となる微生物叢が食事介入の治療効果を決定する。マウスモデルでは、イヌリンの補給は、様々な結果と関連していました。3 つの研究は、C57Bl6 マウスで実施されました。1つの研究では、イヌリンは果糖を含む西洋食によって誘導された体重増加と脂肪症を減少させたが [41] 、他の研究ではイヌリンは高脂肪食の悪影響を逆転させなかった [42]。n-3系脂肪酸欠乏食を与えたマウスでは、イヌリン投与は体重増加と脂肪化を促進し、グルコースホメオスタシスの障害を逆転させなかった[43]。APOE*3-Leiden.CETPマウス（動脈硬化モデル）では、イヌリンは高コレステロール血症や動脈硬化の進展を抑制せず、高い割合の食事性コレステロールと組み合わせると、肝炎の発現さえももたらしました[44]。我々の手では、イヌリンの補充は、従来飼育されていたC57Bl6マウスの西洋食の効果を全く逆転させなかった。マウスの腸内細菌叢はヒトとは大きく異なり、同じ系統のマウスでも飼育施設が異なれば、細菌叢の構成は大きく異なる。したがって、上記の研究結果のばらつきは、介入前の腸内細菌叢の設定の違いに起因している可能性がある。これらの証拠を総合すると、食事による強い微生物叢の相互作用と、この関係の治療目的への含意が強調される。
先に引用したビーガンFMT研究では、参加者は習慣的な食事を変えないよう明示的に求められた。したがって、ヴィーガンドナーの微生物叢の効果が控えめであったのは、FMTの治療能力を発揮できなかったFMT受診者の食事に起因している可能性がある。この仮説は、成人ビーガンおよび雑食性ヒト集団の腸内細菌叢およびメタボロームを比較した我々の以前の観察研究によって裏付けられた[27]。その結果、糞便中の微生物相組成にはわずかな差しかなかったが、糞便中のメタボロームには大きな差があり、これは両群の食生活が大きく異なることを反映していることが判明した。
4.2. 食事誘発性ステトーシスに対する菜食主義者の微生物叢の保護効果は、食物繊維の補給に依存する
我々は、西洋食によって誘発された体重増加、すなわち内臓脂肪の膨張に対抗する菜食主義者の微生物相の保護能力を示すことができなかった。一方、イヌリンの摂取は、肝臓への過剰なTAG蓄積を防ぎ、糖代謝障害を改善した。我々は、この観察結果に基づいて、潜在的なメカニズムを示唆することができる。イヌリンの補充は、微生物叢の組成に大規模なシフトを誘導し、肥満誘発性食餌の効果をしばしば打ち消すことが示された。動物門レベルでは、イヌリンはファーミキューテス類の豊度を刺激し、その結果、バクテロイデスとファーミキューテスの比率が減少していた。また、VG_SD + I および VG_WD + I では、Desulfobacterota の存在量が減少し、硫黄化合物代謝菌が減少し、有害な硫黄含有代謝物の生成が抑制されることが示され、イヌリン存在下での硫黄含有代謝物の生成抑制が示唆された。
さらに、イヌリン補給によって有意に影響を受ける肝臓TAG量と細菌の存在量との関連性を調べた。その結果、細菌の存在量と肝臓のTAG量との間には、4つの負の相関関係しか見いだせなかった。そのうちの4つ（Lactonifactor sp., Agathobacter sp., B. ovatus, B. uniformis）は、いずれもイヌリンに有意に刺激される細菌に属していた。Lactonifactor (ρ = -0.8) は、植物リグナンである secoisolariciresinol diglucoside を、抗酸化、抗がん、抗炎症、遺伝子発現調節、抗糖尿病、抗エストロゲンなどの治療特性を持つ生理活性物質である enterodiol および enterolactone [45] に変換しています [46]．米国の成人2294人を対象に行われた横断研究では、尿中エンテロラクトン濃度がNAFLDと負の相関を示しました[47]。本研究でイヌリンに最も刺激されたアガソバクター属細菌（ρ = -0.7）は、酪酸産生菌です。異なる食物繊維源（オートミール、ライ麦）により刺激され、より低い心血管疾患または代謝性リスクと関連することが報告されている[48,49]。B. uniformisの枯渇は観察研究においてNAFLDで発見された[50,51]。B. uniformisの投与、特に食物繊維との併用は、食事誘発性肝脂肪症および炎症を改善し、低下した腸管免疫防御を回復させ、全身のグルコース消費を改善した[52,53]。Qiaoらは、B. uniformisの有益な効果のメカニズムを提案した。彼らは、B. uniformisが葉酸を合成することができ、その有益な効果は、少なくとも部分的には、葉酸によって強化された一酸化炭素代謝によって説明されるかもしれないことを証明した[54]。細菌と肝臓のTAG含有量との相関は、ほとんどが正であった。興味深いことに、肝臓TAGと正の相関を示す細菌の38％（n = 14）は、イヌリンの影響を受け、いくつかの細菌（24％、n = 9）では、イヌリンがWDの効果を打ち消すことさえある。これらの結果から、イヌリン補給による腸内細菌叢組成の変化が、脂肪症の改善に関与している可能性が強く示唆された。
4.3. イヌリンの補給と微生物叢のパフォーマンス
糞便中のVOCsスペクトル解析により、イヌリン補給は、アミノ酸代謝を犠牲にして糖類分解発酵を強調することにより、盲腸内細菌叢の代謝性能に影響を与えることが確認された。このシフトは、（i）トリプトファン発酵産物インドールの減少（VG_SD + Iのみ）、（ii）メチオニン/システイン発酵産物ジメチルトリスルフィドの減少（VG_SD + IおよびVG_WD + I両方）、（iii）ブタン酸の増加（VG_SD + Iのみ）と（iv）酢酸の増加（VG_SD + Iおよび VG_WD + I両方）に記録されている。主な繊維発酵産物は短鎖脂肪酸（SCFA）で、そのポジティブな効果は広く認められている [55]。プロピオン酸および酪酸は明らかに有益であると考えられている。酢酸の役割はそれほど単純ではなく、脂肪生成基質であり、肝臓での脂質合成の基質として機能する可能性があるからである [56]。これに対し、青木らは、腸管内腔のプレバイオティクス発酵に由来する酢酸が、肝細胞のFFAR2シグナルを介して肝脂質代謝とインスリン感受性を調節し、NAFLDの進行を予防するという代替仮説を提唱した[56]。
食物繊維の健康上の利点は、主に大腸におけるSCFAの産生を促進することに基づいて判断されてきた。補完的な仮説として、食物繊維の有益な効果は、タンパク質発酵の阻害によっても媒介される可能性があるため、やや軽視されている [57] 。タンパク質発酵は、上皮細胞の代謝およびバリア機能に影響を及ぼす本質的に有毒な内腔化合物を産生する [58] 。De Preter [57]は、オリゴフルクトース強化イヌリンが用量依存的にSCFA産生を刺激し、並行してジメチルトリ（ジ）サルファイドやメチオンのような含硫化合物の生成を阻害することを実証した。我々のデータは、イヌリンの補給が大腸のタンパク質分解発酵を減衰させるという仮説を支持するものであった。VG_SD + I群とVG_WD + I群の両方で、ジメチルトリスルフィドの含有量が有意に減少し、この化合物は肝臓TAG含有量と強い正の相関が認められた（ρ = 0.75）。また、盲腸内の酢酸濃度はVG_WD + I群で有意に増加し、脂肪率と負の相関を示した（ρ = -0.65）。したがって、SCFAによる盲腸・結腸内腔の酸性化の結果として生じるアミノ酸発酵の減衰と、糖質発酵の増加によって課せられる異化抑制［57］が、プレバイオティクス補給の付加的な保護機構を示すかもしれないと仮定している。5.結論
ヒトの混合ビーガン微生物叢をヒト化した無菌マウスのモデルを用いて、肥満、肝脂肪症、グルコースホメオスタシス低下のような西洋型食の悪影響から保護しないことを発見した。一方、イヌリンを西洋式食事に補充すると、体重増加には影響しないが、脂肪沈着が逆転し、グルコース代謝が改善された。イヌリン添加により、腸内細菌叢の組成と代謝性能が大きく変化し、タンパク質分解型発酵から糖質分解型発酵へのシフトが誘導された。この結果は、健康な微生物叢を不健康な環境に適用し、その後の食事療法を行わない場合、代謝異常の治療におけるFMTの成功率が比較的低いことを説明するものである。代謝性非感染性疾患の治療にビーガン微生物群によるFMTを用いる可能性について、本研究は、特定の微生物群の移植だけでなく、その後のイヌリンや他の食物繊維による食事介入および/または食事の変更が治療の成功に必要であることを指摘するものである。
補足資料
https://www.mdpi.com/article/10.3390/nu15020454/s1, Supplemental methods Table S1 盲腸内細菌叢の構成：レベル L_1 (門). 表S2 盲腸内細菌叢の構成：レベルL_6（種）。表S3 盲腸内の揮発性有機化合物スペクトル。図S1 シャノン指数で評価したタイムポイントAにおける糞便微生物相のα多様性。図S2 タイムポイントAにおける微生物相組成。 図S3 タイムポイントBにおける盲腸微生物相のα多様性をShannon指数で評価した。図 S4 血清メタボローム組成。ファイルS1: Supplemental Method [59,60,61,62,63,64].
著者による貢献
コンセプト立案。M.C., M.H. and J.G. (Jan Gojda); Methodology: 方法論：M.C.、H.P.、J.H.、形式分析：M.H.、N.D.、 I.M.、J.H, M.K. (Marek Kuzma) および M.K. (Maria Kralova)；資金獲得，M.K. (Marek Kuzma) および J.G. (Jan Gojda);Investigation, M.H., J.H., T.H., M.K. (Marek Kuzma), I.B., E.S., D.F.., J.G. (Jaroslav Golias), B.D., J.J., I.C. and J.G. (Jan Gojda); Visualization, N.D. and E.S.; Writing-original draft, M.H.; Writing-review & editing, M.H., N.D., I.M., J.H., M.K. (Marek Kuzma), M.K. (Maria Kralova) and J.G. (Jan Gojda).。すべての著者は、掲載された原稿を読み、同意している。
資金提供
本研究は、チェコ共和国保健省、助成金NV-18-01-00040、MH CR-DRO (Institute for Clinical and Experimental medicine-IKEM, IN 00023001) およびプロジェクトNational Institute for Research of Metabolic and Cardiovascular Diseases (Programme EXCELES, Project No. LX22NPO5104) -Funded by the European Union-Next Generation EUにより助成された。
施設審査委員会声明
便のヒトドナーは、ヘルシンキ宣言に基づき、大学病院Kralovske Vinohradyの倫理委員会（EK-VP/26/2017）により承認された研究の一環として募集されたものである。動物試験プロトコルは、保健省CRの審査委員会（または倫理委員会）により承認された（2018年4月12日よりプロトコルコード22/2018）。
インフォームド・コンセントの表明
本研究に参加したすべての被験者からインフォームドコンセントを得た。
データ利用可能性ステートメント
シーケンスデータは、Sequence Read Archiveデータベースでアクセッション番号PRJNA891477 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA891477、2022年11月16日にアクセス可能である。
利益相反
著者は利益相反を宣言していない。
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Daskova, N.; Heczkova, M.; Modos, I.; Hradecky, J.; Hudcovic, T.; Kuzma, M.; Pelantova, H.; Buskova, I.; Sticova, E.; Funda, D.; Golias, J.; Drabonova, B.; Jarkovska, J.; Klarova, M.; Cibulkova, I.; M. Cibulkova, I.; Gojda, J.; Cahova, M. Protective Effect of Vegan Microbiota on Liver Steatosis Is Conveyed by Dietary Fiber: Implications for Fecal Microbiota Transfer Therapy（菜食主義者の微生物相による肝脂肪症の予防効果は食物繊維によって伝えられる。Nutrients 2023, 15, 454. https://doi.org/10.3390/nu15020454
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Daskova, Nikola, Marie Heczkova, Istvan Modos, Jaromir Hradecky, Tomas Hudcovic, Marek Kuzma, Helena Pelantova, Irena Buskova, Eva Sticova, David Funda, Jaroslav Golias, Barbora Drabonova, Jarmila Jarkovska, Maria Kralova, Ivana Cibulkova, Jan Gojda, and Monika Cahova. 2023. "Protective Effect of Vegan Microbiota on Liver Steatosis Is Conveyed by Dietary Fiber: Implications for Fecal Microbiota Transfer Therapy" Nutrients 15, no.2: 454. https://doi.org/10.3390/nu15020454。