非工業型食生活の心臓代謝への利点は腸内微生物叢の調節に関連している
記事オンライン版2025年1月23日
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非工業型食生活の心臓代謝への利点は腸内微生物叢の調節に関連している
李福勇∙アニッサ・M・ アーメット∙カトリ・ コルペラ∙ …∙梁 李∙カーラ・M・ プラド∙イェンス・ ウォルター お問い合わせ…もっと見る
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ハイライト
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回復食は微生物叢の多様性を減少させたが、L. reuteriの持続性を高めた。
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この食事は、工業化によって変化したいくつかの微生物叢の特徴を修正した。
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食事は微生物由来の血漿代謝物に有益な変化をもたらした
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食事による心臓代謝への利点はマイクロバイオームの特徴によって予測された
まとめ
工業化は腸内細菌叢に悪影響を及ぼし、慢性の非感染性疾患にかかりやすくする。我々は、非工業化の食生活パターンの主な特徴を再現した食事（復元食）と工業化微生物叢ではほとんど見られない細菌（Limosilactobacillus reuteri）からなる微生物叢復元戦略を、健康なカナダ人成人を対象としたランダム化対照給餌試験で試験した。復元食は、腸内細菌叢の多様性を低下させたにもかかわらず、パプアニューギニア農村部のL. reuteri株（PB-W1）の持続性を高め、工業化によって変化したいくつかの微生物叢の特徴を是正した。この食事はまた、慢性の非感染性疾患の病因に関与する微生物叢由来の血漿代謝物を有益に変化させた。L . reuteri投与とは無関係に、心臓代謝に対するかなりの利益が観察され、そのうちのいくつかはベースラインおよび食事に反応する微生物叢の特徴によって正確に予測できた。この研究結果は、腸内微生物叢の回復を目的とした食事介入によって、慢性病態の根底にある宿主-微生物叢相互作用を改善できることを示唆しており、食事に関する推奨事項や治療および栄養戦略の開発につながる可能性がある。
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)01477-6?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0092867424014776%3Fshowall%3Dtrue
図S11 腸内細菌叢と宿主の復元食に対する反応の多様性（ 図7に関連
考察
NCDsは工業化社会で蔓延するほど増加しているが、これは腸内細菌叢の枯渇と変化と並行して進行した。工業化されたライフスタイルと食生活の欧米化は、明らかにヒトをNCDsに罹患させやすくしている。NCDsを予防するためには、健康なうちに腸内細菌叢を回復させることが必要である。そこで我々は、カナダに住む健康な人を対象にマイクロバイオーム回復戦略をテストし、腸内細菌叢の生態系、宿主のメタボローム、および心代謝疾患リスクの予測因子に及ぼす影響を明らかにした。
その結果、マイクロバイオームを復元する我々の能力と臨床的意義に関する重要な洞察が明らかになった。L.ロイテリPB-W1を安定的に "再導入 "できたのは1人だけであり、1回だけの投与では、L.ロイテリはマイクロバイオーム生態系、血漿メタボローム、慢性疾患のリスクマーカーに検出可能な影響を及ぼさなかった。さらに、復元食はマイクロバイオームの多様性を減少させ、マイクロバイオームの組成と機能的特徴に対する影響は被験者間で非常にばらつきがあり、ベースライン時の個人間ばらつきの大きさに比べれば小さいものであった。しかし、個体内で評価すると、食事の影響はマイクロバイオームの時間的変動の大部分を説明した。さらに、健康を促進すると考えられる種を含む有意な組成の変化が検出され、相互の関連性と安定性が増加した。復元食は、NCDsに関与するとされる、主に微生物由来の血漿中代謝産物を有益に変化させた。この食事療法は心臓代謝にかなりの影響を及ぼし、その結果、体重が減少し（参加者は計算上の必要カロリーを摂取したにもかかわらず）、血漿中の空腹時LDLが17％減少し、空腹時グルコースが6％減少し、CRPが14％減少した。最も重要なことは、工業化によって悪影響を受け、NCD病理学において確立された役割を持つマイクロバイオームの特徴（例えば、発酵能力、SCFA、ビロフィラ、粘液分解遺伝子）が、回復食によって改善されたことであり、これらの効果のいくつかは、回復食の実質的な心代謝改善効果を予測させるものであった。
L.ロイテリ菌はパプアニューギニアの農村部では優占種であり13、その有病率は狩猟採集民では工業化社会と比較して20倍高い14。しかしながら、L.ロイテリ菌の有病率（3％未満）と存在量は狩猟採集民集団では低く14、非工業化微生物叢の一員としてのその正確な生態学的役割はまだ十分に解明されていない。このことは、L. reuteriがヒトの腸内細菌叢でほとんど検出されない理由と、本試験で1回投与しただけでは1名を除くすべての参加者で安定的にコロニー形成されなかった理由の両方を説明する可能性を示している。とはいえ、非工業化型L. reuteriPB-W1は、経口投与から2日後には型株DSM20016Tよりも少なくとも10倍高い個体数を形成し、復元食によってその持続性と生存率が高まったことから、PB-W1株はヒトの腸内環境と非工業化型食の両方に優れた適応性を示すことが示された。今後、PB-W1の反復投与によってプロバイオティック免疫学的効果が得られるかどうか、特に増殖基質と組み合わせることで腸内でのパフォーマンスが向上するかどうかを検証する必要がある。さらに、他の揮発性および／またはヒトの工業化社会に否定的に関連する（VANISH）種や失われた微生物についても、非工業化型飼料との組み合わせで、特にヒトと進化的につながりのあるものを試験する必要がある73。
復元食は、発酵可能な基質の多様性を高め、微生物群集内の正の相互作用の数を増加させたが、多様性（すなわち、豊かさと均等性）を減少させた。この発見は予想外であったが、メカニズム的な説明の可能性がある。我々の解析では、パラバクテロイデス（Parabacteroides）やバクテロイデス（Bacteroides）のような酸に敏感な分類群74の減少は、pHの変化によって引き起こされたことが確認された（図S7B）。さらに、復元食は炎症や胆汁酸の排泄といった宿主の表現型を変化させたため、炎症時に濃縮されることが多い胆汁耐性分類群（Bilophilaや Alistipesなど）の競争上の優位性が低下し、復元食期間中に繁殖したFaecalibacterium77のような炎症に敏感な分類群が犠牲になった可能性がある75,76。復元食によって、潜在的な増殖基質（乳製品や食肉由来の糖タンパク質など）の供給源がさらに取り除かれた78。このため、これらの資源に依存していた微生物が、復元食によって提供された新規基質を利用するのに必要な適応を欠いたために、生息数が減少した可能性がある79。この点で、マイクロバイオームの多様性を復元する際のハードルは、工業化環境では微生物への曝露や拡散（衛生管理など）が少ないことである13。欧米食が腸内細菌叢の絶滅を誘発したことを検証した多世代マウスモデルでは、糞便曝露を伴わない低繊維食から高繊維食への切り替えは、失われた微生物の多様性を回復させるのに十分ではなかった。
多様性の減少にもかかわらず、群集の有益な属性と考えられている相互連結性と安定性は回復食中に増加し84、回復食によって誘導された組成シフトは一般的に有益であるとみなされている（例えば、ビフィズス菌、フェカリス菌、およびラクノスピラ科の増加）。最も重要なことは、工業化によって影響を受けた腸内細菌叢の特徴が復元食によって改善されたことである。発酵能とSCFA産生が増加し、pHが低下し、炎症性微生物（Bilophilaや Alistipesなど）の生息数が減少し、粘液分解の可能性が低下した。これらの食事が介在する効果のいくつかは、レストア・ダイエットの臨床効果と関連しており、レストア・ダイエットがその効果を発揮する潜在的なメカニズムを提供している。pHの低下はマイクロバイオームの代謝に広範な好影響を及ぼす。85さらに、飽和脂肪の摂取量が増加すると増殖するBilophilaは、マウスの代謝および免疫学的機能障害を悪化させることが示されており75 、86、疫学的研究では腺腫および大腸がんと関連している。さらに、粘液の分解は炎症を引き起こす重要な病理学的因子である。興味深いことに、回復食はCOVID-19の軽度の転帰を予測させる細菌属の存在量を増加させる一方で、臨床転帰の不良につながる分類群を減少させた91,92。したがって、回復食は腸内微生物の多様性を減少させたが、宿主-マイクロバイオームおよびマイクロバイオーム-免疫相互作用に対する全体的な影響は有益であったと考えられる。
回復食が心臓代謝にもたらす大きな利点のうち、最も可能性の高い食事による決定因子を明らかにするために、今回の知見を他の栄養戦略の効果と比較することは興味深い。健康な成人を対象とした研究で、食事指導により発酵食品または食物繊維（約43g/日）の摂取を増やしたところ、発酵食品介入によりいくつかの炎症性サイトカインが減少したが、高繊維質介入は脂質および血糖プロファイルに影響を及ぼさなかった69。この研究で観察された食物繊維の有益性における、回復食と比較した場合の顕著な違いは、食物摂取を厳密にコントロールする利点に由来するのかもしれない。本研究で得られた知見は、地中海食や厳格な植物性（ビーガン）食など、他の植物が豊富な食餌の心臓保護効果に沿ったものである。地中海食（食物繊維約24g/日）を摂取したメタボリックシンドロームの男性被験者では、グルコース（-3.4％）、HOMA-IR（-24.3％）、総コレステロール（-17.5％）、LDL（-16.7％）、HDL（-15.4％）濃度が低下したが、CRPは変化しなかった93。同様の所見は、カロリーを制限した地中海食 を6ヵ月間摂取した肥満の被験者でも観察され、LDL（-3.5％）、HDL（+5.1％）、トリグリセリド（-13.2％）、CRP（-10.9％）が改善した94。入院患者を対象としたクロスオーバー研究では、糖尿病のない成人（BMI 27.8±1.3kg/m2）に、本研究と同量の食物繊維（31.4g/1,000kcal）を含む厳格な植物性食事、または低炭水化物食を提供した66。2週間後、植物ベースの食事は総コレステロール（-25.7％）、LDL（-26.3％）、CRP（-42.9％）、グルコース（-6.6％）、インスリン（-26.5％）を有意に減少させた。全体として、復元食の効果は、代謝および抗炎症効果において、他の植物が豊富な食事に匹敵するようである。
植物性食物の健康効果は確立されているが、その基礎となるメカニズムや腸内細菌叢の役割については、まだ未解決の問題がある。本研究は、これらの疑問の解決に貢献するものである。復元食によって影響を受ける血漿中の代謝産物の多くは、微生物由来であるか、微生物によって修飾されたものであり、健康に影響を及ぼすものである。例えば、インドール-3-プロピオン酸は、回復食によって増加するが、腸内細菌叢によって内因性に産生される神経保護作用のある抗酸化物質であり、2型糖尿病や動脈硬化のリスク低下と相関している。一方、8-ヒドロキシグアニンは突然変異誘発と発癌のマーカーである。104,105このように、今回の知見は、脳の老化と認知、癌予防、長寿に対する植物ベースの食事の効果について、そのメカニズム的な説明の可能性を示すものであり、これらの効果に腸内細菌叢が関与していることは明らかである。
多くの食事介入は、その生理学的効果においてかなりの程度の個人差を示す70,106,107このことは、個別化された栄養学的アプローチの根拠となる。対照摂食試験を実施することにより、標準化された食事に対する微生物および生理学的反応のばらつきの程度を直接的に明らかにした。腸内細菌叢の組成の変化は個人差が大きかったが、機能的特徴（例えばCAZymes）に対する食事の影響にはあまり差が認められず、血中代謝産物やリスクマーカーに対する影響は個人間で非常に一貫していた。これらの知見を説明する可能性としては、異なる微生物群の間に機能的な重複が存在すること、復元食に含まれる複雑な栄養素が多種多様な微生物群に影響を与えたこと、微生物群に依存しない食事の影響などが考えられる。これらの知見は、食事療法を推奨する上で重要な意味を持つものであり、植物性の豊富な食事は、一貫した、そしておそらくは集団全体に恩恵を及ぼすものであり、個人化する必要がないことを実証している。
先祖代々のマイクロバイオーム、あるいは「健康な」マイクロバイオームさえも定義できないこと110や、非工業化集団に関連するマイクロバイオーム形質が健康を促進するというエビデンスがないこと（例えば、工業化環境における平均寿命の長さを考慮すると）についての懸念が提起されている。加えて、腸内細菌叢の表現型効果は文脈に左右される-環境要因や遺伝的素因によって有益にも有害にもなりうるのである。さらに、工業化されたマイクロバイオームは、特定の環境に適応している可能性が高く、変化しにくい。我々の研究から、工業化腸内細菌叢を復元しようとする際に適用される生態学的制約に関する重要な洞察が明らかになった。工業化されたマイクロバイオームの特徴である多様性の低下は改善されず、L. reuteriは1回の投与では再導入できず、マイクロバイオームの変化は非常に個別的であった。さらに、我々の知見は、工業化マイクロバイオームの少なくとも一部のメンバーが、食物繊維の豊富な食事に誤って適応していることを示唆している。食物繊維をベースとした戦略で多様性を増大させ79、特にVANISH種を反復投与することなく、工業化されたマイクロバイオームをより先祖に近い状態に回復させることは不可能かもしれない。
このような懸念は確かに正当化されるが、多様性の完全な回復が不可能であったとしても、腸内細菌叢の関連する組成的・機能的特徴を是正して有益な結果をもたらす可能性を示唆していることから、私たちはいくつかの知見を有望視している。工業化によって変化したマイクロバイオームの特徴のうち、病理学的に確立された役割を持ついくつかの特徴（発酵能力、SCFAs、Bilophila、粘液分解など）が改善され、この食事療法が臨床的にかなり有益であることが予測された。さらに、我々の知見は、工業化腸内細菌叢と非工業化腸内細菌叢との間に機能的冗長性があることを示唆しており、工業化腸内細菌叢は、VANISH種が枯渇し欠乏しているものの、非工業化型食餌の健康効果の少なくとも一部を媒介する能力を維持している。
研究の限界
非工業化型食生活のパターンは多様であり、祖先の食生活については不確実性がある111。加えて、復元食はカナダで入手可能な食品で構成されているため、非工業化食生活の近似値に過ぎない。したがって、植物性食品、高繊維質食品を豊富に摂取し、高度に加工された食品を避けるなど、主要な食事の特徴を再現することに重点を置いた。L. reuteriDSM20016T株は、非工業化PB-W1株よりもずっと長い間実験室で増殖されてきたため、ヒトにおける生態学的性能が低下している可能性がある。本研究に登録された参加者は、キャンパスに近く、クリニック受診に積極的であることから、主に学生または大学職員であり、一般集団への結果の一般化には限界があるかもしれない。サンプルサイズは比較的小さく（n= 30）、これは食事介入のクロスオーバーデザインによって部分的に緩和されたものの、パラレルアームデザインでL. reuteri群とプラセボ群に無作為化された参加者数（各群n= 9-11）は、腸内マイクロバイオームおよび/または宿主生理学に対するL. reuteriの効果を検出する統計的検出力に限界がある可能性がある。予測モデルを評価するための独立したテストセットを作成するのに十分な大きさのnを持っていなかったので、サンプルサイズはまた、機械学習アプローチの限界である；しかしながら、潜在的なバイアスは、モデル評価のための外部交差検証の標準的な技術の使用によって部分的に軽減された。統計的検出力を維持し、意味のあるマイクロバイオームの変化と宿主-マイクロバイオーム相互作用の可能性を検出するため、intention-to-treat解析ではなくper-protocol解析を実施した。対照摂食試験は、復元食が腸内細菌叢と慢性疾患のリスクマーカーに及ぼす因果関係を明らかにするためにデザインされた。今後、非工業化型食生活のメカニズムやマイクロバイオームとの因果関係を確認するための研究が必要である。
リソースの利用可能性
連絡先
リソースや試薬に関する詳細な情報およびリクエストは、リードコンタクトであるJens Walter(jenswalter@ucc.ie)までお願いします。
材料の入手可能性
本研究では新たな試薬は作成していない。
データおよびコードの利用可能性
全てのシーケンスデータ（16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスとWMS）はNCBI Sequence Read Archive (SRA; accession number: SRA: PRJNA1000186)に寄託されている。DOIはkey resources tableに記載されている。本論文で報告されたデータの再解析に必要な追加情報は、要望に応じて主担当者から入手可能である。
謝辞
本研究に広く参加してくれた参加者に感謝したい。L . reuteriPB-W1が単離された以前の研究に貢献（倫理申請やサンプル採取など）してくれたAndrew Greenhill（オーストラリア、Federation University）とPeter Siba（パプアニューギニア医学研究所）に感謝する13。L. reuteri PB-W1は、PrecisionBiotics Group Ltd.の商標である。摂食試験と参加者の臨床測定は、アルバータ大学農業・食品・栄養科学科のHuman Nutrition Research Unitで行われた。全メタゲノムシークエンシング（WMS）データの解析は、ComputeOntario（computeontario.ca ）およびDigital Research Alliance ofCanada（aliancecan.ca ）の支援により可能となった。Michael G. Gänzle教授、Rebeca M. Duar博士、Inés Martínez博士には食品グレードのL. reuteri接種菌の調製に関する助言を、Daniel J. Tancredi教授とZhengxiao Zhang博士には統計解析に関する指導をいただいた。また、マルトデキストリンのプラセボを提供してくれたIngredion社に感謝する。
本研究は、Weston Family Microbiome InitiativeおよびPrecisionBiotics Group Ltd.の支援を受けた。F.L.は、浙江大学「Hundred Talents Program」Research Start-up FundおよびAlberta Innovates Postgraduate Fellowshipからの資金援助に感謝する。A.M.A.は、Izaak Walton Killam Memorial Scholarship、Alberta Innovates Graduate Student Scholarship、Frederick Banting and Charles Best Canada Graduate Scholarship、Walter H. Johns Graduate Fellowship、University of Alberta Doctoral Recruitment Scholarshipからの資金援助を謝意として示す。C.M.P.は、Campus Alberta Innovates Program (CAIP)およびCanada Research Chairs Programによる支援を受けた。J.W.は、CAIP、アイルランド科学財団APCマイクロバイオーム・アイルランドセンター助成金（APC/SFI/12/RC/2273_P2）、アイルランド科学財団教授職（19/RP/6853）を通じての資金提供を謝意としている。
著者貢献
構想：J.W： J.W. 資金獲得： 研究計画：C.J.F.、L.L.、C.M.P.、J.W： F.L.、A.M.A.、A.G.、E.C.D.、C.J.F.、L.L.、C.M.P.、およびJ.W.： A.M.A.、Z.Z.、C.J.F.、およびC.M.P. 対照摂食試験のための食事計画の作成： 参加者の募集とデータ収集、回復食の準備： 臨床試験の監督： L.ロイテリ菌接種の準備と品質管理、および糞便サンプル中のL.ロイテリ菌の持続性のモニタリング： 糞便サンプルの採取、DNA抽出、化学分析： 糞便乾燥質量および腸管バリア機能マーカーの測定：F.L.、A.M.A.、J.L.、R.M.Q： 慢性疾患のリスクマーカーの測定：B.S.、S.C.B： A.M.A.、T.B.S.R.、C.J.F. 腸内細菌叢のバイオインフォマティクス解析： 血漿メタボローム解析：F.L.、F.A.、N.S.： 統計解析：F.L.、X.W.、S.Z.、L.L.： F.L.、A.M.A.、K.K.、E.C.D.、J.A.B. 機械学習： A.M.A.、F.L.、R.G.、D.K. 原著論文の執筆： データ解釈および最終原稿：全著者。
利益宣言
NiMeはA.M.AおよびJ.W.の商標である。J.W.はNovonesis A/SにライセンスされたLimosilactobacillus reuteriPB-W1（NCIMB 42835）に関する特許の所有者であり、その収入はこの菌株の単離と特性決定に関与したパプアニューギニアおよびカナダの研究機関と共有される。J.W.はさらに、PrecisionBiotics/Novonesis A/Sから謝礼および/または有給のコンサルティングを受けている。A.G.はダノン・スペシャライズド・ニュートリションの社員である。C.M.P.は過去にAbbott Nutrition社、Nutricia社、Nestlé Health Science社、Pfizer社、AMRA Medical社、Novo Nordisk社から本研究とは無関係に謝礼および/または有料のコンサルティングを受けている。
STAR★メソッド
主要リソース表
試薬またはリソースソースの識別子
細菌およびウイルス株
Limosilactobacillus reuteriPB-W1 Archer et al.37 PMID:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38047281/
リモシラクトバチルス・ロイテリ（Limosilactobacillus reuteri）DSM 20016TLerche andReuter38 N/A
化学物質、ペプチド、組換えタンパク質
DmPA標識キット Nova Medical Testing Inc. NMT-4167-KT
Dansyl 標識キット Nova Medical Testing Inc. NMT-4101-KT
重要な市販アッセイ
QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit Qiagen Cat# 51604
U-PLEX ヒトインスリンアッセイ MesoScale Discovery Cat# K1516HK-1
V-PLEX ヒト CRP キット MesoScale Discovery Cat# K151STD-2
IDK® カルプロテクチン（MRP 8/14）（便）ELISA Immundiagnostik AG Cat# K6927
リポポリサッカリド結合タンパク質（LBP）ELISA Immundiagnostik AG Cat# KR6813
IDK® ゾヌリン（便）ELISA Immundiagnostik AG Cat# K5600
保存データ
16S rRNA 遺伝子アンプリコンシーケンシングおよび全メタゲノムシーケンシングのオリジナルデータ 本論文https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA1000186
オリゴヌクレオチド
プライマーペア：784F（フォワード：5′-RGGATTAGATACCC-3′）；1064R（リバース：5′-CGACRRCCATGCANCACCT-3′） Martínez et al.13 PMID：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25892234/
L. reuteriPB-W1 および DSM 20016T の株および系統特異的 qPCR プライマーLi et al.113 PMID:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39244633/
ソフトウェアとアルゴリズム
QIIME2 (v2020.11) Bolyen et al.114 https://qiime2.org/
IMG/MER Chen et al.115 https://img.jgi.doe.gov/
NCBI Web BLAST N/Ahttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
FastQC (v0.11.8) N/Ahttps://github.com/s-andrews/FastQC
Trimmomatic (v0.39) Bolger et al.116 http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (v2.3.5.1) Langmead andSalzberg117 https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
MetaPhlAn 4.0 Blanco-Míguez et al.24 https://huttenhower.sph.harvard.edu/metaphlan/
HUMAanN 3.0 Beghini et al.118 https://huttenhower.sph.harvard.edu/humann/
DIAMOND (v0.9.32) Buchfink et al.119 https://github.com/bbuchfink/diamond
R (v4.2.1) R Core Teamhttps://cran.r-project.org/
rbiom (v.1.0.3)Smith120 https://cmmr.github.io/rbiom/index.html
mice (v4.2.1) van Buuren andGroothuis-Oudshoorn121 https://github.com/amices/mice
Factoextra (v1.0.7) Kassambara およびMundt12 https://rpkgs.datanovia.com/factoextra/index.html
FactoMineR (v2.8) Husson et al.123 http://factominer.free.fr/
vegan (v2.6.4) Oksanen et al.124 https://github.com/vegandevs/vegan
nlme (v3.1.157) Pinheiro et al.125 https://cran.r-project.org/web/packages/nlme/index.html
MuMIn (v1.48.4)Barton126 https://cran.r-project.org/web/packages/MuMIn/index.html
geepack (v1.3.9) Halekoh ら127 https://cran.r-project.org/web/packages/geepack/index.html
emmeans (v1.8.3) Lenth他128 https://github.com/rvlenth/emmeans
cvcqv (v1.0.0)Beigy129 https://github.com/MaaniBeigy/cvcqv
caret (v6.0.93)Kuhn130 https://topepo.github.io/caret/
car (v3.1.1) Fox andWeisberg131 https://cran.r-project.org/web/packages/car/index.html
MaAsLin2 Mallickら132 https://github.com/biobakery/Maaslin2
DataAnalysis (v4.4) Bruker Corporationhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/ms-software.html
IsoMS Pro (v1.2.7) Nova Medical Testing Inc. NMT-5101-SW
MetaboAnalyst 4.0 Chong et al.133 https://www.metaboanalyst.ca/
Prism (v10.2.2) グラフパッドhttps://www.graphpad.com/
その他
Globe® 10DE Maltodextrin, Non-GMO Ingredion Canada Corporation, Mississauga, Ontario, Canadahttps://www.ingredion.com/na/en-us.html
L. reuteri 用食品グレード培地 本論文の表S12
L.ロイテリ分離培地（LRIM） Duar et al.134 PMID:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28389535/
100% Complete Multi For Adults Jamiesonhttps://www.jamiesonvitamins.com/
実験モデルと研究参加者の詳細
参加者の募集と選択
この概念実証試験は、アルバータ大学保健研究倫理委員会（Pro00077565）およびカナダ保健省（ファイル番号237696）の承認を受け、ClinicalTrials.gov（NCT03501082）に前向きに登録された。本試験は、関連するすべての機関および国の規制機関の要件を遵守した。安全性モニタリングはアルバータ大学の臨床研究品質管理部が独自に実施した。試験データの収集と管理には、アルバータ大学のWomen and Children's Health Research Instituteが主催・支援するREDCap電子データ収集ツールを使用した135。
BMI20.0～29.9kg/m2の18～45歳の健康な人を2019年1月から2020年1月の間に募集した。除外基準は以下の通り：長期胃腸障害歴（例．炎症性腸疾患、セリアック病）、糖尿病、心血管疾患、がん、その他の炎症性疾患、下剤、抗糖尿病薬、抗高血圧薬、脂質低下薬、抗炎症薬の慢性使用、妊娠検査陽性（スクリーニング来院時の尿サンプルで判定）、または自己申告による授乳中または閉経期の女性、排便回数1日1回未満、週7杯を超えるアルコール、タバコ（喫煙またはチューイン）、違法薬物または大麻の使用； 週5時間を超える激しい運動、復元食の食品または成分に対するアレルギーまたは不耐性、ベジタリアンまたはビーガン、登録前3ヵ月以内の抗生物質の使用、プロバイオティクス、プレバイオティクス、食物繊維、オメガ3脂肪酸、またはハーブのサプリメントの使用（被験者がこれらのサプリメントを使用しているが、他に適格なものがある場合は、試験参加前に4週間のウォッシュアウト期間を選択することができる）、104細胞/グラムを超えるL. reuteriが糞便1グラム当たり104個以上存在すること（上記の基準をすべて満たした人のみで評価；n＝42）。アルバータ大学の保健研究倫理委員会（Health Research Ethics Board）の要請により、参加者の家系、人種、民族に関する情報は収集しなかった。
検体採取
便検体は、0、4、6、8、12、16、21、42、46、48、50、54、58、63、84日目（すなわち、各食事期間の0、4、6、8、12、16、21日目および最終洗浄日；図1A）に採取した。参加者には、便検体容器（Fisher、カナダ）と密閉プラスチック袋からなる採便キットが提供された。検体を受け取ってから4時間以内に、嫌気環境（5％CO2、5％H2、90％N2）で処理した。生の糞便サンプルは、下流の分析用に分注され、SCFA定量用に滅菌1:5リン酸（5%）で希釈され、L. reuteriの定量培養用に滅菌1:10リン酸緩衝生理食塩水（PBS）と10%グリセロールで希釈された。
各食事期間の0日目と21日目（すなわち、0日目、21日目、42日目および63日目）に、参加者が一晩12時間絶食した後、K2-エチレンジアミン四酢酸およびリチウムヘパリンチューブを用いて静脈穿刺により血液を採取した。全血は、下流の分析のために、採取後90分以内にAlberta Precision Laboratories（カナダ、AB州エドモントン）に送られた。血漿用の血液は遠心分離して分注し、直ちに-80℃で保存して下流の分析に使用した。血漿メタボロミクス（以下に詳述）のために、各食餌期間の8日目（L. reuteri補給後4日目、8日目と50日目）に追加の血液サンプルを採取した。
方法の詳細
介入
無作為化対照摂食試験をデザインし（図1A）、以下の効果を同時に評価できるようにした： 1）L.ロイテリの単回補充とそれが腸内細菌叢に再確立されるかどうか、2）L.ロイテリとは独立した復元食、3）L.ロイテリと食事との潜在的相互作用。復元食（A.M.A.とJ.W.によってNiMeTM食として商標登録されている）は、典型的なカナダの食事と比較して、極端な性質と対照的であるため、厳密に制御され、標準化された方法で提供することにした。クロスオーバーデザインにより、参加者はrestore食を摂取する群と、3週間通常の食事療法を続ける群に無作為に割り付けられ、3週間のウォッシュアウトの後、もう一方の食事療法に3週間切り替えた。並行群間デザインにより、参加者はさらに、パプアニューギニア農村部由来のL. reuteri株（PB-W1™；PrecisionBiotics Group Ltd.の商標）、タイプ株（DSM20016T ）、またはプラセボ（マルトデキストリン）のいずれかに無作為に割り付けられた。各食事期間の4日目に、参加者はL.ロイテリまたはプラセボのいずれかを単回投与された。この研究は、L. reuteriの長期的な持続性を評価するために、最終的に3週間のウォッシュアウトで終了した。
無作為割り付け順序はコンピュータで作成され、被験者の割り付けに関与していない研究者によって隠蔽された。無作為割り付けは、両方のデザイン（すなわち、合計6群）を考慮した：参加者は、開始時の食事期間（回復食または通常食）と接種物（L. reuteri株またはプラセボのいずれか）に割り付けられた。参加者が研究を辞退した場合、その代わりに別の被験者が募集され、同じ無作為割付法で割り付けられた。無作為化スキームは参加者にも研究者/スタッフにも明らかにされず、L. reuteriの割り付けについてはデータ解析が完了するまで二重盲検化が維持された。食事介入の性質上、食事割り付けに対する盲検化は不可能であった。
L.ロイテリ菌接種およびプラセボ調製
L .ロイテリ接種は、アルバータ大学農学・食品・栄養科学部の食品グレード研究室で、高度に標準化されたL.ロイテリ生菌数を保証する以前に開発された標準操作手順（Standard Operating Procedure）に従って調製された134。参加者が摂取する直前に細胞を採取し、ボトル入りの湧水に懸濁した。サンプルは、L. reuteriの定量化のためにMRS寒天培地に、汚染の有無を確認するためにBHI寒天培地に定量的にプレーティングした。マルトデキストリンのプラセボ（GLOBE® 10DE Maltodextrin、Non-GMO、Ingredion社、米国イリノイ州、2g）もボトル入りの湧水に溶解した。
L.ロイテリ菌接種液とプラセボは、被験者の割り付けやデータ解析に関与しない研究者が蓋付きの不透明なカップに準備した。カップには「A」、「B」、「C」のラベルが貼られ、二重盲検化が維持された。摂取前の培養結果に基づき、ヒト試験を通じて被験者に提供されたPB-W1およびDSM20016Tの細胞数は、それぞれ10.44±0.02および10.23±0.04Log10の生存細胞数（平均±SEM）であった。
回復食の準備と遵守
回復食のすべての食事および間食は、Human Nutrition Research Unit（カナダ、AB州エドモントン）の代謝厨房で調理され、食材および食品は0.1g単位で計量された。参加者全員には、回復食期間中、同一の食事と間食が提供された。カロリー必要量は、Mifflin St.Jeor予測式137に適切な身体活動係数を乗じて算出され、参加者には体重を維持するために必要量の100kcalに最も近い値が与えられた。飲料は回復食の一部として提供されたのではなく、スクリーニング時の自己申告による1日のカロリー含有飲料消費量に基づいてカロリー割り当てが調整された。参加者は提供された試験食のみを摂取するよう奨励されたが、試験食をすべて食べた場合は、約100kcalの間食を1日1回とることが許された。参加者は3～5日ごとに研究用食品を受け取り、調査担当者が残りの食品の重量を測定して服薬状況を評価できるように、すべての容器を持ち帰るよう指示された。介入期間中に参加者が提供された試験食の80％未満しか摂取しなかった場合、その参加者は試験から除外された（n= 2）。研究を完了した参加者のうち、回復食プロトコールの遵守率は94.4±6.4％（平均±SD）であった。最後に、回復食と参加者の通常の食事との間の微量栄養素摂取の潜在的な相違を考慮し、参加者にはマルチビタミン（100％ Complete Multi For Adults、Jamieson、カナダ）が提供され、12週間の研究期間中毎日摂取するよう指示された。
参加者が報告した結果
胃腸症状に関する質問票を用い、胃痛、腹部の張り、鼓腸の強さを、症状なし（0）から重度（4）までの5段階の快楽的尺度を用いて判定した136。同じ質問票で、便の通過時間のマーカーが評価された136： 便の硬さは、Bristol Stool Scaleを用いて評価し、両端を「硬いまたは断片的」（0）と「完全に液体」（6）とし、中央を「ソーセージ状または蛇状で、滑らかで柔らかい」（3）とした。排便回数は、5段階の快楽的尺度を用いて評価し、両端を「3日に1回以下」（0）と「1日3回以上」（4）とし、中央を「1日1回」（2）とした。質問票は、両食事期間（すなわち、ベースライン時、第1週、第2週、第3週）において毎週実施された。
身体活動レベルは、有効な国際身体活動質問票（International Physical Activity Questionnaire）を用いて評価した138。気分状態を評価するために、有効なProfile of Mood States質問票（Profile of Mood States questionnaire）を用いた140。
参加者の通常の食事摂取量を評価するために、Automated Self-Administered 24-hour Dietary Assessment Toolのカナダ版（ASA24-Canada 2016）を用いて24時間食事想起を実施した（National Cancer Institute, MD, USA）。参加者は、通常食期間のベースライン時と3週目、および回復食期間のベースライン時に、2回の24時間食事リコール（平日と週末の1日ずつ）を行った。これは、通常食期間中に有意な食事変化がなかったことを確認するとともに、参加者の通常食摂取量と回復食の組成を比較するためであった。通常食のプール値は、すべての食事リコール（すなわち、通常食のベースラインと3週目、回復食のベースライン）の平均値として計算された。これらの値は、2つの食事期間間（すなわち、プールされた通常食 vs 3週目の回復食）の差の検定に使用された。ベースラインの食事の質を定量化するために、Jessriら141に概説された手順に基づいて、カナダのフードガイド（2007）に適合させたHEIスコアも算出した。
DNA 抽出および塩基配列決定
微生物DNAは、前述したようにQIAamp Fast DNA Stool Mini Kitに基づく修正プロトコルを用いて糞便サンプルから抽出した113。その後、100μlの溶解バッファー を細胞ペレットに加え、混合物を37℃で30分間インキュベートした。その後、サンプルを1mLのInhibitEX緩衝液と混合し、ボルテックスとビーズビートでホモジナイズした。DNA単離のための製造業者のプロトコルの残りのステップに従った。細菌16S rRNA遺伝子のV5-V6超可変領域は、ビフィズス菌と 乳酸菌だけでなく、ヒト糞便サンプルの微生物群集全体に対してより高い解像度を提供することから選択された。この標的領域は、プライマー対784F（5′-RGGATTAGATACCC-3′）と1064R（5′-CGACRRCCATGCANCACCT-3′）を用いて増幅した。アンプリコンは、ミネソタ大学ゲノミクスセンター（米国ミネソタ州ミネアポリス）でIllumina MiSeq PE300を用いてペアエンドシーケンス（2 x 300 bp）した。十分なシーケンス深度を確保し、バッチ効果を防ぐため、全サンプルのアンプリコンをプールし、同じプールを2つのシーケンスレーンを用いて繰り返しシーケンスした。0日目、8日目、42日目、50日目（すなわち、各食餌期間の0日目と8日目）のサンプルから抽出したDNAもWMSにかけた。各DNAサンプルのWMSライブラリーは、NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina（New England Biolabs, Whitby, ON, Canada）を用いて作成した。ライブラリーをプールし、Génome Québec Innovation Centre（カナダ、QC州モントリオール）でNovaSeq 6000 S4 PE150プラットフォーム（2 x 150 bpペアエンドシーケンス）を用いてシーケンスした。全サンプルのWMSデータは、バッチ効果を避けるために単一レーンを同時に使用して作成した。
バイオインフォマティクス解析
16S rRNA遺伝子のアンプリコンシーケンスデータは、QIIME2を用いて処理した114。簡単に説明すると、プラグインcutadapt trim-pairedを使用して、残存するプライマーとアダプターをトリミングした。dada2 denoise-pairedパイプラインを使用して、低品質塩基の切り捨て、ペアエンドリードの結合、キメラの除去、ASVテーブルの作成、ASVの代表配列の取得を行った。SILVAデータベース（バージョン138）の16S配列の超可変V5-V6領域をfeature-classifier extract-reads関数で抽出し、feature-classifier fit-classifier-naive-bayesを用いてNaive Bayes分類器を学習させ、配列の分類を行った。各ASVの代表的な配列は、IMG/MERシステム115および/またはNCBI Web BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)を用いて、可能であればさらに種レベルでの分類を割り当てた。NCBI Taxonomyデータベースには、原核生物の42の系統名（例えば、Bacillota[旧Firmicutes]、Bacteroidota[旧Bacteroidetes]、Actinomycetota[旧Actinobacteria]、Pseudomonadota[旧Proteobacteria]）が追加されているが、本研究で参照した出版物の大部分は、これらの微生物の旧命名法に準拠している。従って、本研究では以前の命名法をそのまま使用した。
シングルトンASVとダブルトンASVは、下流の解析では削除した。サンプル間のα多様性指標（すなわち、観察された特徴、Pielouの均等性、Shannon指数）およびBray-Curtis非類似度行列を推定するために、細菌配列数をサンプルあたり4,200リードに希釈し、リード数が4,200未満のサンプルは以降の解析のために削除した。そして、diversity core-metrics-phylogenetic という関数を用いて、ASVのアルファ多様性指標とベータ多様性指標を計算した。サンプルの少なくとも20%で相対量が0.1%以上の微生物分類群（すなわち、門、綱、目、科、属、種、ASVレベルでそれぞれ6、9、19、34、74、124、205）を下流の解析に使用した。
WMSデータセットの品質をFastQC(https://github.com/s-andrews/FastQC)を用いて調べ、残存アダプター配列をフィルターし、平均品質スコア<20の塩基をTrimomatic v0.39.116を用いてトリミングし、100 bp以下の長さのトリミングリードは下流解析のために廃棄した。バクテリオファージΦX174（WMSライブラリーのイルミナスパイクイン）とヒトDNAリードの配列は、Bowtie2（バージョン2.3.5.1）を用いてΦX174ゲノムリファレンス（NCBI accession: NC_001422.1）とヒトゲノムリファレンスGRCh38にWMSデータセットをマッピングすることで除去した117。CAZymesを同定するために、DIAMOND（バージョン0.9.32.133）119を使用して、QC後のWMSリードをdbCAN2データベース（バージョン9.0）143にE値＜1e-10をカットオフとしてアライメントした。マッピングされた各リードについて、E値が最も低いベストヒットをダウンストリーム解析に使用した。さまざまな糖質カテゴリーの利用に関連するCAZymesは、以前に提案された26のようにグループ分けされ、さらに各カテゴリーにCAZymeファミリーを追加することで更新された（Table S13 ）。WMSデータのバイオインフォマティクス解析は、Digital Research Alliance of Canadaが提供するコンピューティングプラットフォームで行った。シングルトンおよびダブルトンの微生物フィーチャーは、下流の解析のために削除した。少なくとも20%のサンプルで相対量が0.005%を超える組成および機能的特徴を下流解析に含めた。WMSフィーチャーのアルファ多様性指標は、QIIME2のプラグイン多様性アルファを用いて計算した。WMS特徴（すなわち、SGB、パスウェイ、CAZymes、およびEC）に基づくサンプルのBray-Curtis非類似度行列は、Rパッケージrbiom120を使用して生成され、PCoAは、QIIME2のプラグイン多様性pcoaおよびエンペラープロットを介して可視化された。
糞便中のSCFA、BCFA、pHおよび乾燥質量割合
SCFA および BCFA は、Agricultural, Food & Nutritional Science Chromatography Facility（University of Alberta、カナダ、エドモントン）のガスクロマトグラフィーを用いて、0 日目、8 日目、21 日目、42 日目、50 日目、および 63 日目（すなわち、0 日目、8 日目、および 21 日目）の糞便サンプルから定量した、 総 SCFA 濃度は酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、およびバレラート の合計として決定し、各 SCFA の相対比率はこれらの個々の SCFA を総 SCFA で除して決定した。総 BCFA はイソ酪酸およびイソバレレート濃度の合計とした。糞便乾燥質量パーセンテージは、生糞便を103℃のオーブンで一晩乾燥させることにより決定した107。糞便pHは、Accumet™ AB150 pHメーター（Fisher, Canada）を用いて、生糞便を蒸留水で1:4に希釈し、既述の方法で分析した107。
血漿メタボローム
カルボキシルおよびアミン/フェノールサブメタボロームについては、高性能化学同位体標識液体クロマトグラフィー質量分析（CIL LC-MS）プラットフォームを使用して血漿サンプルのメタボロームをプロファイリングした145。簡単に説明すると、各サンプルの2アリコート（30μL）を、それぞれDmPA標識キット（カルボキシルサブメタボローム用）およびDansyl標識キット（アミンおよびフェノールサブメタボローム用）を使用して標識した。各代謝物の相対濃度を測定するために、個々の試料を12C2-試薬で個別に標識し（軽標識）、すべての試料のアリコートを含むプール試料（内部標準として機能する）を13C2-試薬で標識した（重標識）。等量の13C2-標識リファレンスプールを各12C2-個別サンプルと混合し、混合物のLC-MS分析は、バッチ効果を防ぐために1回で行った。得られたデータは、ソフトウェア IsoMS Pro 1.2.7（Nova Medical Testing Inc. 代謝物同定のために、複数の代謝物識別子に基づいて、ピークペアを CIL 標識代謝物ライブラリとリンクされた同一性ライブラリに対して検索しました。
安全関連検査
Sysmex XN-10™ Automated Hematology Analyzer（米国イリノイ州リンカーンシャー）を用いて、赤血球、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球容積、平均赤血球ヘモグロビン濃度、赤血球分布幅、血小板、白血球、好中球、およびリンパ球を測定するために、全血球数の微分分析を行った。アルブミン、ナトリウム、カリウム、塩化物、尿素、クレアチニン、推定糸球体濾過量、総蛋白、免疫グロブリン（Ig）G、IgA、IgMはBeckman Coulter UniCel DxC-800（Mississauga, ON, Canada）で定量した。
慢性疾患のリスクマーカー
グルコース、総コレステロール、HDL、非HDL、トリグリセリドをBeckman Coulter UniCel DxC-800 (Mississauga, ON, Canada)で定量した。インスリンと CRP は、それぞれ U-PLEX Human Insulin Assay（アッセイ内 CV 5.2%）と V-PLEX Human CRP Kit（アッセイ内 CV 5.0%）を用いて分注した血漿で測定し、SECTOR® Imager 6000（Meso Scale Discovery®; Rockville, MD, USA）を用いてメーカーのプロトコールに従って分析した。グルコースとインスリンのデータは、HOMA-IR147とQUICKIの算出に使用された148。便中カルプロテクチンは、酵素結合免疫吸着測定法（カタログ番号K6927、Immundiagnostik AG、ドイツ、ヘッセン、CV 4.8%）を用いて、製造業者のプロトコールに従って測定された。
体重は、0日目、8日目、21日目、42日目、50日目および63日目に、0.1kg単位で校正済みデジタル体重計（Health o meter® Professional 752KL, Pelstar LLC; McCook, IL, USA）を用いて測定した。身長は、0日目に0.01cm単位で測定した（Digi-kit digital stadiometer, Measurement Concepts, Quick Medical®; Issaquah, WA, USA）。 身長と体重は、参加者が薄着でポケットを空け、靴を脱いだ状態で測定し、BMI（kg/m2 ）の算出に使用した。
腸管バリア機能のマーカー
リポ多糖結合蛋白は血漿で、ゾヌリンは生便で測定した。両マーカーは、酵素結合免疫吸着アッセイ（カタログ番号KR6813およびK5600、それぞれCV 4.2%および4.7%; Immundiagnostik AG, Hessen, Germany）を用いて、製造業者のプロトコールに従って測定した。
定量および統計解析
糞便サンプル中のL. reuteriの定量
糞便サンプル中のL. reuteri株の存在量は、定量培養とqPCRの両方により測定した。定量培養は、ほとんどの被験者のヒト糞便サンプルからL.reuteriを定量的に分離するのに十分な選択性を有するL. reuteri分離培地（LRIM）を用いて行った134。qPCRによるPB-W1およびDSM20016Tの定量は、それぞれ菌株特異的または系統特異的プライマーを用いて、既述の方法113に従って行った。qPCRは生細胞と死細胞の両方からDNAを取得するのに対し、定量培養は生細胞数を推定することから、以前に示唆されたように、糞便サンプル中の定量培養とqPCRを用いて推定した細胞数の比率を用いて、L. reuteriの生存率を評価した113。
定量的培養データは、LRIM選択培地上で生育するバックグラウンド細菌コロニーのない26人の参加者（PB-W1群：n＝9、DSM20016T群：n＝10、プラセボ群：n＝7）について得られた；すなわち、LRIM上で生育するL. reuteri以外の細菌種（16Sサンガー配列決定により確認）を有する4人の参加者（DSM20016T群：n＝1、プラセボ群：n＝3）は培養分析から除外された。株特異的qPCRデータは、20人の被験者（PB-W1はn＝9、DSM20016Tはn＝11）について得られたが、プラセボ群は、LRIM上の選択的培養によってL. reuteriが存在しないことが確認されたため含まれなかった。L. reuteriPB-W1は、全試験を通じて1人の被験者（RW-16）に安定して生着したため（図S3B）、その培養およびqPCRデータは、持続性に関する以降の解析から除外した。
統計解析
この概念実証試験では、主要アウトカムが以前に検討されていなかったため、検出力計算を行うことができなかった。しかし、各L. reuteri群に10人の参加者（プロバイオティクスの持続性を試験するために以前使用された149）、および同様の介入試験に基づく合計30人の登録を目指した150,151統計解析は、特に指定がない限り、Rおよび/またはGraphPad Prismを用いて実施した。全試験を完了した参加者のみが最終解析に含まれた（n= 30）。参加者のうち1人は、両食事期間の終了時に血液サンプルを提供できなかった；したがって、血漿サンプルのすべての分析にはn= 29を含めた。データは、ヒストグラムおよびQQプロットの視覚的検査を用いて正規性を評価し、Leveneの検定を用いて分散の均一性を確認した。各分析で使用した統計学的検定、ならびに中心および分散の測定の種類は、本文および図の凡例に記載されている。箱ひげ図が利用された場合、中心線は中央値を示し、箱は25パーセンタイルから75パーセンタイルの四分位範囲（IQR）を包含し、外れ値が同定されない限り、黒いひげはデータの最小値と最大値を示す。欠損データは、Rパッケージmouse.121を用いた多変量インピュテーションにより統計解析のためにインプットされた。
慢性疾患のリスクマーカーおよび腸管バリア機能マーカーのベースラインデータと、各食餌期間内の各マーカーの変化率を、factoextra122およびFactoMineR123パッケージを用いてPCAにより順序付けした。グループ間差（回復食対通常食）は、Rパッケージveganを用いたPERMANOVAにより評価した124。PERMANOVAは、マイクロバイオームの全体構造に対する様々な因子（すなわち、個人差、食事、排便回数、便の一貫性）の影響を評価するためにも実施した（1000通りの並べ替えあり）。
線形混合モデルでは、参加者IDをランダム因子として、食事期間とL. reuteri接種量を固定因子として含めた。16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングから得られたデータについては、介入日を追加固定因子として含めた。各食事期間のベースライン値は、安全性に関連する検査指標、慢性疾患のリスクマーカー、および腸管バリア機能のマーカーに関する各アウトカム変数の共変量として、Rパッケージnlme,125を用い、また16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングおよびMaAsLin2で適合させたWMS由来のデータについて実施した特徴ごとの検定に含めた132。各微生物特徴の相対存在量は、以前に示唆されたように、モデルに入力する前に対数変換した152。多重比較のためのBenjamini-Hochberg補正後、FDR調整両側p＜0.05を有意とみなした。
胃腸症状、知覚ストレス、身体活動、および気分のアンケートから得られたデータは、順序データまたは順序データから得られたもの（すなわち、合計または平均）であり、非正規分布であった。食事とL. reuteriの全体的な効果を評価するために、反復測定モデルを用いたGEEにRパッケージgeepack127を使用した。有意な効果が観察された場合、推定限界平均とemmeansパッケージを使用して、群内一対比較が適用された128。
血漿メタボロームデータセットの統計解析およびデータの可視化には、MetaboAnalyst（https://www.metaboanalyst.ca/ ）を使用した。133復元食の全体的な効果を推定するために、ベースラインから各食事期間の終了時（21日目）までのシフトに基づいてPLS-DAを実施し、1000回の並べ替え検証からp値を求めた。L. reuteriの影響を検出するため、各食餌期間中のシフト（[8日目；L. reuteri接種4日後]-ベースライン）に基づいてPLS-DAを実施した。
復元食に有意に反応した微生物分類群と血漿中代謝産物との相関を、スピアマンの順位相関を用いて調べた。上述の線形混合モデルから得られたβ係数に従って、復元食によって増加または減少した上位30（すなわち、β係数の絶対値が最も高い）属およびASV（16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスデータセットから）を同定し、解析に含めた。これらの分類群の相対存在量シフトは復元食による代謝物のシフトと相関させ、異常値の可能性のあるもの（平均±3SDの範囲外のもの）は解析前に除去した。
復元食に対する腸内細菌叢と宿主の反応のばらつきを定量化するため、まずすべての値に最小値の絶対値を加え（すなわち、非負にし）、次に平均値に対する標準偏差の比としてCVを計算することで、修正変動係数（mCV）を算出した。これは以下について計算された： ASVと属（16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシング）、パスウェイ、酵素、CAZymes（WMS）、血漿代謝物、慢性疾患のリスクマーカー。Rパッケージcvcqv129を使用して、mCVと、各データセット内で最大の（正と負の）効果量を持つ特徴量の絶対変化量の95％信頼区間を計算した。
機械学習モデル
多くのデータセットには数百の特徴があったため、各モデルに含まれる特徴の最適な数を決定するために、再帰的特徴選択を使用した。参加者コホートのサンプルサイズが小さく、独立したテストセットがないため、また、最も情報量の多い特徴セットを特定するために使用するサンプル数を最大化するため、特徴選択には内部的な1対1の交差検証を使用した。そして、識別された特徴セットは、目的の結果を予測するモデルの訓練に使用された。モデルの訓練に使用するサンプル数を最大化するために、再度リーブワンアウト交差検証を実施した。バイアスのリスクを低減するための標準的な機械学習アプローチ153を用いて、このプロセス全体（特徴選択とモデル学習）を、外部5重クロスバリデーションを用いて5回別々に実行し、これらの5重にわたる平均AUROC（分類）またはR2（回帰）を報告した。分類タスクの感度や特異度、回帰タスクの平均二乗誤差（RMSE）や平均絶対誤差（MAE）などの他のモデル性能指標は、補足表（表S8、S9、S10 ）に報告されている。微生物組成プロファイル（ASV/SGB、属、科、門、およびすべての分類レベルの組み合わせ）、マイクロバイオームの機能的特徴（SCFA、パスウェイ、CAZymes、EC）、および宿主の特徴（慢性疾患のリスクマーカー、血漿メタボローム、食事摂取）を用いて、別々のモデルをトレーニングした。生態学的指標（ASV、SGB、パスウェイ、CAZymes、ECについて算出されたα多様性指標とBray-Curtis距離、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスとWMSから得られたPrevotella/Bacteroides比を含む）と平均影響因子（相互作用ネットワーク解析から得られた変数、 また、Average Influencer（Streptococcaceae、Bacteroidaceae、Erysipelatoclostridiaceae、Rikenellaceae、Pasteurellaceae、Akkermansiaceae、Clostridiaceae、Desulfovibrionaceaeの平均相対存在量を反映する変数で、復元食の段階で他への正の影響が増加した）の予測値も評価した。モデルの上位予測特徴をモデルにおける重要度に基づいて同定し、5つのフォールドで平均して平均重要度スコアを与えた。最もよく機能する回帰モデル（すなわち、 R2＞0.30）については、上述のように、上位予測特徴とリスクマーカーの変化率との間のスピアマンの相関係数を計算した。
RFモデルで採用したのと同じ入力変数をMLRモデルでも使用したが、データの次元を減らすために、PCAを適用して、食事摂取量、慢性疾患のリスクマーカー、生態学的指標、微生物組成プロファイル（各分類群レベルで個別に）、機能プロファイル（各機能カテゴリーで個別に、および組み合わせて）、SCFA、および血漿メタボロームプロファイルの変動を最も説明する上位3つのPCを得た。PCのサンプル外れ値は、中央値からの絶対偏差が5を超えるものとして同定され、下流の解析から除外された。異なる炭水化物源を利用するCAZymeカテゴリーについては、分析を実行する前にRパッケージcar131を用いて分散インフレーション因子（VIF）を計算し、VIF＞10で多重共線性が高いとみなした。p＜0.05のPCと変数は有意とみなし、修正R2値を用いてモデルを評価した。
線形モデル
宿主反応に対するさまざまな種類の変数の複合効果を、参加者IDをランダム因子として、nlmeパッケージ125を用いた線形モデルで分析した。分類学的組成、多様性指標、CAZyme比、SCFAなどのマイクロバイオームの特徴の変化、時点間の変化、リスクマーカーのベースライン値、ベースラインの食事などの説明変数は、結果変数との関連に基づいてモデルに選択された。最終モデルは、微生物叢の特徴と食事（通常食または回復食）の両方を説明変数として含み、微生物叢の変化を効果的に調整し、各リスクマーカーに対する回復食の微生物叢に依存しない効果を評価できるようにした。最終モデルの各変数で説明される分散は、MuMInパッケージを用いて計算した126。pH、便の硬さ、および排便回数の変化と微生物との相互作用は、時点間の微生物相対存在量の変化を応答変数とし、前の時点における微生物の相対存在量を予測変数として、同様のステップワイズモデル縮小プロトコルを用いて評価した。