珪藻類におけるフラボドキシンの2つのクレードは、酸化ストレスと鉄制限を緩和する機能が異なる

2023年7月1日 12:17

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シリ・グラフ・ファン・クレーベルド
サシャ・N・コーセル
スティーブン・ブラスコウスキー
ライアン・D・グラウスマン
ミーガン・J・シャッツ
Eヴァージニア・アームブラスト
他著者リストを展開
米国・ワシントン大学・海洋学部
分子工学大学院プログラム、ワシントン大学、シアトル、ワシントン州、アメリカ合衆国
他、著者リストを展開
2023年6月6日
https://doi.org/10.7554/eLife.84392
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シリ・グラフ・ファン・クレーベルド
サシャ・N・コーセル
スティーブン・ブラスコウスキー
ライアン・D・グラウズマン
ミーガン・J・シャッツ
E・バージニア・アームブラスト

(2023)
珪藻におけるフラボドキシンの2つのクレードの異なる機能が酸化ストレスと鉄制限を緩和する

eLife 12:e84392.
https://doi.org/10.7554/eLife.84392
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概要
植物プランクトンは、鉄の生物学的利用能が低下し、酸化ストレスを誘発する今日の酸素濃度の高い海洋条件に適応するために、多様なメカニズムに依存している。例えば、鉄が制限された条件下では、鉄を必要とするフェレドキシン電子シャトルタンパク質が、効率の悪い鉄を含まないフラボドキシンへと置換される。しかし、珪藻は他の植物プランクトンとは対照的に、高鉄領域でフラボドキシンを転写する。ここでは、珪藻に存在するフラボドキシンの2つのクレードが機能的分岐を示し、クレードIIのフラボドキシンのみが鉄制限への順応において正統的な役割を示すことを示す。我々は、モデル珪藻Thalassiosira pseudonanaからクレードIフラボドキシンのCRISPR/Cas9ノックアウト株を作製し、これらの細胞株は酸化ストレスに対して過敏であるが、鉄制限に対しては野生型の応答を維持することを見いだした。天然の珪藻群集では、クレードIのフラボドキシン転写産物量は、鉄の利用可能性に応答するというよりも、むしろ日周期にわたって調節されているのに対し、クレードIIの転写産物量は、鉄が制限された地域か、人工的に誘導された鉄制限下で増加する。珪藻の中で観察された2つのフラボドキシン変異体の機能特化は、現代の海洋に関連する2つの主要なストレス因子を再確認し、多様な水生生態系で繁栄する珪藻の戦略を示している。
編集部の評価
本研究は、鉄に乏しい外洋環境においてフェレドキシンの代わりに鉄を節約するタンパク質として最初に報告された珪藻由来のフラボドキシンの機能的多様化に関して、確かな証拠とともに貴重な知見を提示している。
https://doi.org/10.7554/eLife.84392.sa0
決定書
Scietyに関するレビュー
イーライフの査読プロセス
はじめに
すべての生命は、タンパク質のドナーとアクセプター間の電子の授受によって駆動される酸化還元に基づく代謝経路に依存している。光栄養体における豊富な電子シャトルの一つは、フェレドキシン（Fd）である。フェレドキシンは小さな可溶性の鉄硫黄クラスター含有タンパク質で、酸素光合成の際に光化学系Iの間質表面から電子を受け取り、多様な代謝過程に関与するアクセプターへの移動を促進する（Mondal and Bruce, 2018）。鉄-硫黄クラスターを持つFdsのようなタンパク質は、酸素がほとんど存在せず、第一鉄と硫化物が豊富にあった時代に生じたと仮定される古代の生体触媒である（Cammack, 1982）。約24億年前の大酸化現象の間に、第一鉄は第二鉄型に酸化され、水酸化第二鉄として、あるいは陰イオン塩との不溶性錯体として急速に沈殿した。こうして、好気的生息環境における微生物の増殖は、鉄の生物学的利用能によって制限されるようになった（Imlay, 2006）。さらに、鉄を含むタンパク質は、酸素や活性酸素種（ROS）による損傷に敏感であり、Fdは酸化ストレスに応答して発現量が低下する（Singh et al.）しかし、現代の海洋植物プランクトン（シアノバクテリアや光合成真核生物）は、Fdに依存し続けており、細胞内鉄の30-40%までをこれらのタンパク質内に隔離している可能性がある（Erdner, 1997）。このように、酸素光合成中の電子シャトリングにFdを利用することは、十分な鉄の生物学的利用能の要求と、光合成中に生成される活性酸素に対する感受性の向上の両方を伴う。
鉄が制限された条件下では、光合成微生物は鉄を含むFdを機能的ホモログであるフラボドキシンに置き換えるのが一般的である（Smillie, 1965; Hutberら, 1977; Sandmannら, 1990）。フラボドキシンはフラビンモノヌクレオチド(FMN)を補酵素として用い、電子シャトルの効率は劣るが、鉄が不足しても光合成電子輸送を続けることができる(Zumft and Spiller, 1971; Yoch and Valentine, 1972)。陸上植物やある種の沿岸藻類からフラボドキシンが検出されないことから、フラボドキシンは陸上系を含む鉄の豊富な環境に生息する種から失われていると考えられた（Pierella Karlusich et al.）しかしながら、悪条件に応答したFdのダウンレギュレーション(Singh et al., 2010; Singh et al., 2004)や、酸化ストレス下のシアノバクテリアSynechocystisにおけるフラボドキシンの誘導(Jeanjean et al., 2003; Kojima et al., 2006; Singh et al., 2004)は、植物プランクトンにおけるフラボドキシンの生理学的役割の追加を示唆している。
Fdに対するフラボドキシンの発現レベル（転写産物またはタンパク質レベルから推定）は、海洋植物プランクトンの天然群集がその場で鉄の制限を経験しているかどうかを評価するために、いくつかの研究で用いられてきた（Boyd et al.、1999; DiTullio et al.、2005; Erdner and Anderson、1999; Jones、1988）。メタトランススクリプトーム研究は、予想通り、ほとんどの主要な真核植物プランクトン系統（葉緑素、ハプト藻、渦鞭毛藻）が鉄の利用可能性に応答してフラボドキシン転写物量を調節し、鉄が充足した環境ではフラボドキシン転写物量が減少することを示している（Caputi et al.）環境メタトランスクリプトームを詳しく調べると（Marchetti et al., 2012; Carradec et al., 2018; Caputi et al., 2019）、珪藻のフラボドキシン転写産物量は予想通り鉄の利用可能性と逆相関しておらず、フラボドキシンは鉄が豊富な環境下でしばしば高濃度で検出されることがわかった。環境中のフラボドキシンとFd転写産物量の直接的な比較は、Fdがいくつかの珪藻のプラスチドゲノムにコードされている（Groussman et al., 2015; Gueneau et al., 1998; Lommer et al., 2010; Oudot-Le Secq et al., 2007; Roy et al., 2020）という事実によって複雑であるが、珪藻は他の植物プランクトンと比べてフラボドキシンの転写を異なる方法で制御しているようである。珪藻の自然群集における特徴的なフラボドキシン転写パターンを説明する可能性は、いくつかのモデル珪藻において、フラボドキシンが2つの異なる系統学的クレードに分岐し、クレードIIのフラボドキシンのみが鉄の制限によって誘導されるという発見から得られており、クレードIのフラボドキシンはこれらの種において異なる役割を果たしている可能性が示唆されている（Whitney et al.）
ここでは、植物プランクトンにおけるクレードIとクレードIIのフラボドキシンの分化と、珪藻におけるそれらの潜在的な役割を明らかにするために、環境データと実験データの遺伝学的調査とモデル珪藻における遺伝子ノックアウト戦略を組み合わせた。モデル珪藻と天然植物プランクトン群集の両方から得られた結果から、これら2つのフラボドキシン鎖は機能的分岐を示すことが示された。すなわち、茎脚類のフラボドキシン鎖IIは低鉄条件への順応に関与し、フラボドキシン鎖Iは酸化ストレスへの順応に関与すると考えられる。この機能的分岐は、珪藻が多様な生態系で繁栄する能力を高めていると考えられる。
研究結果
クレードIのフラボドキシンはストラメノパイルのサブセットに出現した
フラボドキシンI族とII族の最初の記述は、6種のモデル珪藻と1種の非珪藻ストラメノパイルからの配列に基づいており（Whitney et al. 我々は、公開されている転写データを調べることによってこの研究を補足し、クレードIとクレードIIの両方のフラボドキシンをコードする3つのモデル珪藻において、クレードIIのフラボドキシンのみが鉄制限によって有意に誘導されることを見出した（Graff van Creveld et al.
さらなる海洋植物プランクトンにおけるクレードIとクレードIIのフラボドキシンの分布を決定するために、PF00258から適応したフラボドキシンドメインのカスタムメイド隠れマルコフモデル（hmm）-プロファイルを用いて、500以上の海洋原生生物、細菌、古細菌のゲノムとトランスクリプトーム（Coeselら、2021）のフラボドキシン配列について公開されているものをスクリーニングした（e < 0.001; hmmsearch; Eddy, 1998; Finnら、2014）。フラボドキシンドメインは1191個のフラボドキシン遺伝子（補足ファイル2；補足ファスタファイル2）で検出され、既知の光合成フラボドキシンタンパク質とクラスターを形成する332個の遺伝子が含まれていた（図1-図1A、黒ラベル）；残りの配列は多様で遠い非光合成関連タンパク質のクレードと類似性を示した（図1-図1A、赤ラベル）。さらに、この系統樹と、既知の光合成フラボドキシン（図1-図1A、黒ラベル、樹の右側）とその他の遺伝子（図1-図1A、赤ラベル、樹の左側）の区別を利用して、これまで特徴づけられていなかった光合成フラボドキシン（樹の右側のラベルのないフラボドキシン）を同定した。同様の方法はCaputi et al., 2019でも用いられた。推定される光合成関連フラボドキシンは4つのクレードに分離した（図1A、図1-図1A）。2つのクレードは緑藻類由来の光合成フラボドキシンで構成され、1つはガンマ-プロテオバクテリアとグループ化し（ピンクで強調表示、図1A、図1-図1B）、もう1つはシアノバクテリアおよび渦鞭毛藻類とグループ化した（緑で強調表示、図1A、図1-図1B）。これらのクラスター内で、標識されたSynechococcusおよびProchlorococcusフラボドキシンは、鉄制限に応答して誘導されることが以前に示された（Kashtanら、2014；Mackeyら、2015；Thompsonら、2011；Yousefら、2003）。鉄制限によって誘導された1つのシネココッカスフラボドキシンは、緑藻類とガンマ-プロテオバクテリアフラボドキシンのクレード内にグループ分けされた（ピンクで強調表示、図1A、図1-図1B）；他のすべての鉄制限によって誘導されたシネココッカスフラボドキシンは、シアノバクテリアと渦鞭毛藻由来のタンパク質を含む緑藻類のクレード内にグループ分けされた（緑で強調表示、図1A、図1-図1B）。
図1 補足1
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海洋微生物におけるフラボドキシンの系統。
( A) 光合成フラボドキシン類の最尤(RAxML)系統樹（完全な樹は図1-図1Aを、分類学的注釈は図1-図1Bを参照）; ... もっと見る
図1-図1
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公開データベース中のフラボドキシン。
(A) フラボドキシン類の最尤(RAxML)木。光合成を行わないフラボドキシン蛋白質またはフラボドキシンドメインを持つ蛋白質を持つ生物名を赤でラベルし、以前に同定された... さらに表示
2011年にWhitneyらによって同定されたクレードIとIIのフラボドキシン類は、もともと紅藻類の二次共生に由来する真核藻類からのみ検出された（図1A、図1-図1B）。クレードIフラボドキシンは、茎葉藻類（オレンジ色でハイライト、図1、図1-補遺1B）と2つの渦鞭毛藻類（Durinskia balticaとKryptoperidinium foliaceum）で検出された。どちらの渦鞭毛藻も、珪藻内共生体に由来するタンパク質を発現している（Hehenberger et al., 2016; Imanian et al., 2010; Imanian and Keeling, 2007; Yamada et al.）以前、クレードIのフラボドキシンとして定義された（Whitney et al.、2011）線虫Aureococcus anophagefferens由来のフラボドキシンは、別の未分類の葉状植物とグループになっている（図1A、図1-図1B）。この枝は、ここではクレードIのベースと定義される。以前にテストされたクレードIフラボドキシン遺伝子のいずれも、鉄制限生長条件に転写反応しない（星、図1A、補足ファイル1a）。クレードIIフラボドキシン遺伝子は、クレードIフラボドキシンよりも系統学的に多様であり、珪藻、非珪藻茎脚類、ハプト藻、渦鞭毛藻（Karenia brevisとKarlodinium micrum）の配列からなる（図1A、図1-補遺1B）。クレードIIのベースは、鉄制限下で実験的に誘導されたPhaeocystisフラボドキシン（標識）を含むハプト藻配列のクラスターによってここで定義される（Wu et al.）既知の珪藻の鉄制限応答性フラボドキシンはすべてクレードII内に集まっており（補足ファイル1a）、ストラメノパイル内でのクレードIとクレードIIのフラボドキシン間の機能的分岐と一致している。
ストラメノパイルの多様な系統におけるクレードIとクレードIIのフラボドキシンの分布をより詳細に調べるために、さらに56のストラメノパイルのトランスクリプトームとゲノムを検索した（補足ファイル1b、補足ファイル2；補足ファスタファイル3）。両クレードのフラボドキシンは、外洋と沿岸の分離株で同様に分布しているようであり、クレードIIのフラボドキシンが低鉄環境から分離された種にのみ保持されているという証拠はない（図1-図1B、補足ファイル1b）。ペンネート珪藻とセントリック珪藻から得られた珪藻クレードIフラボドキシンは、高いブートストラップサポートを持つ堅いクラスターを形成し（図1B、図1-図1C）、一部の種で複数のコピーが検出された（補足ファイル1b、図1-図1D）。調べた分類群の多くは、クレードIとクレードIIの両方のフラボドキシンをコードしている。約半数の分類群は1つのクレードのフラボドキシンのみをコードしているようであるが（図1-図1D）、この不在は、利用可能な配列データのほとんどがトランスクリプトーム由来のものであるため、それぞれのゲノムからの不在というよりは、培養条件を反映しているのかもしれない（補足ファイル1b）。それにもかかわらず、クレードIフラボドキシン配列の欠如は、Phaeomonas（Pinguiophyceae；一方、PelagophyceaeやDictyochophyceaeのメンバーのような珪藻に近縁なストラメノパイルは、一般的にクレードIとクレードIIの両方のフラボドキシンをコードしている（図1B、図1-図1E、補足ファイル1b）。
クレードIとIIのタンパク質分岐の潜在的な分子基盤を探るために、我々はストラメノパイルフラボドキシンを紅藻Chondrus crispusのフラボドキシン配列（補足ファイル2；補足ファスタファイル4）にアラインメントした。予想通り、FMNと水素結合を形成するアミノ酸側鎖（図1-図1Fの下線）は、2つのクレード間で保存されている。クレードIとクレードIIのフラボドキシン配列は、アミノ酸57と103（C. crispusの配列に従って番号付け、図1-図1F）で互いに異なっている。アミノ酸57では、C. crispusとクレードIタンパク質ではアスパラギン（N）が支配的であり、クレードIIタンパク質ではヒスチジン（H）が支配的である。アミノ酸103では、C. crispusとクレードIIタンパク質ではシステイン（C）、クレードIタンパク質ではアラニン（A）が支配的である。どちらのアミノ酸変化も、FMN結合トリプトファンとチロシン（W56、Y98、図1-図1Fにアスタリスクで示す）の近くで起こっており、2つのフラボドキシンの異なる機能と一致している。
酸化ストレスと鉄ストレスに対する珪藻フラボドキシンの転写応答
シアノバクテリアのフラボドキシンが鉄制限と酸化ストレスに対する適応において二重の役割を果たすことが観察されていることから（Jeanjean et al., 2003; Kojima et al., 2006; Singh et al., 2004）、我々は、ストラメノパイルにおける2つのクレードは、クレードIIに特異的な鉄制限応答と、クレードIに特異的な酸化ストレス応答という機能的分岐を示すと仮定した。この仮説を検証するために、酸化ストレスあるいは鉄制限にさらされた5種の珪藻の転写応答を調べた。鉄制限に応答してclade IとIIのフラボドキシンを転写するかどうか、複数の珪藻のスクリーニングを容易にするため、強力な鉄キレート剤デスフェリオキサミンB（DFB）を用い、短期間の鉄制限を強化した。2つの近縁のモデル中心性珪藻：河口域に隔離されたThalassiosira pseudonanaと外洋に隔離されたThalassiosira oceanica、そして3つの非モデル外洋隔離珪藻：2つのペンネート、Amphora coffeaeformisとCylindrotheca closterium、1つの中心性Chaetoceros sp.を選んだが、いずれもゲノム配列やトランスクリプトーム配列は公開されていなかった。今回も、複数の珪藻のスクリーニングを容易にするため、酸化ストレスに対する単一の処理に焦点を当てた。酸化ストレスは最低致死量のH2O2（200-250 µM）で誘導したが、これは同様の処理がT. pseudonanaとPhaeodactylumにおける他の、環境に関連した形態の酸化ストレス因子の代表であることが示されたからである（Graff van Creveld et al.）それぞれの珪藻について、低鉄培養物が光化学系IIの最大光化学収量（Fv/Fm）の減少を示すまで、6つの複製を鉄過剰条件下で、3つの複製を鉄制限条件下で3-6日間（種による、図2-図1A-C、図2A、補足ファイル1c）培養し、鉄制限を示し、その時点で鉄制限条件下と鉄過剰条件下の両方でトランスクリプトームサンプルを収集した。この時点で、鉄量制限条件と鉄量充足条件の両方について、トランスクリプトームサンプルを収集した。鉄量充足条件のレプリカのうち3つを、致死量のH2O2で模倣した酸化ストレスに暴露し、細胞の表現型（Fv/Fmまたは細胞量）がコントロールから変化しない、暴露から約1.5時間後にトランスクリプトームサンプルを収集した。多次元尺度（MDS）プロットに見られるように、3つの条件は5つの珪藻種で異なる全体的な転写反応を引き起こした（図2-図1D）。
図2と1つの補足
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珪藻培養における鉄制限と酸化ストレス。
( A) 5種の珪藻の光合成効率（Fv/Fm）、各トランスクリプトームの細胞を採取する前、エラーバーは生物学的3連複の標準偏差を表す。転写... さらに表示
図2-図1
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珪藻培養物のトランスクリプトーム。
(A）実験デザインとトランスクリプトーム採取時の代表的なフラスコの写真。全実験は、各処理について生物学的3反復で行われた。それぞれの... もっと見る
異なる珪藻種は異なるフラボドキシンクレードを発現した。CylindrothecaとT. oceanicaはclade IとIIの両方のフラボドキシンを転写した；T. oceanicaはclade IIフラボドキシンの2つのアイソフォームを転写した（ここではA, Bと表示、図2B）；T. pseudonana, Chaetoceros, Amphoraはclade Iフラボドキシンのみを転写した。酸化ストレスや鉄ストレスに対するフラボドキシンの誘導も、種によって異なっていた。T. oceanica (clade II-A)とCylindrothecaのclade II遺伝子の転写レベルは鉄制限に応答して有意に上昇した（それぞれ5.3倍と9.5倍の変化、偽発見率[FDR]<0.01、図2B）が、これらの珪藻のclade I遺伝子は、H2O2曝露後も鉄制限下でも転写産物量に有意な変化を示さなかった（FDR = 1、図2C）。T. oceanica clade II-B遺伝子の転写量はいずれの処理にも反応せず（図1B）、以前の結果と一致した（Supplementary file 1a, Lommer et al.） T.pseudonana、Chaetoceros、Amphoraのclade Iフラボドキシン転写産物は、鉄制限下で上昇した（それぞれ3.2倍、1.5倍、9.9倍の変化、FDR < 0.01、図2C）。これらの珪藻はクレードIのフラボドキシンのみをコードしており、クレードIのフラボドキシンはクレードIIのフラボドキシンがない場合にのみ鉄制限下で誘導されることが示唆された。T.pseudonanaのクレードIフラボドキシン遺伝子だけが、H2O2処理に応答して有意に転写された（2.4倍の増加、FDR < 0.01、図2C）。これらの結果から、クレードIIフラボドキシンは鉄の制限に転写応答することが確認され、ある生物種におけるクレードIフラボドキシンの転写応答は、クレードIIフラボドキシンも転写されるかどうかに依存している可能性が示唆された。
クレードIフラボドキシンの機能的役割
ある種におけるクレードIとIIのフラボドキシン間の機能的冗長性や相乗作用の可能性を明らかにするために、T. pseudonanaのクレードIフラボドキシン遺伝子ノックアウト（KO）を作成した。この珪藻はクレードI遺伝子（TpFlav, Thaps_19141）を1コピーしかコードしておらず、クレードII遺伝子を欠いているからである。CRISPR/Cas9を用いて、FMN結合部位を欠失させた3つの独立したKO株を作製した（図3-図1A-C）。同じプラスミドで形質転換した野生型様株（WT）も2株保持したが、こちらはフラボドキシン遺伝子が編集されていなかった（図3-図1BおよびC）。細胞増殖、Fv/Fm、および最終的な運搬能力は、鉄欠乏増殖条件下でWT細胞とKO細胞の間に有意差はなかった（図3AおよびB、図3-図1DおよびE）。細胞数はWT株とKO株で同程度で、12日目には約300万個/mlに達した（WT 3.04±0.25、KO 2.93±0.11、図3A、図3-補遺1D）。光合成効率もWT株とKO株で同程度であった（1日目でそれぞれ0.64±0.016、0.63±0.040、図3B、図3-補遺1E）。WT株とKO株は、鉄制限下で細胞分裂とFv/Fmの同程度の減少を示し、～3日後には最大約40万個/mlに達し（図3A、図3-補遺1F）、Fv/Fmは0.63±0.016（replete条件の全細胞株）から0.57±0.016（KO株）または0.57±0.004（WT株）に減少した（図3B、図3-補遺1G）。従って、野生型およびKO T. pseudonana株はともに、鉄制限条件下での反応が乏しい。このことは、野生型細胞が低鉄への馴化中に、鉄を必要とするFdをフラボドキシンに置換していないことを示唆している。しかしながら、WT細胞株とKO細胞株との表現型の違いは、H2O2処理後に現れた（図3C、図3-図1HおよびI）。100μMのH2O2に暴露すると、24時間後にWT細胞の約73％が死滅した。対照的に、KO細胞を同量のH2O2に暴露すると、24時間後にKO細胞の約100％が死滅し、これはWT細胞を2倍の量のH2O2（200μM）に暴露した場合と同程度であった。H2O2に対するKO株の過敏性（図3C、図3補1HおよびI）は、クレードIフラボドキシンが酸化ストレス応答に関与していることを示している。
図3 1の補足
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鉄制限と酸化ストレスに対するT. pseudonanaフラボドキシンKO株とWT株の応答。
3系統の独立したWT株（灰色）とフラボドキシンKO株（橙色）を、鉄過剰（丸印）と鉄制限（三角印）条件下で数日間生育させた。(A)フローで測定した細胞量。
図3-図1
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T.pseudonanaにおけるフラボドキシンのノックアウト。
(A) T. pseudonanaフラボドキシン（TpFlav）のDNAおよびアミノ酸配列、エクソン（水色）、FMN結合部位（オレンジ）、FMNを挟む側鎖を持つアミノ酸（*）およびsgRNA（赤）を示す。ターゲット... もっと見る
図3-図1-ソースデータ1
図3-図1Bの非切抜きゲル。
完全未編集ゲル。
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図3-図1-ソースデータ2
図3-図1Bの切り抜きなしゲル。
バンドを明確に標識した完全ゲル。
https://cdn.elifesciences.org/articles/84392/elife-84392-fig3-figsupp1-data2-v2.zip
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北太平洋における環境フラボドキシン転写
実験室での解析にとどまらず、自然界におけるクレードIとクレードIIのフラボドキシン類の潜在的な役割を探るために、北太平洋の3つの研究クルーズで採取した120の真核生物の表層水メタトランスクリプトームを解析した： Gradients 1クルーズ（2016年4月／5月）は、21°Nから38°Nまで、〜158°Wに沿って南／北に通過した（10ステーション、トリプリケート）；Gradients 2クルーズ（2017年5月／6月）は、24°Nから42. 5°N（10ステーション、3連）、および日周サンプリングクルーズ（2015年7月/8月）は、北太平洋亜熱帯海（NPSG）、〜156.5°W、24.5°NのステーションALOHA付近で実施された（24回ポイント、重複）；甲板上栄養添加実験は、37°N、158°WのGradients 2で実施された（インキュベーション：4条件、3連）（図4A）。
図4と1つの補足
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北太平洋における2つのフラボドキシンクレードの検出。
(A）2017年5月9日から6月26日までの、衛星、平均クロロフィル推定値を背景としたサンプリングエリアの概要。コペルニクス海洋研究所の海洋色彩テーマセンターから提供されたデータ。
図4-図1
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北太平洋の環境リードを配置したフラボドキシン類の北太平洋最尤(RAxML)木。
このツリーは図1B、図1-図1C、図4Bにも示されている。枝はクレードIをオレンジ色、クレードIIを紫色で示す。色のついた帯は分類を表し、色分けは... さらに表示
種または属レベルでのクレードおよび分類学的所属は、我々のstramenopile-expanded photosynthetic flavodoxin reference tree（図4-図補遺1）内での系統学的配置（Barbera et al. 2つのフラボドキシンクレードのコンティグは、3つの探検隊すべてのメタトランスクリプトームから検出され、特にGradients 1と2のトランセクトに沿って、クレードIIフラボドキシンのコンティグの数と系統学的多様性が大きかった（図4B）。環境クレードIIフラボドキシンの大部分は、もともと南大西洋から分離された放射状中心性珪藻Chaetoceros dichaetaの参照配列に最も近縁であった；さらなるクレードIIコンティグは11の他の珪藻属に分布していた（図4B、図4-図1）。非珪藻のstramenopilesの中で、クレードIIのフラボドキシンコンティグの大部分はDictyochaとFlorenciellaに割り当てられ、追加のコンティグは他の5属に分布した（図4B、図4-図1）。クレードIのフラボドキシン類のコンティグは、主にFistulifera solarisに割り当てられた。Fistulifera solarisは、この地域の珪藻群集を支配している珪藻（Dore et al., 2008; Villareal et al.
群集組成、栄養塩の利用可能性（Gradoville et al., 2020; Juranek et al., 2020; Lambert et al., 2022; Park et al., 2022; Pinedo-González et al., 2020）、およびフラボドキシン転写パターン（図5AおよびB、図5-図1、補足ファイル1d）は、勾配1および2の南／北トランセクトに沿って空間的に変化した。勾配1では、鉄（Fe）と硝酸塩（N）は、NPSGの北側ではN濃度が増加しFe濃度が減少するという、予想された相反する濃度パターンを示し、その結果、NPSG内ではN/Feが低く（～0.01μM/nM）、移行帯とさらに北側ではN/Feが3～4桁高く（～10～100μM/nM）なった（図5CとD）。対照的に、勾配2では、ダスト沈着量の増加によって遷移帯内で鉄が増加し（Pinedo-González et al.、2020）、その結果、北緯40°までの遷移帯全体でN/Feが比較的低くなった（<10μM/nM）（図5EおよびF）。短いシーケンスリードをフラボドキシンコンティグにマッピングし、各サンプルのそれぞれの分類学的順序に割り当てられた総転写物濃度に対してこれらのカウントを正規化することによって、2つのクルーズトランセクト（図5AおよびB）を横断する属間のフラボドキシン転写物量を比較した（図5図補1Aのスキーム）。クレードIのフラボドキシン転写産物は、FistuliferaとDactyliosolenの2属で検出され、これらの転写産物の相対量は、両クルーズともN/Fe比が1未満（μM/nM）のNPSG内で高かった（図5A-F）。対照的に、クレードIIのフラボドキシン転写産物量は、2つのクルーズ間で空間的な違いを示した。勾配1では、相対的なクレードIIフラボドキシン転写産物量は遷移帯内で増加し、N/Fe比が37 (µM/nM)以上に達した北緯33°でピークに達したが、このトランセクトの最北ステーションである北緯37°で最も高い相対的転写産物量を示したChaetocerosを除くすべての属で検出された（図5A、C、D）。グラディエント2（Park et al., 2022; Pinedo-González et al., 2020）で検出された高い鉄分濃度と一致し、相対的なクレードIIの転写産物量は、グラディエントIのクルーズ中に見られたようなトランジションゾーン内での大きな増加は見られなかった。それどころか、検出された10属のうち4属の転写産物量は、N/Feが最初に6μM/nM超に達した地点である北緯40°までピークに達しなかった（図5B、EおよびF）。これらの結果は、クレードIIフラボドキシンは比較的高硝酸、低鉄条件下で多様な属によって特異的に発現されるのに対し、クレードIフラボドキシンの転写は貧栄養、非鉄制限条件下で少数の珪藻属に限定されることを示している。
図5と1つの補足
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北太平洋における珪藻フラボドキシン遺伝子の転写パターン。
(A, B) Gradients 1 transect (A)またはGradients 2 transect (B)における珪藻フラボドキシン遺伝子の相対転写のヒートマップ。1リットルあたりのフラボドキシン配列リードは属レベルで合計し、... さらに表示
図5-図1
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北太平洋におけるフラボドキシン遺伝子の転写パターン。
(A) 環境フラボドキシンの検出、アノテーション、定量化のためのメタトランスクリプトームワークフローチャート。左のグレーの枠は、この研究に先立って行われた解析： RNA抽出、... もっと見る
ある場所の北太平洋の珪藻属がN/Feの変化にどのように反応するかを明らかにするために、その場のN/Fe比が0.24（μM/nM、図5F）である北緯37度、西経158度から採取した微量金属清浄海水を用いて、グラディエント2のデッキ上で培養実験を行った。海水サンプルは、甲板上の温度制御されたインキュベーターで4日間維持され、栄養塩無添加（コントロール）、1 nM FeCl3（+Fe）、または5 µM NO3および0.5 µM PO4（+N+P）のいずれかに調整された。メタトランスクリプトーム解析のためのサンプルは、T = 0とT = 4 dに採取した。この研究のために、1リットルあたりのフラボドキシン転写産物を各処理における各属について合計し、すべての処理で検出された属ごとのフラボドキシン転写産物の合計に対して正規化した（例えば、「行正規化」）（図5G、図5-図1A）。これらの実験では、両方のクレードからのフラボドキシン類が検出された。クレードIのフラボドキシン転写産物は、in situサンプル（T = 0）と実験処理（T = 4 d）（37°N図5B、補足ファイル1d）の両方で低値であり、両方の栄養補正条件（FeまたはN+P）により、ChaetocerosとDactyliosolenに割り当てられた相対転写産物量が減少した（図5G）。対照的に、N+P処理では、Chaetoceros、Proboscia、Pseudo-nitzschiaを除くすべての属で、対照群およびFe処理群の両方と比較して、相対クレードII転写産物量が有意に増加した（図5G）。Probosciaはin situ（T=0）で最も高い相対転写物量を示し、ChaetocerosとPseudo-nitzschiaはコントロールで最も高い相対転写物量を示した。これらの結果から、珪藻類はクレードIIフラボドキシンの転写をアップレギュレートすることで鉄の制限に応答することができ、37°Nのin situで検出されたクレードII転写産物の相対的な存在量が低いのは、サンプリング時の鉄過剰状態を反映しているという推論が支持される。重要なことは、これらの実験から、鉄の利用可能性に対する珪藻属内の反応の多様性が示され、シュードニッツキアやケトケロスなどの珪藻が、鉄の制限条件に対する適応的な反応を実験室で研究できる可能性が示されたことである。
クレードIフラボドキシンの役割の可能性をさらに探るために、低窒素・高照度環境であるNPSG（Diel 1 cruise, Wilson et al. 光合成活動放射量（PAR）は毎日、酸化ストレスを高めると予想される条件である〜2000μmol photons・m-2・s-1（Coeselら、2021年）に達した。1リットルあたりのフラボドキシン転写産物は、Gradients transectsのサンプルで行ったように、各分類群に割り当てられたリードの合計で正規化した（図5-図1A）。クレードIIの転写産物量は日周期を通して低く（図5H）、これはグラディエント・トランセクトに沿った同程度の緯度（〜24°N、図5AおよびB）で検出された低い転写産物量と一致しており、これらの地点の非鉄制限条件を代表している。対照的に、フラボドキシンI群は転写産物量に明確な日内パターンを示した。ほとんどのコンティグがF. solarisに割り当てられ、19コンティグのうち13コンティグが午前6時に転写産物量の有意なピークを示し（RAIN解析、BH相関<0.05）、その後1日を通して徐々に減少し、夕暮れ時に最小となった。午後10時から午前2時までの夜間におけるクレードIの転写産物量の増加は、夜明け後の高照度への曝露を予期して、日中調節されていることを示唆している。
考察
海洋植物プランクトンは、酸素が豊富で鉄分の乏しい現代の海洋条件に適応するために、複数のメカニズムに依存している。我々はフラボドキシンの役割に注目した。フラボドキシンは鉄非依存性の電子シャトルタンパク質で、鉄が制限された条件下では、より効率的な鉄依存性タンパク質であるフェレドキシンに取って代わることができ、活性酸素の影響を受けにくい。フェレドキシンとフラボドキシンの両方は、緑藻類、紅藻類、灰色藻類のプラスティドを生み出した一次内部共生の間に飲み込まれたシアノバクテリアに存在したと推定される（Campbell et al.）その後の紅藻の二次内部共生の間に、これらのタンパク質は、ストラメノパイル、渦鞭毛藻、およびハプト藻の系統に移され、これらは共に現代の地球海洋における炭素フラックスを支配している。フラボドキシンの複雑な進化の歴史は、鉄の豊富な環境で進化した生物における複数の水平的遺伝子転移と遺伝子喪失の両方を反映していると仮定される、生命のあらゆる領域に散在する分布をもたらした（Pierella Karlusich et al.）海洋微生物におけるフラボドキシンの遺伝学的調査を拡大した結果、シアノバクテリアと一次共生生物（紅藻類と緑藻類）のフラボドキシンには予想された関連性があり、二次共生生物のフラボドキシンとは分岐していることが確認された。海洋シアノバクテリアと緑藻のフラボドキシンによる鉄の制限に対する応答性は、鉄の利用可能性がこれらの生物のゲノム内にフラボドキシンを保持するための強い選択圧であるという命題を支持している（Pierella Karlusich et al.）クレードIとクレードIIのフラボドキシンが二次（および三次）共生体内に分布していることは、さらなる選択圧を示唆している。モデル生物由来のクレードIIフラボドキシンは、鉄制限に対する応答性を示し、鉄制限条件下でフェレドキシンがフラボドキシンに置換されることが予想される。しかし、ストラメノパイルズ系統間のクレードIIフラボドキシンの分布は、現代の鉄条件とは無関係のようである。クレードIフラボドキシンはストラメノパイルに限られており、クリシスタから分岐した後、ディアトミスタで分化したらしい（図1-図1E）。クレードIフラボドキシンは、多様な珪藻にまたがって保持されているようで、その種がもともと鉄の乏しい外洋から分離されたのか、鉄の豊富な沿岸環境から分離されたのかにかかわらず、しばしば複数のコピーで存在する。
我々の研究以前は、海洋植物プランクトンにおける酸化ストレス応答の一部としてのフラボドキシンの役割については、比較的注目されていなかった。しかし、大腸菌では内因性フラボドキシンの過剰発現により酸化ストレスに対する耐性が増強され（Zheng et al., 1999）、陸上植物ではシアノバクテリアフラボドキシンの異所性発現により酸化ストレスを含む幅広いストレスに対する耐性が増強される（Blanco et al., 2011; Ceccoli et al., 2011; Mayta et al., 2019; Tognetti et al., 2006; Zurbriggen et al., 2008）。同様に、高レベルで発現した場合、既知の鉄応答性フラボドキシンは、酸化ストレスのようなFdの機能を低下させる可能性のある新たなストレスを緩和する可能性がある。5種の珪藻を用いた我々の実験室での研究から、クレードIIフラボドキシンの発現は鉄の制限に対する適応であり、おそらく光化学系Iの電子シャトルとしてFdに置き換わることが確認された。クレードIIフラボドキシンを持たない珪藻では、クレードIフラボドキシンも鉄制限によって誘導されるが、その転写産物量は2桁低い（図2BとC、補足ファイル1a）。このことは、クレードIフラボドキシンのみを持つ珪藻では、鉄要求量を減少させる手段としてのFd置換は、低鉄条件への適応においてそれほど重要な役割を果たしていない可能性を示唆している。注目すべきは、鉄の制限それ自体に関係しないDFBの望ましくない影響を排除できないことを認識しながらも、以前に記載したように（Andrewら、2019；Kranzlerら、2021；Lampeら、2018；Timmermansら、2001；Wells、1999）、様々な珪藻で鉄の制限を強化するために強力な鉄キレート剤DFBを使用したことである。ここでは、2つのフラボドキシンクレードの転写が鉄の制限に対して異なる反応を示すかどうかを調べるための実験にDFBを用いた。T. oceanicaとT. pseudonanaの結果は、DFBを添加しなかった文献と一致した。T. oceanicaでは、1つのクレードIIフラボドキシンの発現のみが誘導された（図2BとC、Lommer et al.）鉄制限に応答したT. pseudonanaのクレードIフラボドキシンのmRNAの軽微な誘導は、DFBを添加しない低鉄への長期および短期適応の両方で検出された（Goldmanら、2019；Thamatrakolnら、2012）。このフラボドキシンには日周調節があるようで、観察された誘導は概日時間や日周期の設定に特異的なのかもしれない（Goldman et al.）
クレードIフラボドキシンのノックアウトは、鉄欠乏条件下でH2O2誘導酸化ストレスを部分的に緩和することを示している（図3C）。酸化ストレスにおけるクレードIフラボドキシンの役割のさらなる支持は、クレードIフラボドキシンが残基103のシステインをアラニンに置換することによってクレードIIフラボドキシンと区別されるという観察から得られた（図1-図1F）。システインは酸化ストレス下で酸化されやすく（D'Autréaux and Toledano, 2007）、クレードIIタンパク質を不活性化すると予想される。酸化ストレスにおけるクレードIフラボドキシンの役割をさらに支持するためには、酸化ストレスが超最適照射、紫外線照射、生物学的相互作用などの他の環境条件によって引き起こされるような今後の研究が必要である。
クレードI遺伝子がクレードII遺伝子よりも桁違いに低いレベルで転写されるという観察結果は、異なる転写制御が細胞内でのクレードIフラボドキシン転写物の蓄積を制御しているか、あるいは酸化ストレスが鉄欠乏に比べてFdプールのより少ない部分を枯渇させる可能性を示唆している。あるいは、我々のバルク測定におけるクレードI転写物量の低さは、酸化ストレスを誘発する手段であるH2O2曝露（Mizrachi et al. 一方または両方のフラボドキシンクレードを保持するための潜在的な選択圧を同定するためには、2つのタンパク質を用いて、酸化ストレス感受性を誘発する条件下で予想通り異なる効率を示すかどうか、そしてそれらのタンパク質レベルが異なる制御を受けているかどうかを明らかにするメカニズム研究が有益であろう。
真核植物プランクトン群集のメタトランスクリプトーム研究から、clade IとIIのフラボドキシン遺伝子の転写プロファイルの一般的なパターンと、異なる珪藻の特異的な応答の両方が明らかになった。野生珪藻のクレードIIフラボドキシン遺伝子は、鉄制限（ここではN/Feが4μM以上）によって硝酸同化作用が低下した環境で転写される。検出された異なる珪藻属は、2つのトランセクトで遭遇した条件に特異的な反応を示した。環境中のChaetocerosは、他の非鉄制限ステーションでこの属が検出されたにもかかわらず、推定鉄制限ステーションでのみclade IIフラボドキシンを転写した。対照的に、他の2つの環境珪藻属、Pseudo-nitzschiaとFragilariopsisは、総転写産物量に基づくと、どちらも数値的には豊富であった（図5-図1C）が、これら2種のクレードII転写産物量は、両方のトランセクトを通して比較的低いままであり、これらの種がサンプリング時に鉄制限を経験していなかったことを示唆している。同様に、ペラゴ藻類のPelagomonasもトランセクト全体で豊富に生息していたが、クレードIIの転写量は比較的低かった（図5-図1BとC）。重要なことは、検出されたChaetocerosのいくつかの種がクレードIのフラボドキシンをコードしていたことである（図4-補遺1）。これらのフラボドキシンは、比較的低いレベルで検出されるか、あるいはトランセクトに沿って全く検出されなかったことから、環境条件に応答した2つのフラボドキシンクレードの転写の特異性が示された。
NPSGは鉄分が豊富で光量が多い環境であり、酸化ストレスが亢進するため、Fdの機能が損なわれる可能性がある。この仮説と一致して、クレードIの転写産物の相対量がジャイア内で最も多く検出され、その大部分はF. solarisに割り当てられた。このリズミカルなパターンは、FistuliferaのクレードIフラボドキシンでのみ検出され、高照度に対する属特異的な適応か、生物学的相互作用などの他の酸化ストレス発生プロセスのどちらかを示唆している。興味深いことに、モデル珪藻2種のゲノムワイドなトランスクリプトーム・プロファイルを日周期で解析したところ、クレードIフラボドキシンの転写産物量にも日周リズムがあることが示唆された。Phaeodactylum tricornutumのクレードIフラボドキシン（Phatr3_J13706）の発現は夕暮れ前後にピークを示し（Smith et al.、2016）、底生珪藻Seminavis robustaは夕暮れ前にクレードIフラボドキシン（sro1985_g309400、sro668_g166050）を誘導した（Bilcke et al.、2021；補足ファイル1a）。モデル珪藻を用いた実験室での研究においても、また自然の珪藻群集においても、clade Iフラボドキシンには日内リズムがあることから、このタンパク質が夜明けや光合成に関連した酸化ストレスを予測して概日リズムを調節している可能性が強調される。
ここでは、すべてのフラボドキシンが低鉄濃度に応答するわけではないこと、フラボドキシンのサブセット（クレードIフラボドキシン）が酸化ストレス応答に重要である可能性を示す。このような特殊化によって、珪藻や他の茎葉類はストレスの多い急速に変化する環境でも生き残ることができるのかもしれない。今回報告されたフラボドキシンの遺伝子重複と機能分化は、鉄制限と酸化ストレスという2つの主要なストレスに対する珪藻の生存と適応を促進する分子メカニズムを追加した。
材料と方法
HMM検索と系統樹構築
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Flavodoxin_1 seed alignment（Pfam id PF00258; pfam.xfam.org; Finn et al、 P.tricornutum、T.pseudonana、T.oceanicaのフラボドキシンアミノ酸配列で修正したアラインメントから、Multiple Alignment using Fast Fourier Transform (MAFFT) version 7.313 (Katoh et al., 2002; parameters: --localpair --maxiterate 100 -reorder; Supplementary file 2; supplementative fasta file 1)を用いた。） 500以上の海洋原生生物、細菌、古細菌、ウイルスのゲノムとトランスクリプトームから公開されている配列（Coesel et al., 2021）をカスタムhmm-profile（e < 0.001; hmmsearch; Eddy, 1998）を用いて検索し、ヒットした配列はsearch（Edgar, 2010）により同一性99%でクラスタリングした。系統解析のため、配列はMAFFT（パラメータ：-maxiterate 100 --reorder --leavegappyregion）でアライメントした。最尤系統樹はRAxMLバージョン8.2.4（Stamatakis, 2014; parameters: -f a -m PROTGAMMAWAG -p 451325 -x 12345 -# 100; Figure 1-figure supplement 1A and B, Figure 1A）を用いて構築した。先に述べたように（Caputi et al., 2019）、PfamとHMM-searchは、光合成代謝に関与する配列を他の相同配列から識別しない。系統樹を用いて、既知の光合成フラボドキシンを含むクレードと、非光合成フラボドキシン配列を含むアウトグループクレードを区別した（それぞれ黒と赤でラベル付け、図1-図1A）。
ストラメノパイルに焦点を当てた系統解析は、多様なデータソースから得られた56の追加ストラメノパイル配列の同様の検索によって作成された（補足ファイル1b）。配列は我々のカスタムflavodoxin hmmプロファイル（e < 0.001; hmmsearch）を用いて同定し、MAFFT（パラメータ：--add --localpair --maxiterate 100 --reorder --leavegappyregion）を用いてオリジナルのアラインメントに加えた。RAxML（パラメータ：-f E -p 271321 -m PROTGAMMAWAG）で高速ツリーを作成し、「アウトグループ」領域（図1-図1Aの破線の左）から枝を刈り込み、類似したクレードのほとんどを除去し、後述のRAxML EPA解析で環境リードを引き付けるためにいくつかの代表を残した。Tiarina fususの配列も、この繊毛虫は餌で大きく汚染されていると報告されているため、ツリーから削除した（Lasek-Nesselquist and Johnson, 2019）。追加の不正配列は、多数決コンセンサス（MR; Aberer et al., 2013）によってRogueNaRokによって検出され、4つの光合成フラボドキシンクレード内に位置する配列には0.85を超える「rawImprovement」カットオフが適用されたが、アウトグループにはより厳密なカットオフ（0.2以上）が適用された。残りの611配列は、stramenopile光合成フラボドキシンフォーカスツリー（パラメータ：-f a -x 25114 -p 269321 -# 100 -m PROTGAMMAWAG）を作成するために使用された（図1-図1C、図1B）。すべてのツリーの可視化は、Interactive Tree of Life version 5 (https://itol.embl.de/; Letunic and Bork, 2021)で行った。
培養生育条件
詳細なプロトコールのリクエスト
すべての珪藻単離株はProvasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton (NCMA)から入手した。培養は16:8時間の明：暗サイクル、光強度約100μmol photons-m-2-s-1で行った。T. pseudonana (CCMP1335)、T. oceanica (CCMP1005)、A. coffeaeformis (CCMP1405)は20℃で培養した。Chaetoceros sp.（CCMP199）、C. closterium（CCMP340）は24℃で培養した。すべての培養は、実験開始前に少なくとも1ヶ月間、人工海水（EASWまたはAquil培地のいずれか）に順応させた。各生物種の培地タイプと正確な生育条件については、補足ファイル1cを参照。以下の培地を使用した：f/2 (Guillard and Ryther, 1962)、L1 (Guillard and Hargraves, 1993)、EASW (Berges et al., 2001)、Aquil (Price et al., 1989)。鉄の制限実験では、指数関数的に増殖した細胞を4000rpmで遠心した（5-10分、20-22℃、補足ファイル1cに明記）。細胞は、鉄を添加しない増殖培地で3回洗浄した後、鉄を添加しない培地か、1.5μMのデスフェリオキサミンB（DFB；鉄キレーター、シグマ社製）を添加した培地に希釈した。細胞は、新鮮な培地に希釈することで、指数関数的な状態に維持された。培養は、鉄汚染を最小限に抑えるため、ポリスチレン製フラスコで行った。酸化ストレス実験では、予備的な小規模実験で各生物種の致死量を決定し、トランスクリプトームでは最も低い致死濃度（アンフォラでは250μM、その他の培養では200μM）を用いた。トランスクリプトーム解析に用いた実験とは対照的に、T. pseudonanaのWT株とKO株を用いた実験はすべて、f/2を添加したピュージェット湾のろ過海水（FSW）で行った。希釈した細胞は、さらに25～250μMのH2O2で処理した。
細胞数と細胞死
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三重フラスコから150μlのサンプルを採取し、直ちにGuava easyCyte 11HT Benchtop Flow Cytometerを用いて測定した。細胞はクロロフィル自家蛍光（680±30 nm）と前方散乱で検出した。アンフォラ細胞は細胞の塊を形成していたため、フローサイトメーターでは正確な細胞数をカウントできなかった。しかし、Fv/Fmの測定から、サンプリング時に鉄欠乏細胞が健全であったことがわかる。細胞死は、Sytox Green（Invitrogen）染色を最終濃度1 µMで行い、陽性と判定した。サンプルは測定前に暗所で30分間インキュベートした。陽性ゲーティング（525±30 nm）は、未処理染色細胞と未染色細胞に基づいて行った。
光合成効率
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光化学系Ⅱの光化学収率（Fv/Fm）は、15分間暗順応した細胞を用い、Phyto-PAM蛍光光度計（Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany）を用いて測定した。1cmのキュベットに1mlを入れ、30秒間隔で3回測定した。
RNA抽出とトランスクリプトーム解析
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細胞は0.22 µmフィルターに濾過して採取した。処理ごと、種ごとに採取した細胞数、ライブラリー調製に失敗したサンプルの詳細については、補足ファイル1cに示した。各珪藻種の9サンプルは、同じ日時にまとめてサンプリングした。フィルターは液体窒素でスナップ冷凍し、抽出まで80℃で保存した。Zymo Direct-zol RNA MiniPrep Plusキットを用いて、0.22 µmのメンブレンフィルターから全RNAを抽出した。RNAはQbitを用いて定量し、サンプルあたり1900 ngをNorthwest Genomics Center（ワシントン大学）に送った。ポリA選択、ライブラリー調製、およびシーケンシングは、Northwest Genomics CenterでIllumina NextSeqと標準プロトコルを用いて行った。シーケンスリードは、TruSeq3-PE.fa:2:30:10:1:true、LeadingおよびTrailingしきい値25、スライディングウィンドートリミングアプローチ（SLIDINGWINDOW）4:15、平均品質レベル（AVGQUAL）20、最小長（MINLEN）60に設定したカットアダプターおよびその他のイルミナ特異的配列（ILLUMINACLIP）でペアエンドモードで実行したTrimomatic 0.39（Bolger et al. リードはHisat2-2.1.0を用いてT. pseudonanaまたはT. oceanicaのゲノムにマッピングした。得られた配列アライメントマップ（SAM）ファイルから、遺伝子モデルにアライメントしたT. pseudonanaとT. oceanicaのリード数を計算し、アライメントした配列を以降の解析に使用し、TPM（transcripts per million）を用いて正規化した。De-novoトランスクリプトームアセンブリは、Amphora、Chaetoceros、Cylindrothecaの分離培養から抽出したRNA配列から作成した。各生物種の品質管理されたRNAシーケンスデータは、Trinity v2.12.0を使用し、デフォルト設定でアセンブルされ、配列はアンマージペアエンドリードとして提供された。アセンブル前のRNAシーケンスリードは、品質管理ステップとしてそれぞれのアセンブルにマッピングされ、すべての培養から得られたリードの少なくとも85%がアセンブルに成功した。アセンブリの結果、Amphoraでは53,401コンティグ、Chaetocerosでは37,507コンティグ、Cylindrothecaでは73,553コンティグが得られた。
edgeRパイプライン(Chen et al., 2010)を用いて、5種すべてについて異なる条件下での転写変化を同定し、MDSプロットで可視化した（図2-図1D）。EdgeRは、対照サンプルと処理サンプルの一対比較に基づき、log2変換した転写産物レベルの差分発現を検出するために使用した。一般化線形モデル（GLM）準尤度F検定（QLTF）を用いて、有意な発現差（p < 0.01、偽FDR < 0.05）を検定した。
T. pseudonanaとT. oceanicaのフラボドキシン遺伝子はゲノムから取得した（遺伝子ID: THAPSDRAFT_28635, THAOC_31152, THAOC_19008, THAOC_16623）。Amphora、Chaetoceros、Cylindrothecaについては、同種、沿岸分離株のフラボドキシン配列を各生物種アセンブリーに対するblastで使用した（tblastn, -evalue 0.001）。クエリーと検出されたフラボドキシン類は補足ファイル2；補足ファスタファイル5に示した。これらのフラボドキシン類はフラボドキシン類の系統樹に存在する（図1B、赤い星印、補足ファイル1b、関連する発現で示す-本研究）。
TpFlav遺伝子
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T. pseudonana flavodoxinの遺伝子配列およびアミノ酸配列は、JGI genome portal (THAPSDRAFT_28635, transcript ID: EED91575)から入手した。
フラボドキシンノックアウトのためのgRNAデザイン
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2つのsgRNAを用いたゴールデンゲートクローニング（Hopesら、2017；Hopesら、2016）と、一過性形質転換および欠失が確認された後のCas9の除去を可能にするバクテリアコンジュゲーション（Karasら、2015）を組み合わせた。FMN結合部位と保存領域を含む〜120ヌクレオチドを切断するように、2つのsgRNAを設計した（図3-図1A）。CRISPR/Cas9ターゲットの選択およびオンターゲットスコアの推定：NGG PAMを有する20bpターゲットを同定し、オンターゲット効率について、(Doench et al., 2014)オンターゲットスコアアルゴリズムを利用するBroad Institute sgRNAデザインプログラム(https://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)を用いてスコア化した。選択されたsgRNAは、オフターゲットが予測されなかった：完全な20 ntの標的配列とその3′12 ntのシード配列は、T. pseudonanaゲノムに対してヌクレオチドBLAST検索にかけられた。結果として得られた相同配列は、3′末端に隣接するNGG PAM配列の存在についてチェックされた。シード配列の外側の8 ntの配列は、標的配列との相補性を手動でチェックした。部位がオフターゲットの可能性があるとみなされるためには、シード配列が一致し、配列の3′末端にPAMが存在しなければならず、シード配列の外側ではターゲットとBLAST検索からの配列との間に最大3つのミスマッチが許容された。
ゴールデンゲートクローニングによるプラスミド構築
詳細なプロトコールを請求する
ゴールデンゲートクローニングは、Graff van Creveld et al., 2021; Hopes et al., 2016に類似したデザインを用いて、既述（Weber et al., 2011）のように実施した。コンジュゲーションを可能にするレベル1（L1）プラスミドは、Irina Grouneva, Mackinder lab, University of York, UKからの親切な贈り物であった（Nam et al.） L1およびレベル2（L2）アセンブリーのためのゴールデンゲート反応は、各成分40fmolを、ライゲーションバッファー中、10ユニットのBsaIまたはBpiIおよび10ユニットのT4 DNAリガーゼを含む20μlの反応に含ませて行った。反応は37℃で5時間、50℃で5分間、80℃で10分間インキュベートした。反応液5μlを50μlのNEB 5αケミカルコンピテント大腸菌に形質転換した。pICH47732:FCP:NAT(Addgene#85984)からプライマー1と2を用いてPCR増幅し(Supplementary file 1e)、pCR8/GW/ TOPOベクター(Thermo Fisher)にクローニングした。FCPプロモーター、NAT、およびFCPターミネーターレベル0（L0）モジュール（Hopes et al. sgRNAスキャフォールドはpICH86966_AtU6p_sgRNA_NbPDS (Nekrasov et al., 2013)から増幅し、sgRNA配列はフォワードプライマーを介して組み込んだ（3-5、補足ファイル1e）。L0 U6プロモーター（pCR8/GW:U6、Addgene #85981 ）とともに、2つのsgRNAをL1目的ベクターpICH47761およびpICH47772に組み込んだ。L1プラスミド中の挿入領域の塩基配列を決定した（6-7, Supplementary file 1e）。L2アセンブリー： L1モジュールとアニーリングしたオリゴヌクレオチド（8-9、補足ファイル1e）をL2デスティネーションベクターpAGM4723-Del（Addgene #112207 ）にアセンブルした。最終プラスミドL2_Conj_Cas_NAT_FlavをコロニーPCRでスクリーニングし、sgRNA領域の塩基配列を決定した（10-12, Supplementary file 1e）。
バクテリアコンジュゲーションによるT. pseudonanaの形質転換
詳細なプロトコール
L2_Conj_Cas_NAT_Flavプラスミドは、以前に記述したように、大腸菌TOP10細胞からのコンジュゲーションによりT. pseudonana細胞に導入した（Karas et al.） oriT含有プラスミドの共役転移に必要なすべての遺伝子を含む動員ヘルパープラスミドpTA-Mobは、Rahmi Lale（Strand et al. 大腸菌pTA-Mobエレクトロポレーションコンピテント細胞（50μl）を100ngのL2_Conj_Cas_NAT_Flavプラスミドで形質転換し、珪藻細胞へのCRISPR/Cas9プラスミドの共役導入に用いた。一晩培養した大腸菌を50 mlのLB +カナマイシン（50 mg l-1）とゲンタマイシン（20 mg l-1）に接種し、37℃で振盪しながらOD600が約0.3になるまで培養した。約40mlを4000rpm、10℃で10分間遠心分離して回収し、400μlのSOCに懸濁した。約9～105個/ml、Fv/Fm 0.57のT. pseudonana細胞を遠心分離（4000 rpm、10分、18℃）により回収した。約8～107個の細胞を500μlのFSWに懸濁した。T. pseudonanaと大腸菌の細胞を混合し、50％FSW L1、0.8％(w/v)、5％LB(v/v)の2枚のプレートにプレーティングした。乾燥後、プレートを30℃の暗所で90分間培養した後、通常の増殖チャンバー（20℃、約100μmol photons-m-2・s-1）に一晩移した。その後、T. pseudonana培地1mlを各プレートに加え、細胞を掻き取った。各プレートの細胞を、50％FSW L1、0.8％(w/v)、ノルセオトリシン50または100 mg-ml-1、0.8％寒天平板（セレクションプレート）の2枚のプレートにプレーティングし、18℃で培養した。コロニーは約2週間後に出現した。
ノックアウト株の選択
詳しいプロトコールはこちら
コロニーはフラボドキシンアンプリコン（プライマー13-14、補足ファイル1e）のサイズについてスキャンされ、WT（676bp）と編集（〜530bp）フラボドキシンの両方を示すダブルバンドを示すコロニー（おそらくヘテロ接合体またはモザイクコロニー）は、100μg-ml-1ノルセオトリシンを含む新鮮な固体培地に再浸漬された。娘コロニーはフラボドキシンアンプリコンのサイズについてスキャンされ、バイアリル編集フラボドキシンを示す単一バンドを示すコロニーがさらに使用するために選択された。WTまたは編集フラボドキシンを示す単一バンドを示すいくつかのコロニーを、数週間非選択培地に移した。細胞を非選択性固体培地に広げ、単一コロニーを摘出し、抗生物質耐性について試験した。非耐性コロニーのフラボドキシン遺伝子の塩基配列を決定し、KOの正確な欠失箇所を特定するか、コントロールとしてDNA編集がないことを確認した（プライマー14-15 補足ファイル1e）。WTと、フラボドキシン遺伝子の欠失のない2つのコロニー（コロニー5と16）を「WT」と呼び、フラボドキシン遺伝子の欠失のある3つのコロニー（9、14、1）を「KO」と呼ぶ。
特定のクルーズのサンプル採集
ディール1
詳細なプロトコールを請求する
サンプルは2015年7月25日から8月5日まで、R/V Kilo MoanaのクルーズKM1513に乗船し、西経156.5°から北緯24.5°の地点で採取した。約7lの海水サンプルを100μmのナイロンメッシュで予備ろ過し、蠕動ポンプを用いて142mmの0.2μmポリカーボネートフィルターに採取した。クルーズは以前に記述されている（Wilson et al., 2017）。クルーズの追加情報と関連データは、オンライン（https://simonscmap.com/catalog/cruises/KM1513）で見ることができる。
勾配1
詳細プロトコルのリクエスト
サンプルは、2016年4月19日から5月3日にかけて、R/V Ka'imikai-O-Kanaloa号、クルーズKOK1606に乗船し、北緯23.5度から37度、西経158度（Juranek et al.）約6～10 lの海水サンプルを200 μmのナイロンメッシュで予備ろ過し、ペリスタルティックポンプを使用して3 μmと0.2 μmのポリカーボネートフィルターで順次ろ過して回収した。本研究では、この2つのサイズ画分を組み合わせて分析した。その他のクルーズ情報と関連データは、https://simonscmap.com/catalog/cruises/KOK1606。
勾配2
詳細プロトコルの請求
サンプルは、2017年5月27日から6月13日にかけて、R/V Marcus G. Langseth号、クルーズMGL1704に乗船し、北緯〜北緯41°、西経158°で採取した（Juranek et al.）約6～10lの海水試料を100μmのナイロンメッシュで予備ろ過し、上記のように採取した。クルーズの追加情報および関連データは、https://simonscmap.com/catalog/cruises/MGL1704。
甲板上での勾配2インキュベーション
詳細プロトコルを請求する
北緯 37 度、西経 158 度で、水深 15m からポリカーボネート製カーボーイに合計 20 l の海水を採取し、甲板上の温度制御インキュベーターで 96 時間培養した。補正剤を添加しなかった3連カーボイを対照とした。4日後、トランセクトサンプルと同じ方法でサンプルをろ過した（Lambert et al.、2022）。
すべてのメタトランスクリプトーム試料は液体窒素で瞬間凍結し、その後さらに処理するまで80℃で保存した。RNA抽出と配列決定は以前に記述した（Durhamら、2019；Lambertら、2022）。簡潔には、抽出および配列決定効率を補正し、1リットルあたりのリード数に対する最終的な正規化を可能にするために使用された、抽出バッファー中の14の内部mRNA標準のセットを用いてRNAを抽出した（Satinskyら、2013）。DNase処理、精製、定量後、真核生物のmRNAをポリ(A)選択し、せん断し、相補的DNAライブラリーの構築に使用した。配列はde novoアセンブルされ、機能的および分類学的に注釈付けされた。Diel 1のメタトランススクリプトームデータはNCBIのSRAからBioProject PRJNA492142、Gradients 1はBioProject PRJNA690573、Gradients 2はBioProject PRJNA690575で入手可能。
環境メタデータの収集と処理
詳細プロトコルのリクエスト
溶存鉄と窒素濃度はGradientsクルーズ中に測定され（Gradoville et al., 2020; Juranek et al., 2020; Park et al., 2022; Pinedo-González et al., 2020）、Simons Collaborative Marine Atlas Project pycmap API (CMAP; https://simonscmap.com/)から取得された。
メタトランスクリプトーム中のフラボドキシン類
フラボドキシン検出・定量バイオインフォマティックワークフローを図5-図1Aに示す。3つのクルーズにおいて、フラボドキシンと相同性を持つ環境メタトランスクリプトームコンティグを、上述のカスタムメイドのhmm-profileに採用した（e < 0.001; hmmsearch）。環境配列をMAFFT（パラメータ：--add --localpair --maxiterate 100 --reorder）を用いてフラボドキシンアラインメント（stramenopile-enhanced、補足ファイル2；補足ファスタファイル3）に整列させ、RAxML進化配置アルゴリズム（EPA；Barbera et al、 2019; parameters: -f v -m PROTGAMMAWAG）。like_weight_ratio>0.8を持つ環境リードのうち、属レベルでクレードIまたはIIのstramenopilesに配置されたもの、またはより特定されたものを保持した（図4-図1）。クレードと属はフラボドキシン参照系統樹から決定した。各サンプルからの1リットルあたりのリードをクレードおよび属レベルまで合計し、以前に記載されたように（Groussman et al., 2021）、NCBI分類学（Buchfink et al., 2015）と連携してDIAMONDのLCAアルゴリズムを用いてLCA（Lowest Common Ancestor）によって決定されたコンティグの分類学的順序のすべてのリードで割った。正規化されたカウントを複製について平均し、2つのサイズ-フラクションを合計した。インキュベーション実験からの短いリードは、kallisto (Bray et al., 2016)を用いてGradients 2からのflavodoxinコンティグに対してマッピングされ、Coesel et al., 2021; Durham et al., 2019と同様に、合成標準を用いて1リットルあたりのリードに正規化された。正規化されたリードは属レベルに集約され合計され、複製は平均され、2つのサイズフラクションは合計された。図5Gでは、リードをクレードごと、属ごとに正規化している。この方法と進行中のステーションとの違いを図5-図1Aに示す。
有意な日周性の決定
詳細なプロトコルのリクエスト
R (Thaben and Westermark, 2014)に実装されたRhythmicity Analysis Incorporating Non-parametric Methods (RAIN)パッケージを用いて、Diel 1コンティグの有意な周期性をGroussmanら, 2021から取得した。RAIN解析のp値はランク付けされ、Benjamini-Hochberg FDR法を用いてFDR < 0.05で補正された。
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データの利用可能性
培養物のシーケンスデータは、アクセッションコードGSE217467でGEOに寄託されている。本研究の結果を裏付けるその他の関連データはすべて、本論文およびその補足ファイルに掲載されている。
以下のデータセットが作成された。
Graff van Creveld S
Coesel S
Blaskowski S
Groussman R
シャッツ M
アームブラスト E

(2022) NCBI遺伝子発現オムニバス
ID GSE217467. 鉄制限および酸化ストレス下における5種の珪藻のトランスクリプトーム
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE217467
以下の既発表のデータセットを使用した。
Durham BP
Carlson AK
Groussman LT
ヒールRD
カインKR
モラレスKR
コーセルRL
モリスSN
インガルスRM
アームブラストAE
バージニアE

(2018) NCBI BioProject
ID PRJNA492142. Diel Eukaryotic Metatranscriptomes from the North Pacific Subtropical Gyre.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA492142
ランバートBSG
シャッツRD
Coesel MJ
ダーラムSN
アルバーソンBP
ホワイトAJ
アームブラストAE
バージニアE

(2021) NCBI BioProject
ID PRJNA690573 北太平洋の真核生物メタトランスクリプトーム（勾配1）。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA690573
ランバートBSG
シャッツRD
Coesel MJ
ダーラムSN
アルバーソンBP
ホワイトAJ
アームブラストAE
バージニアE

(2021) NCBI BioProject
ID PRJNA690575 オンデッキインキュベーション真核生物メタトランスクリプトーム（勾配2）。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA690575
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アルベルティ A
オーリー J
ベノイストン A
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ビットナー L
ボッカラ M
ブルムJR
ブルネ C
ブッセーニ G
カラタラ A
クラウストレ H
コエリョLP
コリン S
ダニエッロ S
ダ・シルバ C
デル・コア M
ドレ H
ガスパリーニ S
ココシュカ F
ジャメ J
ルジューヌ C
ルポワール C
レスコM
リマ-メンデスG
ロンバード F
ルケシュ J
マイレット N
マドゥイ M
マルティネス E
マゾッキ MG
ネウ MB
パズ・イェペス J
プーラン J
ラモンデンク S
ロマニャンJ
ルー S
サルバージョ・マンタ D
サンジュ R
シュペイヒ S
スプロヴィエリ M
砂川 S
タイランディエ V
田中 A
ティリチンL
トロティエ C
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カンデルス＝ルイス S
シアソン S
ディミエ C
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バルガス C
フォロウズ MJ
グリムスレー N
グイディ・L
ヒンガンプ P
カルセンティ E
ソルディーノP
ステマンL
サリバン MB
タリアブエ A
ジンゴーネ A
ガルチャレク L
ダルテンツィオF
テストール P
ノット F
ダルカラMR
ウィンカー P
ボウラーC
イウディコーネ D
アシーナスSG
ボーク P
ボス E
ボウラー C
バルガス C
フォロウズ MJ
ゴルスキー G
グリムスレー N
ヒンガンプ P
イウディコーネD
ジャイヨンO
カンデルス＝ルイス S
カープ＝ボス L
カルセンティ E
クルジッチ U
ノット・F
緒方均
ペサント S
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サルデ C
シエラッキ M
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決定書
アンドリュー・エリス・アレン
査読編集者; カリフォルニア大学サンディエゴ校, アメリカ合衆国
デトレフ・ヴァイゲル
シニアエディター、マックス・プランク生物学研究所、チュービンゲン、ドイツ
アダム・クストカ
査読者：ラトガース大学ニューアーク校
(i)読者の便宜を図るため、プレプリントと一緒に掲載されるようにデザインされた公開レビュー、(ii)以下に示す修正依頼を含む著者への原稿に対するフィードバック。また、編集者がその論文のどこを興味深く、あるいは重要だと感じたかを説明するアクセプトサマリーも含まれる。
査読後の決定通知
珪藻におけるフラボドキシンの2つのクレードの多様な機能が酸化ストレスと鉄の制限を緩和する」という論文を eLife に投稿していただき、ありがとうございます。あなたの論文は2名の査読者によって査読され、査読エディターとシニアエディターのDetlef Weigelによって評価が監督されました。あなたの投稿論文の査読に関わった以下の人物は、身元を明かすことに同意しています： Adam Kustka (Reviewer #1 )。
査読者は互いの査読について議論し、査読編集者はあなたが修正投稿を準備するのを助けるためにこれを起草しました。
重要な修正点

酸化ストレス実験のニュアンスや限界の可能性について、より徹底的な議論が必要である。
強力なキレート剤であるDFBで鉄飢餓を誘導することによる未知の影響の可能性について、より良い議論が必要である。
3）査読者は、十分な対応が必要な他のいくつかの重要な分野を強調している。
査読者1（著者への提言）：
全体的に、私はこの原稿を大いに楽しんだ。
トランスクリプトーム実験に関しては、いくつかの懸念があった。第一に、鉄の制限は強力な鉄キレーターであるデスフェリオキサミンBを添加することで誘導されるが、これでは一貫した成長速度の制限が得られない。パブリックコメントから発展させると、T. pseudonanaではこの結果、（細胞密度測定の分解能の範囲内で）成長が完全に停止する可能性があった。光捕集複合体を持ち、光に曝されているが分裂できない細胞は、鉄制限と同定されるかもしれないが、低鉄分による成長速度制限とは関係のない酸化ストレスを経験している可能性がある。単独で考えれば、表S1で参照した以前の研究では見られなかったフラボドキシンの「低鉄」反応を説明することができる。また、低鉄も対照処理も、トランスクリプトームサンプリング前の数日間、アンフォラの成長をサポートしなかったようである。Chaetocerosの実験は妥当と思われる。
査読者2（著者への提言）：
一般的なコメント：
著者らは、研究の目的がクレードIフラボドキシンの機能を同定することであったとしても、全体として北太平洋ではクレードIフラボドキシンよりもクレードIIの方がはるかに高発現していることに言及すべきである。この点を明確にするために、図S4をメイン原稿に追加し、情報量の少ない別の図に置き換えることができる。例えば、本論文の図4は、鉄濃度の文脈がないため解釈が難しい。鉄濃度のデータ（図5c-fに示されている）がなければ、鉄の制限に対する反応性に関して、クレードIとクレードIIのフラボドキシン発現パターンが続いているかどうかを見るのは難しい。
原稿の最後には、T. oceanicaのクレードIIフラボドキシンのKO変異体も酸化ストレスに感受性があるのかどうかという疑問が残る。
具体的なコメント
193行目：実験では致死量のH2O2を用いた。そのままでは酸化ストレスに対するKO変異体の耐性を漸増的に判断することができないので、用量反応曲線があればより説得力があった。
https://doi.org/10.7554/eLife.84392.sa1
著者からの回答
本質的な修正：
酸化ストレス実験のニュアンスと限界について、より徹底的な議論が必要である。
μM範囲のH2O2の外因性添加が他の酸化ストレス反応に代表的であることを示すPhaeodactylumとT. pseudonanaを用いた先行研究（Graff van Creveld, 2015, Volpert 2018, Mizrachi 2019）に基づいて、外因性H2O2添加を用いたことを結果セクション（L185-188）で明確にした。我々はさらに、査読者の提案に従って、より広い範囲のH2O2濃度を追加した（図S3H）。また、酸化ストレスにおけるクレードIフラボドキシンの役割を強化するためには、酸化ストレスが超最適照射、紫外線照射、生物学的相互作用などの他の環境条件によって引き起こされる今後の研究が必要であることを、考察のセクション（L417-419）で認めた。
強力なキレート剤であるDFBを用いて鉄飢餓を誘導することによる未知の影響の可能性についてのより良い議論。
考察の項（L395-410）に以下の段落を追加した：
"注目すべきことに、我々は、以前に記載されたように（Andrew et al., 2019; Kranzler et al., 2021; Lampe et al., 2018; Timmermans et al., 2001; Wells, 1999）、様々な珪藻において鉄制限を強化するために強力な鉄キレート剤DFBを使用した。ここでは、2つのフラボドキシンクレードの転写が鉄制限に対して異なる反応を示すかどうかを調べるための実験にDFBを用いた。T. oceanicaとT. pseudonanaの結果は、DFBを添加しなかった文献と一致した。T. oceanicaでは、1つのクレードIIフラボドキシンの発現のみが誘導された（図2B-C、Lommer et al.）鉄制限に応答したT. pseudonanaのクレードIフラボドキシンのmRNAの軽微な誘導は、DFBを添加しない低鉄への長期および短期適応の両方で検出された（Goldmanら、2019；Thamatrakolnら、2012）。このフラボドキシンには日周調節があるようで、観察された誘導は概日時間や日周期の設定に特異的かもしれない（Goldman et al., 2019）。"
3）査読者は、十分に対処しなければならない他のいくつかの重要な領域を強調している。
査読者のコメントに対しては、以下の点から点への回答で対応した。
査読者#1（著者への提言）：
全体的に、私はこの原稿を大いに楽しんだ。
トランスクリプトーム実験に関していくつか懸念があった。第一に、鉄の制限は強力な鉄キレーターであるデスフェリオキサミンBを添加することで誘導されるが、これでは一貫した成長速度の制限が得られない。パブリックコメントから発展させると、T. pseudonanaではこの結果、（細胞密度測定の分解能の範囲内で）成長が完全に停止する可能性があった。光捕集複合体を持ち、光に曝されているが分裂できない細胞は、鉄制限と同定されるかもしれないが、低鉄分による成長速度制限とは関係のない酸化ストレスを経験している可能性がある。単独で考えれば、表S1で参照した以前の研究では観察されなかったフラボドキシンの「低鉄」反応を説明できる可能性がある。
ご丁寧なコメントに感謝する。パブリックレビューへのコメントに記載したように、鉄制限に応答して異なる珪藻分離株が2つのフラボドキシンクレードを転写するかどうかを決定するために、珪藻の「調査」実験でDFBを使用したことを原稿に追加した（L177-179）。T. pseudonanaのWT株とKO株の反応を比較した実験では、DFBを使用せず、代わりに細胞を鉄を添加しない培地に希釈した。強力な鉄キレーターや人工海水を用いないこのマイルドな鉄制限でも、T. pseudonanaは数日後に成長が止まった（図S3F）。さらに、我々の結果は、Thamatrakolnら、2012、Goldmanら、2019（L395-410）を含む他の研究と一致している。
また、低鉄処理も対照処理も、トランスクリプトームサンプリング前の数日間、アンフォラの成長をサポートしなかったようである。Chaetocerosの実験は妥当であると思われる。
アンフォラは、フローサイトメトリーによる細胞数カウントには適さない、細胞の塊／短い鎖を形成していた。この追加情報を修正原稿（L531-534）に追加しました：
「アンフォラ細胞は細胞塊を形成しており、フローサイトメーターによる正確な細胞数カウントは不可能であった。しかし、Fv/Fmの測定結果から、サンプリング時の鉄欠乏細胞は健全であったことがわかる。"
査読者2（著者への提言）：
一般的なコメント：
著者らは、研究の目的がクレードIフラボドキシンの機能を同定することであったとしても、北太平洋ではクレードIフラボドキシンよりもクレードIIフラボドキシンの方がはるかに高発現していることに言及すべきである。この点を明確にするために、図S4をメイン原稿に追加し、情報量の少ない別の図に置き換えることができる。例えば、本論文の図4は、鉄濃度の文脈がないため解釈が難しい。鉄濃度のデータ（これは図5c-fに示されている）がなければ、鉄制限に対する反応性に関して、クレードIとクレードIIのフラボドキシン発現パターンが続いているかどうかを見るのは難しい。
我々は、結果（L268-270）に記載されているように、クレードIとIIの転写産物量の違いに関する査読者の評価に同意する：
「2つのフラボドキシンクレードのコンティグが3つの探検隊すべてのメタトランスクリプトームから検出され、特にグラディエント1と2のトランセクトに沿って、クレードIIのフラボドキシンのコンティグの数と系統学的多様性が多かった（図4B）。
北太平洋におけるクレードIとクレードIIの発現量の違いについて、考察（L420-422）に追記しました：
"クレードI遺伝子がクレードII遺伝子よりも桁違いに低いレベルで転写されるという観察結果は、培養においても北太平洋においても、異なる転写制御がクレードIフラボドキシンを制御している可能性を示唆している..."
図4Bは、図S4を要約しているので、メイン図にとどめるべきだと考える。図4Bは図S4に比べてシンプルで読みやすく（ラベルが大きい）、定量的であるため、本文に適している。両図とも、3つの異なる探検隊によって北太平洋で検出されたフラボドキシン類の分類とクレードを示している。査読者が述べたように、鉄濃度に関連するフラボドキシン発現の詳細は図5に示されている。
図4Aは、図4Bと図5に対して、サンプリング海域と異なる探検隊の相対的な位置、および甲板上でのインキュベーションの状況を示している。
原稿の最後には、T. oceanicaのクレードIIフラボドキシンのKO変異体も酸化ストレスに感受性があるのではないかという疑問が残る。
われわれもそう思うし、この変異体が欲しいと思っている！しかし、T. oceanicaの形質転換は（まだ）確立されていない。新しい形質転換系の確立は、今回の原稿の範囲外である。
具体的なコメント
193行目：実験では致死量のH2O2を使用した。このままではKO変異体の酸化ストレスに対する耐性が漸増するのか判断できないので、用量反応曲線があればより説得力があった。
ご指摘ありがとうございます。ご要望のあったH2O2に対する用量反応を行い、0, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250 µM処理におけるWTとKOの反応を含む新しい図S3Hを追加しました。
https://doi.org/10.7554/eLife.84392.sa2
論文および著者情報
著者詳細
Shiri Graff van Creveld
ワシントン大学海洋学部、シアトル、米国
貢献
概念化、データキュレーション、形式分析、調査、視覚化、方法論、執筆（原案）、執筆（校閲・編集
競合利益
このORCID iDは、この論文の著者を特定するものである。
サシャ・N・コーセル
ワシントン大学海洋学部、シアトル、米国
貢献
方法論、執筆-原案、執筆-校閲・編集
競合利益
このORCID iDは、この論文の著者を特定するものです。
スティーブン・ブラスコウスキー
ワシントン大学海洋学部、シアトル、米国
分子工学大学院プログラム、ワシントン大学、シアトル、ワシントン州、シアトル、アメリカ合衆国
貢献
データキュレーション, ソフトウェア, 執筆 - 査読と編集
競合利益
このORCID iDは、この論文の著者を特定するものです。
ライアン・D・グラウスマン
ワシントン大学海洋学部、シアトル、米国
貢献
データ管理、ソフトウェア、調査、執筆 - 査読および編集
競合利益
このORCID iDは、この論文の著者を特定するものです。
ミーガン・J・シャッツ
ワシントン大学海洋学部、シアトル、米国
貢献
調査
競合利益
このORCID iDは、この論文の著者を特定するものです。
Eヴァージニア・アームブラスト
ワシントン大学海洋学部、シアトル、米国
貢献
構想、監修、資金獲得、執筆-原案、執筆-校閲・編集
コレスポンデンス
armbrust@uw.edu
競合利益
このORCID iDは、この論文の著者を特定するものです：0000-0001-7865-5101」。
資金提供
サイモンズ財団 (426570SP)
Eヴァージニア・アームブラスト
サイモンズ財団(721244)
バージニア・アームブラスト
資金提供者は、研究デザイン、データ収集と解釈、論文投稿の決定には関与していない。
謝辞
R/V Kilo Moana、R/V Kaimikai O Kanaloa、R/V Langsethの乗組員および科学関係者、ならびにSimons Collaboration on Ocean Processes and Ecology (SCOPE)プログラムの運営スタッフの後方支援に感謝する。甲板上での孵化を手伝ってくれたBryn Durham、生理学的測定を手伝ってくれたAidan DeHan、有益な議論を提供してくれたZinka Bartolekに感謝する。本研究は、サイモンズ財団からの助成金（SCOPE Award ID 721244 to EVA）により実施された。
シニアエディター
Detlef Weigel、マックス・プランク生物学研究所、チュービンゲン、ドイツ
査読編集者
Andrew Ellis Allen, カリフォルニア大学サンディエゴ校, アメリカ合衆国
査読者
アダム・クストカ、ラトガース大学ニューアーク校
出版履歴
プレプリント掲載 2022年10月21日（プレプリントを見る）
受理 2022年10月23日
受理受理：2023年6月5日
受理原稿公開 2023年6月6日（第1版）
記録版発行 2023年6月22日（第2版）
著作権
© 2023, Graff van Creveld et al.
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