ヒト1型糖尿病における腸管粘液層の変化は、ディスバイオシスおよび免疫調節異常と相関している

2023年4月17日 14:49

マルタ・ロ・コンテ
イリア・コソリッチ
ロベルト・フェラレーゼ
マルティナ・アントニーニ・チェンチッキオ
アンジェリカ・ノビリ
ヴィットリア・パルミエリ
ら
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オープンアクセス公開日:2023年4月14日DOI:https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2023.104567
概要
背景
1型糖尿病（T1D）の前臨床モデルでは、腸管バリア（GB）の完全性が、常在細菌叢と免疫細胞間のクロストーク異常の回避や自己免疫の予防に重要である。腸管バリアは、腸管上皮バリア（IEB）と、免疫寛容の維持に重要なムチンや抗菌ペプチド（AMP）を含む粘液層で構成されています。T1Dの前臨床モデルでは、GBの変化は主に粘液層に影響する。ヒトのT1Dでは、腸管透過性の増大とIEB損傷が証明されているが、粘液層の完全性については評価されていない。
研究方法
T1D患者および健常対照者（HC）の腸管組織において、リポポリサッカライド結合蛋白（LBP）や骨髄分化蛋白2（MD2）などのIEB損傷や細菌移行の血清学的マーカー、タイトジャンクション蛋白、ムチン、AMPのmRNA発現を測定しGB完全性を評価しました。同時に、腸組織の免疫学的プロファイリングと粘液関連腸内細菌叢（MAGM）の16S rRNA解析を実施した。
研究成果
我々のデータは、T1D患者において、粘液層の変化、いくつかのムチン（MUC2、MUC12、MUC13、MUC15、MUC20、MUC21）およびAMP（HD4およびHD5）のmRNA発現の低下を伴うGB障害を示す。粘液層の変化は、Bifidobacterium dentium、Clostridium butyricum、Roseburia intestinalisなどの短鎖脂肪酸（SCFA）産生菌の相対存在量の減少と相関し、ムチン発現や腸管免疫恒常性を制御していた。また、T1D患者では、Tヘルパー（Th）1、Th17、TNF-α+ T細胞などのエフェクターT細胞の割合が高く、腸管免疫の調節不全が見られました。
解釈
我々のデータは、粘液層の変化がT1D被験者に存在し、ディスバイオシスおよび免疫調節異常と関連していることを示している。
資金提供
若年性糖尿病財団（MFにGrant 1-INO-2018-640-A-N、JDに2-SRA-2019-680-S-B）およびイタリア保健省（MFにGrant RF19-12370721）から研究助成を受けた。
キーワード
ムチンについて
抗菌ペプチド
マイクロビオタ
免疫異常
自己免疫性糖尿病
文脈の中の研究
はじめに
ヒトおよび前臨床モデルでの研究により、腸内環境と常在細菌叢がT1Dの自己免疫病態を制御していることが明らかにされた
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が、この調節効果の根底にあるメカニズムはほとんどわかっていません。生理的な条件下では、常在する腸内細菌叢は腸管内腔に含まれ、宿主との相互作用は、組織の恒常性を維持し、細菌成分の腸管および末梢組織への移行を防ぐ物理的および生物的バリアによって制御されています。これらの物理的・生物学的バリアは、腸内細菌叢と免疫系とのクロストークを制御する上で重要な役割を担っており、その変化により、腸粘膜の免疫細胞の異常活性化や腸外組織における自己免疫の発生につながる可能性があります。
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この仮説に沿うように、動物モデルにおける最近の研究では、GBの完全性の喪失が、常在腸内細菌叢による島嶼部反応性T細胞の活性化と自己免疫性糖尿病の発生をもたらすことが示されています。
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ヒトでは、β細胞自己免疫（膵島自己抗体陽性）があり、高血糖がない人では、T1Dの臨床的発症前にラクチュロース／マンニトールテストで測定した腸管透過性の上昇が検出可能である、
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このことから、GBの損傷は、糖尿病による代謝の変化に伴う二次的なものではなく、T1Dの病態に直接関係していることが示唆されます。
GBの主な機能は、病原体の侵入を防ぎ、腸内細菌叢（細菌、ウイルス、原虫、真菌）と腸管免疫細胞の間のクロストークを制御しながら、栄養素、水分、電解質の吸収を制御することである。したがって、食物抗原や常在細菌叢だけでなく、膵島などの腸管外組織の抗原を含む自己抗原に対する耐性と免疫の均衡を保つためには、腸管の完全性が重要である。
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GBのこれらの重要な機能は、粘液層とタイトジャンクションで相互接続された上皮細胞の単層からなる複雑な構造、IEBによって維持されています。粘液層は、常在菌が宿主と接触する前に最初に出会うバリアであり、消化管全体を覆っています。粘液は特殊なゴブレット細胞（GC）によって作られ、腸上皮表面を緻密な糖衣で覆い、腸管粘膜を腸管内腔の内容物や常在菌から隔離しています。小腸では、粘液は薄く、細菌種を含む単層で構成されている。大腸の粘液は厚く、小腸の粘液に比べ、内側の無菌区画（細菌がいない）と外側の細菌種が多く生息する区画がある。粘液は腸の健康にとって重要であり、その損傷は腸組織内の細菌の移動につながり、そこから全身循環に移行することになる。重要なことは、粘液層は単なる物理的なバリアではなく、重要な免疫調節作用と抗菌作用を持つ分子の複雑なシステムで構成されていることである。
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とAMPの2種類があります。
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ムチンは、分泌型と膜貫通型の2つに分類される糖タンパク質である。ヒトには5種類の分泌型ムチンが存在するが（MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC19）、
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は、特に小腸の粘液層構造は、GCが産生するMUC2のみで構成されています。
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膜貫通型ムチンは、粘膜上皮の先端面にある糖鎖の重要な構成要素であり、MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC12、MUC13、MUC15、MUC16、MUC17、MUC20、MUC21がある。
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膜貫通型ムチンの組成は、粘液層内の特定の微生物種の存在を制御するのに重要である。なぜなら、多くの常在菌がこれらのムチン糖鎖をエネルギー源として利用するからである。
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したがって、膜貫通型ムチンの変化は、腸管粘液層に存在する細菌種、いわゆる粘液関連腸内細菌叢（MAGM）の改変に関与していると考えられる。また、ムチンは重要な免疫調節機能を担っており、腸粘膜免疫を直接調節し、腸の炎症を予防する。例えば、MUC2は寛容なCD103+樹状細胞の分化を誘導する。
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この考え方に沿って、炎症性腸疾患（IBD）に罹患した人の腸では、粘液層、特にムチンの組成に変化が見られるという。
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T1Dの前臨床モデルでは、粘液層の構造やムチンの組成の変化が検出されていますが、
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が、ヒトのT1Dでは、粘液層の完全性が分析されることはなかった。
AMPは、上皮に近い粘液の強固な層内に集中している。これらの分子は、常在菌の粘膜表面へのアクセスを制限し、宿主免疫細胞との相互作用を制御することにより、内腔の微生物に対する多層的な防御を維持するための基本である。AMPは、腸のすべての上皮細胞で産生されるが、消化管を覆う腸管細胞や小腸のパネス細胞（PC）で最も多く産生される。AMPには、α-ディフェンシン（HD）、カテリシジン、再生膵島由来タンパク質（REG）3などがあり、常在菌の構成、消化管の健全性、腸管粘膜免疫、細菌の移動などを制御する基本となっている。AMPは、ムチンとタイトジャンクションタンパク質（TJP）の発現を促進することにより、GBの完全性を維持します。
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ムチンと同様に、AMPの発現異常は、IBDの免疫制御異常や慢性炎症と関連しています。
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ヒトのT1Dでは、腸の炎症の初期症状が記録されています、
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ディスバイオシスによるものである可能性がある
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とGBインテグリティの損傷につながる。
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しかし、IEBの破損が明確に示されている一方で、粘液層とその構成、そしてそれがヒトT1Dにおける細菌トランスロケーションと腸粘膜免疫にどのように影響するかについてはほとんど知られていない。
ここでは、T1D患者と健常対照者の小腸において、細菌転座の血清学的マーカー、およびIEBと粘液層の成分（ムチンとAMP）のmRNA発現レベルを分析することにより、GBの完全性を解析しました。T1D患者では、血清学的なゾヌリンレベルの上昇により、IEBの損傷の存在を確認した。さらに、T1D患者において、細菌転移している兆候（MD2の血清レベルが高い）と、異なる構造ムチン（MUC2）および膜貫通ムチン（MUC12、MUC13、MUC15、MUC20、MUC21）、AMP（HD5、HD6）のmRNA発現不全による粘液層の組成変化が確認されました。T1D患者における粘液層組成の変化は、MAGM組成の変化と関連しており、特に、短鎖脂肪酸（SCFA）のような耐性代謝物や粘液層の再生を促進する基本的な酵素を放出するBifidobacterium dentium、Clostridium butyricum、Roseburia intestinalisといったいくつかの細菌種の相対存在量の減少が確認されている。我々のヒトT1Dコホートにおける粘液層の変化とディスバイオシスは、免疫調節障害と関連しており、腸粘膜におけるエフェクターTh1、Th17、TNF-α+ T細胞の割合が増加していました。本データは、T1D患者において、物理的・生物学的な腸管バリアの変化が存在し、粘液調節細菌のディスバイオシスや免疫調節障害と関連していることを示唆しています。
研究方法
研究対象者
本研究は、T1D患者 vs 健常対照者の腸内環境を比較した観察的横断研究である。本研究で対象としたT1D患者17名と健常対照者16名（アナグラムデータは補足データの表S1）は、2015年3月から2017年12月の期間にOSR消化器病棟で診断目的（消化不良、胃食道逆流、便通の変化など）で食道・胃・腸内視鏡検査（EGDS）を行った成人男女の方々。T1D患者および健常対照者のいずれも、EGDS検査後に消化器病変と診断されることはありませんでした。2つのコホートでは、年齢について統計的に有意な差は見られませんでした。T1Dの診断は、米国糖尿病学会の基準に基づいて行われた。
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T1D、HCともに除外基準は以下の通り：EGDS前3ヶ月間の抗生物質およびコルチコステロイド治療、胃腸炎、胃潰瘍、過敏性腸疾患（IBS）、IBD、胃がん・大腸がんの臨床歴。本研究に登録された17名のT1D患者のうち5名がセリアック病に罹患しており、17名中3名が最近（6ヶ月未満）T1Dと診断された。すべての患者は白人で、肥満（BMIが18～30）の患者はいなかった。本研究に登録されたT1D患者に関する罹病期間、糖代謝指標（HbA1c）、セリアック病、他の自己免疫疾患を含む併存疾患などの臨床情報は、補足データの表S2に示した。EGDSの際、各T1D患者は、食事がイタリア国民の食事摂取基準値（補足データの表S3）と一致していることを確認するために、3日間の食事アンケートに回答するよう求められた（補足データの表S3）。
試料の収集と処理
すべてのEGDSは、サン・ラファエル病院（OSR）の消化器病棟で実施された。腸の組織片と血液サンプルは、EGDS処置時に各個人から同時に採取された。MAGMは、EGDS処置の開始時に、特定の組織ブラッシャー（Cytology brush, Cook Medical, USA）を用いて腸粘膜を優しくブラッシングすることにより採取した。腸粘膜の組織片は、十二指腸の下降片から採取し、直ちに完全RPMI1640培地（10％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン（100μg／ml）、2mMグルタミン、10mM Hepes、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM非必須アミノ酸、0.05mMβ-メルカプトエタノール含むRPMI1640）に入れて急速に処理しました。RT-qPCRサンプルの調製のために、1つの腸組織断片をRNA後溶液（Invitrogen）に集め、RNA抽出まで-80℃で直ちに凍結した。
単細胞分離（FACS分析）のために、カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス平衡塩溶液（HBSS）中で、1 mmol/Lジチオスレイトール（DTT）および5 mmol/L EDTAと37℃で15分間インキュベートすることによって、粘液および上皮細胞を組織から除去した。組織サンプルをHBSSで洗浄し、カルシウムとマグネシウムを補充したHBSS中の1mg/mlコラゲナーゼA（Roche Diagnostics Ltd., Indianapolis, IN）、および5単位/ml DNase I（Roche Diagnostics Ltd. ）で37℃で1時間消化し、解離が完了するまで穏やかにピペットで機械的に破断した。インキュベーション後、組織サンプルから放出された腸管細胞を70μmのセルストレーナーに通し、完全RPMI1640培地で洗浄した。末梢血単核細胞は血液からFicoll勾配を通して分離し、RPMI1640培地で洗浄した。
腸管バリアー損傷と細菌トランスロケーションの血清学的マーカー
血清サンプルは、室温で1時間インキュベートした後、1600gで10分間遠心分離（Multifuge 3SR centrifuge）して末梢血から得た。血清中のゾヌリン、LBP、MD2の定量測定は、ELISA法を用いた市販のキットを用いて、メーカーの説明書に従って行った。以下の市販キットを使用した：ヒトゾヌリン定量ELISAキット（テクノジェネティクス社）；ヒトMD2定量ELISAキット（シグマ・メルク社）；ヒトLBP定量ELISAキット（バイオメティック社）。
リアルタイムqPCR
EGDS中に採取した十二指腸生検から、100μLのクロロホルムを加え、300μLの70％エタノールで水相を沈殿させ、RNeasy Mini Kit（QIAGEN）を用いてRNAを精製することでRNAを抽出した。RNAはSuperScript III First-Strand Synthesis Systemを用い、製造者の指示に従い再転写を行った（Life Technologies）。ゾヌリン-1（ZO-1）、ゾヌリン-2（ZO-2）、クローディン-1（CLN-1）、オクルディン（OCLN）などの異なるTJPに特異的なプライマーを用いて、SYBR Select Master Mix（Life Technologies）でリアルタイムqPCRアッセイを実施しました、 ViiA 7 Real-Time PCR System（Life Technologies社製）を用いて、ムチン（MUC1、MUC2、MUC3A、MUC4、MUC12、MUC13、MUC15、MUC17、MUC20、MUC21）およびAMP（Reg1α、Reg3α、REG3γ、BD1、BD3、LL-37、HD5、HD6）。すべての遺伝子の発現を参照遺伝子GAPDH（異なるサンプル間で最も低い分散を示した参照遺伝子）に正規化し、結果はΔΔCt法を用いて算出した。ヒト腸管ムチンおよびTJPのプライマーは、Bio-Rad社から購入した。特定のプライマーのヒトAMP遺伝子配列は、National Center for Biotechnology Informationウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）のオンラインBlastプログラムによって決定し、GeneBankデータベースと比較した（Supplement Dataの表S4）。
FACS解析
腸管組織からの単細胞懸濁液を、Golgi Plug（BD Biosciences）存在下、50 ng/ml PMA（Sigma）および1.25 μg/ml ionomycin（Sigma）を含む完全RPMI 1640培地中で4時間刺激した。細胞を1%FBSと0.09%NaN3を含むPBS中で収穫し、Fixable Viability Dye eFlour 506 (eBioscience)で染色した。細胞はまず表面マーカーを染色し（4℃で20分）、次にBD Cytofix/Cytoperm kitを用いて固定・透過処理し（4℃で30分）、最後に細胞内サイトカインを染色した（4℃で25分）。使用した抗体は以下の通りである： APC-Cy7コンジュゲート抗ヒトCD3（RRID: 15829228, BD Biosciences）、Pe/Texas Redコンジュゲート抗ヒトCD4（RRID: AB_10371766, Thermo Fisher）、eFluor 450コンジュゲート抗ヒトインターフェロン（IFN）-γ（RRID：AB_2043866、eBioscience）、APC コンジュゲート抗ヒトインターロイキン（IL）-17A (RRID： AB_1724136、eBioscience）、PEコンジュゲート抗ヒトIL-22（カタログ番号：IC7821P、R&D Systems）、Alexa Fluor-488コンジュゲート抗ヒトIL-4（RRID：AB_493324、BioLegend）、PE-cy7コンジュゲート抗ヒト腫瘍壊死因子（TNF）-α（RRID：AB_1727578、BD Biosciences）、PercP／Cy5． 5コンジュゲート抗ヒトIL-10（クローンJES3-9D7 BioLegend）である。データはLSRFortessaセルアナライザー（BD Biosciences）を用いて取得し、FCS Express V4ソフトウェア（De Novo Software）を用いて解析した。Th1細胞（CD3+CD4+IFN-γ+）、Th17細胞（CD3+CD4+IL-17+）、Th22細胞（CD3+CD4+IL-22+）、Th2細胞（CD3+CD4+IL-4+）、TNF-α+T細胞（CD3+CD4+TNF-α+）、Tr1細胞（CD3+CD4+IL-10+）を確認しました。ゲーティング戦略については補足図S1を参照。
マイクロバイオームシーケンス
ヒトマイクロバイオームシーケンスは、Illumina Miseqプラットフォーム（Illumina）を用いた16Sアンプリコンシーケンスにより実施した。全DNAは、EGDS中に採取した十二指腸のブラッシュ材から、QIAamp DNA Micro kit（Qiagen）を用いて、製造者の指示に従い精製した。16S rRNA遺伝子のV3-V4領域は、FastStart High Fidelity PCR System（Roche）、バーコード付きサンプル特異的プライマー：［V3-16S-Fw：CCT ACG GGN GGC WGC AG；V4-16S-rev：GAC TAC HVG GGT ATC TAA TCC］を用いて抽出した500 ngから増幅されました。以下のサイクリング条件を採用した： 94℃、2分、35サイクル（94℃、30秒、56℃、30秒、68℃、1分）、その後、使用するまで4℃で保存した。アンプリコンはAMPure XPビーズ（Beckman Coulter, Brea, USA）を用いて精製した。各サンプルにイルミナシーケンスアダプターを追加するために、2回目のPCRステップを実施した。Nextera xt Index Kit (Illumina) とKAPA HiFi HotStart PCR kit (KAPA Biosystem) を使用し、以下の増幅プロトコルで行った： 95 ℃ 3 分、（95 ℃ 30 秒、55 ℃ 30 秒、72 ℃ 30 秒、72 ℃ 4 分）を 8 サイクル行い、4 ℃で保存した。精製したDNAは、Qubit Fluorometer（Thermo Fisher）および20,100 Bioanalyzer System（Agilent）を用いて定量した。16S rRNAデータのメタゲノム解析のために、微生物のリードをBMTagger (ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/agarwala/bmtagger/) で人間のリードと識別した。種/科/目レベルでの解析を行うため、Kraken2を用いてリードをcollection of all available genomes (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)にマッピングし、k-merの正確なアライメントと正確なリード分類を行いました。
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統計解析
2群（T1DとHC）間の差の統計的有意性は、ノンパラメトリックなMann-Whitney U testで計算し、平均値±SDで表した。統計解析にはGraphPad Prism, version 8.0 (GraphPad Software, San Diego, CA)を使用し、p≦0.05の値を統計的に有意とした。検出力解析は、腸管免疫細胞サブセットに関する過去のデータに基づいて算出した
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とαの多様性
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は、T1D患者対HCの場合。グループサンプルサイズは17（T1D）と16（HC）で、Mann-Whitney Uテストを用いて、集団の効果量が1.00で有意水準（α）が0.050の場合、効果量ゼロの帰無仮説を棄却する80.00%の検出力を達成できると予想した。
16S rRNAデータの相対存在量プロファイリングと差分解析は、DESeq2を用いて分散安定化変換を行った上で実施した、
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ここで、p≦0.05は統計的に有意であるとみなした。分散安定化変換アルゴリズムを使用した。
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この関数は，適合した分散と平均の関係から分散安定化変換を計算し，カウントデータ（サイズ係数または正規化係数で分割して正規化）を変換し，ほぼホモスケダス（平均値の範囲内で一定の分散を持つ）値の行列を生成する．この変換は、ライブラリサイズに関しても正規化されます。種のアルファ多様性は、vegan::diversity (https://cran.rproject.org/web/packages/vegan)で計算した。シャノン指数とシンプソン指数は、特定の集団内の種の比例した存在量から多様性を外挿するものである。可視化にはggplot2
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とクローナです。
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ノンパラメトリック多変量解析は、ggstatplot Rパッケージ（https://joss.theoj.org/papers/10.21105/joss.03167）を用い、有意水準＝0.05、信頼水準＝0.95、多重比較p値調整はボンフェローニ・ホルム法で実施した。
倫理について
すべての人が書面によるインフォームドコンセントに署名し、研究手順を遵守し、研究目的のために腸管組織片および血液サンプルを提供することを認識していた。本研究は、2014/10/02にIRCCS San Raffaele Scientific InstituteのInstitutional Ethical Committee（プロトコル：T1D-GUT2014）（イタリア、ミラノ）により承認されました。
資金提供者の役割
本研究は、若年性糖尿病財団からの研究助成金（MFに助成金1-INO-2018-640-A-N、JDに2-SRA-2019-680-S-B）およびイタリア保健省（MFに助成金RF19-12370721）により支援されています。資金提供者は、研究デザイン、データの収集・分析・解釈、報告書の執筆、論文の投稿の決定には一切関与していない。私は、この論文を書くために、製薬会社やその他の機関から報酬を受け取っていない。著者は、本試験におけるデータへのアクセスを妨げられることはなく、出版に向けた投稿の責任を負う。
結果
T1D患者におけるGBと粘液層の組成の変化
T1Dの患者および前臨床モデルにおけるβ細胞自己免疫の発症は、腸管透過性の亢進に伴うGBの損傷に先行している。
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GBは、タイトジャンクション、アドヒアレントジャンクション、デスモソームからなる複雑な接合系によって保持された上皮細胞の単層であるIEBと、腸内細菌叢と免疫系とのクロストークを制御するために重要な分子であるムチンやAMPを含む粘液層で構成されています。ヒトT1Dを対象とした先行研究では、IEBの損傷が報告されているが、粘液層の完全性については分析されていない。そこで、T1D患者と健常対照者のコホートにおいて、GBの両構成要素であるIEBと粘液層の完全性を評価した（図1a）。IEBの完全性は、T1D患者と健常対照者の小腸組織サンプルにおいて、血清学的なゾヌリンレベルと構造的TJPのmRNA発現を測定することで評価された。ゾヌリンは、病原体や大腸菌などの常在菌との相互作用や、グリアジンなどの食事性タンパク質がCXCR3受容体を介してIECから放出される内因性タンパク質である。
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血清中のゾヌリンの存在は、タイトジャンクションの分解と「リーキーガット」の生物学的マーカーである。今回のデータは、T1D被験者において、健常対照者と比較して血清中のゾヌリンレベルが上昇するというこれまでの知見を裏付けるものでした（＊＊＊＊p ≤ 0.001, Mann-Whitney U test）（図1b）。IEBの損傷は、細菌成分の血液循環への無制限な通過につながる可能性がある。後者のシナリオは、T1D患者において、リポポリサッカライド結合タンパク質であり、TLR4と活性複合体を形成して炎症性サイトカインの産生につながる骨髄分化タンパク質2（MD2）の血清レベルが上昇しているという発見によって示唆されました。
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(＊p≦0.05、Mann-Whitney U test)（図1b）。また、小腸で発現するTJP、特にバリア形成TJPであるCLN1、OCLN、ZO-1、ZO-2のmRNA発現量の差をRT-qPCRで測定し、IEBの完全性を評価した。その結果、T1DサンプルではOCLNのmRNA発現が増加した以外は、TJPの変化は認められず、T1D患者におけるGBの完全性を回復するための代償機構を示す可能性が示された（図1c）。
図1T1D患者におけるIEBの損傷と細菌の転位。(a) 研究デザイン。EGDS中に十二指腸粘膜を軽くブラッシングし、粘液関連腸内細菌叢（MAGM）を収集した。その後、TJPs、ムチン、AMP mRNA発現のqRT-PCRと腸管免疫細胞のFACS解析のために、腸管組織片を2-3個収集した。また、EGDS時に同じ個体から末梢血のアリコート（4-5ml）を採取し、細菌転座のマーカーの血清学的分析を行った。(b）T1D患者（n＝17）およびHC（Ctrl、n＝16）におけるゾヌリン、リポポリサッカライド結合タンパク質（LBP）およびミエロイド分化2（MD2）の血清学的レベルを、ELISAアッセイによって測定した。(c）T1D患者（n＝17）およびHC（n＝16）のヒト十二指腸サンプルにおけるTJP遺伝子発現ZO-1、ZO-2、CLNおよびOCLNのリアルタイムqRT-PCR分析。Relative Abundance [A.U.]は、ΔΔCT法を用いて算出した。すべてのデータは、平均値±SDで表される。∗Mann-Whitney U testにより、＊p≦0.05；＊＊p≦0.01；＊＊＊＊p≦0.001。
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粘液層は、細菌の移動を防ぎ、腸粘膜を保護するための基本的な腸バリアの重要な構成要素である。T1Dの自然発症モデルである非肥満性糖尿病マウス（NOD）では、最近、粘液の構造と組成の変化が示され、β細胞自己免疫の活性化とT1Dの発生に関連することが明らかになりました。
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我々は、小腸粘膜におけるいくつかのムチンとAMPのmRNA発現を測定することにより、ヒトT1D患者における粘液層の完全性を評価した。RT-qPCR解析の結果、T1D患者では健常対照者と比較して、構造的ゲル形成ムチンであるMUC2（＊p≦0.05、Mann-Whitney U test）を含む各種ムチンが統計的に有意に減少していることが判明した。 05, Mann-Whitney U test）、MUC12、MUC13、MUC15、MUC20、MUC21などの膜貫通型ムチン（MUC12は＊＊p≦0.001、MUC13、MUC15、MUC21は＊＊p≦0.01、MUC20は＊p≦0.05、MnWitney U test）、など様々なムチンが、健常対照者と比較して、有意に減少していました（図1a）。また、α-ディフェンシン5（HD5）とα-ディフェンシン6（HD6）という2つの重要なAMPのmRNA発現が有意に低下したことも検出された（＊＊＊p：HD5≦0.001、＊＊p≦0. 01 for HD6, Mann-Whitney U test）、T1D被験者では健常対照と比較して、BD1、BD3、LL-37（hCAP18、ヒトカチオン性抗菌タンパク質のペプチド）、Reg1α、Reg3αなどの他のAMPには変化がなかった（図2b）。
図2T1D被験者におけるムチンとAMPのmRNA発現量の減少。(a) T1D患者（n = 17）と健常対照（HC、n = 16）のヒト十二指腸サンプルにおけるいくつかのムチン（MUC1-4、MUC12-13、MUC15、MUC17、MUC20-21）の遺伝子発現のリアルタイムqRT-PCR分析。(b）T1D患者およびHCのヒト十二指腸サンプルにおけるヒトHD5、HD6、BD、Reg3、およびLL-37（hCAP18、ヒトカチオン性抗菌タンパク質のペプチド）のAMP遺伝子のリアルタイムqRT-PCR解析。すべてのデータは、平均値±SDで表されます。∗Mann-Whitney U testにより、＊p≦0.05；＊＊p≦0.01；＊＊＊＊p≦0.001。
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T1D患者の粘膜関連微生物群における酪酸産生菌の相対存在量の低下と粘液層の変質が関連していること
粘液層の完全性は、腸内常在細菌叢を調節する上で重要な役割を担っている。例えば、膜貫通型ムチンの組成は、糖鎖をエネルギー源とし、腸粘膜に近接した粘液層に存在する選択された微生物種（すなわち、粘液関連腸内細菌叢：MAGM）の存在を調節する。重要なことは、粘液の完全性がMAGMの組成に影響を与えるだけでなく、いくつかの微生物種が粘液の産生と機能を制御できることである。T1D患者における粘液層の変化を発見した我々は、MAGMもまた調節不全に陥っているのかどうかを問いました。この疑問に答えるため、T1D患者と健常対照者の十二指腸の腸粘膜をEGDS処置中に優しくブラッシングして粘液層に存在する細菌種を採取し、16S rRNA分析により細菌組成を解析しました。まず、T1D患者と健常対照者の間で、細菌の多様性と優位性が低下したリッチネスが検出されました（図3a）。これは、T1D vs HCの糞便から分離した腸内常在細菌叢で検出されてきたものと同様です。
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,
38
さらに、T1D患者と健常対照者のMAGM間で発現が異なる細菌種を79種発見し、T1D被験者では55種が増加、24種が減少した（図3bおよび補足データの表S5）。特に、T1D患者で相対量が減少した24菌種のうち19菌種がSCFA産生菌（酪酸、プロピオン酸、酢酸）であった（Supplementary DataのTable S5）。その中でも、生存に粘液層の完全性に厳密に依存し、その再生に重要な酪酸産生偏性嫌気性菌3種、Bifidobacterium dentium、Clostidrium butyricum、Roseburia intestinalis（∗p ≤ 0.05, DESeq2統計検定）の相対量が統計的に有意に減少していた（図3c）。
図3T1D被験者の粘液関連微生物叢におけるSCFA産生菌の相対存在量の減少。EGDS中に小腸粘膜から分離したブラッシュ材の腸内細菌叢プロファイルを、細菌DNAの16S Amplicon Sequencingで評価した。(a)T1D対HCにおける種αの多様性と優越性。(b) T1DとHCのMAGM間で発現が異なる79の細菌種は、T1D vs HCで55種が増加、24種が減少していた。粘液再生に重要な働きをする3つのSCFA産生菌、Bifidobacterium dentium、Clostridium butyricum、Roseburia intestinalisは、T1D患者においてHCと比較して有意に減少していた（青い点）ことが分かった。16S rRNAデータの相対存在量プロファイリングと差分解析は、DESeq2を用いて分散安定化変換を行った上で実施した、
31
ここで、p≦0.05は統計的に有意であるとみなした。
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T1D患者における粘液層の完全性の喪失は、腸管免疫ホメオスタシスの変化と相関する
粘液層の構成と腸管粘膜免疫の間には、双方向の制御が存在する。腸管粘膜に細菌が侵入して粘液層が損傷すると、免疫細胞が異常に活性化され、炎症性表現型が獲得される可能性がある。粘液層に存在し、膜貫通型ムチンに依存して生存する常在菌は、SCFAなどの耐性代謝物を放出することにより、免疫恒常性の維持に寄与する。一方、腸管免疫細胞は、炎症性サイトカインを放出したり、GCやPCなどのムチンやAMPを産生する腸管細胞の機能を直接調節することで、GBの完全性に影響を与えることがあります。ここでは、T1D患者コホートにおいて、粘液層の変化が腸管免疫のホメオスタシスの喪失や炎症性免疫プロファイルと関連しているかどうかを検証した。T1D患者および健常対照者の腸管粘膜免疫を解析するために、十二指腸生検から分離した単一細胞懸濁液に対してマルチパラメトリックFACS分析を行った。その結果、T1D患者の腸では、健常対照者と比較して、Th1細胞（CD4+IFN-γ+）、Th17細胞（CD4+IL-17+）、TNF-α+ T細胞を含むいくつかのエフェクターT細胞サブセットの割合が著しく増加していた（図4）（∗∗p ≤ 0.005 for Th1 and Th17 cells and∗p ≤ 0.05 for TNF-α+ T cell, Mann-Whitney U test）．また、T1D患者の腸管粘膜では、腸管粘膜の免疫制御や組織修復機能を担うサブセットであるTh2（CD4＋IL-4＋）細胞の減少も検出された
39
,
40
(＊＊p≦0.01、Mann-Whitney U test)。IL-22+（IL-22+CD4+）とTr1（IL-10+CD4+）細胞の相対割合については、T1D患者と健常対照との間に差は検出されませんでした。Tエフェクター細胞の頻度の増加は、T1D患者の腸管免疫細胞で観察されたが、末梢血単核細胞（PBMC）では観察されなかった（データ示さず）。しかし、腸管免疫細胞で見られたのと同様に、Th2細胞（CD3+CD4+IL-4+）の減少が見られた（データ示さず）。腸管免疫細胞サブセットの差異、潜在的交絡因子（年齢、性別）、T1D患者で変化する他の腸管関連パラメータ（ゾヌリン、MD2、HD5、HD6、MUC2、MUC12、MUC20、MUC21）の相関関係を見つけるために多変量解析を実施しました。我々のデータ（補足データの図S2）では、年齢/性別と、T1D患者における腸内変化の検査済みバイオマーカーのいずれにも相関がないことが示されている。
図4 T1D患者における粘液層組成の変化は、腸管免疫調節異常と相関している。T1D患者および健常対照者の腸生検から分離した単一細胞懸濁液をFACS分析した。データは、CD3+CD4+T細胞全体のうち、異なるT細胞サブセットのパーセンテージで表される。T1D被験者の腸において、Th1（CD3+CD4+IFN-γ+）、Th17（CD3+CD4+IL-17+）、TNF-α+（CD3+CD4+TNF-α+）、Th22（CD3+CD4+IL-22+）、Tr1（CD3+CD4+ IL-10+ ）、Th2（CD3+CD4+IL-4+）細胞を健康コントロールと比較してみた。T1D患者の腸粘膜では、INF-γ+ Th1、IL-17+ Th17、TNF-α+ T細胞のエフェクターが増加し、IL-4+ Th2細胞は減少したことが検出されました。すべてのデータは、平均値±SDで表されます。∗Mann-Whitney U testにより、＊p≦0.05；＊＊p≦0.01；＊＊p≦0.005とした。
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ディスカッション
ヒトやT1Dの前臨床モデルにおいて、免疫の恒常性を維持し、自己免疫疾患を予防するためには、腸管だけでなく膵島のような遠位臓器においてもGBの完全性が重要であることを示す証拠が増えつつある。この考え方に沿って、腸管透過性の増大は、ヒトでも臨床的なT1Dの発症に先行する。
7
や動物モデルで使用されています、
5
,
41
,
42
このことから、腸管の損傷は、T1Dの自己免疫病態とメカニズム的に関連していることが示唆される。ヒトのT1Dでは、腸の炎症とGBの完全性、特に腸の上皮バリアの損傷の兆候が大きく記録されている。
24
,
43
,
44
,
45
例えば、初期の研究では、T1D患者だけでなく、β細胞自己免疫を持つが高血糖を持たない糖尿病予備軍においても、ラクチュロース/マンニトールテストによる腸管透過性の上昇が報告された。
7
T1D患者の50％とその一親等の血縁者の25％の血清中にゾヌリンレベルの上昇が検出された研究により、GBの完全性の破壊が確認されました。
8
Zonulinは、細胞間タイトジャンクションを分解することで腸管透過性を調節する内因性タンパク質であるため、血清中に検出された場合、IEBの完全性を損なうバイオマーカーとみなされる。
46
しかし、バリア形成TJPであるCLN1、OCLN、ZO-1、ZO-2といったIEBの構造タンパクのmRNA発現に異常は認められなかった。免疫恒常性の維持に重要であり、自己免疫性糖尿病の前臨床モデルで変化する粘液層は、ヒトのT1Dでは研究されていない。T1Dの自然発症前臨床モデルであるNODマウスにおけるGBの完全性の喪失は、特にIEBよりも粘液層に影響を与える。
5
T1D患者の腸組織では、粘液層構造の維持に重要なゲル形成性ムチンMUC2、有益な常在菌による粘液層のコロニー形成を制御する膜貫通型ムチンMUC12、MUC13、MUC15、MUC20、MUC21を含むいくつかのムチンのmRNA発現レベルの著しい低下が検出された。
16
また、ムチンのmRNA発現量の減少に加え、AMP HD5とHD6のmRNA発現量も減少していることから、T1D患者集団では、抗菌活性を含む粘液層の生物学的機能全般が変化していることが明らかになりました。このデータは、T1D患者の血清中の2つのAMP、ヒトカテリシジンAMP（CAMP）とヒトβディフェンシン1（BD1）の減少を示した過去の文献と一致している。
47
T1Dの前臨床モデルで以前行われた粘液層構造の生体外での定性分析によって、RT-qPCRデータを検証することはできなかった
5
というのも、EGDSで腸管組織を採取すると、粘液層のほとんどが破壊され、その構造を正しく可視化することができないからです。しかし、ムチンとAMPsのmRNA発現量の減少に関する我々のデータは、前臨床モデルで発見された粘液層組成の異常がT1D患者にも存在することを示唆している。
T1D患者における粘液層組成の変化は、遺伝的あるいは環境的な要因に関連している可能性がある。実際、粘液層の完全性、ムチンとAMPの放出は、いくつかの観察から示唆されるように、腸内細菌叢によって制御されている。例えば、無菌マウスでは粘液層が変化しているが、マウス常在菌のコロニー形成により正常化される。
48
粘液常在菌が放出する細菌性グリコシダーゼは、まずムチン糖鎖を分解し、次にムチンタンパク質骨格を攻撃し、粘液の再生と完全性の基礎となっている。また、Clostridium butyricumやRoseburia intestinalisなどの粘液常在菌は、粘液層のグリコシル化プロファイルを調節するために必要なグリコトランスフェラーゼを分泌している。また、粘液常在菌は、ムチンの放出を促進し、粘液層の完全性を維持するために重要なSCFAなどの主要代謝産物を産生する。
49
,
50
例えば、SCFAである酪酸は、GCによるMUC2の発現と分泌をアップレギュレートし、粘液のグリコシル化を増加させ、タイトジャンクションの集合を誘導する。
51
したがって、T1D患者の腸粘膜で発見され、T1D患者の糞便サンプルでも以前に検出された粘液抵抗性細菌、特にSCFA産生細菌の変化は、T1D患者の腸粘膜で発見されました。
38
,
52
,
53
,
54
は、我々のT1D患者コホートで検出されたGC機能の欠陥、MUC2や膜貫通型ムチンの発現低下、タイトジャンクションの分解（ゾヌリンの血清学的レベルの上昇を伴う）を説明できるかもしれません。
粘液層の変化はT1Dの病態にどのように影響するのでしょうか？ムチンの分解によって生成され放出された単糖類は、細菌の代謝によって、重要な免疫調節機能を担う代謝物であるSCFAsを生成するために利用されます。腸管粘膜組織に戻って拡散したSCFAは代謝環境を変化させ、IEBの完全性に影響を与えムチン発現を制御するだけでなく、腸管レベルや膵島など腸から遠位の臓器での免疫寛容を促進します。実際、ヒトやT1Dの前臨床モデルにおける先行研究では、腸内細菌叢によるSCFA産生の欠乏がT1Dの発生に関連することが示されている。
54
,
55
さらに、酢酸と酪酸の2種類のSCFAを経口投与すると、NODマウスの自己免疫性糖尿病が予防された。
56
SCFAは、免疫寛容機構、特に腸粘膜におけるFoxP3+ Treg細胞の分化を誘導する。
57
したがって、T1D患者のMAGMにおける粘液層の変化とSCFA産生菌の相対量の減少は、β細胞自己免疫の予防に重要な免疫制御機構に影響を与える可能性がある。後者の仮説を支持するものとして、T1D患者ではFoxP3+ Treg細胞の腸管分化が低下していることが判明している。
29
粘液バリアの変化によるT1D発症の別のメカニズムは、腸粘膜や全身循環における細菌の移動と細菌の成分の通過を可能にすることであると考えられている。T1D患者において発現が異常であることが判明したムチンであるMUC2を主成分とする粘液層は、通常は常在菌を寄せ付けないが、この最初の防御ラインが破綻すると常在菌は上皮に接触する。圧倒的な量の細菌が上皮の免疫細胞に到達すると、明白な炎症反応が引き起こされ、その後、細菌の転位、すなわち、細菌分子や抗原が血流や末梢組織へ無制限に移動することが起こる。これらの現象は、通常、IBDの発症初期に起こるものである、
16
しかし、T1D患者におけるMD2の血清学的レベルの上昇という我々の知見は、T1Dにおいても細菌のトランスロケーションが起こりうることを示唆している。細菌転座とヒトT1Dとの直接的な因果関係はまだ証明されていないが、我々は、細菌成分の血液循環への通過が、以下の2つのメカニズムで膵島内の自己免疫を調節できると推測している：1）微生物成分、例えば、微生物が分泌した代謝物が膵臓組織に到達して膵臓インスリン生産β細胞に直接作用し、保護作用を引き起こすか、膵島を保護することができる
58
または炎症と細胞損傷を引き起こす。2）常在細菌と免疫細胞との間の異常なクロストークが、腸管粘膜内で島嶼反応性T細胞の活性化とエフェクター表現型の獲得につながる可能性がある。後者の仮説を支持するものとして、T1Dの前臨床モデルを用いた研究では、腸管粘膜に侵入した常在菌が、分子模倣のメカニズムを通じて直接島反応性T細胞を刺激することが見出されている。
5
,
6
,
9
,
10
,
59
並行して、細菌産物はパターン認識受容体を通じて、腸粘膜内の腸管樹状細胞を活性化させることができます
60
そして、エフェクターT細胞の分化を促進する炎症性表現型に向かわせる。この見解に沿うように、我々はT1D患者の腸管粘膜にエフェクターTh1、Th17、TNF-α+ T細胞の増加を見出した。膵島反応性T細胞による腸の活性化とエフェクター表現型の獲得に関する直接的な証拠は動物モデルでのみ存在するが、T1D患者のヒト膵島に浸潤するT細胞が腸に由来するという観察（すなわち、腸ホーミング受容体CCR9とα4β7を発現）は、ヒトT1Dにおいてもこの病原シナリオを支持している。
61
T1D患者の腸内では、エフェクターT細胞の相対的な割合が増加するとともに、Th2細胞の存在も減少していることが判明した。腸管GCによるムチンの放出は、IL-4やIL-13のようなTh2型サイトカインによって制御されている、
39
,
40
T1D患者の腸粘膜におけるTh2細胞の相対的な割合の減少は、GC機能の欠陥と粘液層の変化に寄与している可能性があると我々は考えている。
遺伝的にT1Dに罹患するリスクのある人では、特定のHLA対立遺伝子による自己抗原提示、胸腺選択の欠陥、末梢寛容の失敗など、いくつかのメカニズムによって、末梢循環に島嶼反応性T細胞が存在することになる。ほとんどの場合、これらのT細胞は、末梢で活性化されない限り、静止状態にあり、β細胞自己免疫やT1Dを引き起こすことはない。動物モデルの研究では、GBの完全性が失われ、常在する腸内細菌叢と免疫系との間のクロストークが異常になると、末梢で膵島反応性T細胞が活性化し、T1Dになることが示されました。
5
本研究は、ロンバルディア地方に住み、イタリアン（地中海料理）な食生活を送る白人のみからなるT1D患者の小規模コホートで行われたため、T1D患者全体を部分的に代表しているに過ぎないといういくつかの限界がある。実際、腸内細菌叢と腸内環境は、食事だけでなく、公害、運動、その他のライフスタイルや地理的条件などの環境要因に大きく影響される。しかし、このような制約やデータの相関性にもかかわらず、今回発表された結果は、GBの完全性と粘液バリアの機能が、ヒトにおいても膵島の自己免疫破壊につながる病原メカニズムを防ぐために重要である可能性を示唆しています。異なるT1Dコホートでこれらのデータを確認し、ヒトT1Dで観察される物理的および生物学的GBの変化が、動物モデルで報告されたものと同様のメカニズムでβ細胞自己免疫の活性化に直接関与しているかどうかを評価するために、さらなる研究が必要である。
5
,
6
また、膵島自己免疫疾患や遺伝的にT1Dリスクのある小児を対象としたプロバイオティクスや食事介入による概念実証の臨床研究は、T1D患者において減少したSCFA産生菌の相対量を増やすことを目的としており、GB完全性とヒトにおけるT1Dの発生を関連付けるために重要である。
寄稿者
MLC：データキュレーション、形式分析、調査、方法論、可視化、執筆（原案）。IC：調査、方法論。RF：データキュレーション、正式な分析、調査、方法論。MAC：調査、方法論、検証。AN：データキュレーション、方法論、検証。VP：データキュレーションと正式な分析。LM：データキュレーション、形式的分析、検証、視覚化。LAL：データキュレーション、フォーマルな分析、検証。WL：方法論。MR：形式的な分析、調査、方法論。ED：データキュレーション。AMB：調査。EP：データキュレーション MS：調査および監督。EB: 監督とリソース AF: 概念化、方法論、執筆-レビュー-編集。FU: 概念化および監督。JD: 概念化、リソース、監督。NM: 概念化、方法論、監修、執筆-レビュー-編集。MF: 概念化、データキュレーション、正式な分析、資金獲得、プロジェクト管理、監督、可視化、執筆-オリジナルドラフト。
データ共有に関する声明
シーケンスデータは、プロジェクトのコードPRJNA764177でNCBIのサイト（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）に寄託されています。我々の研究成果を裏付けるその他のデータは、合理的な要求があれば、対応する著者から入手可能である。
利害関係の宣言
著者らは、競合する利害関係はないことを宣言している。
謝辞
研究目的のために腸管粘膜サンプルの提供を快く承諾していただいた参加者（T1D患者および健常対照者）の皆様に感謝いたします。
付録A. 補足データ
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表S1〜S4、図S1〜S2
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掲載されました： 2023年4月14日
受理されました： 2023年3月30日
改訂版として受理された： 2023年3月9日
受領しました： 2022年7月27日
アイデンティフィケーション
DOI: https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2023.104567
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© 2023 The Authors. 発行：エルゼビアB.V.
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図1T1D被験者におけるIEB損傷と細菌トランスロケーション。(a) 研究デザイン。EGDS中に十二指腸粘膜を軽くブラッシングし、粘液関連腸内細菌叢（MAGM）を収集した。その後、TJPs、ムチン、AMP mRNA発現のqRT-PCRと腸管免疫細胞のFACS解析のために、腸管組織片を2-3個収集した。また、EGDS時に同じ個体から末梢血のアリコート（4-5ml）を採取し、細菌転座のマーカーの血清学的分析を行った。(b）T1D患者（n＝17）およびHC（Ctrl、n＝16）におけるゾヌリン、リポポリサッカライド結合タンパク質（LBP）およびミエロイド分化2（MD2）の血清学的レベルを、ELISAアッセイによって測定した。(c）T1D患者（n＝17）およびHC（n＝16）のヒト十二指腸サンプルにおけるTJP遺伝子発現ZO-1、ZO-2、CLNおよびOCLNのリアルタイムqRT-PCR分析。Relative Abundance [A.U.]は、ΔΔCT法を用いて算出した。すべてのデータは、平均値±SDで表される。∗Mann-Whitney U testにより、＊p≦0.05；＊＊p≦0.01；＊＊＊＊p≦0.001。
図2T1D被験者におけるムチンとAMPのmRNA発現の低下。(a) T1D患者（n = 17）と健常対照（HC、n = 16）のヒト十二指腸サンプルにおけるいくつかのムチン（MUC1-4、MUC12-13、MUC15、MUC17、MUC20-21）の遺伝子発現のリアルタイムqRT-PCR分析。(b）T1D患者およびHCのヒト十二指腸サンプルにおけるヒトHD5、HD6、BD、Reg3、およびLL-37（hCAP18、ヒトカチオン性抗菌タンパク質のペプチド）のAMP遺伝子のリアルタイムqRT-PCR解析。すべてのデータは、平均値±SDで表されます。∗マン・ホイットニーのU検定により、＊p≦0.05；＊＊p≦0.01；＊＊＊＊p≦0.001。
図3T1D被験者の粘液関連微生物叢におけるSCFA産生菌の相対存在量の低下。EGDS中に小腸粘膜から分離したブラッシュ材の腸内細菌叢プロファイルを、細菌DNAの16S Amplicon Sequencingで評価した。(a)T1D対HCにおける種αの多様性と優越性。(b) T1DとHCのMAGM間で発現が異なる79の細菌種は、T1D vs HCで55種が増加、24種が減少していた。粘液再生に重要な働きをする3つのSCFA産生菌、Bifidobacterium dentium、Clostridium butyricum、Roseburia intestinalisは、T1D患者においてHCと比較して有意に減少していた（青い点）ことが分かった。16S rRNAデータの相対存在量プロファイリングと差分解析は、DESeq2を用いて分散安定化変換を行った上で実施した、
31
ここでp≦0.05は統計的に有意とみなされた。
図4 T1D患者における粘液層組成の変化は、腸管免疫調節異常と相関する。T1D患者および健常対照者の腸管生検から分離した単一細胞懸濁液をFACS分析した。データは、CD3+CD4+T細胞総数のうち、異なるT細胞サブセットのパーセンテージで表されます。T1D被験者の腸において、Th1（CD3+CD4+IFN-γ+）、Th17（CD3+CD4+IL-17+）、TNF-α+（CD3+CD4+TNF-α+）、Th22（CD3+CD4+IL-22+）、Tr1（CD3+CD4+ IL-10+ ）、Th2（CD3+CD4+IL-4+）細胞を健康コントロールと比較してみた。T1D患者の腸粘膜では、INF-γ+ Th1、IL-17+ Th17、TNF-α+ T細胞のエフェクターが増加し、IL-4+ Th2細胞は減少したことが検出されました。すべてのデータは、平均値±SDで表されます。∗Mann-Whitney U testにより、＊p≦0.05；＊＊p≦0.01；＊＊＊p≦0.005。

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