新生児期のBos taurusにおける腸内細菌叢の一塩基分解能での時間的コロニー形成

新生児期のBos taurusにおける腸内細菌叢の一塩基分解能での時間的コロニー形成
董泉彬、華東秀、王秀超、焦玉文、呂劉、鄧秋峰、呉廷廷、周華陽、丁羅陽、胡士賢、石静、王義峰、張海峰、盛延輝、孫維、沈亦肇、唐麗明、孔香清、陳麗民
doi: https://doi.org/10.1101/2023.03.30.535011
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ABSTRACT
背景 新生児子牛のルーメンは未発達であり、生後間もない時期には限られた機能しか発揮されない。したがって、腸内の微生物の獲得とコロニー形成は、新生児子牛の健康な宿主-マイクロバイオーム共生を確立するための鍵となる。微生物に関連した健康上の結果は、特定の微生物の個々の菌株の結果であるように思われる。しかし、先駆的な微生物株の時間的なコロニー形成と、新生児子牛の健康と成長との関連性については、十分に理解されていない。
結果 これを解決するために、36頭の新生児子牛の出生から産後2ヶ月までの腸内細菌叢を縦断的にプロファイリングし、微生物移植（MT）を実施して腸内細菌叢を再形成しました。深く配列された糞便サンプルのゲノム再構築の結果、合計3,931個のメタゲノム集合ゲノム（MAG）が得られ、そのうち397個はBos taurusの既存のデータベースと比較したところ新種として同定されました。一塩基レベルのメタゲノムプロファイリングでは、出生後に微生物が急速に流入し、その後、生後数週間の間に強い選択を受けることが示された。MTは、主にPrevotella種とBacteroides種に由来する33のMAGの遺伝子構成を再編成することが判明した（FDR<0.05）。さらに、2000万以上の微生物の一塩基変異（SNV）を736の血漿代謝物に結びつけ、グルタチオンやL-ドーパを含む宿主免疫および神経関連代謝物の微生物遺伝子制御の可能性を示す、研究全体の有意な24の関連（P < 4.4×10-9） を明らかにすることができました。さらに、統合解析の結果、微生物の遺伝的変異は、そのコード化されたタンパク質の構造制御を介して代謝物を調節することにより、新生児子牛の健康状態や成長成績に影響を与える可能性があることが判明しました。例えば、新生児子牛のアルブミン濃度や総抗酸化能は、SNVによって代謝酵素の構造制御を介して決定されるL-ドーパと相関があることを見出した。
結論 今回の結果は、微生物株の時間的なコロニー形成とMTによる株の入れ替えが、新生児子牛の腸内細菌叢の発達に不可欠であることを示し、新生児子牛の健康状態や成長パフォーマンスを改善できる戦略の開発に役立つと考えられる。
はじめに
新生児期の動物におけるマイクロバイオームのコロニー形成は極めて重要であり、これらの常在微生物は、免疫系の成熟、栄養素の利用および改変、病原体のコロニー形成の防止など、多くの機能を支えています [1, 2] 。乳牛には多様なラムネ菌の群集が存在し、成長と乳生産のためのエネルギーを供給していますが、新生児期の子牛のルーメンはまだ発達途中であり、初期には限られた機能しか示しません [3] 。したがって、腸内細菌叢の獲得とコロニー形成は、新生児子牛の健全な宿主-微生物共生を確立するための鍵となります。したがって、腸内細菌叢と新生子牛の健康状態との関係を理解するためには、生後間もない時期の腸内細菌叢の時間的ダイナミクスを解明することが重要である。最終的には、より良い健康状態と成長パフォーマンスを達成するための介入戦略の設計に役立つと思われます。
新生児子牛を対象とした研究では、出生後に微生物の分類学的組成が劇的に変化することが示されています[4-6]。例えば、出産後24時間以内に、EnterobacteriaceaeとEnterococcusの存在量が著しく増加する[4]。生後1週間後には、Lactobacillusと粘膜関連Escherichiaが有意に多くなります[5, 6]。また、泌乳牛と子牛では、腸内細菌の集団構造が大きく異なる[7]。さらに、腸内細菌叢の組成と構造は、個人間で経時的に変化する可能性があります。これらの観察により、宿主とマイクロバイオームのクロストークが新生児の健康と成長に及ぼす影響について、的を絞ったメカニズム解明を行うための基礎が築かれました。
しかし、新生子牛の腸内細菌叢の時間的ダイナミクスに関する研究は、主に分類学的および機能的組成に焦点を当てており、微生物株が時間と共にどのように進化していくかは検討されていません。各微生物種は、一塩基変異（SNV）が異なる異なる菌株で構成され、異なる機能を持つ可能性があります[8-10]。近年、ヒトにおいて、微生物の遺伝子組成と長寿[11]、さらに複数の疾患リスク因子[12]との間に決定的な関連があることが明らかになりました。したがって、微生物遺伝的変異の時間的動態を追跡し、新生子牛の健康状態や成長と関連付けることで、新生児動物における腸内細菌叢の役割に関する新しい情報を得ることができるかもしれません。
本研究では、36頭の新生子牛の出生から産後2ヶ月までの腸内細菌叢を縦断的に追跡調査し、微生物移植（MT）を行い、微生物株の変更が子牛の健康状態や成長成績に影響を与えるかどうかを評価しました。子牛の腸内細菌ゲノム構成の時間的安定性を特徴付け、さらに時間的変動と新生動物の健康状態および成長との関連性を調査しました。さらに生物学的な洞察を得るために、様々な時点で736種類の代謝物の血漿レベルをプロファイリングし、微生物が新生児に与える遺伝的影響の背後にある潜在的なメカニズムを突き止めました。
結果
ゲノムアセンブリの結果、397の新しい種レベルのゲノムを得た
本研究は、腸内細菌株の時間的動態を一塩基分解能で調べ、早期の微生物介入が新生児子牛の健康と成長成績に与える影響を調査することを目的としたものです。このために、36頭の新生児子牛を、対照群（CON）、ルーメン微生物叢移植群（RMT）、オートクレーブによるルーメン液移植群（RFT）の3群にランダムに割り付けた。生後15日、35日、56日に糞便サンプルを採取し、Illumina NovaSeq-6000プラットフォームを用いたメタゲノムシークエンスに供した。新生子牛から採取した104個の糞便サンプルについて、平均して3680万個のペアリードを得た。
新生児子牛の腸内の微生物ゲノムを再構築するために、de novoアセンブリを実施した。再構築されたゲノムの量を最大化するために、最近の研究[13]で示唆されているように、単一サンプルアセンブリ戦略に従いました。詳細なワークフローは図1Aに示されています。このパイプラインを使用することで、メタゲノム集合ゲノムに関する最小限の情報（MIMAG）基準[14]を満たし、完全性が50%以上、汚染が10%未満である合計3,931のメタゲノム集合ゲノム（MAG）を得ることができました。注目すべきは、平均完全性84%、汚染率1.7%という高品質なアセンブルゲノムであったことです（Table S1）。
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図1.本研究のメタゲノム組立てゲノム。
A. 微生物ゲノムアセンブリーワークフロー。B.代表的な472種レベルのメタゲノム組立てゲノム（MAG）の系統樹。枝の色は細菌が属する系統を表し、外側の円の青色は、既存のゲノムリファレンスと比較して新たに同定された種であることを示す。C. 最近の3つの研究から得られた代表的なマグ472個と公開されているリファレンスゲノムの比較。D. 新たに同定された397種のMAGに含まれる微生物遺伝子の機能的アノテーション。
次に、平均塩基同一性（ANI）の閾値を95％として全3,931ゲノムをクラスタリングし、代表的な原核生物472種を得ることにより、それらのMAGの分類学を確認した（表S2）。GTDB-Tk [15]を用いた分類学的分類によると、これらのゲノムは主にFirmicutesおよびBacteroidota門に属している（図1B、表S2）。これらの代表的なゲノムを、RUG [16], RUG2.0 [17], African MAGs [18]など、牛から得られた既存の微生物ゲノムと比較しました。95%ANIで、RUG、RUG2.0、African MAGsと比較したところ、それぞれ446、420、444が新規であることが分かりました（図1C）。重要なことは、472個の代表的なゲノムのうち397個が、上記の研究でカバーされていないことです（図1C）。
これらの新規種の機能性を調べるため、Prokka [19]を用いて、新たに発見されたゲノムの機能性遺伝子のアノテーションを行いました。その結果、これらの新規種は、適応応答型感覚キナーゼからグルタミン合成酵素まで、さまざまな機能性を持つことがわかった。一方、相当数の遺伝子はアノテーションができず、47%の遺伝子は仮説的であった（図1D, Table S3）。
まとめると、新たに構築されたゲノムは、新生児子牛のマイクロバイオーム研究のための既存のリソースを補完する貴重なものであり、この集団における腸内微生物の分類と機能的能力についてさらなる洞察を与えるものである。
新生児子牛における腸内細菌菌株の時間的変動性
新生児子牛における腸内細菌株の経時的なコロニー形成を調べることは、子牛の発育を促進するメカニズムに関する洞察を提供し、宿主の健康を促進するための介入の潜在的なターゲットを特定できることから、非常に重要です。ここで、各子牛から得られたMAGの数を異なる時点で比較することにより、新生児子牛で得られたMAGの数が時間の経過とともに増加することを発見しました（図S1A）。さらに、この増加は、有意な負の相関は見られたものの正の相関は見られなかったことから、シーケンスの深さの違いによる偏りはなく（図S1B）、新生子牛の発育の最初の数週間は、出生後に腸内細菌株が急速に流入することが示されました。
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図S1.MAGsとシーケンスの深さの時間的な違い。
A. サンプルあたり得られたMAGsの時間的変化。スピアマン検定とクラスカル検定を使用して、サンプルごとに得られたMAGsの時間的相関とグループ内差を評価する。B. サンプルあたりのシークエンス深度の時間的変化。SpearmanおよびKruskal検定を用いて、サンプルごとに得られたシーケンシングリードの時間的な相関とグループ内差を評価する。
新生児子牛の腸内における微生物株の時間的なコロニー形成を研究するために、ショットガンメタゲノムデータを活用して、一塩基変異（SNV）を用いた株レベル解析を実施しました。これを実現するために、現在最も包括的なマイクロバイオーム配列リソースであるUHGG[20]データベースと、私たちのMAGを組み合わせました。これにより、研究固有の微生物株だけでなく、他の既存株も調査することができました。このカスタマイズされた参照データベースにシーケンスリードをアライメントし、inStrain [21]アルゴリズムを用いてSNVコールを実施しました。
合計で、カスタマイズした参照データベースの1,209の代表的なMAGに由来する21,737,415のユニークなSNVが104サンプルで検出され、サンプルあたりのSNVの範囲は440,250から1,564,434であった。組み立てられたMAGの数と同様に、3つのグループすべてにおいて経時的なSNV数の増加が観察され（図2A）、新生子牛の腸内細菌叢のゲノム多様性が時間と共に増加していることが示されました。SNV数が最も多かった細菌種は、Bacteroides uniformis、Parabacteroides faecavium、Phocaeicola vulgatusでした。さらにSNVの子牛内遺伝的差異を解析したところ、Alistipes senegalensis、Prevotella sp002353825、Bacteroides gallinarumなどSNVに有意な時間変化を示すMAGを特定し、Roseburia inulinivorans、Bacteroides intestinalis、Enterenecus faeciumは比較的低い遺伝変動を示した (Figure 2B, Table S4).
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図2.新生児子牛の腸内細菌株の時間的変動性
A. サンプルごとに検出された一塩基変異（SNV）の総数です。各ドートは1サンプルを表す。Spearman検定とKruskal検定を使用して、サンプルごとに得られたSNVの時間的相関とグループ内差異を評価する。B. 種レベルのMAGの時間的ゲノム非類似度を示す。グループ内ゲノム距離はKimura 2-parameter法を用いて算出した。C. 新規の種レベルのMAG F86_56.11の子牛間ゲノム非類似度を示す。Kruskal検定とSpearman相関を用いて、グループ内の時間的差異と関連性を評価した。D. 新規種F86_56.11の系統樹。色はサンプリング時期を表す。E. ファミリートランスポザーゼをコードする遺伝子内で検出されたSNVをヒートマップで図示したもの。遺伝子の長さとSNVが検出されたサンプル数を示す。F. ギ酸脱水素酵素H（FDH）をコードする遺伝子内で検出されたSNVをヒートマップで示す。遺伝子の長さとSNVを持つサンプル数を示している。
興味深いことに、新規種であるF86_56.11の遺伝的変動は、時間の経過とともに大きく変化していることがわかった。この種のSNVに基づく子牛間の非類似度は時間とともに増加し、15日目に一貫して最も低くなった（Kruskal test, P < 1.0×10-5, Figure 2C）。さらに系統解析の結果、本種には2つの異なる株があり（図2D）、35日目および56日目と比較して15日目に株1の有意な濃縮が観察され（Fisher exact test, P < 1.07×10-10, 図2D）、本菌の時間変動性が高いことが示された。新生児期の子牛の腸内環境が時間とともに変化すると、微生物に選択圧がかかり、進化して新しい条件に適応するように促し、生存と繁殖の機会を増やします。
F86_56.11で観察された時間的な遺伝的変動の潜在的なメカニズムを調べるため、有意な時間的差異を示すSNVを持つ遺伝子を解析しました。ゲノムアノテーション解析の結果、F86_56.11では、ファミリートランスポザーゼをコードするいくつかの遺伝子が有意な時間的変動を示すことが判明した（クラスカルテスト、P < 0.05, 図2E、表S5）。トランスポザーゼは、トランスポゾンをゲノム内の異なる場所に移動させることを促進するタンパク質である。トランスポゾンに結合してゲノム内での移動を促進し、ゲノムの変異を促進することができます[22]。トランスポゾンとそれに関連するトランスポザーゼの活性は、細菌の進化や環境への適応に大きな影響を与える可能性があります[22]。
さらに、ギ酸脱水素酵素H（FDH）をコードする1,695 bpのfdhF_2遺伝子のSNVも時間差を示すことがわかった（Kruskal test, P= 2.5x10-2, Figure 2F, Table S5）。FDHは、短鎖脂肪酸（SCFA）の生成における重要な中間体であるギ酸代謝に関わる重要な酵素である［23］。酸性デタージェント繊維（ADF）および中性デタージェント繊維（NDF）も経時的に有意な変化を示したことから、FDHの経時変化は新生児子牛の繊維消化に関連していると考えられる（クラスカルテスト、P < 9.6×10-4, Figure S2）。これらの結果から、新生児子牛の微生物株で観察された経時的な遺伝的変動は、微生物に対する選択圧によるものであり、それによって微生物が進化し、腸内環境の条件の変化に適応するようになることが示唆される。この適応過程には、トランスポーザブルエレメントやFDHなどのSCFAsの代謝の時間的変化の根底にある潜在的なメカニズムが関係している可能性がある。
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図S2.新生児子牛における繊維消化率の時間的変化。
A. 中性デタージェント繊維（NDF）消化率の時間的変化。各ドットは1サンプルを表す。B.酸性デタージェント繊維（ADF）消化率の時間的変化。クラスカルテストによるP値を示す。各ドットは1つのサンプルを表す。
微生物移植は新生児子牛の腸内細菌株を変化させる
新生児子牛の腸内細菌株の時間的なシフトを調べることに加え、ルーミナル微生物叢移植がこれらの子牛の腸内の特定の微生物株のコロニー形成を変えることができるかどうかについても調べました。そのために、3群すべてに存在する686個のMAGのゲノム非類似度（木村2パラメータ距離）を比較したところ、33個のMAGで有意差が認められました（Kruskal test, FDR < 0.05, Table S6）。特に、RMTによって有意に変化したMAGの多くは、Prevotella mizrahii、Prevotella sp900543585、Bacteroides caccae、Bacteroides fragilisといったPrevotellaおよびBacteroides属のものでした（図3A、図S3、Table S6）。
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図S3.グループ間のMAGのゲノム非類似度。
子牛間のMAG非類似度はKimura 2-parameter法を用いて算出した。グループ間の差異を評価するためにクラスカルテストを使用。
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図3.微生物移植は新生児子牛の腸内細菌株を変化させる。
A. MAGはグループ間でその遺伝子構成に違いが見られる。X軸は属の違い、Y軸はMAGの数を表す。青いバーはFDR < 0.05で有意差を示したMAGを表す。B. グループ間でSNVに差がある微生物遺伝子の分布。X軸は遺伝子内の差分SNVの数、Y軸は微生物遺伝子の数を表す。C. 遺伝子内の差分SNVが存在する場所。D. 機能的アノテーションが可能な微生物遺伝子の割合。E. MAGあたりの差分SNVを持つ微生物遺伝子に基づく26の有意な機能濃縮の概要。F-I. Prevotella copri_A、Prevotella mizrahii、Butyricicoccus新種（F63_15.33）、Lawsonibacter sp000177015の微生物移植によって変化した差分ゲノム座と、差分SNVを持つ遺伝子によって濃縮された機能経路の図。X軸はSNVのゲノム上の位置を表し、Y軸はグループ間の差分SNVのP値（-log10）を表示しています。
差分MAGの根底にある機能的な違いをさらに調べるために、グループ間で差分SNVを持つ遺伝子を解析しました。合計で、グループ間で少なくとも1つの差分SNVを持つ16,497個の遺伝子を同定し（表S7）、そのうち3,766個（全遺伝子の22.8％を占める）は複数の差分SNV（3個以上、図3B）であった。注目すべきは、差分SNVの83.4%が遺伝子のコーディング配列（CDS）内に位置し（図3C、表S7）、16,497遺伝子のうち7,914遺伝子（48.0%）が機能注釈されていたことです（図3D、表S7）。これらの遺伝子は、短鎖脂肪酸、ビタミン、アミノ酸の代謝など、RMTによって誘導されたと考えられる幅広い生物活性をコードしていた（Table S7）。これらはすべて新生児子牛の成長と発達に重要であり、早期の微生物介入は新生児子牛の腸内細菌叢の遺伝子構成と機能性を再構築する上で大きな影響を及ぼすことが示唆された。
差分SNVを持つ遺伝子のCOG（clusters of orthologous genes）[24]IDを入手したので（表S7）、COGパスウェイデータベース[24]をカスタマイズして、MAGごとに差分SNVを持つ遺伝子に基づいてパスウェイ濃縮度を算出した。合計で、19の微生物パスウェイと16のMAGの間で26の有意な濃縮を確認した（Fisherの正確検定、FDR<0.05、図3E、テーブルS8）。例えば、Prevotella copri_AとPrevotella mizrahiiは、抗酸化関連セリン経路（p=1.4×10-2、図3F）およびSCFA関連グルコネシン生成経路（p=1.7×10-2、図3G）に対して濃縮されていました。さらに、Butyricicoccusの新種（F63_15.33）でSNVが差分された遺伝子は、主にSCFA関連経路（Pgluconeogenesis = 2.5×10-2, PNa+-translocating Fd_NADH oxidoreductase=2.5×10-2 ）や抗酸化関連のシステイン生合成経路（p = 3.2×10-2, Fig.3H ）に濃縮されていたことが確認された。さらに、ローソニバクターsp000177015は、コバラミン（ビタミンB12、P=1.2×10-5、図3I）およびイソロイシン、ロイシン、バリンなどの分岐鎖アミノ酸（BCAA）生合成経路（P=3.0×10-3、図3I）を豊富に含んでいました。これらの結果は、より良い健康と成長のために腸内細菌株を再構築し、代謝を調節するために、新生児子牛の生後間もない時期に微生物を介入させることの重要性をさらに強調しています。
新生児子牛の血漿中代謝物と関連する微生物SNVs
我々は、微生物株の遺伝子構成において、時間的およびRMTによって引き起こされる著しい差異を特徴付けた。しかし、相当数のSNVは機能的なアノテーションを付けることができない（図3D）。SNVが宿主の病態生理をどのように駆動するかをより深く理解するために、我々は、代謝物が宿主と微生物の相互作用において重要な役割を果たすと仮定した。そこで、SNVと血漿中の代謝物との関連性を評価した。まず、サンプルの20％以上に存在し、マイナーアレル頻度が10％であるSNVを選択しました。このようにして、最終的に787,964個のSNVが、新生児子牛の血漿代謝物の潜在的な微生物遺伝的決定因子を特定するために、736個の非標的血漿代謝物と関連づけられました。
19のMAGからの50のSNVと13の代謝物との間に、合計52の有意な関連が同定され（表S9）、FDRは0.05未満、対応するP値は4.4×10-9未満であった。同じ代謝物に関連する同じMAGからの高相関SNV（r2> 0.9、図S4）をフィルタリングし、24の独立したSNV-代謝物間の関連性を得た（図4）。最も有意な関連は、新種由来のSNV（F75_56.48）とホスファチジルコリンの血漿レベルとの間に見出された（P= 6.63×10-11）．24の関連性のうち、8つはPrevotella属由来のSNVで観察され、代謝物には主にグルタチオン、D-3-フェニル乳酸、L-ドーパが含まれていました。グルタチオンは、病原性や細菌の病原性に影響を与えることが報告されており、宿主はグルタチオンを用いて細菌の侵入に対する反応を調節していると考えられます[25]。D-3-フェニル乳酸（PLA）は、多くの微生物の増殖を抑制することが可能です[26]。さらに、アグマチンデイミナーゼをコードする遺伝子のSNVは、重要な内因性アンドロゲンステロイドホルモンであるデヒドロエピアンドロステロン（DHEA）と関連していました[27]。アグマチンデイミナーゼは、微生物のプトレシン生合成経路に関与しており[28]、精子形成、精子運動、卵胞形成、排卵などの生殖プロセスに関連している[29]。
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図S4.微生物SNVの相互相関。
ヒートマップは、血漿代謝物との有意な関連を持つSNV間のスピアマン相関を示す。色の濃さは相関の強さを表している。
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図4.血漿代謝産物の微生物遺伝的決定要因。
マンハッタンプロットは、微生物の一塩基変異（SNV）と736種類の非標的血漿代謝物との関連を示しています。プロットの各ポイントは遺伝的座位を表し、X軸は異なる属のメタゲノム集合ゲノム（MAG）のゲノム位置を、Y軸は線形関連性のP値を表しています。破線は試験的に有意な線（P < 4.4×10-9）を表し、関連性の詳細な情報は表に記載されている。有意水準以上の代謝物との関連を示すSNVについては、有意水準以下でも他の代謝物との関連を同じ色で強調表示しています。
以上、未注釈のSNVと代謝物の間に観察された関連は、新生児子牛における宿主と微生物の相互作用の背後にあるメカニズムをより深く理解するための貴重なリソースとなるものであった。これらの関連性は、新生児子牛の健康と成長に及ぼす微生物株の変動による影響を明らかにするための、標的を絞ったメカニズム調査の指針となる可能性があります。特定の代謝物に関連する特定のSNVを同定することで、微生物ゲノムと宿主生理の間の複雑な相互作用を解明できるかもしれません。最終的には、この情報は、新生児子牛の健康と成長を改善するための新しい介入策や治療法の開発につながるかもしれません。
新生児子牛の表現型と関連する微生物SNVs関連代謝産物
SNVに関連する代謝物と新生児子牛の表現型との関係をさらに理解するために、代謝物と表現型との関連解析を実施した。50個のSNVに関連する13個の代謝物（FDR < 0.05、表S9）および14個の表現型に関連する147個の代謝物（FDR < 0.05、表S10）のうち、6個の代謝物が両方に関連していることが分かった（図5A、表S11）。これらの関連に関与する表現型は、血漿総コレステロール、アルブミン、マロンジアルデヒド、総抗酸化能、ならびにADFの消化率であった（図5A）。注目すべきは、SNV関連代謝物のほとんどが、L-ドーパ、D-3-フェニル乳酸、ステアラミド、グルタチオン、デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）を含む新生児子牛の総抗酸化能と関連していたことです。グルタチオンと遺伝子F73_15.69_31314_3のSNV部位との間に最も強い関連性が観察された。例えば、遺伝子座F73_15.69_31314_1086にCまたはT塩基を持つ子牛は、血漿グルタチオンのレベルが異なっていた（P=2.8D×D10-9、図5B）。グルタチオンは細胞の恒常性維持や様々な疾患における酸化的損傷に対する防御に必須の分子であり[30]、血漿グルタチオン濃度と新生子牛の抗酸化能の間には強固な相関が認められた（rSpearmanD=D0.65, PD=D1.2D×10-6, Figure 5C）。しかし、Prokkaに基づくこの遺伝子の機能は未解明であったため、次にAlphaFold2 [31]を適用してコードされるタンパク質の構造を予測し（図5B）、さらにDeepFRI [32] で推定したタンパク質構造に従って、機能をATP結合と注釈した。グルタチオンは、ATPの存在下、GSH IとGSH IIの触媒により、L-グルタミン酸、L-システイン、グリシンが順次反応することで生成する[33]。このタンパク質はATPと結合し、グルタチオンの合成と輸送に影響を与える可能性が示唆された[34]。したがって、この遺伝子の変異は、構造的な規制を介してグルタチオンの生合成に重要な役割を担っている可能性がある（図5D）。
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図5.新生児子牛の表現型に関連する微生物SNVs関連代謝産物。
A. サンケイ図は、新生児子牛のSNVs、代謝物、表現型の関連を示している。B. Prevotella copri_Aの遺伝子座F73_15.69_31314_1086と血漿グルタチオンレベルとの関連性。C. 新生児子牛の血漿グルタチオンレベルと抗酸化力の相関関係。X軸は正規化した血漿グルタチオンレベル、Y軸は正規化した新生児子牛の抗酸化力を表す。適合した直線回帰線は、95％信頼区間とともに示されている。スピアマン相関係数とP値も示した。D. 遺伝子F73_15.69_31314_3の推定タンパク質構造とこの遺伝子の変異部位。E. Limisoma sp000437795の遺伝子座F79_35.20_33548_357における異なる塩基型と血漿L-Dopaレベルとの関連性。F. 血漿L-Dopaレベルと新生児子牛の抗酸化力との相関性。X軸は正規化された血漿L-Dopaレベルを、Y軸は正規化された新生児子牛の抗酸化力を表している。フィットした線形回帰線とスピアマン相関係数、P値を示す。G. 遺伝子F79_35.20_33548_1の推定タンパク質構造と、この遺伝子上の変異部位を示す。
また、F79_35.20_33548_1の複数のSNVが血漿中L-ドーパ濃度と関連していることがわかった。遺伝子座F79_35.20_33548_357にAまたはGの塩基を持つ子牛はL-ドーパのレベルが異なり（P=8.7×10-11、図5E）、血漿L-ドーパレベルと抗酸化力の間に有意な相関が観察された（rSpearmanD=D0.56、PD=D8.0×10-8、図5F）。L-ドーパは、金属イオンを含むチロシナーゼに依存するメラニン生合成の重要な前駆体であり、細胞を酸化ストレスから守るために重要な役割を担っている[35, 36]. F79_35.20_33548_1がコードする機能は金属イオンの結合であり、SNVによる構造変化で制御することができる（図5G）。したがって、タンパク質F79_35.20_33548_1の複数の部位における変異は、メラニンの代謝過程に影響を与え、最終的に抗酸化能に影響を与える可能性がある。これらの結果は、特定の微生物の遺伝と機能を特定することで推定されるメカニズム的洞察を提供し、腸内細菌叢が新生児子牛の健康に与える影響にどの代謝物が関与している可能性があるかを明らかにしました。
考察
本研究では、一塩基レベルでの腸内細菌叢の時間的動態と、新生児子牛に対する早期微生物介入による影響について縦断的に調査した結果を紹介します。36頭の新生児子牛の104サンプルから腸内細菌のシーケンスデータを組み立てた結果、合計3,931個のメタゲノム組み立てゲノム（MAGs）が得られた。このデータセットには、472のユニークな種レベルのMAG（95% ANI）が含まれており、そのうち397は牛でこれまでに報告されていないため、ボス・タウラスのマイクロバイオーム研究のための新たなリソースを提供することになる。腸内細菌叢の時間的ダイナミクスをSNVレベルで特徴付けたところ、出生後に微生物が急速に流入し、その後、生後数週間の間に強い選択が行われることが確認されました。さらに、微生物介入によって新生児子牛の腸内細菌株が再形成されることを発見しました。また、数百万個の微生物SNVと数百種類の血漿代謝物との関連を評価し、腸内細菌叢の宿主代謝に対する遺伝子制御を明らかにしました。その結果、宿主の代謝に関わる微生物の遺伝子制御が、新生児子牛の健康状態や成長成績に関連する可能性があることが明らかになりました。
腸内細菌叢が新生子牛の健康にどのように影響するかを理解するためには、生後間もない頃の微生物叢の時間的動態を研究することが重要である。16S rRNAシーケンシングを用いた先行研究では、生後数週間の新生子牛の消化管内微生物叢の組成の変化について検討されています。メタゲノムシークエンシングを用いた本研究では、経時的なマイクロバイオームの遺伝子構成をより詳細に理解することができ、新生子牛は出生後急速に微生物株にコロニー形成され、その後生後数週間で強い遺伝子選択を受けていることが明らかになりました。我々は、新生子牛の糞便サンプルから数千のMAGを生成し、既存のルーメンデータベースではこれまで表現されていなかった397の新規種レベルのMAGを特定しました。これは、糞便サンプルとルーメンサンプルの違い、および地域差によるものと考えられます。私たちの研究は中国で行われましたが、他のデータベースではスコットランド [16, 17] やアフリカ [18] の牛に焦点が当てられています。これらの新しく構築されたゲノムは、今後のBos taurusのマイクロバイオーム研究のための追加リソースとなります。
我々は、SNVプロファイルを解析することにより、新生子牛における微生物株の経時的なコロニー形成を調査しました。私たちは、私たちのサンプル固有のゲノムとUHGG配列リソースを組み合わせて利用し、研究固有の微生物株と既存の微生物株の両方でSNVを正確に解析しました。その結果、腸内微生物の遺伝的安定性は、種によって大きく異なることがわかりました。Roseburia inulinivorans、Bacteroides intestinalis、Enterococcus faeciumなどの一部の種は、経時的な変化が比較的少ないことがわかりました。興味深いことに、ヒトを対象とした先行研究でも、Bacteroides [37]などのこれらの種の一部は、幼少期にコロニー形成され、幼少期に高い遺伝的安定性を示すことが示されています [38]。さらに、我々はメタゲノミクスシーケンスを用いて、菌株のSNVプロファイルを特定するだけでなく、これらのSNVに基づく遺伝的クラスターを駆動する可能性のある機能的差異を検討した。その結果、SCFA代謝に関わる遺伝子の時間的変化は、新生児子牛で観察される繊維消化の経時的変化と関連している可能性があることがわかりました。また、本研究は、メタゲノムSNVが新生児動物における腸内細菌叢の役割を理解するための余分な情報源であることを実証しています。SNVsプロファイルに基づき、新生児子牛の腸内細菌叢は、菌株レベルでの早期微生物介入によって変化しうることを発見した。例えば、Prevotella属とBacteroides属のゲノム構成が有意に変化していた。
さらに、血漿中の736種類の代謝物に関するメタゲノム全体の微生物SNV関連研究では、24の独立したSNVと代謝物の関連性が確認されました。これらの関連性の3分の1は、Prevotella属のSNVと、グルタチオン、D-3-フェニル乳酸、L-ドーパなどの関連代謝物について観察されました。注目すべきは、これらの代謝物のいくつかは、新生児子牛の表現型とも関連していたことである。新生児子牛の血漿中代謝物の遺伝的決定要因を明らかにすることで、宿主の病態生理を駆動するSNVの潜在的役割に光を当てることができるようになった。特に、微生物株由来のSNVと血漿中の代謝物との間に有意な関連が見られたことから、微生物の遺伝的変異が宿主と微生物の相互作用を形成する上で重要な役割を果たし、宿主の代謝調節に寄与している可能性が示唆されました。これらの知見は、観察された関連性の根底にある分子メカニズムをさらに調査することの重要性と、健康や病気における宿主と微生物の遺伝的変異の相互作用を理解するための潜在的な意味を強調するものである。
本論文で紹介した研究は、新生児子牛の腸内細菌叢の時間的動態と、その健康や成長との潜在的な関連性について貴重な知見を提供します。しかし、認識すべきいくつかの限界があります。まず、我々は多くの新規微生物株を特徴付け、新生児子牛におけるその重要性を強調しました。しかし、これらの菌株を培養・分離する能力は現在のところ不明であり、その生存能力と実験的検証の可能性を判断するためにはさらなる研究が必要である。第二に、本研究で観察された関連性は、必ずしも因果関係を意味するものではないことに留意することが重要である。観察された関連性の根底にあるメカニズムや、新生児期の子牛の腸内細菌叢を改善するための潜在的な意味を調べるには、さらなる研究が必要である。これらの限界はあるものの、本研究は、新生児子牛の腸内細菌叢の時間的動態に関する新しい洞察を提供し、生後間もない腸内細菌叢を改善するための戦略を開発するための今後の研究の可能性を明らかにしています。
テーブル・レジェンズ（TABLE LEGENDS
表S1. 再構築された3,931の微生物ゲノムの品質特性
表S2. 代表的な472種レベルのゲノムの分類学的分類
表S3. 新たに報告された397の種レベルのMAGのゲノムアノテーション
表S4. 異なる時間間隔でのMAGの子牛内ゲノム非類似度
表S5. F86_56.11で有意な時間差を示すSNVを持つ遺伝子
表S6. 個々のMAGのグループ間におけるゲノムの違い
表S7. 異なる時点のグループ間でSNVに差がある16,497遺伝子のアノテーション
表S8. 差分SNVを持つ遺伝子に基づく微生物パスウェイ（COG）エンリッチメント
表S9. 新生児子牛のSNVと血漿代謝物の関連性
表S10. 血漿中の代謝物と新生子牛の表現型との相関性
表S11. RMTによって影響を受けるMAGに関連する代謝物は、新生児の子牛の表現型にも関連する
METHODS
動物たち
本研究では、36頭の新生子牛を3つのグループに無作為に割り付け、生後2ヶ月間追跡調査しました。グループには、コントロールグループ（CON）、ルーメン微生物叢移植グループ（RMT）、ルーメン液移植グループ（RFT）が含まれます。生まれたばかりの子牛は、バケツを使ってミルクを与える訓練を受けた後、個別の子牛小屋に移された。スターターは生後3日目に自由摂取させ、その後は毎日午前中に1回与えた。殺菌した全乳を1日2回、0800時と1800時にバケツで与え、子牛は生後56日目に離乳された。RMTおよびRFTは獣医師が行い、RMTおよびRFTに使用するルーメン液は、健康な牛（4歳、600kg、乾期）から、朝の給餌の2時間後に永久ルーメンカニューレで採取した。新鮮なルーメン液は生乳と混合し、採取後すぐにRMTグループの子牛に与えた。RFT群については、給餌前にルーメン液をオートクレーブで滅菌した。7日目から11日目、21日目から25日目、42日目から46日目にそれぞれ50 mL、80 mL、110 mLのラムネ液を給与した。生後15日、35日、56日に糞便と血液サンプルを採取した。
血液バイオマーカー
血漿サンプルは、血中尿素窒素（BUN）、グルコース、総コレステロール、トリグリセリドの濃度分析に使用し、血清サンプルは、総蛋白、アルブミン、アルカリフォスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、総抗酸化能、マロンジアルデヒドの濃度分析に使用しました。血中バイオマーカーの濃度は、Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute（中国・南京市）の市販キットを用いて分析した。
非標的メタボローム解析のために、血漿サンプルをあらかじめ冷やした80%メタノールで再懸濁した。サンプルを氷上で5分間インキュベートし、15,000g、4℃で20分間遠心分離した。得られた上清を、Orbitrap Q ExactiveTMHF質量分析計と結合したThermoFisher Vanquish UHPLCシステムからなるLC-MS/MSシステムに注入した。UHPLC-MS/MSで生成された生データファイルは、Compound Discoverer 3.1 (CD3.1, ThermoFisher) を使用して処理し、各代謝物のピークアライメント、ピークピッキング、および定量を実行した。正規化されたデータは、付加イオン、分子イオンピーク、フラグメントイオンに基づいて分子式を予測するために使用されました。その後、ピークは mzCloud (https://www.mzcloud.org/)、mzVault、および MassList データベースと照合され、正確な定性および相対定量結果を得ることができました。代謝物のアノテーションは、KEGGデータベース（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）、HMDBデータベース（https://hmdb.ca/metabolites）、LIPIDMapsデータベース（http://www.lipidmaps.org/）を用いて実施しました。
消化率
飼料の消化率を測定するために、内部マーカーとして酸性デタージェント不溶性灰を使用した[39]。各子牛から糞便、スターターおよび乳サンプルを採取し、18日目から20日目、33日目から35日目、54日目から56日目にプールした。プールした試料を55℃で48時間乾燥させ、1mmのスクリーンで粉砕し、AOAC Internationalに従って乾物（DM、方法930.15）と粗タンパク質（CP、方法996.11）含有量を分析した。スターターおよび糞中の中性デタージェント繊維（NDF）および酸性デタージェント繊維（ADF）の含有量は、Van Soestら［40］の記載に従って熱安定性α-アミラーゼおよび亜硫酸ナトリウムを用いて測定した。見かけの全管消化率は、Riceら[41]の方法に従って推定した。
メタゲノムデータ作成と前処理
生まれたばかりの子牛から糞便サンプルを採取し、生産後15分以内に速やかにフリーザー（-20℃）に入れた。その後、サンプルはドライアイスで実験室に運ばれ、さらに処理するまで-80℃で保存された。QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（Qiagen, cat.51604）を用いて糞便DNAを分離し、Illumina NovaSeq-6000プラットフォームを用いて配列決定を行った。シーケンス施設では、メタゲノム生シーケンスデータから低品質リードを破棄し、Bowtie2（v.2.1.0）を使用して汚染リードを除去した［42、43］。フィルタリング後、サンプルあたり平均3,680万（sd = 360万）のペアリードを取得し、その後の解析に使用した。
De novoアセンブリとビニング
糞便サンプルからメタゲノム集合ゲノム（MAG）を再構築するために、図1Aに示すようなバイオインフォマティクスパイプラインを使用した。低品質リードやコンタミネーションリードを除去した後、Trimomatic (v.0.33) [44] を用いてアダプタートリミングを行い、得られたクリーンリードをMEGAHIT (v.1.2.9) [45] の入力として使用しました。その結果、合計2,673,254,051本のリードから200bp以上のコンティグが20,149,780本得られました。その後、Bowtie2（v.2.1.0）を用いてリードをフィルタリングしたアセンブリにマッピングし、得られたBAMファイルをSAMtools（v.1.15）を用いてBAM形式に変換した [46]. カバレッジは、MetaBAT2 (v.2.12.1) パッケージの jgi_summarize_bam_contig_depths スクリプトを使用して計算し [47] 、コンティグのビニングは MetaBAT2 を使用して 1.5 kb より短いコンティグは破棄して実行しました。
ゲノムの品質
ビニング後、「lineage_wf」ワークフローを用いて、系統特異的なシングルコピー遺伝子のコピー数に基づくCheckM (v.1.1.3) [48] を用いて、品質（完全性と汚染）を推定した。ゲノムの完全性が50%以上、汚染が10%未満という基準をクリアしたゲノムのみを選びました。これは、最近のガイドライン[14]による「中品質のドラフト」の基準も満たしています。このプロセスでフィルタリングした結果、合計3,931個の再構築ゲノムが確認され、シングルコピーのコア遺伝子を解析して測定した品質統計値を表S1に示す。
生物種レベルの代表的なMAG
3,931 個のゲノムを推定種レベルでクラスタリングするために、dRep (v.3.2.2) [49] を使用しました。dRep は、-pa 0.9 (90%で一次クラスタ)、-sa 0.95 (95%で二次クラスタ)、-cm larger (カバー方法：大きい)、および -con 10 (contamination threshold of 10%) オプションで実行しました。95%の閾値は、種レベルのクラスタリングによく使われる[50]。ゲノムは、完全性、汚染度、ゲノムサイズ、コンティグN50に基づいてスコアリングされ、各二次クラスターから最もスコアの高いMAGのみが、脱複製セットの勝利ゲノムとして保持されました。最終的に、472種の種レベルの代表MAGを選択しました。
分類学的分類と系統学的解析
各再構築ゲノムの分類学的アノテーションは、GTDB-Tk (v.2.0.0, database release 207) [15, 51] と 'classify_wf' 機能（デフォルトパラメータ）を用いて実施しました。GTDB-Tkは、120のユビキタスシングルコピータンパク質の連結によって細菌分類を提案し、生成された配列アラインメントを用いて最尤樹を生成した。このツリーは、Interactive Tree Of Life (iTOL, v.4.4.2) [52]を用いて可視化およびアノテーションが行われた。
遺伝子予測
Prokka (v1.13.3) [19] は Prodigal (v2.6.3) [53] を利用し，以下のオプションで 3,931 の MAG の各コード配列 (CDS) を予測し注釈をつけた．c'（閉じた末端を持つタンパク質のみを予測）、'-m'（Nsとしてマークされた配列のストレッチにまたがって遺伝子が構築されるのを防ぐ）、'-p single'（単一種を含むゲノム集合体のためのシングルモード）。
一塩基バリアントコール
精度と網羅性を高めるため、私たちの研究固有のゲノムと公開ゲノムデータベース（UHGG）を組み合わせて参照ゲノムを構築しました。まず、472種レベルの全ゲノムと、これまでにヒト腸内に存在することが知られているすべての微生物種を含むUHGGゲノムコレクション全体を1つのFASTAファイルに統合し、そこからBowtie2マッピングインデックスを作成しました。その結果、FASTAファイルには、プロファイリングしたいゲノムがすべて含まれていました。次に、dRep（v.3.2.2）に付属するparse_stb.pyスクリプトを用いて、どの足場がどのゲノムから来たかを示すために、各足場のゲノム割り当てをリスト化したscaffold-to-binファイルを作成しました。その後、Bowtie2（v.2.1.0）を用いて、メタゲノムリードをよくできた参照データベースにマッピングし、BAMファイルを作成しました。次に、Prodigal（v.2.6.3）を用いて各ゲノムの遺伝子を予測し、遺伝子レベルのプロファイリングを行うための遺伝子ファイルを作成しました。必要なファイルが揃ったところで、inStrain profile (v.1.3.2) を各サンプルに対してデフォルトのパラメータで実行し、一塩基変異体 (SNV) をコールしました。inStrainで定義された「class」タイプが「SNV」であるSNVのみを選択し、scaffold、position、reference baseを1つの部位にまとめた。
ゲノムの非類似性
サンプル間のゲノムの違いを比較するために、SNVに基づくゲノム距離を定義した。まず、各サンプル結果ファイルからSNV部位（con_base）を抽出し、参照塩基とそれに対応する変異型に関する情報を得た。このとき、最も多くのリードでサポートされている塩基（con_base）のみを考慮した。次に、すべてのサンプルをマージして、各行がSNVを表し、各列が各サンプルの変異型を表す行列にしました。各列を1つの配列として扱い、それらを整列させて、EMBOSSパッケージのKimura 2パラメータ法 [54]を用いてサンプル間のペアワイズ塩基置換率を含む系統的距離行列を生成した。種内の明確な株クラスターを特定するために、SNPハプロタイプ距離行列を最大距離を分割することで正規化し、R基本関数hclusterのcompleteメソッドを使用して階層的クラスタリングを実施した。ゲノム異同へのアクセスには、クラスカルテストを使用した。
タンパク質の立体構造および機能予測
SNVの影響を受ける一部の遺伝子の機能は不明であった。これに対処するため、ColabFold [55]とMMseqs2 [56]を通じてAlphaFold2人工知能アルゴリズムを使用し、複数配列アラインメントに基づくタンパク質構造をモデル化しました。次に、タンパク質言語モデルとタンパク質構造からの配列特徴を活用してタンパク質機能を予測するグラフ畳み込みネットワークであるDeepFRI [32]を用いて、これらのタンパク質の機能を予測しました。
アソシエーション解析
各塩基部位について、参照塩基にかかわらず、すべてのサンプルについて4つの可能なシナリオ（すなわち、A、T、C、G）が存在する。最初に、1つの塩基が母集団の90%以上を占める部位を除外し、次に、サンプルの20%未満に存在するSNV部位をフィルターで除外しました。次に、データの97.36%を占める2塩基が存在するケースのみを検討し、2値変数として扱った。次に、連続形質と二値形質についてそれぞれ線形回帰モデルとロジスティック回帰モデルを用いて、微生物のSNVと宿主の表現型や代謝物との関連性を確立しました。使用した式は以下の通りです： メタボライト/表現型 ∼ SNV + 日。SNVに対するRMTの影響を明らかにするために、以下の式を持つロジスティックモデルを使用した： SNV ∼ group + day。
倫理的承認
本研究は、河北農業大学の機関倫理審査委員会により承認された（文献：YS19003）。
データの入手方法
本研究の主要な知見を裏付けるすべての関連データは、論文およびその補足情報ファイル内で入手可能です。本研究の解析に使用したメタゲノム配列の生データは、European Nucleotide Archive (ENA) のアクセッションID PRJEB42631から入手できます。
資金提供
このプロジェクトは、中国国家自然科学基金（NSFC）優秀若手科学者基金プログラム（海外）、NSFC表面助成（32270077）、江蘇省医療専門家助成、江蘇省自然科学基金助成（BK20220709）により行われた； 江蘇省双創プロジェクト（JSSCBS20221815）、NJMUスタートグラント（303073572NC21 & YNRCZN0301）、中国農業研究システムMOFおよびMARAプロジェクト、現代農業産業技術研究システム河北乳牛イノベーションチーム（HBCT2018120203）である。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、発表の決定、原稿の作成に関与していない。
著者の貢献
Y.S.、L.T.、X.K.、L.C.が本試験を構想・運営した。Y.S.、Y.L.、T.W.、Q.D.、Y.G.、Y.C.、Q.L.、J.S、H.Z、L.D. 、S.H、 J.L. 、YG、 Y.W. 、そして L.C. がサンプルを収集しデータを作成しました。Q.D.とL.C.はデータを分析した。Q.D.、D.H.、X.W.、Y.J.、L.C.は原稿を作成した。Q.D.、D.H.、X.W.、Y.J.、L.L.、Q.D.、T.W.、H.Z、L.D、S.H、 J.S., Y.W.、HZ, Y.S.,W.S.、Y.S., L.T.,X.K. and L.C. reviewed and editing the manuscript.
掲載の同意
すべての著者が最終原稿を読み、承認した。
競合する利益
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。
謝辞
本研究の運営スタッフの支援に感謝する。
略号
SNVs
一塩基多型
マグネシウム
メタゲノミックアセンブルゲノム
メッセージ転送
微生物移植
エスシーエフエー
短鎖脂肪酸
COG
オーソロックスな遺伝子クラスタ
BCAA
ぶんさゆうアミノさん
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2023年3月31日掲載
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