ヒト膵島のプロテオームに対する複数のストレス因子の影響から、その関与する経路に関する新たな知見が得られる

2023年7月25日 20:50

プロテオミクス
アーリービュー 2300022
研究論文
オープンアクセス
ヒト膵島のプロテオームに対する複数のストレス因子の影響から、その関与する経路に関する新たな知見が得られる

https://analyticalsciencejournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/pmic.202300022

メハリ・ムーズ・ウェルデマリアム、プティ・レディ・スディール、ウー・ジョンミン、チャン・チビン
初出：2023年7月24日
https://doi.org/10.1002/pmic.202300022
について
セクション

要旨
膵β細胞の機能障害は1型糖尿病の初期の特徴である。β細胞機能障害を引き起こす潜在的に重要な因子の中には、サイトカイン攻撃、糖毒性、小胞体（ER）またはミトコンドリアストレスの誘導がある。しかしながら、厳しいストレス下でβ細胞がグルコースの恒常性を維持できなくなる正確な分子メカニズムは不明である。本研究では、高濃度グルコース存在下で炎症性サイトカイン、タプシガルギン、ロテノンを用いて、ヒト膵島の機能不全β細胞が経験する条件を模倣し、TMTベースのプロテオミクスで膵島プロテオームの変化をプロファイリングした。この結果は、ラベルフリーの定量プロテオミクスでさらに検証された。ストレス条件下で発現量の異なるタンパク質を調べたところ、免疫関連経路はサイトカインによって、呼吸性電子輸送鎖と小胞体経路のタンパク質プロセッシングはロテノンによって、そのほとんどが障害されることが明らかになった。高濃度グルコースとともにタプシガルギンを投与すると、脂質合成経路とペルオキシソームタンパク質輸入経路のタンパク質が劇的に増加し、エネルギー代謝経路と小胞分泌関連経路は抑制された。一方、高濃度グルコースは、ロテノンによって誘導された複合体Iの阻害を緩和した。この結果は、β細胞の機能障害に関与する分子事象のより包括的な理解に貢献するものである。
略号
AGC
オートゲインコントロール
BCA
ビシンコニン酸
DDA
データ依存収集
FA
ギ酸
HCD
高エネルギー衝突解離
HLA
ヒト白血球抗原
MHC
主要組織適合性複合体
RF
無線周波数
TMT
タンデムマスタグ
1 はじめに
膵β細胞は、主にインスリンを循環中に分泌することによって血糖値の恒常性を調節する役割を担っている[1]。β細胞の機能不全は、1型糖尿病（T1D）の初期の重要な特徴である[2]。β細胞の機能障害や死滅を引き起こす潜在的に重要なメカニズムの中には、サイトカイン攻撃、小胞体（ER）やミトコンドリアストレスの誘導、高血糖による糖毒性などがある [1, 3-6] 。
インターロイキン-1β（IL-1β）、インターフェロン-γ（IFN-γ）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）などの炎症性サイトカインは、アポトーシス促進タンパク質の活性化や小胞体ストレスの誘導など、さまざまな機序でβ細胞の機能障害に関与する [3, 7]。サイトカインによるβ細胞障害の影響は、様々な細胞モデルやヒト膵島で証明されている。最近の研究では、グルコースによるIL-1βのβ細胞産生がヒト膵島の糖毒性に関与していることも示されており、β細胞の損傷におけるサイトカインとグルコースの協調作用が示唆されている [8]。
ERはインスリン生合成に重要なオルガネラであり、膵β細胞における全タンパク質産生の半分を占める [9] 。膵β細胞におけるインスリン合成の亢進は、ERにおけるフォールディングされていないインスリンの蓄積につながり、これがT1D進行の潜在的なメカニズムの一つとして報告されている [1]。タンパク質のグリコシル化の阻害、Ca2+ホメオスタシスの破綻、ウイルス感染などの他の因子もERストレスを引き起こし、最終的に糖尿病の病態に発展する[1]。例えば、ERストレス物質であるタプシガルギンによって化学的に誘導された膵島β細胞の異常なタンパク質修飾は免疫原性であり、T1Dにおいて自己反応性T細胞による認識を引き起こす [10] 。防御機構として、β細胞はERストレスに応答してunfolded protein response (UPR)シグナル伝達経路を活性化することにより、過剰なタンパク質の負荷を軽減する。しかし、重度の小胞体ストレス下では、細胞は不可逆的なプログラム細胞死へと進む。
ミトコンドリアは細胞のエネルギー源であり、酸化的リン酸化（OXPHOS）と脂肪酸のβ酸化を担い、グルコースと脂質の代謝において重要な役割を果たしている[11]。近年、β細胞や免疫細胞におけるミトコンドリアの機能障害が、T1D [12] やT2D [6] の発症に関与していることが示唆されている。膵β細胞におけるインスリンの合成、処理、分泌には高いエネルギーが必要であるため、そのミトコンドリアは活性酸素種（ROS）産生の主要な場所でもある [13] 。これらのプロセスの調節障害は、β細胞の機能障害や死と関連することが報告されている。例えば、Liら[14]は、ロテノンによるミトコンドリア複合体Iの阻害が、ATP枯渇と活性酸素の増加をもたらしたと報告している。さらに最近では、小胞体-ミトコンドリア間のクロストークがT1Dにおけるβ細胞破壊に関与していることが示唆されている[15]。
我々は最近、タプシガルギンとロテノンがINS-1β細胞株に対して異なるプロテオーム・プロファイルの変化を誘導することを報告した [16]。小胞体およびミトコンドリアにおけるストレスに加えて、生体内のβ細胞は糖尿病の初期および進行段階においてさらなるストレスにさらされている。この点に関して、最近の研究では、炎症性サイトカインに曝されるとβ細胞のプロテオームが著しく変化することが同定されている[17, 18]。したがって、サイトカインに対するβ細胞の反応と、小胞体やミトコンドリアの化学的ストレス因子に対するβ細胞の反応に違いがあるかどうかを確認することは、貴重なことであり、β細胞が自然に存在するオルガノイドである初代ヒト膵島で、β細胞がin vivoで経験するストレス条件を忠実に模倣した環境でこれを実施することが必要である。この目的のために、我々は等重量標識に基づく定量的プロテオミクスを用いて、ヒト膵島における、化学的に無関係な古典的なストレス条件によって障害されるプロテオームの変化とパスウェイを明らかにした。われわれのデータは、これらのストレス因子の相乗効果に関する広範な見解を提供するとともに、それぞれのストレス条件に特有の特異的な経路を同定した。
意義
インスリンを産生する膵β細胞がストレス条件に曝されると、β細胞の機能障害を引き起こし、最終的に1型糖尿病を引き起こす可能性がある。しかし、異なるストレス条件が協調して働くかどうかはよくわかっていない。我々の結果は、炎症性サイトカイン、小胞体ストレッサーであるタプシガルギン、ミトコンドリアストレッサーであるロテノン、および高濃度グルコースはすべて単独で作用し、それぞれの作用機序に一致してヒト膵島のプロテオームにおいてストレッサー特異的な調節異常を誘導すること、そしてサイトカインまたはロテノンに暴露されたときに最も劇的な変化が起こることを示している。タプシガルギンは高濃度グルコースと組み合わせると膵島プロテオームに対して相乗的な撹乱作用を示すが、ロテノンの影響は高濃度グルコース存在下では減少する。複数のストレス条件下でヒト膵島プロテオームを調べることは、in vivoにおける膵島およびβ細胞の機能障害メカニズムを理解する上で貴重な情報を提供する。ロテノンに対する高濃度グルコースの緩和効果は、ロテノン誘導細胞毒性に対する保護メカニズムを示唆し、ミトコンドリアストレスに起因する膵β細胞死における治療的意義があるかもしれない。
2 材料と方法
ヒト膵島の培養と処理
膵島はProdo Labs (https://prodolabs.com/)から購入した。組織は死体ドナーからのものであったため、本研究はヒトを対象とした研究とはみなされず、研究実施の同意は不要であった。組織提供者（n = 3）の特徴を表S1に示す。ドナーの平均年齢は57.0±10.4歳、肥満度は28.0±6.2であった。膵島調製の初期純度は85％-95％、生存率は95％であった。
個々のドナーからのヒト膵島をカウントし、500膵島相当量を8本のチューブに分注した。受領後、輸送培地を、10％ウシ胎児血清（FBS）（Thermo Fisher、カタログ番号：16000-044）、100 U/mLペニシリン-ストレプトマイシン、2 mM L-グルタミンおよび25 mM HEPESを添加した予冷CMRL培地（Gibco、カタログ番号：11530-037、5.6 mMグルコース含有）に交換した。次に、膵島を37℃、5％CO2で48時間、以下の処理条件下で培養した：(i)グルコース（22.3mM）、(ii)サイトカイン（R&D Systems、50U/mL IL-1β、1000U/mL IFN-γ、1000U/mL TNF-α）、(iii)サイトカイン＋グルコース（50U/mL IL-1β、1000U/mL IFNγ、1000U/mL TNFα、22. 3 mMグルコース）、（iv）タプシガルギン（Tocris Bioscience、0.5 µM）、（v）タプシガルギン＋グルコース（0.5 µMタプシガルギン＋22.3 mMグルコース）、（vi）ロテノン（Tocris Bioscience、0.1 µM）、（vii）ロテノン＋グルコース（0.1 µMロテノン＋22.3 mMグルコース）、および（viii）培地のみのコントロール。条件(ii)、(iv)、(vi)、(viii)はすべて5.6mMグルコースを含んでいた。インキュベーション終了後、膵島サンプルを180×g、6℃で2分間遠心した。膵島ペレットを氷冷PBSで2回洗浄した。サンプルは処理前に-80℃で凍結した。
細胞溶解およびS-trapベースのタンパク質消化
細胞溶解とタンパク質消化は、以前に記載されたように行った[16]。簡単に述べると、膵島サンプルは5% SDS、50 mM triethylammonium bicarbonate (TEAB)、pH 8.0を含む溶解バッファーで溶解した。タンパク質濃度は、還元剤に適合するBCAアッセイキット（Thermo Fisher Scientific, Catalog#: 23252,)を用いて測定し、50μgのタンパク質をS-trapマイクロカラム（ProtiFi, NY）を用いて消化した。S-trapカラムから溶出したペプチドを乾燥させ、0.1% FAで再構成した後、Pierce fluorometric peptide assay kit (Thermo Fisher Scientific, Catalog#: 23290)を用いてペプチド濃度を測定した。溶出したペプチドサンプルは、TMT標識およびラベルフリーベースの分析用にそれぞれ分注した。
TMT 10-プレックス標識と高pH逆相ステージチップ分画
各サンプルのペプチドを、TMT 10plex kit（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、メーカーの指示に従って標識した。標識後、サンプルを結合し、高pH逆相stop-and-go抽出（Hp-RP StageTips）を用いて分画した。分画したサンプルをSpeedvacで乾燥し、0.1% FAで再構成した。得られたペプチドをEvotips (EvoSep, Denmark)を用いて脱塩・濃縮した。
ラベルフリー定量プロテオミクスのための分画とライブラリー構築
ラベルフリー定量（LFQ）スペクトルライブラリーを構築するために、各消化サンプルから等量のペプチド（1 µg）をプールした（総プールペプチド量：24 ug）。プールしたペプチドをHp-RP StageTipsで分画し、6フラクションを集めた。乾燥後、分画したペプチドサンプルを0.1% FAで再構成し、Evotipローディングに供した。
LC-MS/MS分析
すべてのペプチドサンプルは、EvoSep Oneシステム（EvoSep, Odense, Denmark）を用いて、15 cm × 150 µm i.d.キャピラリーカラム（1.9 µm C18粒子）で、あらかじめプログラムされた1日あたり15サンプルのグラジエント法（グラジエント長88分）を用いて分離した。移動相は、溶媒Aとして0.1% FA、溶媒BとしてACN中0.1% FAで構成され、ペプチドは溶媒Bの35%以内で0.22 µL/minの流速でカラムから溶出された。Evosep Oneシステムは、Easysprayソースを備えたOrbitrap Exploris 240質量分析計（ThermoFisher Scientific）にオンラインで連結された。TMT標識ペプチドの場合、装置はDDAモードでフルMSスキャン設定を行った：分解能60k、質量範囲m/z 350-1600、RFレンズ：分解能60k、質量範囲m/z 350-1600、RFレンズ：70%、正規化AGCターゲット：300%、次いで分解能45k、標準AGCターゲット、HCDコリジョンエネルギー31で0.7 m/zのアイソレーションウィンドウ、ダイナミックエクスクルージョン25秒のトップ20 MS/MSスキャンを行った。
ラベルフリー定量取得法では、以下のMS設定を用いてスペクトルライブラリを構築した： 120k分解能、質量範囲375-1500m/z、注入時間25ms、AGCターゲットの300%。40秒間の排除時間で上位20個のプリカーサーイオンを1.5 m/zの分離ウィンドウと7E4の最小強度で選択し、HCDコリジョンエネルギー30でフラグメンテーションした。
データベース検索
TMTデータについては、MS/MS rawファイルをProteome Discoverer (PD, version 2.5.0.400, Thermo Fisher Scientific)で処理した。簡単に説明すると、Sequest HT検索エンジンを適用して、一般的に観察されるMSコンタミ（246エントリーを含む）を補足したUniprotヒトタンパク質データベース（リリース2021.07、20307エントリー）に対して生データを検索した。検索は、TMT 10plex試薬のリジンとN末端の静的修飾（+229.163）Da、システインのカルバミドメチル（+57.021）Da、メチオニン残基の酸化の動的修飾（+15.995）Da、前駆体質量の許容範囲20ppm、フラグメント質量の許容範囲0.5Daで設定しました。消化酵素としてトリプシンを使用し、最大2回のミス切断を行った。ペプチド長の最小値は7、最大値は144とした。信頼性の高い結果を得るために、タンパク質同定は、ペプチドスペクトルマッチ(PSM)、ペプチド、タンパク質レベルで1%の偽発見率(FDR)になるようにフィルターをかけた。FDRはPDに組み込まれたPercolatorアルゴリズムを用いて計算した。
ラベルフリーデータについては、PDソフトウェア（バージョン2.5.0.400）を用いて生ファイルを処理した。簡単に説明すると、2段階のSequest HT検索エンジンが適用され、TMTデータ処理で使用したのと同じタンパク質データベースとMSコンタミに対してマッチングされた。Minora特徴検出器をラン間のマッチングに使用し、同定性を高めた[19]。また、INFERYSを使用してPSMの強度ベースの再スコアリングを行い、確実な同定を強化した[20]。ラベルフリーデータの修飾は、システイン上の静的修飾としてカルバミドメチル（+57.021 Da）、メチオニン上の可変修飾として酸化（+15.995 Da）とし、前駆体の質量許容差は10 ppm、フラグメント質量の許容差は0.02 Daとした。その他のパラメータはTMTデータと同じである。
統計解析
エクスポートされたタンパク質の存在量値は、Perseus [21] ソフトウェア（バージョン1.6.14.0）を用いて解析し、可視化した。統計解析の高い信頼性を確保するため、データはさらにフィルタリングされた： (1)24の生物学的サンプルすべてにおいて欠損値なしに同定されたタンパク質のみ、(2)2つ以上のユニークペプチドで定量されたもの、(3)潜在的な汚染物質を除いたもの。定量されたタンパク質データはlog2変換され、さらに中央値センタリングを用いて正規化された後、ComBatアルゴリズム（Perseusに組み込まれたRソフトウェア）を用いてバッチ効果補正が行われた。サンプルの再現性を評価するために、ピアソンの相関係数、ヒストグラム分布、箱ひげ図を行った。2つの条件間の比較には両側スチューデントのt検定を適用し（FDR < 0.05、Permutation-based FDRによる）、各処置群が対照群と有意に異なるかどうかを判定した。治療によって撹乱された生物学的経路をより良く解釈するために、FDR < 0.05のタンパク質が少ない場合には、未調整のp値も使用した。教師なし階層クラスタリング分析は、視覚的ヒートマップを作成するために行った。結果をさらにグラフ化するために、GraphPad Prism（version 9.3.0, GraphPad software, San Diego, CA）を適用した。
機能とパスウェイの濃縮解析
GeneOntology、KEEG、Reactomeなどの機能データベースを統合した強力なツールであるMetascape [22] (http://metascape.org)を用いて、異なる処理条件から同定された発現量の異なるタンパク質(DEPs)の機能とシグナル伝達経路の濃縮を行い、タンパク質の機能認識を探った。簡単に説明すると、各治療群で発現が増加または減少したタンパク質をMetascapeソフトウェア（バージョン3.5.20211101）に提出し、次に、統計的に有意なp値<0.01、最小カウント3、濃縮度>1.5に基づいて、濃縮されたパスウェイと生物学的プロセスを同定した。上位に濃縮された用語はヒートマップとして表示され、さらに各クラスターで濃縮された生物学的用語に関連するタンパク質の数を示すために表で外挿された。タンパク質間相互作用（PPI）濃縮解析は、STRINGデータベースを用いてMetaScapeで行った。PPIネットワークに3つ以上のタンパク質が含まれる場合、Molecular Complex Detection (MCODE)アルゴリズムが適用され、高密度に結合したネットワーク構成要素が同定される[23]。次に、パスウェイとプロセスの濃縮解析が各 MCODE コンポーネントに独立に適用され、p 値で最もスコアの高い用語が対応するコンポーネントの機能説明として保持される。PPIの図において、色は異なるMCODE構成要素を表す。ネットワークの頂点はタンパク質で、エッジはタンパク質間の相互作用である。
3 結果
研究デザインとプロテオーム解析の概要
本研究の目的は、一般的に知られている様々なストレス誘発因子にさらされた際の、ヒト膵β細胞における分子応答を調べることであった。この目的のために、ヒト初代膵島を培養し、高濃度グルコース（Glc：糖毒性を誘導する）、炎症性サイトカイン（Cyto：IL-1β、IFN-γ、TNF-αを含む）、ロテノン（Rot：ミトコンドリア複合体Iに対する阻害剤）[24]、およびタプシガルギン（Tha：ERストレス誘導剤）[25]という化学的に無関係な様々なストレス因子で処理した（図1A）。相乗効果を評価するために、ヒト膵島を高濃度グルコースの存在下または非存在下で化学的ストレス物質で処理した：サイトカイン＋グルコース（CytoGlc）、ロテノン＋グルコース（RotGlc）、およびタプシガルギン＋グルコース（ThaGlc）。これらの処理後、これらのストレスに応答したヒト膵島のプロテオミクス変化を正確にプロファイリングするために、ペプチドレベルの等重量標識に基づく定量プロテオミクス戦略を適用した。
図1
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キャプション
プロテオミクス解析の結果、方法の項で述べたように処理したデータマトリックスを厳密にフィルタリングした後、1％FDRで7006個のタンパク質群（表S2）が同定され、ヒト膵島の深いプロテオームカバレッジを示した。これらのタンパク質群のうち、3810個のタンパク質群が24個のサンプルのいずれにおいても欠損値なしに信頼性をもって定量され、そのうち3651個（約96％）はユニークペプチド2個以上で定量可能であり、さらなるデータ解析に使用された。定量可能なタンパク質のデータ可視化分析では、各処理条件の3つの生物学的複製間で高いピアソンの相関が示され（図S1A）、タンパク質の存在量分布は一貫しており（図S1B）、各処理条件間で箱ひげ図によって示されるカラム上のペプチド負荷量が等しいことが示された（図S1C）。PANTHER分類システムを用いると、図S2Aに示すように、定量可能なタンパク質の大部分は、細胞プロセス（36％）、代謝プロセス（21％）、生物学的制御（13％）に関連しており、同様に、タンパク質の約43％は分子結合機能に関与し、35％は触媒活性に関連していた（図S2B）。
各膵島細胞タイプに特異的な分泌タンパク質、すなわち、インスリン（INS、β細胞）、グルカゴン（GCG、α細胞）、ソマトスタチン（SST、δ細胞）、膵ポリペプチド（PPY、PP細胞）は、プロテオミクスデータからすべて検出された。INSレベルは、Cyto、CytoGlc、Glc、およびThaGlc条件下でコントロールと比較して有意に減少したが、Rot、RotGlc、およびTha処理では発現に有意な変化はなかった（図1B）。GCGはCyto、CytoGlc、Rot、RotGlc、ThaGlcストレス条件下で有意に減少した（図1C）。SSTとPPYのレベルは、SSTではTha処理で、PPYではThaGlc処理で発現の増加が観察された以外は、すべてのストレス条件下で有意な変化は見られなかった（図S3）。ストレスを受けたヒト膵島に関連する調節異常タンパク質を同定するために、各処理条件をコントロール（Cont）群と比較する両側t検定（FDR < 0.05）を行った。次に、各比較で同定されたDEPをさらに機能濃縮とネットワーク解析のために処理し、後続のセクションで述べるように、障害された生物学的機能とパスウェイを同定した。
サイトカインによって撹乱された発現タンパク質とパスウェイ
ヒト膵島のサイトカイン処理で同定されたDEP（277個の発現上昇タンパク質と91個の発現低下タンパク質）の教師なし階層的クラスタリング解析では、コントロール群に対して明瞭なクラスタリングが見られた（図2A、左および表S3）。プロテオミクスの変化をさらに調べるため、Metascape可視化ツールを用いて、同定されたDEPsのジーンオントロジー（GO）解析を行った。サイトカイン処理で有意に活性化された生物学的プロセスのトップは、インターフェロンシグナル伝達（p < 6.0E-29）とサイトカイン応答（p < 1.2E-13）プロセスであり、炎症性サイトカインにさらされた時の細胞の反応と一致していた（図2A、右）。逆に、サイトカイン処理で低下した生物学的プロセスの上位には、特にホルモン代謝プロセス（p < 2.2E-11）および創傷に対する応答（p < 4.8E-05）が含まれ、サイトカインによって誘導されたヒト膵島のβ細胞機能不全を示している。
図2
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キャプション
277個の発現上昇タンパク質のPPIネットワーク解析により、84個のタンパク質を代表する6つの主要相互作用モジュールが同定された（図2B、表S4）。よく注釈付けられたモジュールの一つは、免疫系におけるサイトカインシグナル伝達であり、HLA-A、HLA-B、HLA-DRB5 [26]のようなT1Dに非常に関連することが知られているいくつかのMHC標的分子で構成されている。このモジュールでは、48個のタンパク質のうち22個がPPIネットワークにおいて有意に濃縮され、相互作用スコアが高かった（図2B (i)）。22個のタンパク質のうち、12個（CASP7、WARS1、CHD2、B2M、IFIT2、CXCL10、CCL5、CMPK2、GBP1、GBP4、ICAM1、ISG15）の発現レベルが図2Cに示された。これら12種類のタンパク質のほとんどは、免疫細胞の走化性とアポトーシスに関連していると報告されている。例えば、カスパーゼ-7（CASP7）は、T1Dの自己反応性T細胞に関与するアポトーシス促進タンパク質である[27]。CCL5とCXCL10は、T1Dにおける自己免疫破壊の促進因子としてよく知られている2つのケモカインであり、T1Dの血清中ではその循環レベルが非常に上昇している [28, 29]。トリプトファン-tRNA合成酵素1（WARS1）は、自然免疫、IFN-γシグナル伝達、免疫細胞増殖において重要な役割を担っており [30]、糖尿病の病態生理や合併症と正の関連があることも報告されている [31]。これらの報告と同様に、サイトカインで処理したヒト膵島ではWARS1のレベルが上昇することがわかった（図2C）。INF誘導性抗ウイルスタンパク質であるIFIT2（図2C）と、IFN-γ誘導性サイトカインとして作用し、アポトーシスを促進することが知られているユビキチン様タンパク質ISG15についても、同様の発現上昇が観察された。MHC-I複合体の構成成分であるβ-2-ミクログロブリン（B2M）もサイトカイン刺激により発現が上昇することが見出され、抗原プロセッシングおよび提示活性の上昇とよく一致している。
ペルオキシソームは複数の経路に関与する膜結合小器官であり、脂質と活性酸素の代謝および抗炎症反応において重要な役割を果たしている [32, 33]。Peroxisome Proliferator-Activated Receptor (PPAR) ファミリータンパク質は、膵β細胞におけるグルコース刺激によるインスリン分泌を調節しており [34]、正常なペルオキシソーム代謝は、マウスのβ細胞の構造と機能を維持するために極めて重要である [32]。本研究では、16種類のタンパク質がペルオキシソームタンパク質輸入経路に関与しており、サイトカイン投与群では一貫して発現レベルが上昇していた（図2B(ii)）；このうち、ペルオキシソーム生合成因子3（PEX3）とペルオキシソーム膜タンパク質（PEX14）は、ペルオキシソーム輸入装置の必須構成要素である。マウスモデルを用いた免疫組織化学的研究では、PEX14の免疫反応性が、外分泌膵臓に比べて内分泌膵臓で有意に高いことが示された [32, 33]。この観察と同様に、最近の研究では、PEX14が発現し、免疫シグナル伝達反応の制御に関与していることが報告されている [35] 。これらの結果は、サイトカインによって誘導される炎症と免疫シグナル伝達に対するペルオキシソームの活性の上昇を反映している。
一方、サイトカイン投与群で有意に発現低下したタンパク質は、インスリン様成長因子（IGF）の輸送とIGF結合タンパク質（IGFBP）による取り込みの制御、好中球の脱顆粒、ペプチドホルモンのプロセシングを含む3つの主要な機能モジュールで強調された（図2D）。IGFおよびIGFBPsは、糖尿病の新たなバイオマーカーとなりうるものとして探索されてきた [36] 。IGFとIGFBPの発現レベルは、病態によって異なる。例えば、IGFBP1とIGFBP2の発現レベルは、T1Dで有意に増加することが報告されている [37] 。注目すべきは、これらのタンパク質のほとんどが、クロモグラニン（CHGBまたはSCG1）、セクレログラニン2（SCG2）、セクレログラニン3（SCG3）を含むグラニンファミリーに属していることであり、これらは最近、糖尿病の重要な一因であることが証明された [38, 39]。ある研究では、SCG3は機能不全に陥ったβ細胞から分泌され、T1Dでは発現レベルが上昇していることが報告されている[40]。
サイトカインと高グルコースによって障害される発現の異なるタンパク質とパスウェイ
ヒト膵島への高グルコースおよびサイトカイン曝露の複合効果も、非処置対照と比較して評価した。この処理条件では合計223のDEPが同定された（図S4、表S5a）。注目すべきは、181個のDEPがサイトカイン単独処理または複合処理効果（CytoGlc）のいずれかによって共通に同定された一方で、42個がCytoGlc処理群で特異的に同定されたことであり（図S4A）、複合処理の相乗効果が特異的なプロテオーム変化を引き起こす可能性が示された。これらの42個のタンパク質のうち、いくつか（PPA1、SDC2、DNAJA1、PSME2、PSMB8、SLC29A1）は、ヒト膵島のIL-1β + IFN-γ処理において調節異常が生じたと以前に報告されている[18]。複合治療効果は、自然免疫反応、炎症反応、およびI型インターフェロン産生の正の制御に主に関与する生物学的プロセスを強調している（表S5b）。CytoGlc投与群で発現が増加した44タンパク質のネットワーク解析では、6つの機能モジュールが強調された（図S4B）。免疫系におけるサイトカインシグナル伝達、抗原プロセシング、MHCクラスIを介した内因性ペプチド抗原の提示、およびタンパク質のポリユビキチン化を含む経路は、Cyto-およびCytoGlc処理群の両方で共通して濃縮されていることが観察された。一方、インターロイキン-1シグナル伝達、ケモカイン受容体はケモカインに結合する、およびIFN刺激遺伝子による抗ウイルス機構は、CytoGlc処理群で特異的に濃縮されていた。
サイトカインに加えて高グルコースによって誘発される変化をさらに調べるため、Cyto投与群と比較したCytoGlcの治療効果も評価した。解析の結果、223個のDEP（74個が発現上昇、149個が発現低下、p＜0.05）が得られた（図2E、表S6）。さらに濾過した結果、サイトカイン単独または非処置の対照ヒト膵島と比較して、CytoGlc処理群で特異的に検出された66のアップレギュレートおよび134のダウンレギュレートタンパク質が得られた。66個の発現上昇タンパク質のPPIネットワーク解析から、13個のタンパク質を代表する2つの主要な相互作用モジュールが同定された（図2F）。いくつかの研究から、転写産物のalternative splicingがβ細胞の正常な機能において重要な役割を果たしていることが示唆された。制御不能なRNA修復系では、ナンセンス媒介崩壊（NMD）のようなRNA崩壊経路が品質管理機構として必要である[41]。インスリンイントロン2を含むプレmRNAの発現レベルは、高グルコースにさらされたヒト膵島で有意に増加することが報告されている [42]。一方、糖尿病では炎症性サイトカインの発現量が増加し、NMD構成因子を刺激することが示されている。本研究において、NMD経路に関与する7つのタンパク質は、CytoGlc処理群で一貫して発現レベルが上昇していた（図2F(i)）；このうちEIF4A3は、mRNA上のスプライスジャンクションに沈着するスプライシング依存性多タンパク質エクソンジャンクション複合体（EJC）の中核成分の1つである［43］。研究により、EIF4A3は様々な癌の潜在的なマーカーとして使用される可能性があり、妊娠糖尿病（GDM）の病因において重要な役割を果たす可能性があることが示されたが [43] 、GDMの病因におけるEIF4A3の正確な分子メカニズムは明らかではない。これらの報告と同様に、EIF4A3レベルの増加は、糖毒性の潜在的な標的を示唆している可能性がある。
一方、CytoGlc処理群で有意に発現が低下したタンパク質は、MET活性の負の制御、血管輸送におけるSNARE相互作用、DNA損傷応答の3つの主要な機能モジュールで強調された（図S4C）。これらのシグナル伝達経路は糖尿病に関連していた [44-46]。例えば、糖尿病患者における最近のデータでは、DNA損傷と修復のアンバランスが他の合併症と関連している可能性が示唆されている [46]。上記の文献と一致するように、DNA損傷応答シグナル伝達経路で有意に発現低下しているタンパク質が観察され（図S4C）、高グルコース濃度下でのDNA修復システムの障害が示唆された。
ロテノンによって撹乱された発現差のあるタンパク質と経路
ロテノン処理により、1105個のDEP（566個の発現上昇タンパク質と539個の発現低下タンパク質）が生じた（図3A、左、および表S7）。機能濃縮解析の結果、ミトコンドリア機能障害に関連するプロセスが発現上昇タンパク質で強調され（図S5A、表S8）、mRNAの安定性制御に関与するタンパク質が発現低下した（図S5B）。アップレギュレートされたタンパク質には、クエン酸（TCA）サイクルと呼吸性電子輸送（ETC）経路に関与する主要な酵素が含まれる（p < 4.6E-61）（図3A、右）。例えば、ETCの複合体Iで同定された41個のタンパク質のうち、17個が有意にアップレギュレートされた（図S5C）。これらには様々なNADH:ユビキノン酸化還元酵素（複合体I）サブユニットNDUFB11（1.5倍）、NDUFB9（1.4倍）、NDUFC2（1.4倍）、NDUFA13（1.3倍）が含まれる（図3B）。また、ATP合成酵素（複合体V）の13タンパク質が有意に発現上昇していることも確認された（図S5D）。さらに、複合体II（SDHA、SDHB、SDHD）、複合体III（UQCRC1、UQCRC2、UQCRFS1、UQCRQ）、複合体IV（COX4I1、COX6C、COX2、COX5A）に関与する主要タンパク質の一部も同様にアップレギュレートされた。さらに、566個の発現上昇タンパク質のうち、PPIネットワーク解析を用いて12の相互作用モジュールに関与する可能性のある224個のタンパク質を同定した（表S9）。最も多くアノテーションされたモジュールのうち、ERにおけるタンパク質プロセッシングは、ロテノン投与群で発現レベルが一貫して上昇した54個のタンパク質が同定された（図S6）。ロテノンは、複合体IにおけるNADHからユビキノンへの電子伝達を阻害し、ATPの合成が制限された酸化的リン酸化の阻害につながる。複合体Iの活性が低下すると、恒常性を維持するために、エネルギー産生を補うために複合体タンパク質の合成の増加が必要となる。タンパク質合成の増加は、ミトコンドリアにおけるアミノ酸、炭水化物、ADP、膜貫通輸送の代謝過程を増加させる（図S5A）。
図3
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一方、ロテノン処理群で有意に発現が低下したタンパク質は、10の機能的相互作用モジュールで強調表示され（図3D、表S10）、酸化ストレスや細胞増殖の低下に対する応答を示していた。例えば、ペントースリン酸経路（PPP）はグルコース代謝の重要な部分であり、糖尿病との関連が知られている[47]。本研究では、発現レベルが低下した41のタンパク質がPPPに濃縮された（図3D(ii)）。これには、トランスケトラーゼ（TKT）やトランスアルドラーゼ1（TALDO1）などの重要な酵素が含まれる[47]。TKTの欠損は、リボース-5リン酸（R5P）の蓄積と解糖の低下を引き起こすことが報告されている [48]。非糖質源からグルコースが合成される経路である糖新生も、ロテノン処理したヒト膵島で有意に低下していることがわかった（図3D（iii））。このことは、糖新生の初期段階がオキサロ酢酸やリンゴ酸の形成のようにミトコンドリアで起こることから、脂肪酸に基づく効率的なグルコース合成のためにミトコンドリアが機能不全に陥っていることを示している。さらに、微小管ベースのプロセスがダウンレギュレートされた。これは、ロテノンが微小管の形成を阻害し、有糸分裂の停止と細胞増殖の阻害をもたらすといういくつかの研究と一致している[49]。
ロテノンと高グルコースによって撹乱された発現量の異なるタンパク質と経路
ロテノンとグルコースの複合処理効果（RotGlc）は、非処理のヒト膵島と比較して69個のDEP（FDR < 0.05）をもたらした（表S11a）。RotGlc処理群（RotGlc vs.Cont）では、ロテノン単独群（Rot vs.Cont）に比べてDEPsの数が少なかったことから、高濃度グルコースによってロテノン誘発毒性が軽減されたことが示唆された。併用処理ではプロテオームの変化はあまり観察されなかったが、RotGlc処理群では、TMEM259、TAX1BP1、TUBGCP6、TENM3など、発現レベルの上昇した主要な制御タンパク質が同定された（表S11a）。例えば、membralin（TMEM259）は妊娠糖尿病で最も変化するタンパク質の一つとして報告されている[50]。このタンパク質はまた、小胞体内のミスフォールディングタンパク質のクリアランスに必要なERAD経路における役割を持つことが注釈されている。
ロテノンに加えて高グルコースによって誘発される変化をさらに評価するため、Rot処理群と比較してRotGlcの処理効果も評価した。この条件では、合計98個のDEP（26個の発現上昇タンパク質と72個の発現低下タンパク質、p＜0.05）が同定された（図3E、表S11b）。さらに濾過および機能濃縮解析を行った結果、RotGlc処理群で特異的に発現上昇した19個のタンパク質は、糖尿病合併症における低血糖誘発性小脳機能障害のメカニズムとして提唱されている脊髄小脳失調症に主に関連していることが示された（図S5E）[51]。我々の結果は、SPTBN2、PUM1およびATXN2Lの3つのタンパク質がこの経路に関与しており、RotGlc投与群で一貫して発現レベルが上昇していることを示している。
さらに、RotGlc処理群で一意に発現低下した60のタンパク質について機能濃縮解析を行ったところ、炭素代謝、モノカルボン酸代謝プロセス、アミノ酸代謝プロセス、および酸素レベル増加に対する応答が、最も濃縮されたGene ontology用語であることが示された（図S5F）。PPIネットワーク解析の結果、ATP5MJ、ATP6AP1、ATP6がアミノ酸代謝過程における発現低下タンパク質の中核であることが示された（図3F）。
タプシガルギンと高グルコースによって撹乱された発現タンパク質とパスウェイ
タプシガルギン単独での処理と比較して、タプシガルギンと高グルコース（ThaGlc）の組み合わせは、プロテオームにおいてより広範な変化をもたらしたので、この条件をさらなる解析のために選択した。全体として、この処理群ではコントロールと比較して849個（308個の発現低下と541個の発現上昇）のDEPが同定された（図4Aおよび表S12）。DEPsの機能濃縮解析をさらに進めると、アップレギュレートされたタンパク質はタンパク質異化プロセス、内膜系組織、ncRNA代謝プロセスなどに関連していた（図S7A）。一方、前駆代謝物およびエネルギーの生成、細胞アミド代謝プロセス、リボースリン酸代謝プロセスは、同じ処理下で減少した（図S7B）。これらの結果は、小胞体内のミスフォールドあるいは蓄積したタンパク質のクリアランスにおける活性の上昇を反映している。例えば、脂質滴関連タンパク質であるTAOK3を過剰発現させると、ヒトおよびマウスの肝細胞における脂質蓄積とERストレスが悪化することが最近明らかになった[52]。この研究と一致するように、我々のデータでも、TaGlc処理したヒト膵島ではコントロールと比較してTAOK3の発現レベルが上昇していることが同定された（図4B、上図））。逆に、RBP4（Retinol-binding protein 4）、PCSK1（neuroendocrine convertase 1）、CPE（carboxypeptidase E）といった他のタンパク質前駆体のプロセシングに関与するタンパク質の発現レベルは、対照群と比較して有意に低下していることがわかった（図4B、下パネル）。これは、ERストレスの結果としてタンパク質プロセシングが低下していることを示している。
図4
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ThaGlc処理群で発現が増加したタンパク質のPPIネットワーク解析から、13の相互作用モジュールに関与する133のタンパク質が同定され、そのうち6つの主要なモジュールがここに示されている（図4C、表S13a）。その中で、イノシトールリン酸代謝は最も注釈が多く、33個のタンパク質が同定された（図4C(i)）。この経路に関与する33個のタンパク質のうち、2倍以上の変化を示したのは6個（LSM2、BIRC6、LDLR、PLCD1、PIKFYVE、HSPBP1）で、LDLR、PLCD1、PIKFYVEは脂質合成、輸送、エンドサイトーシスに直接関与していた。
逆に、ThaGlc処理群で有意に発現低下した144のタンパク質は、9つの機能的相互作用モジュールで強調された（図4D、表S13b）。これらの144個のタンパク質のうち、30個がIGFBP経路によるIGFの輸送と取り込みの制御に関与しており（図4D(i)）、その中には、膵臓β細胞におけるインスリン／ホルモンのプロセシングと分泌に重要なセクレログラニンファミリータンパク質（CHGB、SCG2、SCG3）のような、糖尿病と関連する調節不全の主要タンパク質が含まれている。INSとIGFの調節、酸化的リン酸化と脂肪酸β酸化のこれらの正統的経路に加えて、我々はまた、エキソサイトーシスにおける小胞ドッキングのようなThaGlc下で有意にダウンレギュレートされた新規経路を同定し（図4D(vi)）、再びERストレス下の膵島におけるホルモン分泌障害を示した。
我々はまた、タプシガルゲンの上に誘導された高グルコースの効果を評価するために、ThaGlcとTha処理条件を比較した。解析の結果、362個のDEP（327個の発現上昇および35個の発現低下タンパク質、q＜0.05）が得られた（図4E、表S14）。さらに濾過および機能濃縮解析を行った結果、ThaGlc処理群で一意に発現上昇した97個のタンパク質は、特にMETによるシグナル伝達、小胞媒介輸送、オルガネラ局在に主に関連していることが示された（図S7C）。PPIネットワーク解析により、小胞輸送シグナル伝達経路におけるSNARE相互作用が同定され（図S7D）、13のタンパク質（NUP98、BRD4、KPNA6、VPS18、IRF2BP1、PPP1R9B、PPP4R3B、STX8、MED23、SNAP29、KPNA4、BET1L、GATAD2B）がこの条件下で一貫して発現レベルを増加させた。
一方、ThaGlc処理群（ThaGlc vs. Tha）で有意に発現低下したタンパク質は、抗原プロセシングと提示、細胞質tRNAアミノアシル化、PID TCPTP経路、COPIを介した前向輸送、翻訳を含む5つの主要な機能モジュールで強調された（図4F）。抗原のプロセシングと提示の経路は、適応免疫、ひいては糖尿病において極めて重要であるが[53]、膵β細胞によって自然にプロセシングされ提示されるペプチドについてはほとんど知られていない。最近の研究では、抗原提示細胞における高グルコース濃度の影響が分析され、2型糖尿病（T2D）患者では、低グルコース濃度と比較して、高グルコース濃度下で自然免疫および適応免疫の障害が観察されることが示唆された[54]。この観察結果は、ThaGlcで処理したヒト膵島におけるタンパク質発現の今回の分析結果と一致している（図4F(i)）。一方、糖尿病マウスや患者の骨格筋では、ミトコンドリアのアミノアシル化tRNA合成酵素の発現が変化していることが報告されている[55]。上記の文献と一致して、細胞質tRNAアミノアシル化タンパク質がThaGlc処理群によって調節異常であることが見出された（図4F(ii)）。
高グルコースによって撹乱される発現タンパク質とパスウェイ
サイトカインやロテノンおよびタプシガルギンの他の化学的ストレス因子とは異なり、グルコースのみに暴露されたヒト膵島からは、調整p値（FDR）＜0.05で同定されたDEPはわずかであった（DENND4A、CHGA、SCG3、INS、TIMP2）。基準を緩和（p < 0.05）すると、さらに214のDEPが同定された（表S15）。高グルコース処理で活性化された生物学的プロセスの上位には、異化プロセスの正の制御、タンパク質のフォールディング、細胞アミド代謝プロセスの制御などが含まれた（図S8A）。例えば、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3（GSK3）の役割は、グルコースのホメオスタシスとインスリン抵抗性の発症に関与している [56] 。グルコース処理群でタンパク質発現が上昇した他の興味深い生物学的プロセス／パスウェイには、膜輸送（DENND4A、 TMF1、TRIP10）、細胞内ステロイドホルモン受容体シグナル伝達経路（RNF14、TMF1、UBR5）、およびGTPase活性の活性化（CRK、RANGAP1、RABGAP1）が挙げられる。
対照的に、高濃度グルコース下でダウンレギュレートされた生物学的プロセスのトップは、インスリンプロセッシングと分泌顆粒へのタンパク質局在化などであった（図S8B）。このことは、以前の報告[8]と一致して、ヒト膵島を高濃度グルコースにさらすと分泌されるインスリンのレベルが有意に低下することを反映している（図1BおよびS8C）。これと一致して、分泌タンパク質であるセクレログラニンIII（SCG3）およびクロモグラニンA（CHGA）も、高グルコースとのインキュベーションにより、プロインスリンの選別およびタンパク質分解処理に機能する2つの分泌タンパク質も比例して減少した（図S1C）。一方、細胞外マトリックス成分を分解するメタロプロテアーゼの阻害剤であるメタロプロテアーゼインヒビター2（TIMP2）は、我々の研究で発現の減少を示した（図S8C）。これは、ヒト膵島における糖毒性への応答として、細胞外マトリックスの分解およびリモデリングにおける活性の増加を示している。
ラベルフリー定量プロテオミクスは、ストレスを受けたヒト膵島のTMTベースのプロテオミクス研究で得られた知見を検証した。
ラベルフリー定量（LFQ）は、同じ処理条件下で採取したサンプルを用いて、TMTデータの変化したタンパク質を検証するために行われた。合計で6327個のタンパク質がFDR < 1%で同定され、そのうち約65%は24個のサンプルすべてにおいて欠測なしで定量された（表S16）。TMTデータで同定されたタンパク質のうち、約70％（5453タンパク質）がLFQデータで検出された（図S9A）。さらに、LFQデータで複数の処理条件からの比較を組み合わせると、合計468個のDEPも検出された。これらの共通に同定されたDEP（n = 468）または共通に定量されたタンパク質（n = 3130）のLFQとTMTデータ間のピアソンの相関は高かった（DEPのRは約0.9）（図5A、Bおよび図S9B）。重要なことは、PPIネットワーク解析を用いてTMTデータから選択された標的タンパク質は468個のタンパク質の中に含まれており、TMTデータにおけるそれらの発現傾向はLFQデータと類似していることである。例えば、図5Cに示した5つのタンパク質は、TMTとLFQの両データで同定された呼吸性電子伝達経路に関与しており、対照群と比較して、Rot処理群では一貫して発現レベルが上昇している。
図5
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4 結論
インスリン分泌β細胞の機能障害は、T1Dの早期進行の重要な特徴である。従って、高血糖や他の細胞ストレス条件によって引き起こされる分子メカニズムを包括的に同定することは、過酷なストレス条件下で生存できないβ細胞を深く理解する上で極めて重要である。我々は以前、筋小胞体/ER Ca2+ ATPase経路遮断薬タプシガルギンとミトコンドリア呼吸鎖複合体I阻害薬ロテノンが、ラットINS-1β細胞モデルにおいてβ細胞機能不全の明確な特徴を示したことを報告した[16]。これらの知見と観察をより洗練されたβ細胞モデルに反映させるために、本研究では、MSベースのプロテオミクスを応用して、異なるストレス条件下におけるヒト膵島のタンパク質発現の変化を定量的にプロファイリングした。この目的のために、機能不全β細胞が経験する7つのストレス誘発条件を模倣して、単離したヒト膵島を刺激した。これらの化学的ストレス因子と投与条件は、文献 [18, 57-60]と培養膵島が健康であるという我々の観察に基づいて選択した。
興味深いことに、ヒト膵島をグルコースまたはタプシガルギン単独で暴露した場合にはわずかな変化しか観察されなかったが、これらの組み合わせ（ThaGlc）ではプロテオミクスの変化が劇的に増加した。われわれの結果は、炎症性サイトカインとThaGlcが膵島のプロテオームを変化させる点で共通していることを示した：これは、ThaGlcと炎症性サイトカインの両方によって誘発される小胞体ストレスと膵島細胞の分泌機能と一致している[61]。膵島MHCクラスI抗原発現のアップレギュレーションは、T1Dの重要な特徴として証明されており [62]、β細胞機能不全の分子メカニズムとして、細胞性免疫反応を誘発するこれらのストレス因子の潜在的効果を示唆している。これとは反対に、我々の最近の研究では、タプシガルギンで処理したINS-1細胞において、IGFBP経路によるIGFの輸送と取り込みの制御に関与するタンパク質のレベルが上昇していることが見いだされた [16]。これらのタンパク質の発現レベルに一貫性がないのは、処理条件や細胞の種類が異なるためかもしれない。
一方、ロテノンは、他のストレス物質と比較して、全く異なる効果を示した。単独で使用した場合、酸化的リン酸化、ERでのタンパク質プロセシング、TCAサイクル、呼吸性電子輸送に関与するタンパク質のレベルは上昇したが、PPPと糖新生経路に関連するタンパク質のレベルは低下した。これらの観察のほとんどは、ロテノン処理したINS-1細胞モデルに関する我々の最近の研究[16]と一致しているが、今回のデータでは、さらにいくつかの経路が障害されている。ロテノンのユニークな点は、高濃度グルコースと併用した場合、ダメージ効果が劇的に減少し、69 DEPsにとどまったことである。これは、ミトコンドリアにおけるエネルギー産生の減少に対抗するために、細胞質におけるPPPを介した解糖が促進された結果であると考えられる。また、ストレスを受けたミトコンドリアにおける活性酸素産生の増加に対する抗酸化反応として、重要な抗酸化物質であるグルタチオンのレベルが上昇し、その結果、ミトコンドリアの正常な機能が維持されたのである。ロテノン誘導ストレスに対抗する高グルコースは、Mendivil-Perezらによって報告されており[63]、高グルコース（55 mM）存在下では、低用量グルコース（11 mM）と比較して、ロテノンに暴露したJurkat細胞において細胞死が劇的に（50％以上）減少したことが観察された。逆に、Houらは、ロテノンが複合体Iを阻害し解糖を促進することにより、db/dbマウスの高血糖を改善したことを報告している[64]。上記の文献と同様に、ロテノンと高グルコースを併用するとDEPの数が激減するという我々の観察結果は、高グルコースがロテノンによる細胞毒性を軽減する1つの方法である可能性を示唆しており、ミトコンドリアストレスに起因する膵β細胞死における治療的意義があるかもしれない。
我々の結果はまた、サイトカインミックス（IL-1β+IFN-γ+TNF-α）が免疫応答関連経路を特異的に障害することを強調した（図2B）。最も多くアノテーションされたパスウェイのひとつは、免疫系におけるサイトカインシグナル伝達であり、このパスウェイはこの処理条件下で有意に濃縮され、22個のタンパク質が関与していた。これらのタンパク質の大部分（22個中17個）は、IL-1β+IFN-γに暴露されたヒト膵島で一貫して発現レベルが上昇したことも以前に報告されている[18]。今回のデータで特異的に同定された5つのタンパク質（HLA-A、HLA-DRB5、GBP1、HLA-B、GBP4）が有意に発現レベルを上昇させたのは、今回の治療条件におけるサイトカイン成分（TNF-α）の相乗効果と膵島ドナーの違いによるものと考えられる。我々の観察とは対照的に、最近の研究では、ヒト膵島のベラパミル（カルシウム拮抗薬）治療に反応してHLA-AおよびHLA-B遺伝子のダウンレギュレーションが報告されている[39]。これは、ベラパミルの毒性とサイトカイン誘発ストレスにおける作用機序の違いを示しているのかもしれない。ヒト膵島におけるRNA発現のグローバルシークエンシングを用いた研究でも、サイトカイン（IFN-g+ IL-1β）曝露によって修飾されるいくつかの遺伝子が報告されている [65]。この観察は、サイトカイン処理したヒト膵島におけるタンパク質発現の今回の解析と一致している。
INS-1細胞に関する我々の以前の観察とは対照的に、ヒト膵島のロテノン処理もERストレスに関連する経路を誘導した。このことは、ER経路におけるタンパク質プロセッシングの濃縮に反映され、関与する54のタンパク質の発現レベルが上昇した（図3C(ii)、図S6）。これらのタンパク質には熱ショックタンパクファミリーメンバーが含まれ、これらのタンパク質は、トランスロコン関連タンパク質サブユニットα（SSR1）のようなトランスロケーションされたタンパク質のフォールディングを促進し、ER膜にカルシウムを結合させ、それによってER常在タンパク質の保持を制御するという重要な役割を担っている。これらの同定された新規タンパク質は、UPRシグナル伝達経路につながり、ロテノンによって誘導される小胞体ストレスやミトコンドリアストレスを制御している可能性がある。
もう一つの経路として注目されたのは、IGFBPによるIGFの輸送と取り込みの制御で、これはCyto処理群とThaGlc処理群で最も有意に発現が低下した経路の一つであった（図2D(i)および図4D(i)）。これらのタンパク質は、糖尿病における潜在的なマーカーであることが最近証明された。例えば、クロモグラニンA（CHGA）は、ベラパミルに反応するT1D血清プロテオミクスのグローバル解析において、潜在的な治療マーカーの1つとして同定された[39]。本研究では、このタンパク質の発現レベルは有意ではなかったものの、CHGB、SCG2、SCG3など、インスリンシグナル伝達経路の制御に関与する他のクロモグラニンファミリーを同定した。一方、我々は以前、INS-1β細胞のタプシガルギン処理でこの経路がアップレギュレートされることを報告した。この発現レベルの差は、グルコースの併用処理による相乗効果に起因すると考えられる。
INS-1細胞における我々の以前の観察結果[16]と同様に、我々はまた、ヒト膵島において、OXPHOSタンパク質がロテノンとThaGlcの併用によって調節異常となることを見出した。最近の研究で、小胞体における酸化的なタンパク質の折り畳みと、OXPHOSを介したミトコンドリアの機能障害との間に、重要な制御関係があることが示されたにもかかわらず、これらの酸化的ストレスがどのように様々な疾患の進行に相互作用するのか、その分子メカニズムはまだ解明されていない。我々の結果は、OXPHOSシグナル伝達経路に関与する28のタンパク質の発現レベルがThaGlc処理で減少したのに対し、ロテノン処理では30のタンパク質の発現レベルが増加したことを強調している（表S9および表S13b）。これらの結果は、両ストレス因子の作用機序の違いを反映しており、発現異常タンパク質は小胞体酸化還元制御とミトコンドリア代謝の間の密接な関係の制御に関与している可能性がある。一方、L13aを介したセルロプラスミン発現の翻訳サイレンシングは、両方のストレス因子（RotとThaGlc）によって誘導された調節異常経路のひとつであった。この観察結果は、ロテノン処理したINS-1細胞における最近の報告とも一致していた[16]。これらのストレス応答では、リボソームの構造的完全性に寄与するRNA結合に関連するタンパク質の多くが減少したが、これは小胞体内にミスフォールドタンパク質が蓄積する急性状態を反映している。
結論として、今回の知見は、ヒト初代膵島細胞が炎症性サイトカイン、ER阻害剤タプシガルギン、ミトコンドリア阻害剤ロテノン、高濃度グルコースにさらされると、ストレッサー特異的に反応することを示している。単独で作用した場合、ロテノンとサイトカインが膵島のプロテオームに最も大きな障害を与えるが、タプシガルギンと高濃度グルコースは最小限の効果しか示さない。グルコースとの併用では、タプシガルギンは調節異常タンパク質の数を劇的に増加させるが、ロテノンの効果は改善される。炎症性サイトカイン、ロテノン、タプシガルギン-グルコースはすべて、ペプチドホルモンのプロセシングと分泌に関連するタンパク質をダウンレギュレートする。免疫応答経路に加えて、炎症性サイトカインは小胞体様ストレスを誘導することができ、サイトカインとグルコースとタプシガルギンの複合作用の両方が抗原プロセシングとプレゼンテーションに影響を及ぼす。ロテノンによって誘導されるミトコンドリアストレスもまた、エネルギー代謝や小胞体関連タンパク質のプロセシングにおける重大な調節異常を誘導する可能性があるが、T1Dは自己免疫疾患であるため、我々の結果は、炎症性サイトカインやタプシガルギン-グルコース条件下で観察される抗原プロセシングとプレゼンテーションの異常が、T1Dの病態により関連している可能性を示唆している。この点で、サイトカインやタプシガルギン-グルコースで培養したヒト初代膵島から単離したβ細胞を研究することは、分子的変化、特に翻訳後修飾の異常を伴うタンパク質が、β細胞の機能障害の開始、死、ひいてはT1Dの進行にどのように関連しているかをさらに明らかにするのに役立つであろう。
この研究の限界は、生物学的複製数が少ないことである（n = 3）。生物学的複製（膵島ドナー）の数を増やすことによって、統計的検出力を向上させることができるであろう。また、各治療条件で同定されたすべての経路を詳細に研究することは、この研究の範囲を超えている。
謝辞
本書で報告された研究は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）の糖尿病・消化器・腎臓病研究所（National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases）より、賞番号R01DK114345の支援を受けた。
利益相反声明
著者らは、競合する金銭的利害関係がないことを宣言する。
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