高度のインスリン抵抗性を有する2型糖尿病患者における微生物叢移植
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オープンアクセス速報
高度のインスリン抵抗性を有する2型糖尿病患者における微生物叢移植
著者
アナ・マリア・ゴメス＝ペレス
1,2,
Araceli Muñoz-Garach
2,3,
アグスティン・ラセロット＝クアドラード
4,
イサベル・モレノ＝インディアス
1,2,*および
フランシスコ・J・ティナホネス
1,2,5
1
マラガ生物医学研究所内分泌栄養科、マラガ大学ヴィルヘン・デ・ラ・ヴィクトリア大学病院ナノメディシン・プラットフォーム（IBIMA-BIONANDプラットフォーム）、29016 マラガ、スペイン
2
CIBER in Physiopathology of Obesity and Nutrition (CIBEROBN), Carlos III Health Institute, 28029 Madrid, Spain
3
グラナダ・バイオサニタリー研究所内分泌栄養科（ibs.Granada）、ビルヘン・デ・ラス・ニエベス大学病院、18012グラナダ、スペイン
4
アンダルシア研究・開発・イノベーション計画。CTS 367, University of Granada, 18071 Granada, Spain
5
マラガ大学医学部、29071 マラガ、スペイン
*
著者宛先
Nutrients 2024,16(20), 3491;https://doi.org/10.3390/nu16203491
投稿受理： 2024年9月17日／改訂：2024年10月8日／受理：2024年10月9日／発行：2024年10月15日 2024年10月9日 / 掲載：2024年10月15日
(この記事はプレバイオティクスとプロバイオティクス に属しています。）
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要旨
背景／目的 本研究の目的は、2型糖尿病（T2D）患者に対する健康な除脂肪体重被験者からの糞便微生物叢移植（FMT）の結果を明らかにすることであった；方法： 第II相無作為化単盲検並行群間臨床試験を計画した。事前にインフォームド・コンセントに署名した21名の被験者（男性12名［57.1％］、女性9名［42.9％］）が、除脂肪体重ドナーからのFMT、プロバイオティクス（Lactobacillus delbrueckiispp. ベースライン時の平均年齢は62.5±5.8歳、ベースライン時の平均体格指数（BMI）は約32.4±2.4kg/m2であった。人体測定、生化学的変数、経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）、便微生物叢分析が行われた（ベースライン、4週、12週）。試験は、ヘルシンキ宣言、適正臨床実施指針（CPMP/ICH/135/95）、および臨床試験に関する現行のスペインの法律（RD 223/2004）に従って実施された： FMTの変化は、ドナーで発見された種を犠牲にして起こった。プロバイオティクス群では尿酸の減少（-0.5mg/dL、p= 0.037）、FMT群ではHbA1cの軽度の増加（+0.25％、p= 0.041）が観察されたが、介入後の体重、肥満度、HbA1c、グルコースとインスリンのOGTTの結果には群間で差は認められなかった；結論： 結論：我々のサンプルでは、健康で痩せたドナーからのFMTもプロバイオティクスも、T2D患者のインスリン感受性とHbA1cの改善には有効ではなかった。
キーワード
2型糖尿病；インスリン抵抗性；プロバイオティクス；微生物叢；糞便微生物叢移植
1. はじめに
ここ数十年、非感染性疾患における腸内細菌叢の関与に関する研究は絶え間なく行われており、肥満や糖尿病への関与を示すエビデンスも増えてきている。したがって、プロバイオティクスや糞便微生物叢移植（FMT）などの微生物叢療法が、肥満、糖尿病、その他の代謝性疾患、炎症性腸疾患、感染症など、多様な疾患における治療手段の可能性として提起されていることは驚くにはあたらない[1,2,3,4,5]。しかし、FMTは現在、米国では再発性および難治性のクロストリジウム・ディフィシル感染症の治療法としてのみ承認されている [6]。2型糖尿病（T2D）の治療におけるFMTの使用に関しては、血糖コントロールの軽度の改善を示した研究はほとんどない。例えば、Dingらは、健常ドナーのFMTから12週間後に糖化ヘモグロビン（HbA1c）、血糖、尿酸の改善を認めた。FMT反応者は、非反応者と比較して、ベースライン時にリケネラ科とアナエロトルンカス属の高いレベルを示した [7]。しかし、ほとんどの研究では、肥満やインスリン抵抗性を有する患者において肯定的な結果は確認されておらず、154人が参加した6つの研究を包括する最近のメタアナリシスでも明らかである。著者らは、短期的にはHbA1cに最小限の影響を与え、その後時間の経過とともに減少していくことを観察したが、他の人体計測や生化学的パラメータには明らかな改善はみられなかった [8]。したがって、代謝性疾患におけるFMTおよびプロバイオティクスの役割を明らかにするためには、ランダム化比較試験によるさらなるデータが必要である。
本研究の主な目的は、健康な除脂肪体重の被験者からFMTを行った後、またはT2Dで高インスリン抵抗性の患者にプロバイオティクスを投与した後の微生物叢の変化が、Homeostatic Model Assessmentインスリン抵抗性指数（HOMA-IR）とHbA1cで評価されるインスリン感受性に変化をもたらすかどうかを明らかにすることであった。
2. 材料と方法
この第II相無作為化単盲検並行群間臨床試験は、マラガのVirgen de la Victoria大学病院（スペイン）にて、"Epigenetic modifications and microbiota in the genesis of adipose tissue dysfunction and insulin resistance"（EPIGEN-MICROBIOTA）プロジェクトのサブスタディとして実施され、当地の倫理委員会の承認を得た。この試験は、ヘルシンキ宣言、適正臨床実施指針（CPMP/ICH/135/95）、および臨床試験に関する現行のスペインの法律（RD 223/2004）に従って実施された。本試験は「Epigenetic and Microbiota Modifications」の名称で登録され、コードはNCT05076656である。試験に組み入れられた被験者は以下の基準を満たしていた： メトホルミンによる治療を受けているT2D；肥満度（BMI）30〜40kg/m2；年齢30〜70歳；HOMA-IR＞2；インフォームド・コンセントへの署名。除外基準は以下の通り：メトホルミンとは異なる糖尿病治療、胆嚢摘出術の既往、組み入れ前3ヵ月間の抗生物質またはプロバイオティクスによる治療。21例が3群に無作為に割り付けられた： Kaoら［2］が提案したプロトコールに従った、凍結乾燥カプセルによるFMT経口投与、食品医薬品局（FDA）の一般に安全と認められる細菌（GRAS）リストに含まれるプロバイオティクス（PB）による治療（https://www.fda.gov/Food/IngredientsPackagingLabeling/GRAS/; 2019年4月15日アクセス）、25×109CFU/ピルのラクトバチルス・デルブルエッキイ属ブルガリクスLB-14からなる1日1回投与、およびプラセボ投与（プロバイオティクスおよびFMTと同様の製品であるが、それらの内容は含まない）であった。FMTは、40～65歳、BMI＜25、メタボリックシンドローム基準のない、健康で痩せたドナー2人から採取した。ドナーの糞便サンプルはKaoらの推奨に従って処理された[2]。治験薬は、前夜の腸洗浄後、来院1日目の2日目に単回投与された。参加者はオフィスでカプセルを受け取り、すぐに服用した。その後、直ちに副作用が発現しないか評価するため、約2時間観察された。すべての参加者は、試験期間中、通常の食事と身体活動を維持するよう求められた。
試験参加者は、ベースライン時、4週間後、12週間後に、人体測定、血液検査、75g経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）によるグルコースとインスリンの評価を受けた。Gómez-Pérezら[9]とDíaz-Perdigonesら[10]の方法論に従って、リボソーム16S rRNA遺伝子の配列決定による微生物叢分析のために、各訪問時に便サンプルが採取された。
人体測定変数、HOMA-IR、HbA1cに対する介入の影響を評価するために、定性的変数の度数分布、定量的変数の中央値および四分位範囲に関する研究を通じて統計分析を行った。仮説を比較するために、連続変数にはノンパラメトリック検定を用いた：2群間の比較にはMann-Whitney検定、同一群の前後比較にはWilcoxon検定、複数の群間の比較にはKruskal-Wallis検定を用いた。質的変数に関する仮説の比較には、カイ2検定を用いた。Hoの棄却水準は、研究の最初に提示された仮説に従って、1尾または2尾で0.05とした。
微生物叢の変化に関しては、Ion Reporter（Ion Reporter Software 5.12, Thermofisher; Life Technologies Holdings Pte Ltd., Singapore 739256）というツールを用いてプロファイリングを行い、99%同一性の参照ベースGreengenes version 13_5と種レベルでキュレーションしたMicroSEQ® 16S Reference Library V2013.1を用いてクラスタリングを行った（詳細は補足資料ファイルS1に記載）。フィーチャーテーブルは、ベン図を用いてドナーとレセプターの間で共有される生物種を検索するために用いられた。
3. 結果
合計21名の被験者が対象となった： 57.1％（n=12）が男性、42.9％（n=9）が女性であった。7人が各群に割り付けられたが、2人（FMT群1人、プラセボ群1人）が介入後に治験治療とは無関係の理由で試験から離脱した。ベースライン時、3群は均質であり、統計学的に有意な特徴の差はなかった（表1）。プラセボ群の体重中央値は90（80.5-100.9）kgであったが、PB群では92（79-98.5）kg、FMT群では83.8（77.3-89）kgであった（p= 0.675）。ベースラインのグルコース値は、プラセボ群99.5（87.8-111.5）mg/dL、PB群128（99-134）mg/dL、FMT群110（99-129.5）mg/dLであった（p＝0.314）。HbA1cについては、プラセボ群6.5％（6.2-7.7％）、PB群7％（5.9-5.3％）、FMT群6.6％（6.1-6.9％）であった（p＝0.186）。HOMA-IRについても同様の傾向が認められ、中央値はプラセボ群で2.3（1.7-4.5）、PB群で3（0.6-5.3）、FMT群で3（1.2-3.8）であった（p= 0.091）。ベースライン時のHOMA-β、松田指数に差はみられなかった。
表1. ベースライン時と介入12週後における各介入群の主要変数の比較分析。
プラセボ群の体重中央値は90kg（IQR 80.5-100.9）、PB群の体重中央値は92kg（IQR 79-98.5）、FMT群の体重中央値は83.8kg（IQR 77.3-89）であった（p= 0.529）。代謝状態（HbA1c中央値：プラセボ群6.2％（IQR5.9-6.4％）、PB群6.2％（IQR6-6.9％）、FMT群6.6％（IQR6.1-6.9％）［p＝0.225］）、HOMA-IR、HOMA-β、松田指数（表1 ）、介入後のグルコースとインスリンに関するOGTTの結果（図1 ）に差は認められなかった。
図1：（1a）プラセボ群におけるグルコースに関する75g経口ブドウ糖負荷試験（OTTG）の結果。(1b) プロバイオティクス投与群におけるグルコースに関する75g経口ブドウ糖負荷試験（OTTG）の結果。(1c）糞便微生物叢移植（FMT）群におけるグルコースに関する75g経口ブドウ糖負荷試験（OTTG）の結果。(2a ）プラセボ群におけるインスリンに関する75g経口ブドウ糖負荷試験（OTTG）の結果。(2b ）プロバイオティクス治療群におけるインスリンに関する75g経口ブドウ糖負荷試験（OTTG）の結果。(2c ）糞便微生物叢移植（FMT）群におけるインスリンに関する75g経口ブドウ糖負荷試験（OTTG）の結果。
介入から12週間後、プラセボ群では臨床的・生化学的変数のいずれにおいても差は認められなかった。PB群では、結果はプラセボ群と同様であったが、介入12週後に尿酸が7mg/dL（IQR 5.9〜7.4mg/dL）から6.5mg/dL（IQR 5.3〜6.8mg/dL）へと有意に減少した（p= 0.027）。最後に、FMT群では介入3ヵ月後にHbA1cの軽度の悪化がみられ、ベースライン時の中央値は6.6％（IQR 6.1-6.9％）、FMT後は6.9％（IQR 6.3-7％）であった（p= 0.041）。その他の有意差は認められなかった（表1）。
腸内細菌叢の多様性とプロフィールは、治療法やサンプリングポイント間で有意差は認められなかった。しかし、実験的処置の中では、PBがベースラインと比較して最も少ない種しか失っていなかった（図2a）。興味深いことに、FMT群における変化は、ドナーで発見された種の増加を犠牲にしたものであった（図2b）。最後に、ラクトバチルス・ファーメンタムは、PBの1つのサンプルでのみ検出された。
図2（a）4週または12週の時点で、便微生物叢移植（FMT）群、プロバイオティクス介入（PB）群、プラセボ群の各介入により、ベースラインプロフィールに対して消失、維持、または増加した細菌種の数。(b)FMT介入群では、異なる時点におけるそれぞれのドナーとの関係において、ドナーと受容体の間で共有される細菌種の数、ドナーにのみ認められる細菌種の数、および受容体にのみ認められる細菌種の数を示した。
試験期間中、治験薬に関連した軽度または重篤な有害事象は報告されなかった。
4. 考察
我々は、T2D患者のインスリン感受性およびHbA1cを改善するために、健康で痩せたドナーからのFMTは我々のサンプルでは有効でないことを見出したが、これは以前に報告された結果と一致している。Yuら[11]は、肥満でT2Dリスクの高い成人24人を対象に、12週間の二重盲検臨床試験を行った。参加者は、健康で痩せたドナーからのFMTカプセルを週1回経口投与する群と、プラセボカプセルを6週間経口投与する群に無作為に割り付けられた。12週間後、人体測定値、HOMA-IRやHbA1cなどの代謝パラメータのいずれにおいても、群間に有意差は認められなかった。したがって、われわれの研究で明らかになったように、この方法は安全であり、微生物叢の組成に変化が観察されたものの、代謝機能の面でプラスの効果をもたらすほどではなかった。154人が参加した6つの研究の1つのメタアナリシスでは、肥満とメタボリックシンドロームの治療におけるFMTの役割が評価され、介入後6週間でHbA1cの最小限の減少が認められたが、プラセボと比較した人体計測パラメータ、グルコース値、インスリン感受性の改善はなく、我々の研究と同様に長期的には消失した [8]。T2D患者を対象とした別の研究では、食事介入とFMTを併用した群（各群8名）とを比較し、食事介入群では90日後の血糖値の有意な低下と体重減少が報告されたが、FMT群では報告されなかった [12]。
体重に関しては、自家FMTまたは除脂肪ドナーからのFMTが体重減少および体重の再増加防止に及ぼす影響を評価するために、いくつかの研究が実施された。その結果は矛盾しており、FMTが体重減少や体重維持に影響する可能性を報告しているものもあれば [13]、介入後のBMIに変化がなかったり [4]、肥満手術後の短期および長期における体重減少の割合に差がなかったり [14]と、われわれの結果と一致しているものもある。しかし、Rinottらによって報告された研究では、参加者は自己FMTの前に減量のための食事介入を受けていた。したがって、マイクロバイオーム組成の変化と体重維持は、食事の修正によってより影響を受けた可能性がある [13]。
他のいくつかの研究は我々の結果と対照的であるが、介入の臨床的影響は疑わしい。Dingらは、対照群を設定せずに17人のT2D患者を対象に経内視鏡的腸管FMTを実施し、介入12週後にHbA1c、グルコース値、尿酸の軽度の減少を認めたが（p＜0.01）、個人差も報告されているため、その変化が介入と直接関係するとは言えない[7]。Siewらは、T2Dおよび肥満の被験者の微生物叢の変化に対して、食事改善と組み合わせた、または単独で、4週間ごとにFMTを24週間繰り返すことの効果を報告したが、血糖コントロールや体重に対する効果は認められなかった [15]。4つの無作為化対照試験を含む最近のメタアナリシスでは、非FMT群で得られた結果と比較して、FMT併用療法はT2D患者の血漿グルコース値を低下させる可能性があり、FMT単独療法と比較して、FMT併用療法はトリグリセリド値と総コレステロール値も改善させる可能性があることがわかった。FMT単独治療でも、HOMA-IR、トリグリセリド、HDL値を低下させる可能性がある［16］。
ほとんどの研究でFMTは安全であったが、肥満患者におけるFMT後の有害事象（主に胃腸症状）が報告された [15,17]。
最後に、我々の研究では、腸内細菌叢は統計学的に有意な変化を示さなかったが、ドナー種は受容体種を犠牲にして増加し、修復の可能性を示した [18]。しかし、プロバイオティクス群では、乳酸桿菌はボランティアサンプルではあまり観察されなかったが、これは腸粘膜で観察される可能性を示唆するものではない。無作為化プラセボ対照二重盲検臨床試験において、Wilsonらは87人の肥満の青年を対象にFMTを実施した。FMTは、4人の痩せた同性ドナーの糞便微生物叢を含むカプセルで構成されていた。その結果、マルチドナーFMTは腸内細菌叢の構造と機能に持続的な変化をもたらしたが、支配的な菌株の生着は2つの特定のドナーのマイクロバイオーム（1つは女性、もう1つは男性）に起因することが観察された。これらのマイクロバイオームは、微生物の多様性が高く、プレボテラ/バクテロイデス比が高いことで区別された。同様に、FMTの投与量と由来を標準化しようと試みたが、レシピエント間でドナー株の生着にかなりのばらつきがあった。このことは、FMTの生着に宿主の環境が影響している可能性を示唆しており、このことが異なる結果を部分的に説明している可能性がある［20］。
5. 結論
我々の知見は、FMTとプロバイオティクスの補充を含む介入は、2型糖尿病患者の耐糖能の改善をもたらさなかったことを示している。さらに、これらの介入は参加者の腸内細菌叢に顕著な変化をもたらさなかった。しかし、ドナーの種の増加が観察され、これはレシピエントの種の犠牲の上に成り立っていた。
われわれの研究の主な限界は、サンプルサイズが小さいことと、研究対象が非常に特殊であることで、メトホルミンによる治療を受けた患者に限定されており、一般に初期の代謝制御が良好であった。一方、優血糖-高インスリン血症クランプは難しい検査であり、それを実施するのに必要な培地がなかったため、インスリン抵抗性の評価のためのゴールドスタンダードを使用することができなかった。このため、結論を一般化することは困難である。