腸由来の乳酸は、Akkermansia muciniphilaを介した不安の制御において、トリプトファンから5-ヒドロキシトリプタミンへの変換を促進する

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Volume 17、 2025 - Issue 1
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研究論文
腸由来の乳酸は、Akkermansia muciniphilaを介した不安の制御において、トリプトファンから5-ヒドロキシトリプタミンへの変換を促進する

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/19490976.2024.2447834#d1e511

Miaomiao Pan,Chenglang Qian,Shaoye Huo,Yuchen Wu,Xinyi Zhao,Yueming Ying, show all
Article： 2447834｜Received 14 Sep 2024, Accepted 23 Dec 2024, Published online: 09 Jan 2025
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https://doi.org/10.1080/19490976.2024.2447834
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ABSTRACT
腸内細菌叢は、神経伝達物質産生、免疫シグナル伝達、代謝相互作用を含む経路を通じて、不安制御に極めて重要な役割を果たしている。中でも、トリプトファン代謝から合成される腸由来のセロトニン（5-ヒドロキシトリプタミン、5-HT）は、重要なメディエーターとして同定されている。しかし、特定の微生物因子がトリプトファン代謝を調節し、5-HT産生と不安調節に影響を及ぼすかどうかは、依然として不明である。本研究では、クローズドトレーニングを受けている110名のアスリートを分析し、便中乳酸値が不安指標と有意に関連していることを見出した。また、アスリートにおいて、アッケマンシアの存在量と不安レベルとの間に有意な負の相関が観察された。乳酸とアッケマンソウ（A. muciniphila）の共補給は、主要酵素TPH1を増加させ、IDO1を減少させることにより、トリプトファン代謝を調節し、代謝をキヌレニン（Kyn）から5-HTに移行させた。さらに、乳酸はA. muciniphilaのプロピオン酸産生能を増強し、マウスの不安軽減に寄与する可能性があった。これらの知見を総合すると、腸内乳酸とA. muciniphilaが協力してトリプトファン代謝の不均衡を回復させ、5-HT活性を増加させ、不安表現型を緩和することが示唆される。本研究は、腸内代謝産物と不安制御の間の複雑な相互作用を浮き彫りにし、不安に対する微生物叢を標的とした治療戦略の可能性を提供するものである。

キーワード：腸内細菌叢5-ヒドロキシトリプタミン競合性不安トリプトファン乳酸アカマンシアムチンフィラプロピオン酸
はじめに
不安障害は、世界的に最も蔓延している精神疾患の代表である。セロトニン合成の長期的低下は、社会的ストレスや精神障害に対する感受性の高まりと関連している。引用6 トリプトファン代謝の不均衡は、5-HTの異常産生だけでなく、キヌレニンなどの他の下流代謝産物の蓄積にもつながり、精神疾患の一因となる。このことは、微生物がトリプトファンの代謝バランスの維持に重要な役割を果たしていることを示唆しているが、このプロセスが不安の発生に関与しているかどうかは不明である。Citation9,Citation10腸内細菌叢の組成は、食事、生理的調節、外部環境などの要因に大きく影響されるため、微生物の生理的機能に関する研究はやや限られている。

エリートアスリートは、傷害のリスクや世間の注目といった独特で強いストレス因子を経験している。引用11-13 アスリートの高度に管理された食事、トレーニングのルーチン、休息パターンは、交絡する生理学的因子の影響を最小限に抑え、不安の根底にある特定のメカニズムを調査するための理想的なコホートとなっている。本研究では、閉鎖的なトレーニング環境にある中国の射撃競技選手に焦点を当て、彼らの特徴的な腸内細菌叢を探索することを可能にした。その結果、不安レベルの低いアスリートほど、糞便中の乳酸濃度が上昇していることが示された。さらに、乳酸は不安と負の相関関係にあるAkkermansiaのレベルを増加させ、それらが一緒になってトリプトファン代謝の不均衡を改善することを示した。我々は、A. muciniphilaが乳酸が豊富な腸内環境においてプロピオン酸レベルを増加させ、不安の表現型を緩和し、腸内トリプトファン代謝の不均衡を回復させるのに十分であることを見出した。まとめると、我々の知見は、腸内乳酸とA. muciniphilaが連携して、トリプトファン代謝における不安に関連した不均衡を改善することを示している。

材料と方法
参加者と手順
14歳から34歳の参加者（n=110）は、上海射撃・アーチェリースポーツセンターから組織的に登録され、厳格な参加基準を遵守した：研究開始時にプロバイオティクス製剤を使用していないこと、過去6ヵ月以内に臨床試験に参加していないこと、過去3ヵ月間に抗生物質や非ステロイド性抗炎症薬を服用していないこと、糖尿病、自己免疫疾患、炎症性腸疾患のような胃腸疾患などの持病がないこと。全選手が1-2回の面接を受け、詳細な臨床情報が収集された。一般化不安障害尺度（GAD-7）、State-Anxiety Inventory - trait Version（STAI-T）およびCompetitive State Anxiety Inventory-2（CSAI-2）が、アスリートの不安プロファイルを評価するために用いられた。自己評価、臨床医による詳細な食事内容の評価、トレーナーによる運動パフォーマンスの統計も行われた。糞便検体は、午前中に上海射撃・アーチェリースポーツセンターで採取し、速やかに無菌糞便採取管に固定し、液体窒素で瞬間凍結し、採取後3時間以内に-80℃で保存した。この研究の倫理的許可は復旦大学上海第五人民病院倫理委員会により与えられ、参加者全員が書面によるインフォームドコンセントを行った（承認番号2020002X1）。

著作権許諾の声明
著者らは、本研究で使用したState-Anxiety Inventory - trait Versionが心苑（www.mindgarden.com）の所有物であることを認める。この質問票の使用と複製はマインドガーデン社から許可を得た。著者らは、このツールを研究に含めることを許可してくれた同社の協力に感謝する。

動物実験
一般
6週齢の雄性C57BL/6NマウスをCharles River社（中国、北京）から購入し、実験1週間前から順応飼育した。動物は温湿度管理された部屋（23～25℃、50～60％）に12：12時間の明暗サイクルで飼育され、餌と水は自由に摂取できた。動物は実験群に無作為に割り付けた。動物のプロトコールは、復旦大学基礎医学院の動物倫理委員会の承認を得た（第20220627-001号）。

有酸素運動トレーニングの手順
マウスを無作為にControl（Ctrl）群、Lactate（Lact）群、Exercise（EX）群に割り付けた。Lact群のマウスには、乳酸ナトリウム（750mg/kg、MCE社、米国ニュージャージー州）を毎日腹腔内注射した。対照群とEX群には0.9%生理食塩水を投与した。マウスは、電動トレッドミル（RWD80805A、RWD社、中国・深圳）を用い、電気グリッドの刺激下で2週間の有酸素コンディショニングを行った。運動レジメンへの順応は、10m/分のペースで2日間行い、その後、初日は10m/分で30分間、翌日は45分間と、プロトコルを段階的に開始した。トレーニング頻度は週5日、2日間の休養を挟み、2週間を1サイクルとした。Citation18

ロータロッド試験
加速回転棒装置（VanBi, FanBi, Shanghai, China）を用いて、運動協調性とバランスを評価した。この装置は直径3cmの回転棒で構成されており、6つの走行レーンに分かれているため、最大6匹のマウスを同時に試験することができる。試験前日、動物を毎分4回転（r.p.m.）の固定速度で回転するシリンダー上に置き、回転棒に慣らすため、2時間の休憩を挟んで90秒間隔で2回連続させた。試験当日、動物を回転棒に乗せ、各動物がバランスを維持できた時間を記録した。回転棒は5分間で0rpmから40rpmまで直線的に加速するように設定した。落下潜時は、マウスがポールから落下するか、ポールに取り付けられたまま2回連続回転するか、10秒間に3回回転した後の秒数で測定した。最大潜時は、マウスがポールから落下せず、上記の回転エラーも起こさなかった300秒であった。引用19

慢性
予見不能軽度ストレス刺激（CUMS）法
マウスを無作為にControl（Ctrl）群、慢性予見不能軽度ストレス刺激（CUMS）群、乳酸処理CUMS（CUMS-lact）群、乳酸処理（Lact）群に割り付けた。引用20 CUMS-lact群およびLact群のマウスには、ストレス介入期間中、毎日乳酸ナトリウム（750 mg/kg、MCE社、米国ニュージャージー州）を腹腔内注射した。糞便サンプルは28日目に採取した。行動試験終了後、すべての組織を約2時間以内に採取し、-80℃で保存した。

ABX投与と細菌コロニー形成
アンピシリン、ネオマイシン、メトロニダゾール、バンコマイシンを含む抗生物質カクテルを抗生物質投与（ABX）群に7日間飲水投与した。Akkermansia muciniphila（A. muciniphila, ATCC BAA-835）は、0.5％胃ムチン（MCE, New Jersey, USA）を添加したBrain Heart Infusion（BHI）ブロス中で、37℃で嫌気培養した。マウスを無作為に3群に分け、A. muciniphilaを投与した： ABX+Akk、ABX+Akk+Lact、ABX+熱殺Akkである。A.ムチニフィラ移植の前に、すべてのマウスは7日間のABX投与を受け、その後、2×10^8 cfu/200μLの生きたA.ムチニフィラ、同量およびCFU数の熱殺A.ムチニフィラ（70℃、15分間）、または同量の25％グリセロール（1×）を含む滅菌PBSを毎日胃内投与した。乳酸投与を必要とする群（すなわち、ABX+LactおよびABX+Akk+Lact）のマウスは、以前のプロトコールに従って治療を受けた。プロピオン酸カルシウム経口投与群（ABX+プロピオン酸カルシウム）には、プロピオン酸カルシウム（200 mM、MCE社、米国ニュージャージー州）を7日間投与した。

すべてのAkk群において、コロニー形成前、48時間後および7日後に糞便サンプルを採取した。絶対定量PCR（qPCR）は、A. muciniphilaに特異的なプライマー（フォワードCCTTGCGGTTGGCTTCAGAT、リバースCAGCACGTGAAGGTGGGGAC）を用いて行った。標準曲線を作成するために、A. muciniphilaの一連の希釈標的遺伝子を用いた。各サンプル中のA. muciniphilaのコピー数を糞便重量で正規化した。全16S rRNAも、ユニバーサル細菌プライマー（フォワードACTCCTACGGGAGGCAGCAG、リバースATTACCGCGCTGCTGG）を用いて定量および標準化した。マウスには、滅菌した栄養満点のげっ歯類用飼料とオートクレーブ滅菌水または放射線照射水を与えた。アイソレーター内の温度、湿度、光のサイクルは標準的な実験室レベルで維持され、温度は20～22℃、明暗サイクルは12時間であった。A. muciniphila溶液は上記のように調製し、アイソレーター内でマウスに経口投与した。

行動試験
すべての行動試験の前に、マウスを2時間実験室に置いた。すべてのマウスを同じ順序で試験した。

オープンフィールド試験（OFT）：マウスをオープンフィールド箱（縦×横×高さ、50cm×50cm×50cm、VanBi-OF、FanBi社、上海、中国）の隅に個別に置いた。マウスを6分間自由に探索させ、最後の5分間の自発活動を記録した。各動物の試験後、嗅覚の手がかりを取り除くため、器具をエタノールで洗浄した： 装置は地上100 cmの高さにあり、暗い壁を持つ2本の閉じたアーム（長さ×幅×高さ、60 cm×10 cm×40 cm）と2本の開いたアーム（長さ×幅、60 cm×10 cm、VanBi、FanBi、上海、中国）を含む。4本のアームは中央のプラットフォーム（L×W、10cm×10cm）で連結されていた。マウスを中央のエリアに置き、5分間迷路を探索させた。不安の指標として、時間とアームへの進入を測定した。引用25

UHPLC-MS/MS分析
UHPLC-MS/MS分析は、Thermo Syncronis C18（2.1 mm × 100 mm、1.7 μm）UHPLCシステム（ThermoFisher、ドイツ）とOrbitrap Q ExactiveTM シリーズ質量分析計（Thermo Fisher、ドイツ）を組み合わせ、Scale Co. (Ltd.（中国、北京）で、Orbitrap Q ExactiveTMシリーズ質量分析計（Thermo Fisher、ドイツ）と組み合わせた。サンプルはHypesil Goldカラム（2.1 mm × 100 mm、1.7 μm）に0.2 mL/分の流速で18分間のリニアグラジエントを用いて注入した。溶離液AおよびBは、それぞれ水およびアセトニトリル中の0.1％FAであった。溶媒グラジエントは以下のように設定した： 0 ~ 1 分、95% A; 1 ~ 5 分、95%~40% A; 5 ~ 8 分、40%~0% A; 8 ~ 11 分、0% A; 11 ~ 14 分、0%~40% A; 11 ~ 15 分、40%~95% A; 15 ~ 18 分、95% A。Q ExactiveTM シリーズ質量分析計は、正/負極性モードで、スプレー電圧 3. 2kV、キャピラリー温度320℃、シースガス流量40arb、補助ガス流量10arb。

qPCR分析
TRIZOL（Invitrogen, California, USA）を用いてマウスの結腸片から全RNAを抽出した。クロロホルムとイソプロパノールを用いて水相を沈殿させ、NanoDrop 2000（Thermo Fisher, Massachusetts, USA）を用いてRNA濃度を測定した。逆転写キット（Promega, Shanghai, China）を用いて800 ngのtotal RNAからcDNAを調製し、SYBR green kit（Promega, Shanghai, China）を用いてqPCR解析を行った。

ウェスタンブロッティング
クリーンな結腸組織（2～3cm）を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma-Aldrich、米国ウィスコンシン州）を添加した200μLのSDS溶解バッファー（50mmトリス（pH8.1）、1mmEDTA、1％SDS、1mmフレッシュジチオスレイトール、フッ化ナトリウム、ロイペプチン）を入れた2mLスクリューキャップマイクロチューブに採取した。ホモジナイズ（4800rpm、10秒、6サイクル）を行い、溶解した混合物を12,000rpm、4℃で15分間遠心した。上清を1.5mLエッペンドルフ（Ep）チューブに移し、Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit (Solarbio, Beijing, China)を用いてタンパク質濃度を測定した。6×ローディングバッファー（Beyotime、上海、中国）で煮沸した組織溶解液を10％または12.5％SDS-ポリアクリルアミド勾配ゲル（Genscript、南京、中国）にロードし、液体転写システム（Genscript、南京、中国）を通してPVDF膜（Millipore、マサチューセッツ、米国）に転写した。TBST（10mmトリス塩基pH7.6、150mm NaCl、0.1%(v/v)Tween20）中3%ウシ血清アルブミン（BSA）で2時間RTでブロッキングした後、希釈一次抗体で4℃で一晩膜をプローブした。TBSTで洗浄後、ブロッキングバッファー（1:10,000）中二次抗体で2時間RTでインキュベートした。その後、化学発光HRP基質（Millipore, USA）を用いて可視化を行った。ウェスタンブロッティングに用いた抗体を以下に示す： 抗IDO1（Cell Signaling Technology Cat#51851S, AB_2799402）、抗KMO（Proteintech Cat#10698-1-AP, AB_2296744、中国武漢）、抗3HAO（Proteintech Cat#12791-1-AP, AB_2115432、中国武漢）、抗MCT1（Proteintech Cat#20139-1-AP, AB_2878645、中国武漢）、抗GAPDH（Proteintech Cat#20139-1-AP, AB_2878645、中国武漢）、 中国、武漢）、抗GAPDH（Proteintech Cat#HRP-60004, 2737588, 中国、武漢）、抗TPH（Abcam Cat# ab52954, AB_2207555, 英国、ケンブリッジ）、抗TPH1（HUABIO Cat#ET1610-37, AB_3069921, 中国、杭州）、抗クローディン-1（Abcam Cat#ab307692, AB_3083082, 英国、ケンブリッジ）。

ELISA免疫アッセイ
前頭前皮質および血清からの代謝物アッセイは、メーカーの指示に従って実施した。ELISAキットには、5-HT（E-EL-0033c、Elabscience、武漢、中国）および乳酸（E-BC-Ko44-M、Elabscience、武漢、中国）が含まれた。データはBCAによって決定されたタンパク質濃度に基づいて正規化された。

組織学のためのHE染色
4％パラホルムアルデヒド固定した腸サンプルをパラフィンに包埋し、5μmの厚さで切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）で染色した。ZEN3.1（Zeiss、ドイツ）を用いて顕微鏡写真をスキャンし、観察した。

免疫蛍光
遠位結腸組織をこのアッセイで試験した。灌流した組織を4％パラホルムアルデヒドに4℃で一晩浸し、パラフィンに包埋して3-4μm厚の切片に切り出した。脱脂と抗原回収の後、切片を5％BSA緩衝液で2時間RTでブロックし、続いてブロッキング液で希釈した一次抗体（IDO1 1:100, 51851S, Cell Signaling Technology; 5-HT 1:500, ab66047, Abcam; CgA 1:200, ab45179, Abcam; Claudin-1 1:500, GB14066-50, Servicebio）と4℃で一晩インキュベートした。3回の洗浄後、切片をさらに2次抗体とともに遮光し、RTで2時間インキュベートした。切片をグリセロールで密封する前に、DAPI溶液を塗布した。サンプルはPannoramic MIDI（3D HISTECH、ハンガリー）を用いて共焦点顕微鏡で撮像し、画像はそれぞれCaseViewer2.4（https://www.3dhistech.com/solutions/caseviewer/）およびImageJ（https://imagej.nih.gov/ij/）を用いてエクスポートおよび解析した。

生物学的サンプルの収集と解析
16S rRNA V3-V4領域をPCRで増幅し、lon S5 XL/Illuminaプラットフォーム（Thermo Fisher, Massachusetts, USA）を用いて塩基配列を決定した。配列はunoise3によってノイズ除去され、1塩基精度のアンプリコン配列バリアント（ASV）が得られた。Citation26 その後、vsearchプラグインを使用して97%の同一性で配列をクラスタリングし、SILVAデータベース（V.123, https://www.arb-silva.de/）に照らし合わせて分類学を割り当てた。マイクロバイオームの差異に関する主な分析には、アルファ多様性（Simpson、Shannon、ACE、Chao1指標）とベータ多様性（Bray-Curtis非類似度）が含まれた。主座標分析（PCoA）プロットは、各サンプル間のベータ多様性距離を可視化するために作成された。線形判別分析効果量（LEfSe）分析は、グループ間で差異のある豊富な分類群を同定するために実施された。この方法では、まずノンパラメトリックの因子分析であるKruskal-Wallisとsum-rank検定を用いて有意に異なる存在量の特徴を検出し、次に線形判別分析（LDA）を行って各特徴の効果量を算出した。我々は、Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States2 (PICRUSt2)を用いて、16S rRNA配列から腸内細菌叢のメタゲノム推定を行った。LEfSe と PICRUSt2 モジュールはともに Galaxy (http://galaxy.biobakery.org) のものを使用した。機能項目の統計的差異は、Metagenomic Profilesソフトウェアの統計解析（STAMP v2.1.3, Nova Scotia, Canada）を用いて、一元配置分散分析により評価した。

RNAのトランスクリプトームシークエンシングのために、NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kitを用い、Oligo(dT)磁気ビーズで全RNAを濃縮した。断片化したmRNAを鋳型とし、ランダムなオリゴヌクレオチドをプライマーとするランダム割り込みによってcDNAを合成し、PCRによってライブラリーを増幅した。多重化されたDNAライブラリーはホモジナイズされ、等容量で混合される。混合されたライブラリーは徐々に希釈され、定量された後、イルミナシーケンサーでPE150モードでシーケンスされた。ダウンストリームデータをフィルターし、配列決定してアノテーションファイルを作成し、最後にHTSeq（v0.9.1）とFPKMで発現を正規化した。

統計解析
統計解析はR（V.4.4）を用いて行った。連続変数は平均値±標準偏差（SD）または中央値で表し、カテゴリー変数は比率で表した。アルファ多様性の差はウィルコクソン解析で検証した。PERMANOVAおよびVEGAN Rパッケージを用いて、群集組成とマイクロバイオームの外因性要素との関係を解析した。p値は、Benjamini-Hochberg手順を用いて多重比較を補正し、偽発見率（FDR）を0.05として調整した。Shapiro-Wilk検定とLevene検定は、それぞれ正規性と分散の均質性の仮定を検定するために使用された。その他の統計解析には、Mann-Whitney U検定、Kruskal-Wallis検定、Student's t検定、Pearsonの相関、Spearmanの順位相関が含まれた（GraphPad Prism9, La Jolla, CA, USA）。本論文の図2a、2d、3a、5a、7はBioRender（https://BioRender.com）で作成した。

結果
アスリートにおける腸内細菌叢組成および乳酸値と不安との関連
クローズドトレーニング中のプロシューター110名を対象に調査を行った。彼らの食事、トレーニング方法、スケジュールは厳密に管理されており、腸内細菌叢の研究に理想的なコホートとなった。これらの参加者の基本的な特徴を表S1に概説する。不安レベルはGAD-7スコアリングシステムを用いて評価した。全般性不安症の選手は、特性不安のレベルが高く、競技前の不安がより顕著である（図S1a）。不安と関連する微生物の特徴をさらに調べるために、アスリートの糞便サンプルを分析した。

16S rRNA配列決定を利用し、3つのグループ（健康、軽度、中等度から重度の不安）で204のASVを同定した。その結果、不安レベルが高くなるにつれて、ファーミキューテス属の相対量が徐々に減少することがわかった（図1aおよびS1b,c）。中等度から重度の不安のある人では、Agathobacter、Akkermansia、Bacteroidesの割合が減少し、FaecalibacteriumとDoreaがより多かった（図1b）。線形判別分析の効果量（LEfSe）により、グループ間で明確な微生物マーカーが同定された（p < 0.05、線形判別分析[LDA]スコア > 2）（図S1d）。合計で33の判別分類群が同定され、主に25の属に分類された（図S1e）。不安指標と最も密接に関連する微生物を特定するため、相関分析を行った。その結果、Delftia、Veillonella、Akkermansia、Methylobacteriumが不安と有意な相関を示した（図1c）。注目すべきことに、VeillonellaとAkkermansiaは最近、ヒト腸内の乳酸代謝循環において重要な役割を果たしていることが示されている。その結果、中等度／重度の不安群ではL-乳酸が減少していた（図S1f）。さらに、PICRUSt2に基づいて乳酸循環に関与する可能性のある遺伝子機能クラスターをスクリーニングし、2つのKO遺伝子を同定した： K10530（L-乳酸デヒドロゲナーゼチトクローム［EC:1.1.2.3］）とK00101（L-乳酸オキシダーゼ［EC:1.1.3.2］）である。不安レベルが上昇するにつれて、これら2つのKO遺伝子は減少傾向を示し、腸の乳酸代謝活性の変化を示唆している（図1e）。最後に、食事やパフォーマンスなど様々な因子とアスリートの不安レベルとの相関分析を行った。その中で、便中乳酸値が不安レベルと関連する重要な因子として浮上した（図1f）。

図1. 腸内細菌叢組成および糞便中乳酸値と関連する不安。

(a,b）3群間の門（a）および属（b）レベルでの腸内微生物組成の比較分析。(c)微生物分類群の差と不安尺度スコアとの相関を表したヒートマップ(*,p < 0.05)。GAD：全般性不安障害、STAI：状態特性不安目録、CA：認知的不安、SA：身体的不安、SC：自信。(d)アスリート糞便のノンターゲットメタボローム解析で同定された上位10差分代謝物。(e) PICRUSt2に基づく、乳酸代謝に関連するKO遺伝子K00101およびK10530の相対的存在量を示す環状ヒートマップ。(f)相関相互作用ネットワークヒートマップは、アスリートの心理スケールスコア、食事成分、運動パフォーマンス、および糞便代謝産物の差異（p < 0.05）の間の関係を示している。青い線は負の相関を、赤い線は正の相関を示している。
図1. 腸内細菌叢組成および糞便中乳酸と関連する不安。
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乳酸はマウスの腸内5-HT系を増強した
。 次に、腸内局所の乳酸が不安に及ぼす影響に注目した。全身性の乳酸は腸で速やかに吸収されることから、腹腔内注射によって腸の局所乳酸レベルを変化させることを選択したCitation21。さらに、定期的な運動はマウスの不安を有意に緩和し、運動しているマウスは本研究の陽性対照となった（図2a）Citation21,Citation28,Citation29運動の効果と同様に、乳酸処理によって、オープンフィールド試験と高架式十字迷路試験（EPMT）の両方で不安に関連する行動が減少した（図2b,c）。興味深いことに、乳酸塩はマウスの疲労耐性と平衡感覚も改善した（図2d）。この改善は、不安レベルの低下と強い相関があった（p = 0.002、R = 0.795）（図2e）。

図2. 乳酸はマウスの5-HT系の活性を増強した。

(a) マウス運動モデルの実験デザインの模式図。(b,c)オープンフィールド試験(b)と高架式十字迷路試験(c)の図解と、それに付随する排便頻度とオープンアームでの滞在時間の統計解析を示す棒グラフ。(d) 回転ロッドシステムでの落下時間の3群間比較分析（n = 4）。(e)落下時間と開放腕での滞在時間との間のスピアマンの順位相関。(f）血清中のセロトニン（5-HT）レベルの測定。(g) マウスの大腸におけるトリプトファン水酸化酵素1（Tph1）と前頭前皮質におけるトリプトファン水酸化酵素2（Tph2）の遺伝子発現プロファイル（18S rRNAで正規化）。(h)マウスの大腸におけるセロトニン代謝経路の遺伝子発現プロファイル。18S rRNAに正規化したもので、小胞モノアミン輸送体2（VMAT2）とモノアミン酸化酵素A（MAO-A）を含む。(i) マウス結腸における5-HTと乳酸濃度のスピアマンの順位相関。データは平均値±SDで示され、有意性は*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001; ns, no significanceで示される。
図2. 乳酸はマウスの5-HT系の活性を増強した。
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不安はセロトニン（5-HT）産生の不均衡と関連していることを考慮し、3群間で末梢の5-HTレベルを比較した。その結果、運動と乳酸投与はともに血清5-HTレベルを有意に上昇させた（図2f）。セロトニン合成は、主に腸のエンテロクロマフィン（EC）細胞に発現するトリプトファン水酸化酵素1（TPH1）と、主に中枢神経系に存在するトリプトファン水酸化酵素2（TPH2）という2つの律速アイソザイムによって制御されている。乳酸によるこの酵素発現の変化は、腸でのみ起こった（図2g）。さらに、セロトニンの制御に関与する他の2つの酵素-モノアミン酸化酵素A（MAO-A）と小胞モノアミン輸送体2（VMAT2）-は、処理したマウスの大腸で有意な変化を示したが、脳では見られなかった（図2hとS2a）。大腸組織中の5-HT濃度は、腸内乳酸レベルの上昇に反応して上昇し、局所的な腸内乳酸が腸内セロトニン系の活性に影響を及ぼすという仮説を支持した（図2i）。これらの所見から、乳酸は有意な抗不安作用を発揮し、大腸でのセロトニン合成を促進することによって、局所的な腸内セロトニンレベルと全身的なセロトニンレベルの両方に影響を及ぼすことが示唆される。

乳酸塩は慢性不安を緩和し、マイクロバイオームを再構築した
慢性不安プロセスに対する乳酸塩の効果をさらに調べるため、マウスに慢性予見不能軽度ストレス（CUMS）モデルを確立した（図3a）。乳酸塩はマウスの探索行動を増加させ、高所や露出した場所での回避行動を減少させた（図3b）。以前に観察されたアスリートにおける不安に関連した微生物の変化に基づき、我々はさらに、乳酸が同時に不安マウスの腸内細菌叢に影響を与えるかどうかを調べた。主座標分析（PCoA）により、異なる微生物群集構造が明らかになり、腸内乳酸が腸内細菌叢に直接影響を与えていることが示された（図3c）。乳酸は、乳酸桿菌、アリスティペス、ルミニクロストリジウム、プレボテラ科など、慢性ストレスによって有意に変化した特定の微生物の存在量を回復させた（図S2b）。注目すべきは、アッケマンシアの相対存在量が乳酸処理下で有意に増加したことである（図3d）。しかし、アスリートで観察されたもう一つの不安関連属であるVeillonellaは、乳酸処理後に有意な変化を示さなかった（図S2c）。

図3. 乳酸はマウスの不安を緩和し、腸内細菌叢を調節した。

(a）マウス慢性予見不能軽度ストレスモデルの実験デザインと行動記録プロトコル。(b)オープンフィールド試験と高架式十字迷路試験の結果。周囲フィールドでの滞在時間、オープンアーム、クローズドアーム、および中央領域への進入頻度が強調されている。(c) Bray-Curtis非類似度に基づくマウスの腸内細菌叢β多様性の主座標分析（PCoA）。(d）異なるグループのマウス腸内細菌叢におけるAkkermansiaの相対的存在量。(e)乳酸代謝に関連するKO遺伝子K00101およびK10530の各群における相対的存在量、データはPICRUSt2によって得られた。(f)K00101およびK10530の代表遺伝子であるlldDおよびlctOの相対量は、それぞれ糞便DNAのqPCRにより検証した。16s rDNAは外来性コントロールに用いた。(g)マウスの不安行動指標と特異的機能遺伝子との相関係数。正の相関を赤、負の相関を青で示す。ボックス内の充填率は変数間の相関係数の強さを表す。データは平均値±SDで示した。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001。
図3. 乳酸はマウスの不安を緩和し、腸内細菌叢を調節した。
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不安が腸内乳酸サイクルの活性に関与している可能性があるという前回の結果に基づき、乳酸処理の有無によるマウスの腸内機能遺伝子クラスターの変化を比較した。乳酸は、CUMSモデルにおけるKO遺伝子K00101とK10530の存在量を有意に変化させた（図3e）。この効果は、糞便DNAサンプルのqPCRを用いて、K00101とK10530の代表遺伝子であるlldDとlctOの存在量をそれぞれ定量することでさらに検証された（図3f）。引用32 重要なことに、乳酸塩はK00101の存在量を減少させ、マウスの不安レベルの低下と有意な負の相関を示した（図3g）。

乳酸は、トリプトファン代謝の5-HT合成へのシフトを促進した
。乳酸が主に腸内のセロトニン（5-HT）産生を促進するというこれまでの知見に基づき、マウスの大腸のRNA配列解析を行うことで、乳酸が慢性不安を改善するメカニズムをさらに深く掘り下げた。グループ間比較では、乳酸に反応してインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1（Ido1）の有意な発現低下が見られた（図4a、S3a）。IDO1は、一般に腸組織で高発現しているC33が、乳酸によって阻害された（図4b,c）。重要な酵素として、IDO1はキヌレニン（Kyn）経路を介した遊離トリプトファンの95％の代謝を規定する。したがって、乳酸はトリプトファン代謝をリダイレクトし、Kynから5-HT経路への変換を促進するという仮説を立てた（図4d）。IDO1とTPH1の発現を比較分析したところ、反対の傾向が示された（図4e-g、S3b）。キヌレニン経路の一部であるKMOは影響を受けなかったが、乳酸は神経毒性の副産物であるキノリン酸に関連する酵素であるHAAOを減少させた（図4a,gおよびS3b）。さらに、乳酸塩は腸内の5-HT合成を促進した（図4h-j）。全体として、乳酸塩は結腸におけるトリプトファンからキヌレニンへの変換を減少させ、主要酵素の発現を変化させることによって5-HT経路を活性化する。

図4. 乳酸は酵素制御を通してトリプトファン代謝をリダイレクトした。

(a)対照群と乳酸投与群間の発現差遺伝子(DEG)を示すボルケーノプロットで、絶対倍率変化が2.0以上かつp<0.05の発現上昇遺伝子(赤)と発現低下遺伝子(緑)を強調している。(b) DAPIで染色した大腸組織切片（左）、IDO1（中央）、およびマージ画像（右）。スケールバー：200μm。(c) 結腸組織におけるIDO1の蛍光面積率。(d）トリプトファン代謝の制御経路を示す模式図。略号： トリプトファン（TRP）、キヌレニン（Kyn）、3-ヒドロキシアントラニル酸（3HAA）、キノリン酸（QA）、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）、トリプトファン2,3-ジオキシゲナーゼ（TDO）、キヌレニン3-モノオキシゲナーゼ（KMO）、キヌレニナーゼ（KYNU）、3-ヒドロキシアントラニル酸3,4-ジオキシゲナーゼ（HAAO）。(e) 18S rRNAに対するマウス結腸におけるIdo1とTph1の発現の定量的RT-PCR解析。(f）Tph1とIdo1の遺伝子発現のピアソン相関解析。(g) トリプトファン代謝に関与する酵素のウェスタンブロット解析。(h) クロモグラニンA（CgA）で染色した結腸組織の代表画像（左）、5-HT（中）、およびマージ画像（右）。スケールバー： 100 μm。(i) 結腸における5-HT+細胞/CgA+細胞の定量的評価。(j）マウスの血清5-HTレベルの測定。(k) ウェスタンブロットによるマウス結腸におけるMCT1のタンパク質発現解析および定量解析。(l) GEPIAによる健常人の結腸および小腸末端サンプルにおけるIdo1発現とSlc16a1遺伝子とのスピアマンの順位相関分析。データは平均値±SDで示され、有意性は*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001で示される。
図4. 乳酸は酵素制御を通じてトリプトファン代謝をリダイレクトする。
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Slc16aファミリーのモノカルボン酸トランスポーター1（MCT1）は、細胞の乳酸輸送に極めて重要である。引用36-38 これまでの研究で、運動がMCT1のアップレギュレーションを促進することが示されており、われわれも乳酸調節においてこれを観察している（図4k）。このことは、乳酸がMCT1をアップレギュレートすることによって細胞間乳酸移行を促進し、その結果トリプトファン代謝を制御している可能性を示唆している。

乳酸とA. muciniphilaはトリプトファン代謝を共制御する
乳酸サイクルにおける共生微生物叢の積極的な参加と抗不安作用への寄与の可能性を考慮し、特定の微生物の役割をさらに探索した（図1c,e）。我々は、不安と関連し、乳酸によって有意な影響を受ける種であるAkkermansiaに注目した（図1c、3d）。マウスに7日間の抗生物質投与を行い、その後、乳酸と一緒にアッケマンソウ（A. muciniphila）を投与した（図5a, S3c）。その結果、抗生物質による微生物叢の枯渇後でも、乳酸の補充によってアッカーマンシアの存在量が増加することがわかった（図5b）。A. muciniphilaの投与は腸内細菌叢のα多様性を高め、腸内微生物生態系の回復に寄与した（図5b、S3d）。胚芽枯渇後、A. muciniphila、乳酸、またはこれらを併用した場合の5-HT産生への影響を比較した。その結果、A. muciniphilaと乳酸の共補給は、IDO1とTPH1の発現に有意な影響を及ぼし、大腸の局所と循環の両方で5-HTレベルを増加させた（図5c-e，S3e-f）。抗生物質の残存効果や微生物叢の変化の影響を除外するために、無菌マウスでA. muciniphilaの単コロニー化を行った（図S3g）。しかし、A. muciniphila単独ではトリプトファン代謝に有意な影響は見られなかった（図5f-h, S3h）。微生物のコロニー形成が比較的まばらな空腸では、乳酸をCitation40で補充しても、5-HT系の活性は改善しなかった（図S4a-d）。総合すると、乳酸はアッケマンシアの存在量を増加させ、それらの共存は5-HT産生をより効果的に制御していた。

図5. 乳酸とA. muciniphilaはトリプトファン代謝の方向転換を制御する。

(a) マウス（n = 6）を用いた抗生物質減量・経口投与モデルの実験デザインプロトコール。(b)異なるグループ間での腸内微生物組成の属レベルでの比較分析。(c）マウス大腸におけるトリプトファン代謝に関与する主要酵素の発現を示すウェスタンブロット分析。(d) マウス大腸におけるIdo1とTph1の定量的RT-PCR解析（18S rRNAで正規化）。(e）マウス結腸および血清中の5-HTレベルの測定。(f) 無菌マウス（n = 4）の結腸におけるトリプトファン代謝に関与する主要酵素の発現を示すウェスタンブロット分析。(g）無菌マウス結腸におけるIdo1とTph1の定量的RT-PCR解析（18S rRNAで正規化）。(h）無菌マウス結腸および血清中の5-HTレベルの測定。(i) 60％乳酸ナトリウム添加BHI培地上清中のSCFAs濃度（A. muciniphilaの有無にかかわらず）。(j) 野外におけるマウスの総移動距離と活動時間。(k)マウスの結腸におけるIdo1とTph1の定量的RT-PCR解析（18S rRNAで標準化）。熱不活化A. muciniphila : HI-Akk、プロピオン酸： PA。(l）マウス結腸および血清中の5-HTレベルの測定。データは平均値±SDで示し、有意性は*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ns, no significanceで示す。
図5. 乳酸とA. muciniphilaはトリプトファン代謝の方向転換を制御する。
次に、A. muciniphilaがトリプトファン代謝の制御にどのように関与しているかをさらに調べた。研究により、アッケマンシアは乳酸を炭素源として効果的に代謝できることが示されており（引用27）、腸内におけるSCFAの重要な供給源である（引用41）。そこで、乳酸を添加したA. muciniphila培養上清について、標的SCFA代謝物分析を行った。乳酸添加により、上清中のプロピオン酸濃度が有意に上昇した（図5i）。A. muciniphilaの活性成分を同定するために、熱不活性化したA. muciniphilaとプロピオン酸のマウス代謝への影響も比較した。プロピオン酸はマウスの5-HT系の活性を亢進させ、オープンフィールドの中央領域での動きを増加させた（図5j-l）。熱で不活性化したA. muciniphilaを補充しても有意な改善はみられず、プロピオン酸がA. muciniphilaが不安を軽減する効果的なメカニズムである可能性が確認された。これらの結果を総合すると、A. muciniphilaが乳酸環境下で産生するプロピオン酸が、抗不安作用の鍵となるメディエーターであることが示唆された。プロピオン酸は、A. muciniphilaの代謝によって産生される有効な抗不安成分である可能性がある。

乳酸は腸内細菌叢に依存して腸管バリアーの完全性を維持していた
乳酸が腸管ホメオスタシスにどのように寄与しているのかをさらに掘り下げるため、我々はマウスの大腸を対象にGene Ontology (GO)とKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)の濃縮解析を行った。遺伝子差解析の結果、乳酸塩は細胞接着過程に影響を及ぼすことが明らかになった（図6a）。特に、クローディン-1をコードする遺伝子Cldn1は、腸管透過性マーカー、オクルディン、Zo-1と並んで有意な増加を示した（図6b-e、S4e）。腸管幹細胞の再生に関連するLgr5とMsi1のレベルも乳酸によって有意に上昇し、腸管バリアの完全性の維持に不可欠であった（図6f）。乳酸とA. muciniphilaを相乗的に用いると、腸のバリアが効果的に回復した（図6g-k）。Citation43,Citation44。これらの結果から、乳酸とA. muciniphilaの協同作用は、腸管バリアの完全性を維持し、生態系の不均衡を防ぎ、宿主の精神的健康に恩恵をもたらす上で極めて重要であることが示唆される。

図6. 乳酸は腸内バリアの完全性を維持するために腸内細菌叢に依存している。

(a)コントロールと乳酸処理マウスの結腸で発現が異なる遺伝子のジーンオントロジー（GO）と京都遺伝子百科事典（KEGG）機能濃縮解析。(b)Cldn1を中心とした大腸における発現差遺伝子(DEGs)のランキング。(c) マウス結腸組織におけるクローディン-1、オクルディン、Zo-1 mRNA発現のqPCR解析（18S rRNAで正規化）。(d-e）マウス大腸組織におけるクローディン-1のヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色および免疫蛍光染色とその統計グラフ（e）スケールバー： 50 μm。(f) Lgr5およびMsi1を含む腸管幹細胞マーカーのmRNA発現を18S rRNAで正規化したもの。(g) A. muciniphila投与後のマウスの腸管におけるClaudin-1、Occludin、およびZo-1のmRNA発現（18S rRNAに対して正規化）。(h-i) DAPI染色した結腸組織の代表画像（上）、クローディン-1染色した画像（中）、合併した画像（下）とその統計グラフ（i）スケールバー：200μm。(j) A. muciniphila投与後のマウスの腸管幹細胞マーカーのmRNA発現プロファイル（18S rRNAで正規化）。(k). マウス大腸組織のヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色と統計グラフ。スケールバー：200μm。データは平均値±SDで示し、有意性は*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001で示した。
図6. 乳酸は腸内バリアの完全性を維持するために腸内細菌叢に依存している。
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Discussion
本研究では、中国人アスリートの管理された条件を考慮し、腸内細菌叢が不安にどのように影響するかに焦点を当てた。その結果、不安レベルとAkkermansiaの豊富さの間に負の相関関係があることが示唆された。我々は、乳酸が微生物叢と不安調節をつなぐ重要な分子として機能していることを発見した。乳酸が豊富な環境では、A. muciniphilaの存在量が有意に増加し、それに伴ってプロピオン酸濃度が上昇した。この過程でIDO1とTPH1の発現が著しく変化し、トリプトファン代謝がキヌレニン経路（KP）から5-HT産生へとシフトした。乳酸と微生物叢の相乗的相互作用は、腸管バリアの完全性を高める（図7）。

図7. トリプトファン代謝における乳酸とA. muciniphilaの制御的役割の模式図。

図7. トリプトファン代謝における乳酸とA. muciniphilaの制御的役割の模式図。
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末梢に循環する5-HTは、腸内で代謝されたトリプトファンに由来する。Citation45。IDO1の活性化は、神経毒性代謝物QAを含むKynおよびその誘導体の蓄積につながる。Citation46 QAレベルの上昇およびKyn/TRP比の増加は、精神疾患において一般的に観察される。これらの結果は、トリプトファン代謝が調節されやすく、神経伝達物質の機能を乱し、精神疾患の一因となる可能性があることを示している。引用33 最近の研究では、トリプトファン代謝が精神疾患の治療標的として注目されている。トリプトファンの補給や、ラクトコッカス・ラクティスやラクトバチルス・ラムノサスGGなどの特定の微生物によるコロニー形成は、代謝バランスを効果的に回復させ、表現型の転帰を改善することが示されている。このことは、微生物とその副代謝産物が、宿主の代謝バランスを調整する上で協力できることを示している。さらなる研究により、同様の相乗的相互作用が宿主の生理状態にさらなる影響を及ぼすかどうかを調べる必要がある。

我々の発見は、乳酸によるトリプトファンの代謝調節は、正常な微生物の活動に複雑に依存しており、A. muciniphilaが特に重要な役割を果たしていることを示している。腸内セロトニン系の機能強化には、腸内細菌叢の存在が不可欠であるが、このことは、微生物のコロニー形成がまばらな空腸では、その効果が限定的であることからも明らかである。腸由来の5-HTの変動は、微生物によって調節される可能性があり、その副産物である短鎖脂肪酸（SCFA）や芽胞形成細菌が産生する可溶性因子を介して、腸クロム親和細胞の分泌能に影響を与える直接的なシグナルとして作用する。引用8,引用51 さらに、A. muciniphila由来の外膜タンパク質Amuc_1100は、Toll様受容体2（TLR2）を介して宿主の腸内5-HT系を制御する。しかしながら、5-HT合成の上流成分が同様に影響を受けるかどうかは、依然として不明である。これまでの研究で、大腸のIDO1活性化は小腸に比べてトリプトファンのホメオスタシスに大きな影響を与えることが示されているが、これは常在細菌叢が存在するためと考えられる。プロピオン酸は、A. muciniphilaが不安を調節する重要な成分である可能性がある。引用54 今回の結果から、乳酸はA. muciniphilaにとって有益な増殖環境を提供することが明らかになった。一方、A. muciniphilaは、宿主の代謝不均衡を改善する上で、乳酸に寄与するのに十分である。

アスリートは高レベルの乳酸を生成するが、これは腸内で代謝され、特別な環境を作り出す。乳酸循環に関与する主要微生物であるVeillonellaとAkkermansiaは、アスリートにおいてより高い存在率で見つかった。引用21,引用55 興味深いことに、これら2つの微生物は、我々のアスリートコホートの中でも特に不安の少ないチームメンバーに多く見られた。不安のないアスリートでは、乳酸代謝に関連する遺伝子の存在量が高いことが観察され、微生物の乳酸循環能力が不安を調節する役割を担っている可能性が示唆された。さらに、乳酸を再利用するVeillonellaのような微生物は、乳酸をプロピオン酸に変換することによって運動パフォーマンスを向上させる。これは、乳酸がA. muciniphilaの代謝基質となり、プロピオン酸の産生が促進され、その結果、マウスの持久力とバランスが向上したためと考えられる。乳酸と腸内細菌叢の相互作用についてさらに研究が進めば、エリートアスリートの心身の健康について貴重な知見が得られ、スポーツ心理学の新たな視点に貢献する可能性がある。

研究の限界
本研究にはいくつかの限界がある。第一に、乳酸とA. muciniphilaの有益な効果は、より大規模なヒト集団で検証する必要がある。第二に、A. muciniphilaの活性成分の詳細な分析を含め、不安に関与するトリプトファン代謝経路の制御において、代謝物と微生物がどのように相互作用しているかを探るためには、さらなる研究が必要である。

結論
結論として、我々のin vivoデータは、腸内乳酸とA. muciniphilaが共同でトリプトファンから5-ヒドロキシトリプタミンへの代謝を促進することを支持した。これらの知見は、腸内代謝産物とメンタルヘルスとの間の複雑な相互作用に関する新たな洞察を提供し、不安管理における微生物叢を標的とした治療介入への有望な道を提供するものである。我々の発見は、乳酸が不安の調節に直接関与していること、そして乳酸がより好ましい微生物環境を作り出す能力を持つことを実証することで、乳酸についての理解を広げるものである。

著者の貢献
MP、CQ、HW、CZは研究デザインに参加した。MP、SH、XZ、YY、YcWがデータ収集とデータ解釈を行った。MP、CQ、HW、CZがデータ解析を行い、原稿を作成した。YcW、BW、HY、AY、TW、MFが詳細な文献検索を行った。LW、YhW、YZはデータ解析のための統計解析とバイオインフォマティクス解析をサポートした。CZ、CS、HWは図表の作成を手伝い、インフォマティクスとファインディングをサポートした。すべての著者が原稿に貢献し、原稿の提出に同意した。

データおよび資料の利用可能性
本研究で作成および解析したデータセットは、China National Center for Bioinformation portal repository (subPRO019926, https://ngdc.cncb.ac.cn/sso/login)で利用可能である。

倫理承認
この研究はヒトを対象としており、復旦大学上海第五人民病院倫理委員会の承認を得ている。

補足資料
補足資料
ダウンロード MS Word (11.3 MB)補足資料
開示声明
著者による潜在的な利益相反の報告はなかった。

補足資料
本論文の補足データは、https://doi.org/10.1080/19490976.2024.2447834 からオンラインでアクセスできる。

追加情報
資金提供
本研究は、上海市衛生委員会の分野リーダー助成金[2022XD051]、中国の上海スポーツ科学技術「準備と取り組み重点プロジェクト」[24J007、20J004]、中国の国家重点研究開発プロジェクト[2018YFC2000500][2018YFC2000503]、国家加齢医学臨床研究センターのイノベーション特別プロジェクト[2023KF2004]の支援を受けた。
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