粘膜バイオフィルムは過敏性腸症候群および潰瘍性大腸炎の内視鏡的特徴である

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原著論文｜フルレポート：基礎と臨床-消化管|161巻4号1245-1256.e20頁2021年10月

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粘膜バイオフィルムは過敏性腸症候群および潰瘍性大腸炎の内視鏡的特徴である

https://www.gastrojournal.org/article/S0016-5085(21)03138-3/fulltext?referrer=https%3A%2F%2Ft.co%2F

マキシミリアン・バウムガルトナー
ミカエラ・ラング
ハンター・ホリー
アタナシオス・マクリスタティス
マルクス・ムッテンターラー
クリストフ・ガシェ
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オープンアクセス掲載:2021年6月16日DOI:https://doi.org/10.1053/j.gastro.2021.06.024
PlumXメトリクス

背景と目的
過敏性腸症候群（IBS）および炎症性腸疾患は、生活の質を大幅に低下させ、社会経済的に大きな影響を及ぼす。IBSでは診断と治療の選択肢は限られているが、疾患の病態生理に腸内細菌叢が関与していることを示すエビデンスが出現しつつある。ここでは、消化管疾患における内視鏡的に可視化可能な粘膜バイオフィルムの有病率と、それに関連するマイクロバイオーム組成および代謝の変化について解析した。
方法
欧州の大学に拠点を置く2つの内視鏡センターにおいて、1426例の患者を対象に粘膜バイオフィルムの存在を評価した。大腸生検および糞便サンプルの16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンシークエンス、ディープラーニングベースの画像解析を用いた共焦点顕微鏡、走査型電子顕微鏡、メタボロミクス、in vitroバイオフィルム形成アッセイを用いて、分子および顕微鏡による詳細な解析を行うために17名の患者を選択した。
結果
バイオフィルムはIBS患者の57％および潰瘍性大腸炎患者の34％に存在したのに対し、対照群では6％であった（P < 0.001）。回腸および右側結腸のこれらの黄緑色の付着層は、高密度の細菌バイオフィルムであることが顕微鏡的に確認された。16S-シークエンシングにより、バイオフィルムの存在は、大腸菌やルミノコッカス・グナバスの過剰増殖を含む腸内細菌叢の異常と関連づけられた。患者のバイオフィルムから培養したR. gnavus分離株もin vitroでバイオフィルムを形成した。メタボローム解析により、バイオフィルム内での胆汁酸の蓄積が認められ、これは便中胆汁酸排泄量と相関していたことから、この表現型は下痢の機序と関連していた。
結論
粘膜バイオフィルムの存在は、胆汁酸代謝の破綻と細菌異常症を伴うIBSおよび潰瘍性大腸炎のサブグループにおける内視鏡的特徴である。この結果は、IBSおよび潰瘍性大腸炎の病態生理学に新たな知見を与えるものであり、バイオフィルムがdysbiosisおよび疾患発症の転換点として捉えられることを示している。
図解抄録
図サムネイルfx1
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キーワード
内視鏡検査
微生物叢
機能性消化管障害
細菌-上皮相互作用
本稿で使用した略語：
ASV（amplicon sequencing variant）、BA（bile acid）、BF-（biofilm negative）、BF+（biofilm positive）、DAPI（4′,6-diamidino-2-phenylindole）、GI（gastrointestinal）、IBD（inflammatory bowel disease）、IBS（過敏性腸症候群）、 OTU（操作上の分類単位）、PAS（過ヨウ素酸シッフ）、PEG（ポリエチレングリコール）、rRNA（リボソームRNA）、SEM（走査型電子顕微鏡）、UC（潰瘍性大腸炎）、UCDA（ウルソデオキシコール酸）
知っておくべきこと
過敏性腸症候群（IBS）と炎症性腸疾患（IBD）は、それぞれ欧米人口の10〜15％と0.5〜1％が罹患しており、両疾患の有病率は世界的に増加している1,2。潰瘍性大腸炎（UC）とクローン病はIBDの最も一般的な病型であり、消化管の炎症が長期化し、腹痛、下痢、腸管出血、貧血を引き起こし、衰弱するのが特徴である。IBDは内視鏡検査によって診断されるが、IBSにはそのような即時診断検査は存在しない。IBS患者の多くは、現在の対症療法や原因不明の治療法に失望している4。頻繁な抗生物質療法や微生物に変化を与える食品添加物など、欧米の生活習慣が疾患発症に関与していることが指摘されている5,6。近年、IBSの病態生理学において、細菌の胆汁酸（BA）代謝の変化が注目されている7,8。健康なドナーの糞便を移植すると、IBS症状が一過性に改善する9,10。細菌分類群の相対的存在量の変化は、ハイスループットシークエンシングによって観察されている11,12,13が、細菌バイオマスや細菌群集の空間分布に関する研究は依然として限られている。
バイオフィルム形成は、付着性の原核生物群集が複雑な細胞外マトリックスに自らを埋め込んで競争上の優位性を獲得する、独特の微生物増殖様式である。バイオフィルム形成細菌は、事実上すべての生態系において数的にも代謝的にも優勢であり、人体の慢性細菌感染症にも関与している14,15。健康な腸内では細菌の増殖は通常、小さなマイクロコロニーとして散在しているが16,17、IBD、消化管感染症、右大腸がん、家族性大腸腺腫症などでは、顕微鏡的に多細菌バイオフィルムが観察されている18,19,20,21,22。しかし、腸内におけるバイオフィルム形成の巨視的に見える側面については、これまで検討されてこなかった。IBDにおける免疫系の過剰活性化23、微生物叢を変化させる医薬品24（免疫抑制薬、プロトンポンプ阻害薬、抗生物質の反復使用など）の慢性的使用24、食品添加物（抗菌活性および／または洗浄活性を有するものなど）、さらには消化管感染症や過度の衛生管理25など、微生物叢に対するストレス因子は、組織化されたバイオフィルム形成などの微生物防御機構を誘発する淘汰圧につながる26。
この研究では、2つの内視鏡検査コホート、合計1426人の患者を系統的に調査し、回腸と右側結腸で定期的に観察される黄緑色の付着層が、高解像度の白色光内視鏡検査で容易に確認できるバイオフィルムであることを実証した。このようなバイオフィルムは、IBSに非常に多く、IBDや臓器移植後のコホートではそれほど多くない。我々はさらに、16SリボソームRNA（rRNA）遺伝子アンプリコンシークエンシング、走査型電子顕微鏡（SEM）、ディープラーニングベースの画像解析を用いた共焦点顕微鏡、in vitroバイオフィルム形成アッセイ、およびメタボロミクスを含む様々な学際的技術を適用して、これらのバイオフィルムの特徴を明らかにした。これにより、バイオフィルムの起源に関する高度な理解と、将来の診断および治療選択肢のための新たな機会を提供する。
材料と方法
内視鏡的に可視化可能なバイオフィルムのスクリーニング
オーストリアのウィーン総合病院（n=976）およびドイツのエアランゲン大学病院（n=450）における国際的な多施設共同試験において、内視鏡的に可視化されたバイオフィルムの存在を、合計1426人の患者について評価した。内視鏡的に観察可能なバイオフィルムは、ポリエチレングリコール（PEG）ベースの腸管前処置にもかかわらず、腸管表面に付着した層と定義され、ジェット洗浄による剥離に抵抗するか、フィルム状に剥離した（補足ビデオ1）。各患者の腸管前処置は、Boston Bowel Preparation Scaleを用いてスコア化した27。偽陽性の可能性を最小限にするため、Boston Bowel Preparation Scaleのスコアが6未満の患者は解析から除外した。整腸剤の種類が腸内バイオフィルムの出現に影響を及ぼす可能性があるため、PEGを使用しない整腸剤を使用した患者をすべて除外してコホートを標準化し、すべての患者が標準化された整腸剤レジメン（すなわち、大量のPEGと翌日の午前8時から午後1時の間の予約）を受けていた。内視鏡検査で盲腸に到達しなかった患者も除外した。除外基準を適用した結果、1112例の患者が解析された（オーストリアから756例、ドイツから356例）。バイオフィルムの状態を従属変数とし、疾患コホートおよび国を独立変数とする多変量ロジスティック回帰を用いて、疾患コホートと内視鏡的に可視化された腸内バイオフィルムとの関連を評価した。計算はR.28を用いて行った。
サンプル収集
ウィーンのコホートから 17 例（IBS 56 例、UC 25 例、および大腸内視鏡検査で正常所見のある大腸がん検診を受診中の対照 36 例）を選び、分子および顕微鏡による詳細な解析を行った。サンプルは大腸内視鏡検査中に採取され、直ちに処理された。バイオフィルム陽性（BF+）生検は、内視鏡的にバイオフィルムが確認できる部位（盲腸または上行結腸）から採取した。さらに、バイオフィルム領域から少なくとも10cm遠位のBF+個体から生検を採取した（Distal-Bx；サンプリング部位の描写については補足図4Iを参照）。バイオフィルム陰性（BF-）患者の生検も盲腸または上行結腸から採取した。
粘膜バイオフィルムの顕微鏡分析
大腸生検はSEM、共焦点顕微鏡、明視野顕微鏡で分析した。細菌密度、細菌の総数、付着細菌の存在を定量化するために、最近発表されたディープラーニングアルゴリズムであるU-Net29を、4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）染色した生検切片の共焦点顕微鏡画像で学習させた。検出された細菌（トレーニングセットの一部ではない）の未修正の模範的な画像を補足図2Aに示す。共焦点顕微鏡画像は、切片ごとに目に見える細菌が存在するすべての領域について得られた。細菌密度および付着細菌密度は、144.72×144.72μmの画像中の細菌の最大数として決定した。細菌および付着（上皮から3μm以内）細菌の総数は、各生検の全画像の合計として算出し、上皮の長さで正規化した（隣接するH&E染色切片で決定した生検切片のサイズを調整するため）。メタカルンで固定した表層の厚さは、H&Eおよび過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色切片の明視野顕微鏡検査で評価した。各生検サンプルについて、生検切片全体を解析した。訓練されたU-Netモデルと補足図2Aを再現するデータは、GitHubで公開されている。顕微鏡分析、PAS染色、蛍光in situハイブリダイゼーション、サンプル番号の詳細については、補足方法と補足図3を参照。
粘膜バイオフィルムの分子解析
大腸生検および便サンプルのDNAは、Lysing Matrix Eチューブ（MP Biomedicals）を用いた最初のビーズビーティングステップ、およびPrecellys 24ホモジナイザー（Bertin instruments）を用いた5200 rpm 3×30秒（大腸生検）および5500 rpm 1×30秒（便サンプル）で変更した標準的なQIAamp DNA stool mini kitプロトコル（Qiagen）を用いて抽出した。細菌16S rRNA遺伝子のコピー数は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を用いて定量し、二本鎖DNAの総量（Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kitで評価）で正規化した。メタボロミクスは、回腸生検のサブセット（5個のBF+生検と5個のBF-生検）に対して、液体クロマトグラフィー質量分析計
(脂質分析には液体クロマトグラフィー質量分析装置（Orbitrap Fusion Lumos Tribrid; Thermo Fisher Scientific）を、代謝物分析には液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析装置（6470 triple quadrupole; Agilent Technologies）を用いた。便サンプルのBA組成は、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析計（TSQ Quantiva；Thermo Fisher Scientific）を用いて分析した。方法論、サンプル数、およびバイオインフォマティクスのワークフローについては、「補足的方法」および「補足的図 3」に詳しく記載されている。
細菌群集組成の解析とin vitroバイオフィルム形成アッセイ
大腸生検と便サンプルは、イルミナMiSeqテクノロジーと確立されたパイプラインを用いた16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングに供した30。アンプリコン配列の変異（ASV）はDADA2 Rパッケージ31を用いて推論し、分類学的分類はSINA（バージョン1.6.1）32を用いて行った。細菌群集組成の差異およびBAデータとの相関は、DESeq233およびRheaスクリプト34を用いて解析した。In vitroバイオフィルム形成実験は、確立されたマイクロタイタープレートバイオフィルムアッセイを用いて、バイオフィルム検体から分離した細菌株を用いて行った（詳細は補足方法を参照）35。
データとコードの入手
16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスデータは、BioProjectアクセッション番号PRJNA644520で寄託された。ヒト腸管生検のDAPI染色切片の共焦点蛍光顕微鏡画像における細菌検出のための学習済みU-Netモデルは、同様のプロジェクトに適用する方法や補足図2Aを再現するための簡単なチュートリアルを含め、GitHubに寄託した（github.com/MaximilianBaumgartner/U_Net_bacteria_detection）。
倫理声明
本研究は、各研究施設の倫理委員会の審査と承認を得た： ウィーン医科大学（EK-Nr：1617/2014、1780/2019、1910/2019）、エアランゲン大学クリニック（264_19 B）。すべての研究参加者は、サンプルを提供する前に書面によるインフォームド・コンセントを行った。本研究は、ヘルシンキ宣言に示された倫理原則および適用される連邦規則の要件に従って実施された。
結果
回腸および結腸に内視鏡的に可視の細菌バイオフィルムが存在する
IBS患者の診断的大腸内視鏡検査では、PEGベースの溶液で腸管を適切に整えたにもかかわらず、回腸および右結腸粘膜表面に付着した黄緑色の層が頻繁に観察された（バイオフィルムの巨視的定義については表1を参照）。これらの層は数十センチから腸全体を覆い、集中的なジェット洗浄によって初めてフィルム状に剥離した（補足ビデオ1、図1A、補足図1A）。いくつかの標本を従来の明視野顕微鏡とSEMで観察したところ、高密度の細菌凝集体が存在し（図1Bおよび補足図1A-C）、これらの層が細菌のバイオフィルムであることが明らかになった。この所見をさらに検証するため、BF+領域の大腸生検とバイオフィルムのない患者（BF-）の同領域の生検とを比較した。DAPI染色共焦点顕微鏡画像上で細菌を検出するように訓練されたディープラーニングアルゴリズムであるU-Net29を用いて、これらの生検における細菌の数と密度を定量化したところ（補足図2Aおよび3）、BF-生検と比較してBF+生検では約10倍の増加が確認された（図1DおよびE）。BF+生検のSEMでは、上皮に直接接触した高密度の細菌層が確認されたが、BF-生検では、粘液層表面に細菌が散在する無傷の粘液層が認められた（図1B、補足図1BおよびC）。BF+生検では、上皮に付着している細菌の数も多かった（図1F）。IBS患者からの2つのBF+生検では、細菌が1カ所で上皮に侵入していた（補足図2B）。BF+生検で観察された高い細菌密度を独立した分子的アプローチで検証するため、定量的ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、生検検体から得たDNA抽出物中の細菌16S rRNA遺伝子コピー数を定量した。BF+生検はBF-生検よりも有意に細菌DNAが多かった（図1G）。組織学的に決定された細菌の総量は、上皮付着細菌の数および定量的ポリメラーゼ連鎖反応のデータと相関しており、このことはわれわれのアプローチをさらに検証するものであった（補足図4S）。メタカルン固定およびH&E染色した組織学的生検切片でも違いは明らかで、BF+生検では粘液からなる厚い表面層があり、細菌は上皮と直接接触していた（図1CおよびH）。腸管粘液層の追加的読み出しとして、PAS染色を行った。BF+の生検では、PAS染色層の最大高さは増加したが、平均PAS染色層の高さは増加しなかった（補足図4PおよびQ）。以上より、黄緑色の層は、診断用の高精細白色光内視鏡検査で検出可能な、巨視的に見えるバイオフィルムであると結論した。この表現型は、IBS患者やUC患者だけでなく、健常人にも認められた（補足図4A-H）。また、BF+患者（Distal-Bx；補足図4I）では、BF-患者と比較して、このような目に見えるバイオフィルムのない、より遠位の別の大腸領域から採取した生検において、細菌量、密度、付着が高い傾向が観察され、微生物叢の変化による大腸フィールド効果が示唆された（補足図4J-R）。この閾値を共焦点顕微鏡データに適用すると、BF+患者の89％（巨視的バイオフィルム検出のために我々が確立した内視鏡的特徴によって決定される）（表1）がこの基準を満たしたのに対し、BF-患者では40％であった（補足図4R、72％の精度）。
表1内視鏡的バイオフィルムの定義
変数 高容量PEG腸管準備後の内視鏡的外観、BBPS≧6
糞便残渣 バイオフィルム
場所 盲腸と直腸の間であればどこであってもよい。
形態 斑点状 緑黄色の連続層、時に斑点状
円周上の位置 下側で物質が多いa 全ての側で同様のパターン
ウォータージェット洗浄 洗い落としやすい 洗い落としにくい 膜として剥がれる
洗浄後の残留物 NBIを使用した場合は残留物なし NBIを使用した場合は赤い斑点あり
BBPS, Boston Bowel Preparation Scale; NBI, narrow-band imaging.
a 重力によるもの。
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図サムネイルgr1
図1内視鏡的に可視化されたバイオフィルムは高密度の細菌凝集体からなる。(A-C）巨視的に見えるバイオフィルムを有する患者（BF+ IBS、上段）と有さない患者（BF-対照、下段）の代表的な内視鏡写真と生検の比較。(A）BF+患者の腸粘膜表面に付着した黄緑色の層の内視鏡写真。(B)同じ患者のSEM。BF+生検では上皮に付着した細菌がぎっしり詰まっていることが確認できる（細菌は赤色）。BF-生検では、無傷の粘液層に細菌が散在していた。(C）生検切片をDAPI（青）で染色し、一般細菌プローブMix EUB338 I-III（緑）を用いて蛍光in situハイブリダイゼーションを行ったところ、BF+生検では細菌が上皮に直接接触してびっしりと詰まっている（赤矢印）のに対し、BF-生検では上皮から離れたところに細菌が散在していた。白の破線は上皮の境界を示す。H&E染色により、BF+生検では粘液と細菌からなる表層が認められた。(D）1切片あたりの上皮の長さに対して正規化した細菌の総数（BF+生検：橙色、BF-生検：青色）。(E）1切片あたり144.7×144.7μmの共焦点顕微鏡像における細菌の最大密度。(F)上皮から3μm以内に存在する細菌の数（切片あたりの上皮の長さに対して正規化）。(G) 生検あたりの全二本鎖DNAに対する16S rRNA遺伝子コピーの比率。(H) 1切片あたりの、上皮上部のメタカルン固定H&E染色表面層の最大高さ。(i) 主要研究コホートのバイオフィルムの位置と数。ほとんどのバイオフィルムは回腸、盲腸、上行結腸で観察された。(D,E,F）対数スケールで定義されていないため、x軸にゼロ値を表示。統計解析：（D、E、F、H）Mann-Whitney U検定、n＝37 BF+、n＝47 BF-、（G）対数変換データに対するt検定、n＝42 BF+、n＝56 BF-；＊＊P≦0.01、＊＊＊P≦0.001。
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粘膜バイオフィルムは過敏性腸症候群および潰瘍性大腸炎で頻繁に観察される内視鏡的特徴である。
内視鏡的に可視化されるバイオフィルムの有病率を、独立した2つの大学の内視鏡検査室で調査した。PEGベースの腸管前処置を行い、十分な腸管前処置スケール（Boston Bowel Preparation Scaleスコア≧6）を有する内視鏡検査を予定していた全患者を研究に組み入れ、基礎疾患に従ってグループ分けした。バイオフィルムの状態は、我々の確立した基準に従って決定した（表1、補足ビデオ1）。大腸内視鏡検査1112例中212例（19％）で回腸および／または結腸にバイオフィルムが確認された。バイオフィルムはIBS患者（57％）、UC患者（34％）、臓器移植後患者（23％）、クローン病患者（22％）に多くみられたが、スクリーニング大腸内視鏡検査を受けた健常対照者（6％）にはみられなかった（表2）。多変量ロジスティック回帰では、年齢と性別が解析に影響する可能性は除外された（補足表1および2）。また、多変量ロジスティック回帰モデルでは、内視鏡検査室は有意な影響を及ぼさなかった（P = 0.97）。オーストリアとドイツのコホート間のバイオフィルム有病率を直接比較すると、オーストリアの腺腫コホート（P = 0.036）およびドイツのクローン病コホート（P = 0.007）では、バイオフィルムの有病率が有意に高かった。バイオフィルムは盲腸（72％）、回腸末端（71％）、上行結腸（45％）に多く、横行結腸（18％）、下行結腸（11％）、S状結腸（8％）および直腸（6％）には少なかった（図1I）。回腸のバイオフィルムは95例中66例（70％）で右側結腸のバイオフィルムと一致していた。内視鏡的に観察可能なバイオフィルムは、病態とは無関係に回盲部において最も多かった。UC患者ではバイオフィルムがさらに遠位まで広がっている傾向がみられた（補足図4T）。BF-患者10人中10人は、追跡大腸内視鏡検査でもその表現型を維持していた。BF+患者9例中4例がBF-に移行し、大腸内視鏡検査間隔は平均7ヵ月であった（補足図5）。UCでは、バイオフィルムの存在は疾患の程度と関連しており、組織学的炎症の傾向がみられた（補表1および3）。この関連をさらに調べるために、代表的な患者サブグループにおいて、腸管炎症のマーカーとして糞便カルプロテクチンを分析した。BF+患者はBF-患者に比べ、確かにカルプロテクチン値が高かった。この影響はUC患者においてより顕著であり、BF+患者ではカルプロテクチンが約10倍上昇した（補足表4）。投薬はマイクロバイオームの構成と腸管粘液産生に影響を与える可能性がある24,37。そこで、BF+患者とBF-患者の投薬歴を分析した。この解析により、健常人におけるプロトンポンプ阻害薬とバイオフィルムの存在との関連が明らかになった（補足表4）。最近の抗生物質摂取、プロバイオティクス、非ステロイド性抗炎症薬、甲状腺ホルモン療法との関連は認められなかった。
表2独立した2つの内視鏡検査室における内視鏡的に可視なバイオフィルムの有病率
変数 バイオフィルム有病率： BF+/全症例(%) ORa (95% CI)
合計 オーストリア ドイツ
過敏性腸症候群 65/114 (57) 52/86 (60) 13/28 (46) 19.2 (9.5-42.5)＊ 潰瘍性大腸炎 46/114 (57) 52/86 (60) 13/28 (46) 19.2 (9.5-42.5)
潰瘍性大腸炎 46/136 (34) 30/102 (29) 16/34 (47) 7.4 (3.7-16.2)∗.
臓器移植後 9/39 (23) 6/28 (21) 3/11 (27) 4.3 (1.6-11.7)
クローン病 30/134 (22) 10/82 (12) 20/52 (38) 4.2 (2.0-9.3)∗.
その他 7/50 (14) 7/49 (14) 0/1 (0)
腺腫 26/208 (13) 24/142 (17) 2/66 (3)-。
門脈圧亢進症 8/67 (12) 6/48 (13) 2/19 (11)
大腸がん 4/39 (10) 4/26 (15) 0/13 (0)
憩室性疾患 4/92 (4) 3/29 (10) 1/63 (2) - 消化管出血 3/78 (4)
消化管出血 3/78 (4) 2/52 (4) 1/26 (4) ・・・。
健康な対照群 10/155 (6) 8/112 (7) 2/43 (5) - ・・・。
総計 212/1112 (19) 152/756 (20) 60/356 (17) ・・・。
NSAIDは非ステロイド性抗炎症薬，ORはオッズ比。
a 有意ORと調整ORのみを示す。
b 顕微鏡的大腸炎，膠原病性大腸炎，好酸球性大腸炎，非ステロイド性抗炎症薬による大腸炎，消化管感染症および化学療法による下痢を含む。
∗∗ P ≤ .01.
∗∗∗ P ≤ .001.
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細菌バイオフィルムは、不衛生なマイクロバイオームおよび腸内胆汁酸レベルの上昇と関連している
UC、IBSおよびコントロール患者から採取した大腸生検の16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシング解析から、BF+患者では、疾患の状態にかかわらず、他のすべてのサンプルと比較してマイクロバイオームが有意に変化していることが明らかになった（図2A、補足図6）。全体として、BF+患者では細菌の豊富さと多様性が減少していた（図2B）。Escherichia/Shigella属およびRuminococcus gnavusグループに属する細菌は、BF+生検で特に増加していた（図2C）。全体として、BF+患者の51％およびBF-患者の18％にR. gnavusグループのブルームが認められた（図2D）。バイオフィルムの存在は、Faecalibacterium、Coprococcus、Subdoligranulum、Blautiaなどの短鎖脂肪酸産生細菌属の減少と関連していた（図2E）。6つの大腸バイオフィルムから内視鏡的に採取したブラシサンプルから分離した代表的な15株のin vitroアッセイでは、6つの強力なバイオフィルム産生株が同定された：R. gnavus 1株とStreptococci 5株（歯垢を形成することが知られているStreptococcus parasanguinis 3株を含む）。大腸菌は試験管内で自発的にバイオフィルムを形成しなかった（図2F）。バイオフィルムを形成した回腸生検と形成していない回腸生検のメタボローム解析から、バイオフィルム形成を阻害する細菌の代謝産物であるリン酸ジヒドロキシアセトンの減少とともに、BF+回腸生検ではタウロコール酸（我々の代謝産物パネルで唯一のBA）の蓄積が認められた（図2G）38。さらに、IBS患者の便検体では、BF+患者ではBF-患者に比べ、総BA量が2倍、一次BAとウルソデオキシコール酸（UDCA）が約10倍増加していた（図2H、補足図7）。総便中BA濃度、一次BAコール酸およびUDCAは、BA代謝に重要な役割を果たすR. gnavusグループに属する細菌操作分類単位（OTU）と相関していた（補足図7D）39。マイクロバイオーム、顕微鏡データ、カルプロテクチンおよび便中BAの相関を調べる探索的解析を、ピアソン相関係数行列を用いて行った。IBSでは、微生物の多様性はUDCAレベルおよびEscherichia/Shigellaに属するOTUの相対存在量と負の相関を示した（補足図8A）。Faecalibacteriumに属するOTUは、微生物多様性と正の相関を示し、Escherichia/Shigellaに属するOTUおよびUDCAと負の相関を示した。腸管粘液産生の指標としての平均PAS層高さは、細菌の量および密度と相関していた（補足図8A）。UCでは、マイクロバイオームの多様性は一次BAレベルおよびEscherichia/Shigella OTUの相対存在量と負の相関を示した。同じOTUはカルプロテクチンによって測定される腸の炎症とも相関していた。平均PAS層の高さはBAの総量と相関していた（補足図8B）。
図サムネイルgr2
図2BF+患者における細菌性ディスバイオシス、自発的バイオフィルム形成、およびBA量の増加。(A）IBS患者、UC患者、健常対照を含む大腸BF+生検（オレンジ）およびBF-生検（青）から得られた細菌プロファイル（16S、一般化UniFrac距離）の多次元尺度プロット。(B)BF+生検では、細菌性dysbiosisが認められた（リッチネスとシャノン多様性指数の減少）。(C）BF+生検では、Escherichia/Shigella属およびR. gnavusグループの細菌が豊富であった。(D）BF+生検の51%にR. gnavusのブルームが認められたのに対し、BF-生検では18%であった。(E）BF+生検では、Faecalibacterium、Coprococcus、Subdoligranulum、Blautiaなどの短鎖脂肪酸産生属が減少した。(F)6個のBF+ブラシ（対照2個、IBS患者4個）から分離された15個の細菌のin vitroバイオフィルム形成アッセイ。OD595/OD600比が5を超える菌株をバイオフィルム形成菌と定義し、緑色で示した。挿入図： R. gnavusバイオフィルムのSEM写真。(G)メタボロミクスパネルのボルケーノプロットでは、BF+生検においてタウロコール酸（我々の代謝物パネルにおける唯一のBA）が濃縮され、ジヒドロキシアセトンリン酸が減少していることが明らかになった。 (H)BF+IBS患者の便サンプルにおける総BAおよび一次BAの増加。統計解析： (A)距離行列のパーミュテーショナル多変量分散分析、(B-C, E)多重比較のためのベンジャミニ・ホッホベルク補正を用いたクラスカル・ワリス順位和検定、(D)フィッシャー正確検定、(H)マン・ホイットニーのU検定； (A-E) n = 35 BF+, n = 38 BF-, (F) n = 8 replicates per strain, (G) n = 5 BF+, n = 5 BF-, (H) n = 14 BF+, n = 14 BF-; ∗P ≤ . 05, ∗∗P ≤ .01.
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バイオフィルムは疾患特異的な細菌アンプリコンシークエンスバリアントのシグネチャーを有する。
BF+患者におけるマイクロバイオームの変化をより包括的に把握するために、大腸BF+生検、Distal-Bx（BF+患者において目に見えるバイオフィルムのない遠位領域から採取した生検、補足図4I参照）および便の個々のDNA配列（ASV）の存在量を、異なる病態のBF-患者のそれぞれのサンプルと比較した。健常対照者、IBS患者、およびUC患者では、バイオフィルム形成時の細菌ASVのシグネチャーが明瞭であった（図3、補足図9）。R.gnavus株に属するASVは、UC患者および対照被験者のバイオフィルムで増加していた。UCのバイオフィルムではEscherichia/Shigella属に属するASVが増加しており、IBD発症における大腸菌の重要性がさらに強調された。R.gnavusおよびEscherichia/Shigella属のASVも、BF+のUC患者の炎症組織では、BF-のUC患者の炎症組織と比較して濃縮されていた。さらに、UCのバイオフィルムでは、Bacteroides vulgatus株、日和見病原体であるHaemophilus influenzae、Fusobacterium、Klebsiella属に属するASVが増加していた。IBSのバイオフィルムからは、常在菌と考えられる分類群も含め、いくつかの細菌のASVが減少していた： Bacteroides ovatus、Veillonella atypica、Dialister invisus、Lachnospira種などである。R. gnavusに加え、対照群のバイオフィルムではErysipeloclostridium ramosumとBifidobacterium bifidumのASVが増加していた（補足図9）。BF+患者では、BF+生検とDistal-Bxは、細菌β多様性の順序付けによって可視化されるように、類似していた（補足図6B）。排出されたバイオフィルム細菌が大腸全体の微生物組成に影響を与えることはもっともである。ASVレベルでBF-サンプルとDistal-Bxサンプルを比較すると、BF+対BF-生検解析の全体的な所見が確認された（図3、補足図9）。しかし、BF+とDistal-Bxの間には微妙な違いが存在する： UC患者のDistal-Bxでは、口腔内バイオフィルム形成の初期コロニー形成者26であるVeillonella tobetsuensisに属するASVが増加していたが、これはBF+のUC生検では検出されなかった（補足図9）。IBS患者の遠位Bxサンプルでは、Prevotella属とBacteroides coprocolaに属するASVが増加していたが、これはBF+ IBS生検では明らかではなかった（補足図9）。全体として、これらの所見は、バイオフィルム形成は、感受性宿主における生物相異常微生物叢が関与する疾患特異的プロセスであるという概念を支持するものである。
図サムネイルgr3
図3IBS患者、UC患者、および健常対照の腸内バイオフィルムにおける細菌シグネチャー。IBS、UC、および健常対照について、内視鏡的にバイオフィルムが見える部位（BF+生検）および見えない部位（Distal-Bx）におけるBF+患者とBF-患者（BF-生検）の細菌ASVの変化。粘液層（青）、バイオフィルム（赤）。各ASVについて、菌種または菌属が記載されている。n = 35 BF+生検、n = 38 BF-生検、n = 30 Distal-Bx、n = 51 BF+便、n = 54 BF-便サンプル。
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考察
バイオフィルムは、外的ストレス因子から細菌を保護し、遺伝情報と栄養素の交換を可能にするため、細菌に競争上の優位性をもたらす40,41。口腔や虫垂とは異なり、残りの消化管におけるバイオフィルムの存在については、長い間議論がなされてきた14,15。バイオフィルムは、IBD、42 ピロリ菌感染、43 大腸がんなどで顕微鏡的に観察されている。14 ここでは、腸管バイオフィルムがIBSやIBDの一般的な特徴であり、内視鏡検査で容易に確認できるという有力な証拠を提示する。このようなバイオフィルムは長年にわたって内視鏡医によって観察されてきたが、腸管洗浄が不完全であると誤解されてきた。バイオフィルムはIBS患者の半数以上、UC患者の3分の1に存在することから、バイオフィルムが疾患発症に関与していることが強く示唆され、新たな診断・治療の機会や疾患分類（BF+/-）の有力な根拠となる。
参加した両施設では、主にIBS、IBD、または臓器移植後の患者においてバイオフィルムが検出されたが、これらはいずれも微生物叢が乱れた疾患コホートであった47,48。その上、ドイツのセンターではクローン病患者により多くのバイオフィルムがみられ、オーストリアのセンターでは腺腫コホートで比較的多くのバイオフィルムがみられた。このような違いは、人口統計、栄養状態、薬物療法などの交絡因子を示唆しており、さらに検討する必要がある。われわれは、プロトンポンプ阻害薬などの薬剤がバイオフィルムの存在を増加させる可能性があることを発見した。バイオフィルムに関する今後の研究では、二次医療も対象とし、栄養習慣や投薬に関する詳細なアンケートを実施すべきである。
バイオフィルムは主に回腸と盲腸に発生し、結腸遠位部では病変とは無関係に発生した。盲腸は腸全体の中で最も直径が大きく、便の滞留時間が長く、バイオフィルムが豊富な虫垂に近いことから、そこでのバイオフィルム形成が説明できるかもしれない。IBSは腸管通過時間の延長と関連しており、回腸粘膜への細菌の付着が促進される可能性がある49。さらに、回腸および盲腸には比較的高濃度のBAが存在し、これがバイオフィルム形成の引き金となる可能性がある50。小腸カプセル内視鏡検査により、軟性内視鏡検査では容易にアクセスできない腸管領域におけるバイオフィルムのさらなる有病率が明らかになる可能性がある。本試験に参加した内視鏡医は、胃（まれ）や空腸上部（小腸細菌過剰増殖患者）など、消化管の他の領域でもバイオフィルムを観察した。
顕微鏡的バイオフィルムは以前、粘液層に侵入した109個を超える細菌-mL-1として定義された36。内視鏡検査でこのような顕微鏡的バイオフィルムを巨視的に検出する精度は72％であり、これはスクリーニング大腸内視鏡検査におけるポリープの内視鏡的判定と組織学的判定に匹敵する51。これは、パターン認識とディープラーニングを用いて細菌を定量化した最初の研究であるため、方法論の違いによって説明できるかもしれない。また、このような患者は、調査されなかった消化管の領域に内視鏡的バイオフィルムを持っていたのかもしれない。
バイオフィルムは、R. gnavusや大腸菌の過剰増殖など、多様性の低いマイクロバイオームと相関していた。BF+患者では、常在菌であるFaecalibacterium属およびBlautia属の存在量が減少しており、これらは現在、UCおよびIBSの治療薬として臨床試験中である53,54。バイオフィルムは、サーベイランス内視鏡検査を受ける健常者にも存在するため、関連症状のないまま存在するか、あるいは健全な生態学的平衡と外部からの介入（例えば、宿主免疫系や抗生物質）に難渋し、消化器疾患を発症しやすい調節不全状態55の間の転換点の警告シグナルである可能性がある。内視鏡医は、このようなバイオフィルムは不完全な腸管洗浄の問題ではなく、むしろ、その下の粘膜表面の可視化を改善するために、フラッシングによる内視鏡的除去が必要であることを認識する必要がある。さらに、BF+患者は右結腸新生物の発生リスクがあるため、サーベイランス間隔を短くする必要があるかもしれない46。
IBSやIBDのような複雑な病態と組み合わせた綿密な分子および顕微鏡コホートのサンプルサイズが控えめであることが、本研究の限界である。適用したメタボロミクスパネルにはBAが1種類しか含まれておらず、大腸バイオフィルムとの関連が示されているN1,N12-ジアセチルスペルミンなどの重要な代謝物が含まれていなかった44。バイオフィルム形成の代謝的促進因子および消化器症状との関連について洞察するためには、さらに大規模な縦断的研究を実施する必要がある。加えて、スコープ医は診断とバイオフィルムの位置を認識していたため、バイアスがかかった可能性がある。バイオフィルムと消化器症状との因果関係を立証するためには、in vitro実験、バイオフィルムの状態と位置の盲検スコアリング、盲検介入試験を行う必要がある。
これらのバイオフィルムの物理的性質と大きさ（接着特性、疎水性、弾力性、および範囲）は、蠕動運動を損ない、拡散障壁をもたらす可能性があり、これはBAによる下痢、腹部膨満感、疼痛などの一般的な機能的症状の一因となるか、あるいはその説明となる可能性さえある。実際、BF+のIBS患者のバイオフィルムと糞便の両方でBAの増加が観察され、この仮説を裏付けている。最近の研究でも、IBS患者の糞便サンプル中のR. gnavusの増加とともに、BAの吸収不良が報告されている7。バイオフィルムは、SEM写真やBF+患者の生検で観察された上皮付着細菌の増加からわかるように、保護粘液層を破壊するかもしれない。その結果、大腸菌の病原因子56、R. gnavusの炎症性多糖類57、BA濃度の上昇によるバリア機能の低下58,59を介した免疫系の活性化につながる可能性がある。IBS患者では、粘液産生のマーカーとしての平均PAS層の高さは、共焦点顕微鏡で検出された細菌の量および濃度と相関していた。BAは粘液分泌と細菌のバイオフィルム形成を増加させることが知られている50,62,63。UC患者では、平均PAS層高とBAの総量との相関が観察された。内視鏡的に可視化されるバイオフィルムは、BAの存在下で粘液産生が亢進し、細菌バイオマスおよび細胞外マトリックスが増加した結果である可能性は低くない。
R.gnavus、糞便中コール酸、UCDAは、早期診断のための有望なバイオマーカー候補であると同時に、IBSやUCの治療の標的である可能性がある。バイオフィルムそのものは、機能的な消化器症状を緩和するために機械的または化学的に破壊することができるため、新たな治療標的となりうる。また、BF+のIBS患者がBA-sequestrantによる治療で恩恵を受けるかどうかを調べることも価値がある58。
要約すると、腸内バイオフィルムは高精細白色光内視鏡検査で確認でき、IBS患者の57％およびUC患者の34％に存在することが示された。バイオフィルムは、腸内細菌叢のディスバイオシスおよびBA吸収不良と相関する。BF+患者の71％が、R. gnavusおよび/または大腸菌の過剰増殖という観察可能な表現型を有していた。バイオフィルムは、消化管の健康と疾病を理解する上で新たな次元を示すものであり、機能性消化管障害の診断アルゴリズムと治療アプローチに革命をもたらす可能性がある。
謝辞
Christina Gmainer、Marion Nehr、Kathrin Spettl、Birgitte Selitsch、Anita Krnjic、Jasmin Schwarz、Gudrun Kohlに感謝する； Julia Bra、Barbara Stiedl、Veronika Sturm、Jessica Helfers、Susanne Kellner、Martina Fellinghauer、Marion Metzger、Carmen Demeny、Cornelia Burger、Natascha Horak、Ingrid Schwarz、Stefanie Dabsch、Lindsay Hargitai、Clemens Dejaco、Matthias Mandorfer、Emina Halibasic、Monika Ferlitsch、Johann Hammer、Maximillian Schöniger、Albert Stättermayer、Lili Kazemi、Barbara Tribl； Philipp Königshofer：スライドスキャン、Daniel Steinacher：有意義な議論。
CRediT執筆陣の貢献
Maximilian Baumgartner, MSc（概念化： イコール；データキュレーション： 主導；形式的分析： 同等；資金獲得： 支援、調査： 同等、方法論： 同等、プロジェクト管理： 支援；可視化： リード；執筆-原案： 執筆-原案：リード；執筆-校閲・編集： 同等）。
Michaela Lang, PhD（概念化： 同等；データ管理： 同等；資金獲得： 同等；調査： 同等；資金獲得：同等；調査：同等；方法論：同等；プロジェクト管理：同等 同等、プロジェクト管理： 同等；監督：同等 同等、検証：同等： 同等）。
Hunter Holley, MSc (調査：支援)。
Daniel Crepaz, BSc (調査：支援)。
ベラ・ハウスマン博士（データキュレーション： 同等；調査： 同等： 同等： 同等： 支持；可視化： 支持）。
Petra Pjevac, PhD（データキュレーション： 支持；調査： 支持；方法論： 同等、検証： 支持；可視化： 支持）。
Doris Moser、博士（調査：同等、方法論：同等）。
Felix Haller、医学生（調査：支持、方法論：支持）。
Fabian Hof、医学生 (調査：支持)。
Andrea Beer医学博士（調査：同等、検証：同等）。
Elisabeth Orgler医学生（データキュレーション： 支持；調査： 支持： 支持）。
Adrian Frick医学博士（調査：支持、検証：支持）。
Vineeta Khare, PhD（概念化： 同等、資金獲得： 方法論： 同等、監督： 同等）。
Rayko Evstatiev, MD (調査：支援)。
Susanne Strohmaier, PhD（形式的分析： 支持；調査： 方法論： 支持： 支持）。
Christian Primas医学博士（調査：支持）。
Werner Dolak医学博士 (調査：支持)。
Thomas Köcher, PhD (調査：同等、方法論：同等)。
Klavis Kristaps, PhD (調査：同等、方法論：同等)。
Timo Rath医学博士 (調査：支持)。
Markus Neurath医学博士 (調査：支持)。
David Berry, PhD（概念化： 支援： 資金獲得： 支援： 支援；方法論： 執筆 - 査読と編集： 執筆-校閲および編集：支持）。
Athanasios Makristathis, PhD（概念化： 同等、資金獲得： 同等、調査： 同等、調査：同等、方法論：同等： 執筆-校閲・編集： 執筆-校閲および編集：支持）。
Markus Muttenthaler, PhD（概念化： 同等、資金獲得： リード；調査： 方法論： プロジェクト管理： 同等、監督： 同等；執筆 - 査読と編集： 同等）。
Christoph Gasche医学博士（構想：同等： 同等、資金獲得： 同等、方法論： 同等、プロジェクト管理： 主導；監督： バリデーション： 同等；執筆-レビューと編集： 執筆-校閲および編集：Lead)。
補足的方法
内視鏡的に見えるバイオフィルムのスクリーニング
すべての患者は、階層的にグループ化された1つの疾患コホートに割り付けられた。コホートは、臓器移植後、大腸がん、門脈圧亢進症、IBD、IBS、腺腫、GI出血、憩室性疾患、その他（顕微鏡的、膠原病性、好酸球性、および非ステロイド性抗炎症薬誘発性大腸炎、GI感染症、および化学療法誘発性下痢を含む）、および健常対照の順にグループ化された。さらに、オーストリアのコホートについて、バイオフィルムの状態を従属変数とし、年齢、性別、疾患を独立変数とする、より詳細な多変量ロジスティック回帰を計算した。国ごとの違いを検出するため、各疾患コホートについて、オーストリアとドイツのバイオフィルム有病率を、多重比較のためのボンフェローニ補正を用いたフィッシャー厳密検定で比較した。
サンプル採取
生検体は直ちに液体窒素でスナップ凍結し、DNA抽出まで-80℃で保存するか、組織学的解析のためにメタカルン（60％メタノール、30％クロロホルム、10％氷酢酸）で固定するか、SEMのためにカルノフスキー固定液（2％パラホルムアルデヒド、2.5％グルタルアルデヒド、0.1Mリン酸緩衝液［pH7.4］；Morphisto社、フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）で固定した。患者は整腸剤投与開始後、最初に出た便を便キャッチャー（abbexa）を用いて採取し、便サンプルを4℃で一晩保存した。その後、便サンプルを分注し、-80℃で凍結保存した。
バイオフィルムの組織学的解析
大腸生検片をメタカルン液で4℃、2時間固定し、70％エタノールで3回洗浄し、パラフィン包埋用に処理した。パラフィンブロックは4℃で保存した。4μm厚の大腸生検切片をH&E染色するか、fluorescence in situ hybridization（FISH）およびDAPI染色を行った。16S rRNA標的DNAオリゴヌクレオチドプローブミックス（EUB338 I-III）を用いたFISH染色および共焦点蛍光顕微鏡による画像化は、前述のように行った。
H&EおよびPAS染色切片で、粘液と細菌からなるメタカルン固定表層の最大厚さを評価した。厚さは、上皮境界から層の最大範囲までの垂直距離として測定した。平均PAS層厚は、ランダムな3視野から算出した。
ディープラーニングに基づく細菌検出にDAPIを用いたのは、すべてのサンプルでFISHシグナルが一定にならなかったためである。これは、バイオフィルム形成や患者の投薬による増殖速度の低下が、細菌のリボソームの数やアクセス性に影響し、偏った解析につながることが原因かもしれない2,3。
U-Netは、最近発表されたImageJプラットフォーム（バージョン1.52b）用の細胞の定量化とアノテーションのための深層学習ソリューションである4。我々は、DAPI染色した生検切片の共焦点顕微鏡画像から細菌を検出するためにU-Netを訓練した（FISH染色では100％のハイブリダイゼーション効率が得られなかったため）。14枚の共焦点顕微鏡画像（144.72×144.72μm）中の細菌は、3人のエキスパートのコンセンサスにより、合計5010点のデータでアノテーションされた。標準的なU-Net細胞検出モデル（2d_cell_net_v0_model）を、検出率を決定するための参照として3つの画像を保持したデータセット上で微調整した。10,000回の反復の後、アルゴリズムは80％の検出率に達し、これは2人の人間が同じ画像にアノテーションした場合のばらつきの範囲内であった（データは示さず）。各細菌数について、腸生検切片全体を解析した。検出可能な細菌を含む共焦点顕微鏡画像を、ImageJで学習させたU-Netモデルでアノテーションした。このアルゴリズムは、細菌同士が直接接触している領域で偽陰性を多く示したため、すべてのアノテーションを人手による品質管理にかけた。各共焦点顕微鏡画像内の細菌の最大数を決定し、細菌密度（mLあたり）を算出した。総細菌数は、各生検の全画像の合計として算出し、（隣接するH&E染色切片で求めた生検切片の大きさを調整するため）上皮の長さで正規化し、細菌数とした。付着菌および付着菌密度は、共焦点顕微鏡画像から上記のように求めたが、上皮から3μm以内の菌のみをカウントした。Mann-WhitneyのU検定は、ゼロ値を保持するために非変換データに対して行った。多重比較には、ダンの多重比較検定によるクラスカル・ワリス検定を適用した。データは底10の対数y軸で表示し、（定義されていない）ゼロ値はx軸で表示した。精度は以下の式で算出した：精度＝（真陽性＋真陰性）／（真陽性＋真陰性＋偽陽性＋偽陰性）。
走査型電子顕微鏡検査
生検は直ちにカルノフスキー固定液で固定し、SEM用に段階的エタノール系列で注意深く脱水した。エタノール脱水の後、ヘキサメチルジシラザン（Sigma-Aldrich）で化学乾燥した。試料はヘキサメチルジシラザンに30分間浸し、風乾した。ヘキサメチルジシラザンを完全に蒸発させた後、試料を試料台紙に固定し、金スパッタリング（Sputter Coater Leica EM ACE200; Leica Microsystems, Wetzlar, Germany）を行い、走査型電子顕微鏡（JSM 6310; Jeol Ltd, Tokyo, Japan）で加速電圧 15 kV で観察した。
細菌群集組成の解析
16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンス解析に用いた患者の特徴およびサンプルサイズを補足表5および補足図3に示す。大腸生検および便サンプルのDNAは、標準的なQIAamp DNA stool mini kit（Qiagen）のプロトコルを用いて抽出し、Lysing Matrix E tube（MP Biomedicals）を用いた最初のビーズビート工程と、Precellys 24 homogenizer（Bertin instruments）を用いて、大腸生検では5200rpm×3×30秒、便サンプルでは5500rpm×1×30秒で処理した。16S rRNA遺伝子のV3-V4可変領域のアンプリコンシークエンシングは、1回目のポリメラーゼ連鎖反応を25サイクル、2回目のポリメラーゼ連鎖反応を5サイクル、イルミナMiSeqテクノロジー（805R 5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′, 341F 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′ ）を用いた確立されたバーコーディングアプローチを用いて行った。 5 シークエンシングは、ウィーン医科大学とウィーン大学のJoint Microbiome Facility（プロジェクトID JMF-1901-5およびJMF-1910-2）で実施した。ASVはDADA2 R 6packageを用い、推奨ワークフロー(https://f1000research.com/articles/5-1492)を適用して推論した。FASTQリード1および2は230 ntでトリミングし、シーケンスランごとに許容される予想エラーを調整した。ASV配列はその後、DADA2とSINA（バージョン1.6.1,7）を用いてSILVAデータベースSSU Ref NR 99 release 1388でデフォルトのパラメータを用いて分類した。コンタミネーションは、真のサンプルと比較したネガティブコントロールの分類群の検査によって同定され、分類学に基づいて除去された（Eukaryota、Chloroplast、Mitochondria、Bacillaceae、Oxalobacteraceae、Comamonadaceae、Burkholderiaceaeに分類されたすべてのASVが除去された）。サンプルの類似性の解析には、修正したRheaスクリプトを使用した9。1000リード未満のサンプルは解析から除外した。縦断的サンプリングの場合、偏りを防ぐため、各患者の最初のサンプルのみを解析に使用した。一般化UniFrac距離10は、多次元スケーリングプロットを用いて可視化した。クラスターの有意性は、並べ替え多変量分散分析を用いて評価した。多様性と細菌量の差の検定は、多重比較補正にBenjamin-Hochberg法を用いたKruskal-Wallis順位和検定を用いて行った。存在量が0.5％未満の細菌属は各サンプルから除外した。さらに、検出力を向上させるために、サンプルの30％未満に存在する細菌属を除外した。大腸菌およびR. gnavusのブルームは、大腸生検における相対存在量が3％以上と定義した。ASVの詳細解析では、リード数を1桁以内に抑えるため、2500～25,000リードのサンプルのみを対象とした。各疾患コホートにおいて、大腸BF-生検とBF+生検の間、BF-生検とBF+患者（Distal-Bx）のバイオフィルムのない領域の間、BF+患者とBF-患者の便の間で、DESeq211を用いて一対比較を行った。さらに、UCのBF+患者のバイオフィルムを有する炎症部位（炎症BF+）とUCのBF-患者の炎症部位との比較も行った。各比較において、サンプル数が多いグループで読み取り数が最も少ないサンプルは、同一のグループサイズを達成するために取り除かれた。検体の25％未満に存在するASVは、検出力を向上させるために除去された。相関は、94.5％の配列同一性閾値でクラスタ化したOTUを用いて計算した。OTUは対数比変換され、サンプルの<30%に存在するOTUは分析から除外された。ゼロ値は欠損値として扱った。OTU とメタデータからなる表は中央揃えとスケーリングを行い、Benjamini Hochberg P 値補正でピアソン相関を計算した。
細菌 DNA の定量
0.2μMの341F（5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′）および534R（5′ATTACCGCGGCTGCTGGCA -3′）ユニバーサル16S rRNA遺伝子プライマー、10μLの2X SYBR FASTマスターミックス（サーモフィッシャー社製）、および2μLのサンプルDNAを用いて、20μLの反応で細菌16S DNAを定量した。定量的ポリメラーゼ連鎖反応は7500 Fast Real-Time PCR system（Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。DNA の総量は、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit を用いて、標準プロトコルを用い、2μL のサンプル DNA をインプットとして評価した。細菌の16S rRNA遺伝子コピー／全二本鎖DNAの比率を計算し、データを対数変換してt検定を用いて比較した。対数変換したデータの正規性は、D'Agostino and Pearson omnibus正規性検定（α = .05）を用いて確認した。多重比較のために、トルコの多重比較検定による1元配置分散分析を対数変換データに対して行った。サンプルサイズは、BF+が42例（IBS患者23例、UC患者10例、対照9例）、Distal-Bxが35例（IBS患者16例、UC患者13例、対照6例）、BF-が56例（IBS患者23例、UC患者8例、対照26例）であった。
便サンプルの胆汁酸分析
便検体は真空遠心機で乾燥させた。乾燥便10ミリグラムをLysing Matrix Eチューブに秤量し、6000rpmで3×30秒間ビーズビートを行った。ホモジナイズ後、0.4mLの50mM酢酸ナトリウム（pH5.6）と1.1mLのアセトニトリルを加え、60℃の加熱ブロックに1時間置いた。サンプルを遠心分離し、上清をBAの定量用に採取した。BAsとその結合体は、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計を用い、選択反応モニタリングで定量した。簡単に説明すると、抽出液1μLをKinetex C8カラム（100Å、100×2.1mm）にそれぞれのガードカラムを用い、流速100μL/分で注入した。分離には80%A（水中2.5mM酢酸アンモニウム）から90%B（メタノール中2.5mM酢酸アンモニウム）までの16分間のグラジエントを用いた。高速液体クロマトグラフィー（RSLC ultimate 3000; Thermo Fisher Scientific）は、エレクトロスプレーイオン化を介してTSQ Quantiva質量分析計（Thermo Fisher Scientific）に直接結合した。BAとその結合体は、それぞれのトランジション（例えば、グリココール酸m/z 464からm/z 73）と、真正標準物質の分析によって決定された最適化されたコリジョンエネルギーを用いて、ネガティブイオンモードで分析された。クロマトグラムは、Trace Finder（Thermo Fisher Scientific）を用いて手動で解釈し、実験リテンションタイムと純物質のそれぞれの品質管理との妥当性を確認した。Mann-Whitney U 検定は、多重比較のためのBonferroni 補正を用いて有意差を検定するために行った。
細菌株の単離とin vitro細菌バイオフィルム形成アッセイ
バイオフィルム試料を内視鏡ブラシで採取し、選択培地および非選択培地上で、確立された方法を用いて異なる大気条件下で培養した12。分離した細菌は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析法（Biotyper；Bruker Daltonics）によって同定した。標準プロトコル13を用いたin vitroバイオフィルム形成実験は、生理的条件を提供するために嫌気性テント内で行った。細菌単離株は、サプリメント（37g/L脳心筋注入液、5g/L酵母エキス、1g/L NaHCO3、1g/L L-システイン、1mg/LビタミンK1、5mg/Lヘミン）を添加した脳心筋注入液に接種した。24時間後、菌懸濁液をOD600=0.05に希釈し、U底ポリスチレン96ウェルプレート（Costar社製）に100μL/ウェルずつ8テクニカルレプリケートで移した。プレートは37℃で48時間培養した。浮遊性細胞を含む上清を注意深く除去し、新しい96ウェルプレートに移し、浮遊性細胞のOD600を測定した。細菌バイオフィルムを150μLのBOUIN溶液（0.9％ピクリン酸、9％ホルムアルデヒド、5％酢酸）で15分間固定し、190μLのリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄した。染色には、150μLの1%クリスタルバイオレット溶液を10分間添加し、190μLのリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄した。バイオフィルムの定量には、乾燥したプレート中のクリスタルバイオレットを190μLの30％酢酸に溶解し、プレートをシェーカーに1時間置いた。1:5希釈液の吸光度をTECAN infinite 200 Proプレートリーダーで595 nm、基準波長405 nmで測定した。クリスタルバイオレットの吸光度を希釈を考慮して5倍し、OD595/OD600比を算出し、データはSDを含む平均値で示した。
メタボローム解析
回腸BF+生検5個および回腸BF-生検5個を、Precellys 24 tissue homogenizer（Precellys CK14 lysing kit; Bertin）を用いてホモジナイズした。各組織1ミリグラムにメタノール9μLを加えた。ホモジナイズした組織サンプル10μLをガラスバイアルに移し、脂質内部標準溶液（SPLASH Lipidomix; Avanti Polar Lipids）10μL、代謝物内部標準ミックス40μL、メタノール130μLを加えた。ボルテックス後、500μLのメチルtertブチルエーテルを加え、混合物を25℃で10分間振とう器でインキュベートした。110μLのMSグレードの水を加えて相分離を誘導した。25℃で10分間インキュベートした後、サンプルを1000gで10分間遠心分離した。450μLの上相（有機相）を採取し、窒素エバポレーターで乾燥させた。サンプルを20μLのメタノールで再構成し、脂質分析に使用した。200μLの下相（水相）を採取し、窒素エバポレーターで蒸発させ、20μLの水に再構成し、代謝物分析に使用した。
脂質の液体クロマトグラフィー質量分析には、Orbitrap Fusion Lumos Tribrid質量分析計（Thermo Fisher Scientific）と組み合わせたVanquish UHPLCシステム（Thermo Fisher Scientific）を用いた。脂質の分離は、Accucore C18、2.6μm、150×2mm（Thermo Fisher Scientific）の分析カラムを用いた逆相クロマトグラフィーにより、カラム温度35℃で行った。移動相Aとして、10 mMギ酸アンモニウムと0.1%ギ酸を含むアセトニトリル/水（50/50、v/v）溶液を使用した。移動相Bは、10mMギ酸アンモニウムと0.1%ギ酸を含むアセトニトリル/イソプロパノール/水（10/88/2、v/v/v）溶液を用いた。流速は400μL/分であった。分析脂質種の最適分離を確実にするため、Bのグラジエントを適用した。質量分析計は、電子スプレーイオン化-ポジティブおよび-ネガティブモード、キャピラリー電圧3500 V（ポジティブ）および3000 V（ネガティブ）、気化温度320℃、イオン伝達管温度285℃、シースガス60任意単位、補助ガス20任意単位、およびスイープガス1任意単位で操作した。脂質の検出には、質量分解能120,000のOrbitrap MSスキャンモードを採用した。スキャンレンジは正イオン化モード、負イオン化モードともに250-1200 m/zに設定し、自動ゲインコントロールターゲットは2.0×105、強度閾値は5.0×103に設定した。データ解析はTraceFinderソフトウェア（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。
1290 Infinity II UHPLC システム (Agilent Technologies) と 6470 トリプル四重極質量分析計 (Agilent Technologies) を組み合わせて、代謝物の液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析に使用しました。サンプルのクロマトグラフィ分離は、ZORBAX RRHD Extend-C18、2.1 × 150 mm、1.8 μm 分析カラム (Agilent Technologies) で行った。カラムの温度は40℃に保たれ、1回の分析につき4μLのサンプルが注入された。移動相Aは水中の3%メタノール(v/v)、10mMトリブチルアミン、15mM酢酸、移動相Bはメタノール中の10mMトリブチルアミン、15mM酢酸であった。流速0.25 mL min-1のグラジエント溶出を合計24分間行った。トリプル四重極型質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化ネガティブモード、スプレー電圧2 kV、ガス温度150℃、ガス流量1.3 L/分、ネブライザー45 psi、シースガス温度325℃、シースガス流量12 L/分で運転した。目的の代謝物は、ダイナミックMRMモードを使用して検出した。データ処理には、MassHunter 10.0 ソフトウェア (Agilent Technologies) を使用しました。代謝物の定量には、内部標準化と 10 点直線検量線を作成しました。
統計解析は、MetaboAnalyst パイプラインを使用し、標準的な設定 (欠損値が 50% を超えるフィーチャーは削除、欠損値は元のデータの最小正値の半分で置換、四分位範囲に基づくデータフィルタリング、中央値による正規化、および対数変換)、および P 値のしきい値を .05、ボルケーノプロットにおける ±1 log2 倍変化を使用しました14。
カルプロテクチン分析
便中カルプロテクチンは、検証済みの市販の酵素結合免疫吸着測定法（BÜHLMANN fCAL ELISA、BUHLMANN Diagnostics）を用いて分析した。
探索的相関分析
各患者について、大腸生検からの顕微鏡データ、糞便BAデータ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応、マイクロバイオームデータを統合し、対数変換した。同一患者から2つの生検（すなわち、BF+とDistal-Bx）が得られた場合は、偏りを防ぐため、BF+生検のみをBA、定量的ポリメラーゼ連鎖反応、マイクロバイオームデータとの相関に使用した。ピアソン相関係数の行列は、Rとcorrplotパッケージを用いて計算した15。
図サムネイルfx2
補足図1IBS患者、UC患者、および対照群におけるバイオフィルム・モードの細菌増殖の代表的画像。(A)バイオフィルム洗浄標本を光学顕微鏡で観察すると、黄色、細菌、脱落した上皮細胞が観察される。(B) BF-生検のSEMでは、無傷の粘液層（白矢印）とその上に散在する細菌（細菌の色調を強調した赤）を示す。(C) BF+生検のSEM分析では、上皮に直接接触した厚い細菌バイオフィルム層が認められる（細菌は赤色に発色）。(D）BF+生検のPAS染色。
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図サムネイルfx3
補足図2IBSバイオフィルムの2症例における機械学習に基づく細菌の定量化と上皮への浸潤。(A)U-Net学習セットに含まれていない画像（IBSのBF+患者の大腸生検）でU-Net機械学習により検出された細菌（赤十字）、DAPI（青）、およびFISH一般細菌プローブシグナル（緑）のオーバーレイの未修飾模範画像。(B）IBSバイオフィルム2症例における上皮内への細菌浸潤DAPI（青）FISH一般細菌プローブ（緑）。
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図サムネイルfx4
補足図3主要コホートのサブセットにおける詳細な分子学的および顕微鏡学的解析の説明。サンプル材料、患者コホート、サンプル数など、詳細な顕微鏡および分子生物学的解析の説明。顕微鏡解析（トップパネル）：解析は、メタカルン固定した糞便生検（内視鏡的にBF+、BF-、およびBF+患者[Distal-Bx]からのバイオフィルムのない領域）に対して行われ、各生検から3つの隣接切片をDAPI/FISH、H&E、およびPAS解析用に処理した。共焦点顕微鏡画像は、DAPIチャンネルで細菌が可視化された全切片の全領域から得た。各画像を人工知能による細菌の定量化を行い、切片あたりの上皮の長さ（細菌の量）に対して正規化した細菌の総数を算出した；144.7×144. 7μmの共焦点顕微鏡画像における細菌の最大密度（細菌密度）；上皮から3μm離れた位置にある細菌の数（付着細菌）；上皮から3μm離れた位置にある細菌の最大密度（付着細菌密度）。H&E染色切片は、上皮の全長（正規化のため）と、1切片あたりの上皮上部のH&E表面層の最大幅（表面層）について解析した。PAS染色切片は、切片ごとの上皮上部のPAS染色表面層の平均幅と最大幅（平均PAS層高、最大PAS層高）について分析した。16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシング（左下パネル）は、スナップ凍結した糞便生検（BF+およびBF-、BF+患者のバイオフィルムのない領域[Distal-Bx]）および便サンプル（BF+およびBF-）から行った。メタボロミクス（右下パネル）は、スナップ凍結回腸生検（BF+およびBF-）で実施した。BA分析（右下パネル）は便サンプル（BF+およびBF-）に対して行った。
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図サムネイルfx5
補足図4内視鏡的に可視化されたバイオフィルムは、疾患とは無関係に高密度の細菌凝集体から構成されている。(A-H）疾患コホート（図1と同じ患者）で分離したBF+生検（オレンジ）とBF-生検（青）の比較。(I）生検部位の説明： BF+生検（オレンジ色）は盲腸または上行結腸の内視鏡的にバイオフィルムが確認できる部位から採取し、BF-生検（青色）はBF-患者の同じ部位から採取した。Distal-Bx（生検）（黄色）はBF+患者から内視鏡的にバイオフィルムが確認できない遠位部で採取した。(J-R）補足図4A-Hと同じサンプルに、Distal-Bx（黄色）のデータを追加。(A, J) 切片あたりの上皮の長さに対して正規化した細菌の総数。(B, K) 1切片あたり144.7×144.7μmの共焦点顕微鏡像における細菌の最大密度。(C, L) 各切片における上皮上部のメタカルン固定H&E表面層の最大幅。(D, M）生検の全DNAに対する定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって決定された16S rRNA遺伝子コピーの比率。(E, N)上皮から3μmの位置にいる細菌の数、各セクションの上皮の長さに対して正規化。(F, O) 1切片あたり144×144μmの共焦点顕微鏡像における、上皮から遠位3μmまでの細菌の最大密度。(G, P) 1切片あたりの上皮上部のメタカルン固定PAS表面層の最大幅。(H, Q) 1切片あたりの上皮上部のメタカルン固定PAS染色表面層の平均幅。(R）144.7×144.7μmの共焦点顕微鏡像の少なくとも1枚において、粘液層に109 - mL-1以上の細菌が侵入している生検の割合。(S) BF+生検とBF-生検の顕微鏡データのピアソン相関係数による相関行列。(T）IBS、UC、およびコントロールにおける内視鏡的に可視化されたバイオフィルムの位置。∗P値≦0.05；P値≦0.01；P値≦0.001。(A、B、E、F、J、K、N、O）ゼロ値は対数スケールで定義されていないため、x軸に直接接して表示されている。(A-C、E、F、J-L、N、O) Dunnの多重比較検定によるKruskal-Wallis検定、(D、G、H、M、P、Q) 対数変換データに対するTurkeyの多重比較検定による1元配置分散分析、(R) 重複比較のためのBonferroni補正によるFisher exact検定。(A-C, E-L, N-S) n = 37 BF+, n = 47 BF-, n = 30 Distal-Bx (D, M) n = 42 BF+, n = 56 BF-, n = 35 Distal-Bx.
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図サムネイルfx6
補足図5縦断的バイオフィルム状態のサンケイ図。主要患者コホートにおける縦断的な患者のバイオフィルムの状態、左側が最初の時点、右側が2番目の時点。患者フローはバイオフィルムの状態によって色分けされ、両時点でBF+（オレンジ）、第1時点でBF+、第2時点でBF-（薄いオレンジ）、両時点でBF-（青）の疾患コホートが含まれる。その他はGI感染症および化学療法による下痢を表し、n=19人、大腸内視鏡検査の平均間隔は7ヵ月であった。
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図サムネイル fx7
補足図6疾患別に分離した微生物バイオフィルム組成。(A)BF+患者（円）とBF-患者（三角）の一般化UniFrac距離の多次元尺度プロットを疾患コホートで色分けした図2のサンプル。(B）便サンプル（黒）、BF+生検（オレンジ）、Distal-Bx（黄色）の患者内比較。(C）図2のサンプルを疾患コホートごとに分割したもの。(D）疾患コホートで分割したBF+生検（橙色）とBF-生検（青色）のR. gnavus群の相対存在量と細菌の豊富さの比較（図2BおよびEのデータを使用）。(F)大腸R. gnavus OTU相対量と大腸生検のリッチネスおよびシャノン多様性との相関。(A-C) P値は一般化ユニフラック距離行列の並べ替え多変量分散分析を表す。(D, E) Kruskal-Wallis rank sum test with Benjamini-Hochberg correction for multiple comparisons. (F) 中心対数比変換したOTUの存在量、リッチネス、シャノン多様性のピアソン相関。(A, C-F) n = 35 BF+, n = 38 BF- (B) n = 22 BF+, n = 22 Distal-Bx, n = 22 BF+便サンプル。
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図サムネイルfx8
補足図7IBS患者のBF+とBF-の便中BAレベル。(A)IBSのBF+患者（オレンジ）とBF-患者（青）の便サンプル中の一次BAレベル。(B)BF+およびBF-IBS患者の便検体中の二次BAレベル。(C）IBS患者（BF+）およびIBS患者（BF-）の便検体中のタウロ結合型およびグリコール結合型BA濃度。(D) 大腸R. gnavus OTU相対存在量と便中BA濃度の相関。(A-C）多重比較のためのボンフェローニ補正を用いたMann Whitney U検定。(D) 中心対数比変換したOTU存在量と糞便中BA濃度のピアソン相関。(A-C) n = 14 BF+、n = 14 BF-、(D) n = 40。
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図サムネイルfx9
補足図8IBSおよびUCにおけるカルプロテクチン、マイクロバイオーム、顕微鏡、およびBAデータの探索的相関行列。IBS患者（上段）とUC患者（下段）のピアソン相関係数による相関行列。大腸生検の顕微鏡データ（1切片あたりの上皮上部のメタカルン固定PAS染色表層の平均幅および最大幅［平均PAS層高、最大PAS層高］、1切片あたりの上皮上部のメタカルン固定H&E表層の最大幅［表層］、1切片あたりの上皮の長さに対して正規化した細菌の総数［細菌量］、144.7×144. 7μmの共焦点顕微鏡画像（1切片あたり）［細菌密度］、上皮から3μmの細菌の数（1切片あたりの上皮の長さで規格化）［付着細菌］、1切片あたりの144×144μmの共焦点顕微鏡画像における上皮から3μm遠位までの細菌の最大密度［付着細菌密度］）、定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって決定された16S rRNA遺伝子のコピーの生検の全DNAに対する比率（DNA比率）、 大腸生検のマイクロバイオームデータ（Faecalibacterium属に属するOTU_tq6_57bとEscherichia/Shigella属に属するOTU_9qp_ahyの相対量、マイクロバイオームの豊かさ、シャノン多様性）、便検体のBAデータ（総BA、コール酸、チェノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、UCDA）、便検体のカルプロテクチンデータ（カルプロテクチン）。青が正の相関係数、赤が負の相関係数。P値≦0.05は色分けされている。(A) n = 61。(B) n = 30。
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図サムネイル fx10
補足図9バイオフィルムはASVレベルで疾患特異的変化を示す。各疾患コホートにおける、BF-とBF+の生検、BF-とBF+患者のバイオフィルムのない領域（Distal-Bx）、BF+患者とBF-患者の便の間のASVに基づく差異（DESeq2で決定）。BF+患者のUC炎症領域（炎症BF+）とBF-患者のUC炎症領域の追加比較。ドットの大きさはfold-changeを表し、完全なドットはバイオフィルム環境におけるアップレギュレーションを、空のドットはダウンレギュレーションを表す。ドットは細菌門に基づいて色分けされており、細菌分類学（属および種）はSILVA参照データベースに基づいて各ASVに割り当てられている。n = 35 BF+, n = 38 BF-, n = 30 Distal-Bx, n = 5 inflamed BF+, n = 6 inflamed BF-, n = 51 BF+便サンプル, n = 54 BF-便サンプル。
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補足表1一次患者コホートの臨床的特徴
コホート変数 合計（n = 756）a BF-患者（n = 604） BF+患者（n = 152） P値b
IBS
 合計 n 86 34 52
 性別、n（女性） 62 (72) 26 (76) 37 (71) .63
 年齢（歳）、中央値（範囲） 43 (18-76)∗∗ 42 (19-76) 44 (18-76) .32
 IBS-C, n (%) 7 (8) 4 (12) 3 (6) .42
 IBS-D, n (%) 38 (44) 14 (41) 24 (46) .66
 IBS-M, n (%) 41 (48) 16 (47) 25 (48) 1
UC
 合計 n 102 72 30
 性（女性）、n（%） 44 (43)∗ 31 (43) 13 (43) 1
 年齢（歳）、中央値（範囲） 42 (12-83)∗ 39 (12-83)∗ 44 (17-79) 0.5
 内視鏡的疾患活動性（Mayoスコア）、中央値（範囲） 1 (0-3) 1 (0-3) 0.5 (0-3) .28
 直腸炎 (E1), n (%), n = 98 17 (17) 14 (21) 3 (10) .26
 左側大腸炎（E2）, n (%), n = 98 27 (28) 22 (21) 5 (17) .14
 膵炎（E3）、n（%）、n = 98 54 (55) 32 (47) 22 (73) 0.009∗∗.
臓器移植後
 合計 n 28 22 6
 性別、n（女性） 13 (46) 12 (55) 1 (17) 0.17
 年齢（歳）、中央値（範囲） 61 (21-88)∗ 62 (21-88) 59 (55-69) .92
 肝移植、n（%）、n=27 7 (26) 4 (19) 3 (50) .29
 心臓移植、n（%）、n=27 4 (15) 3 (14) 1 (17) 1
 腎移植、n（%）、n=27 13 (48) 10 (48) 3 (50) 1
 肺移植、n=27 4 (15) 4 (19) 0 (0) 0.55
クローン病
 合計 n 82 72 10
 性別、n（％）、女性 35 (42)∗ 28 (39) 7 (70) 0.09
 年齢（歳）、中央値（範囲） 40 (19-93)∗∗ 40 (19-93) 46 (26-63) 0.66
 内視鏡的活動度（SES）、中央値（範囲） 3 (0-15) 3 (0-15) 3 (0-15) .87
 回腸末端 (L1), n (%) 18 (22) 18 (25) 0 (0) .10
 大腸 (L2), n (%) 18 (22) 15 (21) 3 (30) .68
 回腸結腸（L3）、n（%） 43 (52) 36 (50) 7 (70) .32
 上部消化管 (L4), n (%) 3 (4) 3 (4) 0 (0) 1
 非硬化性/非貫通性(B1), n (%) 37 (45) 33 (45) 4 (40) 1
 厳格化/浸透性（B2/B3）, n (%) 45 (55) 39 (55) 6 (60) 1
その他
 合計 n 49 42 7
 性別 n (%) 女性 22 (45) 19 (45) 3 (43) 1
 年齢、年、中央値（範囲） 60 (22-83)∗∗ 60 (22-83) 59 (33-66) .5
 非ステロイド性大腸炎, n (%) 2 (4) 2 (5) 0 (0) 1
 膠原病性大腸炎、n (%) 2 (4) 1 (2) 1 (14) .27
 顕微鏡的大腸炎, n (%) 2 (4) 2 (5) 0 (0) 1
 消化管感染, n (%) 15 (30) 15 (36) 0 (0) .08
 化学療法誘発性下痢、n (%) 28 (58) 22 (52) 6 (86) .21
腺腫
 総数、n 142 118 24
 性別、n（%女性） 64 (45)∗ 53 (45) 11 (46) 1
 年齢、年、中央値（範囲） 65 (23-91)∗∗ 65 (23-91) 66 (30-80) .91
 門脈圧亢進症
 総数、n 48 42 6
 性別、n（女性） 11 (23)＊＊ 9 (21)＊＊ 2 (33) 0.61
 年齢（歳）、中央値（範囲） 58 (18-83)∗ 58 (18-83) 53 (30-66) .13
 肝疾患の重症度（MELD）、中央値（範囲） 15 (4-40) 15 (4-40) 12 (6-20) .16
大腸がん
 合計 n 26 22 4
 性別、n（女性） 16 (62) 13 (60) 3 (75) 1
 年齢（歳）、中央値（範囲） 65 (35-79)∗∗ 63 (35-79) 73 (51-79) .34
憩室疾患
 合計 n 29 26 3
 性別 n（女性） 12 (41) 10 (38) 2 (67) 0.55
 年齢（歳）、中央値（範囲） 67 (48-87)∗∗ 67 (48-87) 75 (60-75) .5
消化管出血
 合計 n 52 50 2
 性別 n (% 女性) 25 (48) 24 (48) 1 (50) 1
 年齢（歳）、中央値（範囲） 69 (16-88)＊＊＊ 69 (16-88) 67 (61-73) 1
健常対照者
 合計 n 112 104 8
 性別 n (% 女性) 65 (59) 60 (58) 5 (63) 1
 年齢（歳）、中央値（範囲） 51 (19-81) 52 (19-81) 45 (22-72) 0.14
注 値は、連続変数の場合は中央値（範囲）、カテゴリー変数の場合はn（％）で示されている。パーセンテージは、それぞれのデータが得られた各群の実際の患者数に基づいて計算されている。すべての被験者についてデータが得られなかった場合は、それぞれのデータが得られた被験者数をコホート変数の列に示す。連続変数およびカテゴリー変数のP値の決定には、それぞれMann-Whitney U検定および両側Fisher exact検定を用いた。
IBS-Cは便秘優位の過敏性腸症候群、IBS-Dは下痢優位の過敏性腸症候群、IBS-Mは混合性食習慣を伴う過敏性腸症候群、MELDは末期肝疾患モデル、SESは単純内視鏡スコア。
a欄は健常対照との年齢・性差の統計学的検定、＊P≦0.05；＊＊P≦0.01を含む。
b BF+患者 vs BF-患者、＊P≦0.01。
c その他は、顕微鏡的/膠原病/好酸球性/NSAID大腸炎、消化管感染症、化学療法による下痢を示す。
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補足表2一次コホート（n = 756）におけるバイオフィルムの状態の多変量ロジスティック回帰
多変量ロジスティック回帰 粗OR（95％CI） 調整後OR（95％CI） P値
年齢 0.99（0.98-0.99） 1.00（0.99-1.01） 0.55
女性 性別 1.35 (0.94-1.92) 1.04 (0.69-1.56) 0.83
過敏性腸症候群（n = 86） 19.88（8.59-46.01） 20.34（8.72-47.42） 3.1 - 10-12a
UC (n = 102) 5.42 (2.35-12.49) 5.58 (2.41-12.94) 6.2 - 10-5a
臓器移植後（n = 28） 3.55（1.12-11.24） 3.47（1.09-11.05） 0.04b
腺腫（n = 142） 2.64（1.14-6.14） 2.54（1.08-5.98） .03b
大腸がん（n = 26） 2.46（0.65-8.55） 2.25（0.62-8.22） .22
その他（n = 49） 2.17（0.74-6.35） 2.12（0.72-6.25） .17
クローン病（n = 82） 1.81（0.68-4.8） 1.87（0.7-4.99） .21
門脈圧亢進症（n = 48） 1.86（0.61-5.68） 1.85（0.6-5.72） .29
憩室性疾患（n = 29） 1.39（0.35-5.6） 1.33（0.33-5.41） .69
消化管出血（n = 52） 0.54（0.11-2.65） 0.51（0.1-2.54） .41
CIは信頼区間，ORはオッズ比。
a P ≤ .001。
b P ≤ .05。
c 顕微鏡的大腸炎，膠原病性大腸炎，好酸球性大腸炎，非ステロイド性抗炎症薬誘発性大腸炎，GI感染症誘発性下痢，化学療法誘発性下痢を表す。
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補足表3バイオフィルム陽性、バイオフィルム陰性、および遠位大腸生検の病理組織学的評価
コホート/病理組織学的特徴 全体（n = 109） BF-生検（n = 43） BF+生検（n = 35） 遠位Bx（n = 31）
IBS
 合計 n 50 18 19 13
 表面上皮破壊, n (%) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
 炎症性浸潤, n (%) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
 建築物の歪み, n (%) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
UC
 合計 n 30 7 12 11
 表面上皮破壊, n (%) 1 (3) 0 (0) 1 (8) 0 (0)
 炎症性浸潤, n (%) 6 (20) 0 (0) 3 (25) 3 (27)
 建築物の歪み, n (%) 7 (23) 0 (0) 5 (42) 2 (18)
コントロール
 合計 n 29 18 4 7
 表面上皮破壊, n (%) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
 炎症性浸潤, n (%) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
 建築の歪み, n (%) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
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補足表4詳細な分子顕微鏡的コホートのサブグループにおける薬歴およびカルプロテクチンのデータ
コホート/変数 BF-患者 BF+患者 P値a
合計
 合計 n 58 59
 抗生物質, n (%) (n = 107) 31 (58) 33 (61) .84
 プロバイオティクス、n（%）（n = 107） 7 (13) 13 (24) .42
 PPI、n（%）（n = 101） 13 (28) 24 (44) .09
 非ステロイド性抗炎症薬、n（%）（n = 107） 12 (24) 11 (20) .64
 甲状腺ホルモン療法、n（%）（n = 113） 12 (22) 16 (28) .52
 カルプロテクチン、mg/kg、中央値（範囲） (n = 90) 1 (0-261) 30 (0-1712) .03∗.
UC
 合計 n 9 16
 抗生物質, n (%) (n = 22) 5 (55) 8 (61) 1
 プロバイオティクス、n（%）（n = 24） 2 (33) 7 (47) .67
 PPI、n（%）（n = 24） 1 (11) 6 (40) .19
 非ステロイド性抗炎症薬、n（%）（n = 24） 2 (22) 4 (27) 1
 甲状腺ホルモン療法、n(%) (n = 24) 1 (11) 3 (20) 1
 カルプロテクチン、mg/kg、中央値（範囲） (n = 18) 29 (0-246) 243 (0-1592) 0.002∗∗.
コントロール
 合計 n 25 11
 抗生物質, n (%) (n = 30) 9 (43) 3 (33) .71
 プロバイオティクス, n (%) (n = 33) 2 (9) 0 (0) .54
 PPI、n（%）（n=31） 4 (19) 6 (60) 0.04
 非ステロイド性抗炎症薬（n=32） 4 (19) 1 (9) .63
 甲状腺ホルモン療法, n (%) (n = 34) 6 (26) 2 (18) .69
 カルプロテクチン、mg/kg、中央値（範囲） (n = 30) 0 (0-142) 7 (0-96) .84
IBS
 合計 n 24 32
 抗生物質, n (%) (n = 55) 17 (74) 22 (69) .8
 プロバイオティクス, n (%) (n = 50) 2 (9) 6 (21) .43
 PPI、n（%）（n = 46） 8 (47) 12 (41) .76
 非ステロイド性抗炎症薬, n (%) (n = 51) 6 (28) 6 (20) .52
 甲状腺ホルモン療法、n（%）（n = 55） 5 (22) 11 (34) .38
 カルプロテクチン、mg/kg、中央値（範囲）（n = 42） 8 (0-261) 29 (0-1712) .2
注。値は、連続変数（カルプロテクチン、mg/kg便）については中央値（範囲）、カテゴリー変数（過去5年間の抗生物質の使用［抗生物質］、過去3ヵ月のプロバイオティクスの使用［プロバイオティクス］、過去5年間のPPIの使用［PPI］、過去3年間の月平均1回以上の非ステロイド性抗炎症薬［非ステロイド性抗炎症薬］、過去5年間の甲状腺ホルモン療法［甲状腺ホルモン療法］）についてはn（％）で示されている。パーセンテージは、それぞれのデータが得られた各群の実際の患者数に基づいて算出した。すべての被験者についてデータが得られなかった場合は、それぞれのデータが得られた被験者数をコホート/変数の欄に示す。連続変数およびカテゴリー変数のP値の決定には、それぞれMann-Whitney U検定および両側Fisher exact検定を用いた。
NSAIDは非ステロイド性抗炎症薬、PPIはプロトンポンプ阻害薬。
a BF+患者 vs BF-患者、＊P≦0.05；＊P≦0.01。
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補足表5マイクロバイオーム群間比較のための患者特性
特徴 BF-生検 BF+生検 P値a
総数 38 35 -
性別、女性、n（%） 22 (58) 22 (63) .81
年齢、年、中央値（範囲） 50 (19-67) 47 (17-79) .57
コントロール、n（%） 15 (39) 7 (20) .08
IBS、n（%） 15 (39) 21 (60) .1
UC, n (%) 8 (22) 7 (20) 1
最近3年間の抗生物質治療, n (%) (n = 58) 13 (43) 12 (42) 1
注 値は、連続変数の場合は中央値（範囲）、カテゴリー変数の場合はn（％）で示す。パーセンテージは、それぞれのデータが得られた各群の実際の患者数に基づいて算出した。すべての被験者についてデータが得られなかった場合は、それぞれのデータが得られた被験者数を最初の列に示す。連続変数およびカテゴリー変数のP値の決定には、それぞれMann-Whitney U検定および両側Fisher exact検定を用いた。
a BF+患者 vs BF-患者。
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論文情報
出版履歴
オンライン公開 2021年6月16日
受理済み 受理：2021年6月13日
受理 受理：2020年9月22日
脚注
利益相反 著者らは利益相反を公表していない。

資金提供 本研究は、ウィーン科学技術基金（LS18-053）、オーストリア科学基金（KLI 557およびP27831-B28）、欧州連合（EU）のHorizon 2020研究・イノベーションプログラム（714366）およびERC Starting Grant（FunKeyGut 741623）に基づく欧州研究評議会（ERC）の支援を受けた。

識別
DOI: https://doi.org/10.1053/j.gastro.2021.06.024

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© 2021 by AGA Institute. 発行：Elsevier Inc.
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グラフィカルアブストラクト
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図1内視鏡的に見えるバイオフィルムは、高密度の細菌凝集体からなる。(A-C）巨視的に見えるバイオフィルムを有する患者（BF+ IBS、上段）と有さない患者（BF-対照、下段）の代表的な内視鏡写真と生検の比較。(A）BF+患者の腸粘膜表面に付着した黄緑色の層の内視鏡写真。(B)同じ患者のSEM。BF+生検では上皮に付着した細菌がぎっしり詰まっていることが確認された（細菌は赤色）。BF-生検では、無傷の粘液層に細菌が散在していた。(C）生検切片をDAPI（青）で染色し、一般細菌プローブMix EUB338 I-III（緑）を用いて蛍光in situハイブリダイゼーションを行ったところ、BF+生検では細菌が上皮に直接接触してびっしりと詰まっている（赤矢印）のに対し、BF-生検では上皮から離れたところに細菌が散在していた。白の破線は上皮の境界を示す。H&E染色により、BF+生検では粘液と細菌からなる表層が認められた。(D）1切片あたりの上皮の長さに対して正規化した細菌の総数（BF+生検：橙色、BF-生検：青色）。(E）1切片あたり144.7×144.7μmの共焦点顕微鏡像における細菌の最大密度。(F)上皮から3μm以内に存在する細菌の数（切片あたりの上皮の長さに対して正規化）。(G) 生検あたりの全二本鎖DNAに対する16S rRNA遺伝子コピーの比率。(H) 1切片あたりの、上皮上部のメタカルン固定H&E染色表面層の最大高さ。(i) 主要研究コホートのバイオフィルムの位置と数。ほとんどのバイオフィルムは回腸、盲腸、上行結腸で観察された。(D,E,F）対数スケールで定義されていないため、x軸にゼロ値を表示。統計解析：（D、E、F、H）Mann-Whitney U検定、n＝37 BF+、n＝47 BF-、（G）対数変換データに対するt検定、n＝42 BF+、n＝56 BF-；＊＊＊P≦0.01、＊＊＊P≦0.001。
図サムネイルgr2
図2BF+患者における細菌性ディスバイオシス、自発的バイオフィルム形成、およびBAレベルの上昇。(A）IBS患者、UC患者、健常対照を含む大腸BF+生検（オレンジ）とBF-生検（青）の細菌プロファイル（16S、一般化UniFrac距離）の多次元尺度プロット。(B)BF+生検では、細菌性dysbiosisが認められた（リッチネスとシャノン多様性指数の減少）。(C）BF+生検では、Escherichia/Shigella属およびR. gnavusグループの細菌が豊富であった。(D）BF+生検の51%にR. gnavusのブルームが認められたのに対し、BF-生検では18%であった。(E）BF+生検では、Faecalibacterium、Coprococcus、Subdoligranulum、Blautiaなどの短鎖脂肪酸産生属が減少した。(F)6個のBF+ブラシ（対照2個、IBS患者4個）から分離された15個の細菌のin vitroバイオフィルム形成アッセイ。OD595/OD600比が5を超える菌株をバイオフィルム形成菌と定義し、緑色で示した。挿入図： R. gnavusバイオフィルムのSEM写真。(G)メタボロミクスパネルのボルケーノプロットでは、BF+生検においてタウロコール酸（我々の代謝物パネルにおける唯一のBA）が濃縮され、ジヒドロキシアセトンリン酸が減少していることが明らかになった。 (H)BF+IBS患者の便サンプルにおける総BAおよび一次BAの増加。統計解析： (A)距離行列のパーミュテーショナル多変量分散分析、(B-C, E)多重比較のためのベンジャミニ・ホッホベルク補正を用いたクラスカル・ワリス順位和検定、(D)フィッシャー正確検定、(H)マン・ホイットニーのU検定； (A-E) n = 35 BF+, n = 38 BF-, (F) n = 8 replicates per strain, (G) n = 5 BF+, n = 5 BF-, (H) n = 14 BF+, n = 14 BF-; ∗P ≤ . 05, ∗∗P ≤ .01.
図のサムネイルgr3
図3IBS患者、UC患者、および健常対照の腸内バイオフィルムにおける細菌シグネチャー。IBS、UC、および健常対照について、内視鏡的にバイオフィルムが見える部位（BF+生検）および見えない部位（Distal-Bx）のBF+患者とBF-患者（BF-生検）における細菌ASVの変化。粘液層（青）、バイオフィルム（赤）。各ASVについて、菌種または菌属が記載されている。n = 35 BF+生検、n = 38 BF-生検、n = 30 Distal-Bx、n = 51 BF+便、n = 54 BF-便サンプル。
図サムネイルfx2
補足図1IBS患者、UC患者、および対照におけるバイオフィルム・モードの細菌増殖の代表的画像。(A)バイオフィルム洗浄標本は、光学顕微鏡下で黄色、細菌、脱落した上皮細胞を示す。(B) BF-生検のSEMでは、無傷の粘液層（白矢印）とその上に散在する細菌（細菌の色調を強調した赤）を示す。(C) BF+生検のSEM分析では、上皮に直接接触した厚い細菌バイオフィルム層が認められる（細菌は赤色に発色）。(D）BF+生検のPAS染色。
図サムネイルfx3
補足図2IBSバイオフィルムの2症例における機械学習に基づく細菌の定量化と上皮への浸潤。(A)U-Net学習セットに含まれていない画像（IBSのBF+患者の大腸生検）上でU-Net機械学習により検出された細菌（赤十字）、DAPI（青）、およびFISH一般細菌プローブシグナル（緑）のオーバーレイの未修飾模範画像。(B）IBSバイオフィルムの2症例における上皮内への細菌浸潤DAPI（青）FISH一般細菌プローブ（緑）。
図サムネイルfx4
補足図3主要コホートのサブセットにおける詳細な分子学的および顕微鏡学的解析の説明。サンプル材料、患者コホート、サンプル番号など、詳細な顕微鏡および分子生物学的解析の説明。顕微鏡解析（トップパネル）：解析は、メタカルン固定した糞便生検（内視鏡的にBF+、BF-、およびBF+患者[Distal-Bx]からのバイオフィルムのない領域）に対して行われ、各生検から3つの隣接切片をDAPI/FISH、H&E、およびPAS解析用に処理した。共焦点顕微鏡画像は、DAPIチャンネルで細菌が可視化された全切片の全領域から得た。各画像を人工知能による細菌の定量化を行い、切片あたりの上皮の長さ（細菌の量）に対して正規化した細菌の総数を算出した；144.7×144. 7μmの共焦点顕微鏡画像における細菌の最大密度（細菌密度）；上皮から3μm離れた位置にある細菌の数（付着細菌）；上皮から3μm離れた位置にある細菌の最大密度（付着細菌密度）。H&E染色切片は、上皮の全長（正規化のため）と、1切片あたりの上皮上部のH&E表面層の最大幅（表面層）について解析した。PAS染色切片は、切片ごとの上皮上部のPAS染色表面層の平均幅と最大幅（平均PAS層高、最大PAS層高）について分析した。16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシング（左下パネル）は、スナップ凍結した糞便生検（BF+およびBF-、BF+患者のバイオフィルムのない領域[Distal-Bx]）および便サンプル（BF+およびBF-）から行った。メタボロミクス（右下パネル）は、スナップ凍結回腸生検（BF+およびBF-）で実施した。BA分析（右下パネル）は便サンプル（BF+およびBF-）に対して行われた。
図サムネイルfx5
補足図4内視鏡的に可視化されたバイオフィルムは、疾患とは無関係に高密度の細菌凝集体から構成されている。(A-H）疾患コホート（図1と同じ患者）で分離したBF+生検（オレンジ）とBF-生検（青）の比較。(I）生検部位の説明： BF+生検（オレンジ色）は盲腸または上行結腸の内視鏡的にバイオフィルムが確認できる部位から採取し、BF-生検（青色）はBF-患者の同じ部位から採取した。Distal-Bx（生検）（黄色）はBF+患者から内視鏡的にバイオフィルムが確認できない遠位部で採取した。(J-R）補足図4A-Hと同じサンプルに、Distal-Bx（黄色）のデータを追加。(A, J) 切片あたりの上皮の長さに対して正規化した細菌の総数。(B, K) 1切片あたり144.7×144.7μmの共焦点顕微鏡像における細菌の最大密度。(C, L) 各切片における上皮上部のメタカルン固定H&E表面層の最大幅。(D, M）生検の全DNAに対する定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって決定された16S rRNA遺伝子コピーの比率。(E, N)上皮から3μmの位置にいる細菌の数、各セクションの上皮の長さに対して正規化。(F, O) 1切片あたり144×144μmの共焦点顕微鏡像における、上皮から遠位3μmまでの細菌の最大密度。(G, P) 1切片あたりの上皮上部のメタカルン固定PAS表面層の最大幅。(H, Q) 1切片あたりの上皮上部のメタカルン固定PAS染色表面層の平均幅。(R）144.7×144.7μmの共焦点顕微鏡像の少なくとも1枚において、粘液層に109 - mL-1以上の細菌が侵入している生検の割合。(S) BF+生検とBF-生検の顕微鏡データのピアソン相関係数による相関行列。(T）IBS、UC、およびコントロールにおける内視鏡的に可視化されたバイオフィルムの位置。∗P値≦0.05；P値≦0.01；P値≦0.001。(A、B、E、F、J、K、N、O）ゼロ値は対数スケールで定義されていないため、x軸に直接接して表示されている。(A-C、E、F、J-L、N、O) Dunnの多重比較検定によるKruskal-Wallis検定、(D、G、H、M、P、Q) 対数変換データに対するTurkeyの多重比較検定による1元配置分散分析、(R) 重複比較のためのBonferroni補正によるFisher exact検定。(A-C、E-L、N-S）n = 37 BF+、n = 47 BF-、n = 30 Distal-Bx（D、M）n = 42 BF+、n = 56 BF-、n = 35 Distal-Bx。
図サムネイルfx6
補足図5縦断的バイオフィルム状態のサンケイ図。主要患者コホートにおける縦断的な患者のバイオフィルムの状態、左側が最初の時点、右側が2番目の時点。患者フローはバイオフィルムの状態によって色分けされ、両時点でBF+（オレンジ）、第1時点でBF+、第2時点でBF-（薄いオレンジ）、両時点でBF-（青）の疾患コホートが含まれる。その他はGI感染症および化学療法による下痢を表し、n＝19人、大腸内視鏡検査の平均間隔は7ヵ月であった。
図サムネイル fx7
補足図6疾患別に分離した微生物バイオフィルム組成。(A)BF+患者（円）とBF-患者（三角）の一般化UniFrac距離の多次元尺度プロットを疾患コホートで色分けした図2のサンプル。(B）便サンプル（黒）、BF+生検（オレンジ）、Distal-Bx（黄色）の患者内比較。(C）図2のサンプルを疾患コホートごとに分割したもの。(D）疾患コホートで分割したBF+生検（橙色）とBF-生検（青色）のR. gnavus群の相対存在量と細菌の豊富さの比較（図2BおよびEのデータを使用）。(F)大腸R. gnavus OTU相対量と大腸生検のリッチネスおよびシャノン多様性との相関。(A-C) P値は一般化ユニフラック距離行列の並べ替え多変量分散分析を表す。(D, E) Kruskal-Wallis rank sum test with Benjamini-Hochberg correction for multiple comparisons. (F) 中心対数比変換したOTUの存在量、リッチネス、シャノン多様性のピアソン相関。(A, C-F) n = 35 BF+, n = 38 BF- (B) n = 22 BF+, n = 22 Distal-Bx, n = 22 BF+便サンプル。
図のサムネイルfx8
補足図7IBSのBF+およびBF-患者の便中BAレベル。(A)IBSのBF+患者（オレンジ）とBF-患者（青）の便サンプル中の一次BAレベル。(B)BF+およびBF-IBS患者の便検体中の二次BAレベル。(C）IBS患者（BF+）およびIBS患者（BF-）の便検体中のタウロ結合型およびグリコール結合型BA濃度。(D) 大腸R. gnavus OTU相対存在量と便中BA濃度の相関。(A-C）多重比較のためのボンフェローニ補正を用いたMann Whitney U検定。(D) 中心対数比変換したOTU存在量と糞便中BA濃度のピアソン相関。(A-C) n = 14 BF+、n = 14 BF-、(D) n = 40。
図のサムネイルfx9
補足図8IBSおよびUCにおけるカルプロテクチン、マイクロバイオーム、顕微鏡、およびBAデータの探索的相関行列。IBS患者（上段）とUC患者（下段）のピアソン相関係数による相関行列。大腸生検の顕微鏡データ（1切片あたりの上皮上部のメタカルン固定PAS染色表層の平均幅および最大幅［平均PAS層高、最大PAS層高］、1切片あたりの上皮上部のメタカルン固定H&E表層の最大幅［表層］、1切片あたりの上皮の長さに対して正規化した細菌の総数［細菌量］、144.7×144. 7μmの共焦点顕微鏡画像（1切片あたり）［細菌密度］、上皮から3μmの細菌の数（1切片あたりの上皮の長さで規格化）［付着細菌］、1切片あたりの144×144μmの共焦点顕微鏡画像における上皮から3μm遠位までの細菌の最大密度［付着細菌密度］）、定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって決定された16S rRNA遺伝子のコピーの生検の全DNAに対する比率（DNA比率）、 大腸生検のマイクロバイオームデータ（Faecalibacterium属に属するOTU_tq6_57bとEscherichia/Shigella属に属するOTU_9qp_ahyの相対量、マイクロバイオームの豊かさ、シャノン多様性）、便検体のBAデータ（総BA、コール酸、チェノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、UCDA）、便検体のカルプロテクチンデータ（カルプロテクチン）。青が正の相関係数、赤が負の相関係数。P値≦0.05は色分けされている。(A) n = 61。(B) n = 30。
図のサムネイル fx10
補足図9バイオフィルムはASVレベルで疾患特異的変化を示す。各疾患コホートにおける、BF-とBF+の生検の間、BF-とBF+患者のバイオフィルムのない領域（Distal-Bx）の間、BF+患者とBF-患者の便の間のASVに基づく差異（DESeq2で決定）。BF+患者のUC炎症領域（炎症BF+）とBF-患者のUC炎症領域の追加比較。ドットの大きさはfold-changeを表し、完全なドットはバイオフィルム環境におけるアップレギュレーションを、空のドットはダウンレギュレーションを表す。ドットは細菌門に基づいて色分けされており、細菌分類学（属および種）はSILVA参照データベースに基づいて各ASVに割り当てられている。n = 35 BF+, n = 38 BF-, n = 30 Distal-Bx, n = 5 inflamed BF+, n = 6 inflamed BF-, n = 51 BF+便サンプル, n = 54 BF-便サンプル。
表
表1内視鏡的バイオフィルムの定義
表2独立した2つの内視鏡検査室における内視鏡的に可視なバイオフィルムの有病率
補足表1主要患者コホートの臨床的特徴
補足表2一次コホート（n = 756）におけるバイオフィルムの状態の多変量ロジスティック回帰
補足表3バイオフィルム陽性、バイオフィルム陰性、および遠位大腸生検の病理組織学的評価
補足表4詳細な分子顕微鏡コホートのサブグループにおける薬歴とカルプロテクチンのデータ
補足表5マイクロバイオームグループ比較のための患者特性
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