自閉症児の糞便微生物叢はミツバチの腸内代謝と学習・記憶能力に影響を与える
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オリジナル研究論文
Front. 微生物学、2023年11月23日
脊椎動物の消化器系における微生物の役割
第14巻-2023年｜https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1278162
自閉症児の糞便微生物叢はミツバチの腸内代謝と学習・記憶能力に影響を与える
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1278162/full?utm_source=S-TWT&utm_medium=SNET&utm_campaign=ECO_FCIMB_XXXXXXXX_auto-dlvrit
Yiyuan Li1,2 Yan Zhang1 Xi Luo1,2 Yujie Meng3 Zhaopeng Zhong3 Hao Zheng3* Yunsheng Yang1,2*
1中国PLA総合病院第一医療センター消化器肝臓科微生物部
2中国PLA医学院、中国、北京
3中国農業大学食品科学栄養工程学院、中国、北京
自閉症スペクトラム障害（ASD）は一連の神経発達障害であり、発症率は増加傾向にある。消化器症状はASDの一般的な併存疾患である。自閉症児の腸内細菌叢組成は定型発達（TD）児のそれとは異なっており、腸内細菌叢がおそらく微生物叢-腸-脳軸を介して宿主に影響を与えていることが示唆される。しかし、腸内細菌叢の異常と宿主の脳機能との関連は依然として不明である。本研究では、ミツバチモデルを創造的に開発し、糞便微生物叢が宿主に及ぼす潜在的影響について検討した。自閉症児とTD児の糞便微生物叢を、微生物叢を持たないミツバチ（Apis mellifera）に移植し、それぞれASD-糞便微生物叢移植（FMT）ミツバチ（A-BEE群）とTD-FMTミツバチ（T-BEE群）を誘導した。その結果、A-BEE群のミツバチの認知能力は、嗅覚口吻伸展反応条件付けにおいて有意に損なわれていた。メタゲノミクスを用いて糞便微生物叢のコロニー形成を評価した結果、ミツバチの腸内でトリプトファン代謝とタウリン代謝を変化させる原因として、Bacteroides dorei、Bacteroides fragilis、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus paragasseriなど、いくつかの異なる種が明らかになった。さらに、自閉症児の糞便微生物叢は、ミツバチの神経シグナル伝達とシナプス伝達に関与する脳遺伝子をダウンレギュレートした。注目すべきは、A-BEEグループのミツバチの脳内で観察されたスプライシングの異なる遺伝子は、SFARIおよびSPARK遺伝子セットを介して自閉症と診断されたヒトで同定された遺伝子とほぼ重なっていたことである。また、これらのスプライシングされた遺伝子は、神経シナプス伝達に関連する経路に濃縮されていた。我々の発見は、ミツバチの神経学的プロセスに寄与している可能性のある、ヒトの腸内細菌叢の極めて重要な役割について、新たな洞察を与えるものである。さらに、ASDにおける腸と脳のつながりに関するいくつかの研究成果を紹介する。
1 はじめに
社会性昆虫であるミツバチ（Apis mellifera）は、複雑な社会的行動と脳機能を示す。さらに、彼らの安定した単純な腸内微生物は、微生物叢-腸-脳の相互作用を調査するための一定の利用可能性を提供する（Engel et al.） 我々のチームが行った研究により、ミツバチの腸内細菌は腸内での行動や代謝に影響を与えるだけでなく、神経伝達物質のレベルや脳内の転写プログラムも変化させることが明らかになった（Zhang et al.） Gilliamellaは炭水化物とグリセロリン脂質の腸内代謝経路を制御する（Zheng et al., 2016）が、Lactobacillus Firm4とFirm5は主にアミノ酸代謝経路に影響を与え、それによって循環代謝産物と認知行動に影響を与える（Zhang et al.） 興味深いことに、我々の研究では、行動障害を起こしたハチの脳のトランスクリプトームにおいて、嗅覚機能と分業に関わる遺伝子に関連するユニークな遺伝子発現特性を発見した。これらのハチは通常、社会的刺激に反応しない（Zhang et al.） 注目すべきことに、ハチとヒトの社会的反応の根底にある分子メカニズムが相同であるという証拠がある（Shpigler et al.） 精神疾患はまた、自閉症スペクトラム障害（ASD；Sharon et al. さらに我々は、ヒトの自閉症遺伝子データセットと一致する、ハチの脳における行動障害に関連する重複するAS遺伝子を同定した（Zhang et al.） 自閉症のヒトの腸内細菌叢がコロニー形成されたマウスの脳も影響を受けている（Sharon et al.） 自閉症モデルマウスの研究で、Golubevaらは腸内細菌叢、腸内生理、社会的行動の相互作用を発見した（Golubevaら、2017）。これらの知見は、ヒトと遠く離れた昆虫種間で社会的反応性に関連する遺伝子が深く保存されていることが、微生物叢-腸-脳の相互作用を調べる機会を提供することを示唆している。ヒトの糞便微生物叢を移植したミツバチは、自閉症と腸内微生物叢の関係を探る上で有用な役割を果たすかもしれない。
ASDは、社会的相互作用障害、言語コミュニケーション障害、反復的な定型行動を特徴とする一連の異質な神経発達障害であり、自閉症患者の生活に深刻な影響を与え、その家族や社会に重い心理的・経済的負担を強いる（Lai et al.） 自閉症は男性優位で、男女比は約4：1である（Wang J. et al.） ASDの有病率はこの40年間で世界的に20～30倍に増加しているが、その原因はよくわかっていない（Wang J. et al.） 自閉症患者からは、遺伝的な要素を示唆するまれな遺伝子の変化や突然変異、小さな一般的な遺伝子の変異が検出されている（Fang et al.） 遺伝因子と環境因子の相互作用に焦点を当てた研究が増えており、腸内細菌叢は環境因子と遺伝的リスク因子の接点となっている（Waltesら、2019；Chenら、2020；Yuら、2023）。消化器症状はASDの一般的な併存疾患であり（Lai et al., 2014; Vuong and Hsiao, 2017）、微生物叢の異常がASDに関与していることが示唆されている（Finegold et al., 2010; Adams et al., 2011; Vuong and Hsiao, 2017; Kang et al., 2018; Wan et al., 2022）。腸内細菌叢に関する研究では、定型発達（TD）児と比較して、自閉症児では腸内微生物のアルファ多様性とベータ多様性の両方に違いがあることがわかった（Liu et al.） さらに、腸内メタボロミクスにより、微生物叢の違いと共に、自閉症児の腸内にも違いがあることが明らかになった。この研究では、健常者と比較して、自閉症の人の腸内代謝は、胆汁酸代謝、タウリン代謝、不飽和脂肪酸代謝、トリプトファン代謝など、微生物を介する複数の経路で異なっていることが明らかになった（Agus et al.、2018；Zhu et al.、2022）。自閉症児とTD児の尿中の代謝物を比較した研究では、最も分化した代謝経路のひとつがトリプトファンの代謝経路であった。自閉症児では、キヌレニン経路がアップレギュレートされ、セロトニン経路がダウンレギュレートされた結果、メラトニンが欠乏した（Gevi et al.） ある臨床研究によると、自閉症児の睡眠障害は認知機能の低下、気分不良、行動障害と関連しており、適切かつ定期的なメラトニンの補充によってこれらの症状が緩和されることがわかった（Galli et al.） これらの微量代謝産物は、中枢神経系の成長、発達、正常な機能に不可欠であることが多い（Evansら、2008年）。さらに、糞便微生物叢移植（FMT）がトゥレット症候群や自閉症の症状を改善することが研究で報告されている（Kangら、2017、2019；Zhaoら、2017、2020；Li N.ら、2021；Nirmalkarら、2022）。われわれのチームは、6人の自閉症児の治療にFMTを実施し、症状に有意な改善をもたらした。これらの知見は、2017年に症例報告として発表された（Huijun Zhao et al.） これらの知見は、消化管微生物が宿主の免疫、代謝、神経系の発達と機能に影響を与えることを示唆している。腸内微生物に関する研究は、自閉症を理解するための重要な手段となりうる。
ASD疾患の研究で一般的に採用されている動物モデルは、ASDに関連する中核症状、特に社会性、学習、情緒障害などの後期脳機能障害を再現することを目的としている。ミツバチは社会性昆虫であり、巣の内外で一連の複雑な社会的相互作用によって特徴づけられる独特の行動構造を持っている。これらの複雑な行動は、感覚感度、特に嗅覚感度に大きく依存している（Braun and Bicker, 1992; Moauro et al., 2018; Leger and McFrederick, 2020）。例えば、ミツバチは嗅覚情報を用いて餌源を見つけ、巣仲間を認識して情報を伝達し、危害に対抗するために潜在的な捕食者を識別し、ホルモンシグナルを伝達し、摂食行動に関与することができる（Arenasら、2007；Farinaら、2007；Sandoz、2011）。嗅覚口吻伸展反応（PER）に基づいてミツバチの学習・記憶能力を定量的に評価する行動プロトコールが確立されており、ミツバチの脳機能を研究する指標としてこの方法を採用した（Sandoz, 2011; Matsumoto et al., 2012; Van Nest, 2018; Zheng et al.） さらに、微生物叢-腸-脳軸に関連する疾患のメカニズムを研究する場合、微生物叢フリーの動物には独自の利点がある（Bauman and Schumann, 2018; Li Z. et al., 2021）。微生物叢を含まないミツバチの使用は、抗生物質投与の必要性をなくし、それによって生物の自然な生理状態に近づける、確立された技術である（Zhengら、2018；Zhangら、2022a）。そのため、本研究では微生物叢を持たないミツバチを選択した。
本研究では、ASDを研究するための新たなミツバチモデルを開発するために、自閉症の子どもの糞便微生物叢を微生物叢を持たないミツバチの腸内に移植することを試みた。行動実験によりミツバチの学習・記憶能力を評価した。メタゲノミクスを用いて、FMTを受けたミツバチの腸内における糞便微生物叢のコロニー形成、ASD糞便微生物叢がミツバチの脳トランスクリプトームの遺伝子発現特性に及ぼす影響の詳細な探索、ASD糞便微生物叢が腸内代謝に及ぼす影響を評価した。このように、ASDマイクロバイオーム研究における新たなモデルとしてミツバチの潜在的有用性を検証し、ASDメカニズムを理解するための新たな手がかりを提供することを目指した。
2 材料と方法
2.1 子どもの臨床情報収集と糞便サンプル採取
ASDと診断された子どもたちからなるASD-CHILDグループは、中国PLA総合病院第一医療センターで募集された。正常発達児（TD-CHILD群）は、近隣の幼稚園から募集した。参加者全員の保護者から、糞便サンプルおよび臨床情報の収集について同意を得た。その後、保護者は新鮮な糞便を氷の入った保冷箱に移した。糞便サンプルの輸送は、私たちのチームの指定されたメンバーが担当した。本研究の承認は、中国PLA総合病院の倫理委員会（承認番号S2015-110-02）により行われた。すべての小児の法的保護者は、登録前に書面によるインフォームド・コンセントを提供した。登録された被験者は、他の研究に参加することはできなかった。
以下の基準を満たす自閉症児を対象とした： (1) 3歳以上で、Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fifth Editionの基準およびAutism Diagnostic Observation Schedule, Second Edition（ADOS-2）に従ってASDと診断され、(2) 胃腸症状を経験している（Schneiderら、2006；Gothamら、2007；Jurekら、2022）。自閉症児の除外基準は以下の通りである： (1)脆弱X症候群、核型異常、その他の遺伝性疾患、および/または脳奇形と診断された小児、(2)潰瘍性大腸炎、クローン病、または腸癌の小児、(3)過去3ヵ月間にプロバイオティクス/プレバイオティクス介入を受けた小児、(4)FMT治療を受けた小児、(5)重篤な食餌嗜好の小児、(6)糞便サンプル採取の3ヵ月前に抗生物質および抗真菌薬を使用した小児。自閉症児は、リハビリテーション訓練や精神科治療薬などの日常治療を継続することが許可された。小児期自閉症評価尺度第2版（CARS-2）は、ASDの中核症状の全体的な重症度を評価するために適用され、この尺度に基づいて患者は以下のように分類される： 「自閉症ではない(<30)」、「軽度から中等度の自閉症(30-36.5)」、「重度の自閉症(>36.5)」である。(Chlebowskiら、2010；Dawkinsら、2016；Jurekら、2022）。CARS-2には15項目の尺度（個別の行動に関する14の質問と自閉症に関する1つの意見の質問）があり、各項目は同じ年齢の同年齢の同級生に期待されるものと比較した逸脱の重症度を反映する1～4のスコアを持っている。 TD児の養育者／両親は、病歴と家族歴に関するスクリーニングアンケートに回答し、子どもたちは感染症や代謝症候群の可能性を排除するために、検査室での血液、尿、便の検査を受けた。ドナーのスクリーニングの詳細なプロセスは、我々のチームが以前に確立した方法論に基づいている（Wang et al.） 本研究の対象となったすべての子どもの保護者は、子どもの食生活に関する相談に応じた。民族性、食物選択性、偏食、食物摂取量など、栄養摂取に影響を及ぼす可能性のあるさまざまな側面を評価した。 これまでの研究で、自閉症児には消化器症状がよくみられ、そのような児は腸内細菌叢異常のリスクが高い傾向があることが示されている（Wang J. et al., 2022; Wang H. et al., 2023）。そこで、消化器症状を伴う自閉症児を募集した。GSIは、各評価の際に介護者／保護者が記入した。自閉症児には性差がある（Wang J.ら、2022）。しかし、実験のミツバチは働きバチであり、自然界では働きバチはすべてメスである。したがって、この研究では性別の要因は考慮しなかった。
2.2 微生物相を含まないミツバチの作製
この研究で使用したすべてのミツバチ (Apis mellifera) は Dr. Zheng 研究所から提供されたハニカムから得た。微生物群を含まないミツバチはZheng博士の研究室でZheng博士の方法（Zheng et al.） ミツバチのサナギから成虫への移行期には、新たに出現した働き蜂が細菌をほとんど含まないか全く含まない、自然な微生物叢フリー期間がある（Engel et al.） したがって、この生理的段階で得られたミツバチを無微生物 質のミツバチと呼ぶことにした。簡単に説明すると、蛹化の後期になると、蛹は無菌インキュベーターに手作業で移され、そこで35℃、湿度50%で脱皮まで発育し続けた。ミツバチの腸内細菌は厳密には嫌気性ではないため、ミツバチの腸内細菌を粉砕し、細胞数が1×107になるように希釈し、寒天プレート上で細菌が増殖しないことをもって微生物叢のないミツバチと定義した。新たに出現したミツバチ（0 日目）を無菌カップケージに入れ、無菌ショ糖液と無菌花粉を 24 時間与えた後、1 カップあたり 25 ～ 30 匹の従来型（CV 群）、ASD-FMT ミツバチ（A-BEE 群）、TD-FMT ミツバチ（T-BEE 群）の 3 群に分け、対応する介入を行った（1 日目）。ミツバチの食餌の違いによる研究への影響を避けるため、各グループに提供した花粉とショ糖液は同一とした。
2.3 ミツバチのコロニー形成
自然状態では、新たに出現したミツバチは主に 3～4 日間の摂食によって比較的安定した腸内細菌叢を獲得する (Zheng et al., 2018)。そこで本研究では、ヒトの糞便微生物叢を飼料に添加することで、微生物叢を持たないミツバチに対してFMTを実施した。ASD-CHILDおよびTD-CHILDのドナーから新鮮な糞便サンプルを速やかに採取し、4時間以内に親が実験室に移送した後、25％滅菌グリセロールに懸濁し、-80℃のサンプルバンクで保存した。凍結した糞便サンプルはミツバチのコロニー形成前に前処理した。 その後、ろ液を1,000×g、4℃で3分間遠心分離し、上清を抽出した（Sharonら、2019）。A-BEE群のコロニー形成には、ASD-CHILDの糞便サンプルの上清1 mlを上記のように採取し、滅菌スクロース溶液（50％、w/v）1 mlおよび滅菌花粉0.3 gと十分に混合し、最終糞便懸濁液濃度を0.05 g/mlとして給餌した。T-BEE群のコロニー形成には、同じ方法でTD-CHILDの糞便サンプルを用いて餌を調製した。CV 群には、5 μl の野生ミツバチ後腸ホモジネートと 1 ml の 1×PBS 、1 ml の滅菌ショ糖溶液 (50%, w/v) 、および 0.3 g の滅菌花粉を混合したものを与えた。実験用ミツバチは最初の3日間（1～3日目）、24時間ごとに餌を変えながら懸濁液を含んだ餌を与えられた。その後、各ミツバチグループは35℃、相対湿度50％の恒温器に入れられ、8日目まで滅菌スクロース（50％、w/v）と滅菌花粉が与えられた。8 日目に各ミツバチ群に対して行動実験を行った。実験終了後、追加分析のためにミツバチの脳と腸を回収した。
2.4 学習と記憶テスト
匂いを認識・理解・記憶する能力はミツバチの社会活動の多くの要であり、個体間のコミュニケーショ ンに不可欠な手段のひとつであることを考慮し、嗅覚学習と PER に基づく実験を行い、ミツバチの 行動と脳機能の変化を反映させた (Sandoz, 2011; Huijun Zhao et al., 2017; Liu et al., 2017; Van Nest, 2018)。各ミツバチ群の嗅覚学習・記憶能力は 8 日目（すなわち 8 日齢時）に測定した。我々のチームによる既報の研究（Chang 他、2022；Zhang 他、2022a）で報告されている方法を用いた。その後、ミツバチを飼育箱に入れ、2 時間の飢餓状態にした。テストでは、ノナノール (1-ノナノール、purum ≥98.0% GC; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) と n-ヘキサナール (カプロアルデヒド、purum ≥99.0% GC; Macklin; Shanghai, China) を匂い源として用い、ノナノールは嗅覚学習に、 n-ヘキサナールは陰性対照として用いた。コンディショニングの間、全てのミツバチは5ラウンドの訓練を受け、各ラウンドは10分間であった。5回のトレーニングの後、ミツバチは餌を与えずに実験環境に2時間放置した。その後、記憶テストを行った。簡単に説明すると、2 種類の匂い刺激 (ノナノールまたはヘキサナール) をランダムに提示し、視覚刺激の影響を排除するため、各 匂い刺激の後に無臭の清潔な注射器を提示した。PERを観察・記録し、ノナノール刺激下でのみPERを行ったミツバチを記憶テストに成功したとみなした（図1A）。
図 1
www.frontiersin.org
図1. ASDドナーの糞便微生物叢はミツバチの学習と記憶に影響を与える。(A)実験デザインの模式図：微生物叢を含まないミツバチに、無菌のスクロース水と花粉を食餌させた。その後、1～3日齢のミツバチにTDまたはASDドナーの糞便微生物叢をコロニー形成させた。嗅覚学習と記憶の実験はミツバチが8日齢のときに行い、その後組織とサンプルを採取した。(B）ASDドナーのCARS-2の15項目のスコア。ボールの色は自閉症児を表し、ボールの位置は対応する項目の得点を表す。(C）ドナーの基本的臨床情報（詳細は補足表S1を参照）。(D) 正に報酬を与える条件刺激[CS;サンプルサイズ]の学習曲線： サンプルサイズ：TD-BEE 1（n = 39）、TD-BEE 2（n = 40）、ASD-BEE 1（n = 40）、ASD-BEE 2（n = 40）、ASD-BEE 3（n = 40）、ASD-BEE 4（n = 40）、ASD-BEE 5（n = 40）、ASD-BEE 6（n = 40）、CV（n = 40）、合計N = 359）。(E）A-BEE群（ASD-BEE 1～6を含む）とT-BEE群（TD-BEE 1と2を含む）の学習曲線。グループ間の差はカイ2乗検定を用いて決定した。(F) 記憶テストに成功したミツバチの比率（サンプルサイズはDと同じ）。(G) A-BEE群とT-BEE群の記憶テストに成功したミツバチの割合。グループ間の差はカイ二乗検定を用いて決定した。
2.5 組織採取
行動テスト終了後、各ミツバチの中腸、回腸、直腸を含む腸全体を氷上で解剖した。腸は 1.5 mL の滅菌遠心チューブに集め、液体窒素で-80℃の冷凍庫に保存した。同日、解剖針を用いて胸部を蜜蝋プレートに固定し、解剖顕微鏡 (Nikon SMZ745T, 日本) で頭部のクチクラを除去して脳全体を得た。ミツバチの脳全体をスライドに載せ、RNAlater（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）に浸した。さらに、脳組織上の腺（咽頭腺と唾液腺）、複眼2個、単眼3個を細胞鉗子を用いて氷上で取り出し、液体窒素で保存した滅菌済み1.5ml遠心チューブに入れた。これらのサンプルも-80℃の冷凍庫で保存した。
2.6 腸のヘマトキシリン・エオジン染色
解剖したミツバチの腸を固定液 (8% w/v パラホルムアルデヒド) に固定し、PBS で洗浄した後、エタノールで脱水し、キシレンに移した。パラフィン包埋組織を冷却して完全に固化させた後、4～6 mmの厚さで切開した。切片をキシレンおよび一連のエタノール溶液に連続して浸し、ヘマトキシリンで5分間染色した後、1％酸性エタノール（70％エタノール中1％塩酸）で処理した。その後、精製水で洗浄し、エオシンで3分間処理し、再びエタノールとキシレンに浸した。顕微鏡（Leica, Wetzlar, Germany）を用いて腸内組織の形態学的組成を調べた。
2.7 ミツバチの腸管DNA抽出とショットガンメタゲノム配列決定
ミツバチの消化管全体を、酵素を含まない滅菌済みの使い捨て乳鉢と乳棒を使って粉砕し、 セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（CTAB）ビーズ叩きを使って各サンプルから個別にゲノム DNA を抽出した。具体的な実験手順の詳細は、研究チームの以前の研究（Changら、2022年）に記載されている。メタゲノム配列解析には、各群6個の生物学的複製を用いた。
DNAサンプルはBGI Genomics Co. (Ltd.（広州、深圳、中国）に送り、ショットガンメタゲノムシーケンスを行った。シーケンシングはDNBSEQ-T1&T5システムで行われ、150 bpのペアエンドリードが得られた。シーケンスの質はfastp v0.23.2を用い、デフォルトのパラメータで評価した。BWA v0.7.17-r1188とSAMtools v1.9を用いて、ミツバチ参照ゲノム（バージョン Amel_HAv3.1）とヒト参照ゲノム（バージョン hg_19）に属するリードを個別に除去した。Metaphlan2 v3.0.14を用い、各サンプルの群集構造を門レベルおよび種レベルで解析した。次に、Metaphlan2の "merge_metaphlan_tables.py "スクリプトを実行し、ヒト細菌ゲノムのサンプルを、サンプルごとの相対正規化存在量が記載された1つのテーブルにマージした。
2.8 ミツバチの脳RNA抽出とトランスクリプトームシークエンシング
トランスクリプトーム配列決定のために、各グループに6つの生物学的複製を含めた。ミツバチの脳から全RNAをQuick-RNA MiniPrep Kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA)を用いて抽出した。ミツバチの脳からの RNA サンプルは BGI Genomics Co. (Guangzhou, Shenzhen, China)に送り、トランスクリプトーム塩基配列を決定した。シーケンシングはDNBSEQ-T1&T5システムで行われ、150 bpのペアエンドリードが得られた。
Fastp v0.23.2を用いて、各サンプルのシーケンス品質をデフォルトパラメータで評価した。HISAT2 v2.2.1を用いて、ミツバチ参照ゲノムのインデックス（Amel_HAv3.1）を構築し、fastpでトリミングしたリードをHISAT2を用いてデフォルトパラメータでこのインデックスにアライメントした。遺伝子発現の定量は、HTSeq v2.0.1を用いて "union "モードで行い、明らかに単一の遺伝子にマップされたリードのみを考慮した。複数の位置にアライメントされたリード、または複数の遺伝子にオーバーラップしたリードは除外した。微分発現解析は、R（v4.1.0; Love et al., 2014）のDESeq2パッケージ（v1.34.0）を用いて行った。遺伝子の機能解析はKEGG (http://www.kegg.jp/ or http://www.genome.jp/kegg/) に基づき、相同性マーカーはClustering Diagram v3.10.1 (Wu et al., 2015) を用いて検出した。重み付け相関ネットワーク解析（WGCNA）は、協調発現を示す遺伝子モジュールを同定し、これらのネットワーク関係内の主要遺伝子を明らかにすることを目的として、目的の表現型に関連する遺伝子ネットワークを探索するために使用される。我々はR v4.1.0のWGCNA v1.71パッケージを用いて重み付け遺伝子共発現ネットワーク解析を行った(Langfelder and Horvath, 2008)。
ミツバチの参照ゲノムに基づき、rMATS version 4.0.2 (turbo)を用いてイベントレベルの差分スプライシング解析を行った。ASイベントを定量化するために、エクソンに基づくパーセントスプライスイン（PSI）値として知られる比率メトリックを採用した。PSI値は、スキップエクソン(SE)、代替5′スプライス部位(A5SS)、代替3′スプライス部位(A3SS)、相互排他的エクソン(MXE)、および保持イントロン(RI)を含むASイベントのいくつかのクラスについて計算された。p値が0.05未満の事象は、A-BEE群とT-BEE群の間でスプライシングに差があると判断した。ミツバチの脳で発現またはスプライシングが異なる遺伝子とASDのヒトで発現またはスプライシングが異なる遺伝子の類似性を見つけるために、948の既知の自閉症リスク遺伝子（SFARIとSPARK）を代表する3,531の高品質な参照タンパク質配列を、BLASTPを使用してミツバチゲノムに関連するタンパク質配列と双方向ベストマッチ戦略（Altschulら、1990；Zhangら、2022b）でアライメントした。合計649の自閉症関連タンパク質配列が、類似度が30%以上、E値が0.000394未満でマッチした。
SFARI: https://gene.sfari.org/.
SPARK for autism: http://spark-sf.s3.amazonaws.com/SPARK_gene_list.pdf.
2.9 ミツバチ腸のメタボローム解析
各群6個の生物学的複製について、非標的メタボロミクスを実施した。Novogene Co. (Ltd.（中国、北京）が液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）分析を実施した。分析は、Vanquish超高性能液体クロマトグラフィー（UHPLC）システム（Thermo Fisher Scientific）とOrbitrap Q Exactive HF-X Mass Spectrometer（Thermo Fisher Scientific）を用い、正極性モードと負極性モードの両方で行った。Compound Discoverer 3.1（Thermo Fisher Scientific）を使用して、UHPLC-MS/MSで生成された生データファイルを処理し、正確な定性および相対定量結果を得ました。メタボロミクスデータの解析は、MetaboAnalystインターフェース（バージョン5.0）ソフトウェア（Pangら、2021）を利用して実施した。
2.10 統計的手法
2.10.1 メタゲノミクスデータ
微生物のアルファ多様性は、種レベルでの豊かさと多様性（Richness/Shannon index）に従って評価した。A-BEE群とT-BEE群間の細菌の類似性を評価するために、重み付けされていないUniFrac距離行列に基づく主座標分析（PCoA）を用い、並べ替え多変量分散分析（PERMANOVA）を用いて有意性を判定した。腸内細菌量は，A-BEE群とT-BEE群の間で一対のMann-Whitney U検定を用いて比較し，偽発見率（FDR）を低下させるためにBenjamini-Hochberg手順を用いてp値を調整した．
2.10.2 トランスクリプトームデータ
正規分布していない連続データは、Mann-Whitney U 検定を用いて比較した。データは平均値±標準偏差または中央値（四分位範囲）で表した。データ解析はGraphPad Prism v9.0.0（86; Mitteer and Greer, 2022）を用いて行った。
2.10.3 メタボロミクスデータ
標的メタボロミクスデータの統計解析はMetaboAnalyst（バージョン5.0）を用いて行った。統計解析の前に代謝物濃度の正規化、変換、スケールインは行わなかった。欠損値が50%を超えるフィーチャーは、その後の解析から除外した。統計的有意性は、p値＜0.05のMann-Whitney U検定を用いて決定し、限界差はp＜0.05かつfold change（FC）＞2（すなわちlog2FC＞1）と定義した。
2.10.4 マルチオミクスとの関連
正規化したメタゲノム、トランスクリプトーム、メタボロームデータの相関解析を行った。ピアソン相関を用いて、各グループの生物学的に平行な6つの平均値を分析した（p < 0.05）。ニューラルネットワークグラフは、Cytoscape v3.9.1 (Shannon et al., 2003)を用いて可視化した。
3 結果
3.1 登録児童の基本情報
研究期間中に5名のTD児が登録された。そのうち3人は最終的に除外された。1人は家族に精神疾患の既往歴があり、2人の子どもの保護者は研究の途中で辞退した（図2B）。そのため、2人のTD児が研究全体を通して参加した。研究期間中に中国PLA総合病院の外来に入院した自閉症児は14人であった。最終的に3人の自閉症児が除外基準に基づき除外された。除外された子どものうち、1人は核型異常の診断を受け、2人は重度の食嗜好があった。5人の子どもの保護者は、この研究で許可された以上の治療を子どもに受けさせたかったため、研究の途中で同意を取り下げた（図2A）。CARS-2によると、重度の自閉症をもつ3歳から9歳の6人の子ども全員が登録された（図1C；補足表S1）。CARS-2のこれらの項目を数え、プロットした（図1B）。それによると、ASD-CHILD群は、人との関係、模倣、言語コミュニケーションに不完全さを示したが、恐怖と緊張のスコアは低かった。臨床データによると、本研究で精神科の薬を服用している自閉症児はいなかった（補足表S1）。また、登録されたすべての児童は行動療法を受けていた。ASDのために政府が同意した特別な機関で行われた行動療法は、主に応用行動分析療法であった（Granpeesheh et al.） 本研究に参加した子どもたちは、食生活に深刻な偏りはなく、栄養状態は良好であった。TD-CHILD群の平均肥満度（kg/m2）は15.48であったのに対し、ASD-CHILD群では15.73であった（補足表S1）。自閉症児の胃腸症状をGSIを用いて評価した結果、スコアは3から6の範囲であった（図1C；補足表S1）。GSIスコアは登録された自閉症児の消化器症状を反映していた。
図2
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図2. 試験期間中の各群の糞便提供者のフローチャート。(A）ASD-CHILD群のフローチャート。(B）TD-CHILD群のフローチャート。
3.2 自閉症児の糞便微生物叢は微生物叢を含まないミツバチの学習と記憶に影響を与える。
A-BEE群はT-BEE群と比較して学習・記憶能力に違いが見られた。数回のトレーニングの後、T-BEE群（すなわちTD-BEE 1とTD-BEE 2）では半数以上のミツバチが条件刺激（CS）を認識できるようになったが、A-BEE群（すなわちASD-BEE 1-6）ではCSを認識できるようになったミツバチは半数以下であった（図1A,D,E）。5回の訓練後、T-BEE群とA-BEE群の平均正答率はそれぞれ70.87%と38.75%で有意差があった（p < 0.05、カイ二乗検定）。記憶テストでは、TD-BEE 1群とTD-BEE 2群の記憶精度はそれぞれ61.54%と52.50%であったのに対し、ASD-BEE 1-6群の記憶精度はそれぞれ12.50、17.50、15.00、20.00、25.00、35.00%であった（図1F）。さらに、2時間記憶テストにおけるA-BEE群の平均精度（20.83%）は、T-BEE群（56.96%; p < 0.05, カイ二乗検定; 図1G）よりも有意に低かった。要するに、ミツバチの行動は自閉症児の糞便微生物叢に影響され、学習能力と記憶能力の低下を示した。
3.3 移植ミツバチは自閉症児とTD児の腸内細菌叢を部分的に再現できる
TD-CHILD、ASD-CHILD、T-BEE、A-BEEサンプルのメタゲノム配列決定とバイオインフォマティクス解析により、コロニー形成されたミツバチの腸内内容物のアルファ多様性は、子どもドナーのそれよりも低いことが明らかになった。とはいえ、ヒト化ミツバチの腸内内容物のα多様性における群間差は、対応するドナーのそれとほぼ一致していた（図3A,B）。種レベルでは、T-BEE群とA-BEE群のミツバチ腸内における存在量上位20種の割合は異なっていた。ドナーの糞便微生物叢にコロニー形成されたミツバチの腸内マイクロバイオームと、対応するドナーサンプルのマイクロバイオームでは、種の存在量に違いがあったが、最も存在量の多い上位20種の構成比はマイクロバイオーム間で類似していた（図3C,D）。また、β多様性解析の結果、T-BEEグループとA-BEEグループの間には違いが見られたが、グループ内では一貫性が見られた（図3E）。つまり、微生物叢を持たないハチがドナーの腸内微生物をコロニー形成することで、ドナーの腸内微生物の構造と組成をある程度再現することができる。細菌のコロニー形成を分析するため、門レベル分析を行った。自閉症児とTD児の間でバクテロイデーテスの相対的存在量に有意な一貫した差は見られなかった。一方、腸管内のファーミキューテス類の相対量はTD児よりも低かった（補足図S1B）。この違いを菌種レベルで解析した結果、ボルケーノプロットでは63の異なる菌株が認められたが、そのうちA-BEE群では30、T-BEE群では33の菌株が濃縮されていた（補足図S1A）。Bacteroidetesは門レベルでは有意な差は認められなかったが、種レベルでは、Bacteroides fragilis (B. fragilis)、Bacteroides intestinalis (B. intestinalis)、Bacteroides uniformis (B. uniformis)、Bacteroides dorei (B. dorei)など、T-BEE群では有意に濃縮されたが、A-BEE群では相対存在量が低い菌が多く見られた。さらに、Eubacterium eligens（E.eligens）、Faecalibacterium prausnitzii（F.prausnitzii）、Klebsiella aerogenes（K.aerogenes）、Lactobacillus gasseri（L.gasseri）、Lactobacillus paragasseri（L.paragasseri）の相対存在量は、A-BEE群のハチ腸よりも有意に高かった（図3F～N）。
図3
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図 3. ドナー糞便微生物叢によるミツバチのコロニー形成。(A,B)ミツバチの腸内細菌叢のα多様性をリッチネス指数として測定し、ショットガン・メタゲノミック・シーケンスから得られたシャノン指数から、A-BEE群とT-BEE群の間に有意差があることが明らかになった。図上部の短い線はドナーの糞便微生物叢のα多様性を示す。群間の差は、両側Mann-Whitney U検定を用いて決定した。(C）T-BEE群（TD-BEE 1およびTD-BEE 2）およびTD-CHILD群（TD-CHILD 1およびTD-CHILD 2）におけるミツバチ腸内細菌叢の存在量上位20種の割合。(D) A-BEE群（ASD-BEE 1-6）のミツバチ腸内細菌叢における存在量上位20種の割合とASD-CHILD群（ASD-CHILD 1-6）の種の存在量。(E) A-BEE群（ASD-BEE 1-6を含む）とT-BEE群（TD-BEE 1と2を含む）のミツバチ腸内細菌叢プロファイルから種レベルでの重み付けしていないUniFrac距離のPCoA。グループ間の差はPERMANOVAを用いて評価した。(F-N) A-BEE群とT-BEE群のミツバチの腸内の種の正規化存在量。群間の差は両側 Mann-Whitney U 検定を用いて決定した。
ASD-CHILDドナーの糞便微生物叢がミツバチの腸に及ぼす影響を評価するため、中腸、回腸、直腸を含む腸の長さを測定した。腸の長さには群間で有意差はなかった（補足図S1C,D）。回腸（補足図S1E）と中腸（補足図S1F）についてもヘマトキシリン・エオジン染色を行い、腸管構造の変化を確認したが、実験群間で腸管構造に有意な差は認められなかった。
3.4 自閉症児の糞便微生物叢は、遺伝子発現とalternative splicingを制御することで、ミツバチの脳機能に影響を与える。
ミツバチの行動は脳内遺伝子の発現と関連している（Whitfield et al. A-BEE および T-BEE グループに相関する遺伝子クラスターを関連付けるため、WGCNA を実施した。サンプル形質として、異なる腸内微生物を接種したミツバチを用いた。ミツバチの脳における遺伝子発現に基づき、WGCNAを用いて12のモジュール（ME）をクラスタリングした（図4A,B）。黒いモジュール遺伝子クラスター（MEblack）は、ASD-CHILDとTD-CHILDの異なる糞便微生物叢にコロニー形成されたミツバチと有意に相関していた（p < 0.001；図4B）。遺伝子のMEblackモジュールにおけるグループ間の差異を調べるために、ウィルコクソン順位和検定を行ったところ、MEblack遺伝子の発現はA-BEEグループとT-BEEグループで有意に異なっていた、すなわちA-BEEグループで発現が低下していた（p = 0.023；補足図S2）。これらの遺伝子は、セロトニン作動性シナプス、ドーパミン作動性シナプス、シナプス小胞サイクルなどのシナプスシグナル伝達経路や、トリプトファン代謝、ニコチン酸・ニコチン酸アミド代謝、グルタチオン代謝などのアミノ酸代謝経路で有意に濃縮されていた（図3C）。また、これらの差次的発現遺伝子を自閉症児の確立された脳関連遺伝子セットと比較した。MEblackモジュールの147遺伝子のうち、10遺伝子がSFARI遺伝子セットと交差することがわかった（図4D）。交差した遺伝子のうち、発現の差のある遺伝子はANKS1A（ankyrin repeat and SAM domain-containing protein 1A）、GRIP1（glutamate receptor-interacting protein 1）、ALDHs（aldehyde dehydrogenase, mitochondrial）であった、 POLR3A（DNA-directed RNA polymerase III subunit RPC1）、AADC（aromatic-L-amino-acid decarboxylase）は、脳の基礎発達、血液脳関門機能、物質代謝、神経シナプス機能と関連していた（図4E-I）； Wassenberg et al. , 2017；Hartingら、2020；Tanら、2020；Ryuら、2021）。
図4
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図4. ASDドナーの糞便微生物叢はミツバチの脳における学習・記憶関連遺伝子の発現に影響を及ぼす。(A,B) WGCNAにより、異なるミツバチグループ（A-BEEグループとT-BEEグループ）と相関する12の遺伝子モジュール（ME）が明らかになった。色の付いた名前はWGCNAパイプラインによって割り当てられた遺伝子モジュールを表す。ヒートマップの色は正/負のスピアマン相関係数を示す。相関係数は上に、p値は下の四角内の括弧内に示されている。(C) MEblack遺伝子のKEGG濃縮パスウェイ（Fisher exact検定）。(D) MEblackモジュール遺伝子のベン図とSPARKおよびSFARI遺伝子データセットとの重複。(E-I) A-BEEおよびT-BEEミツバチの脳における遺伝子の正規化数。グループ間の差は対応のない t 検定を用いて評価した。ANKS1A: ankyrin repeat and SAM domain-containing protein 1A; GRIP1: glutamate receptor-interacting protein 1; ALDH: aldehyde dehydrogenase, mitochondrial; POLR3A： DNA-directed RNA polymerase III subunit RPC1、AADC: aromatic-L-amino-acid decarboxylase。
さらに、ハチの脳の遺伝子のASは、糞便微生物とも相関していた。ミツバチの脳（MEblack）で差次的に発現した遺伝子のKEGG機能濃縮解析から、スプライソソーム経路の関与が示唆された（図4C）。そこで、ASD-CHILDおよびTD-CHILDドナーの糞便微生物でコロニー形成されたミツバチの脳における異なるAS事象を解析した。脳関連遺伝子の異なるネイティブスプライシングイベントのrMATS解析によると、44,705イベントが検出され、異なるASタイプの中でSEが最も多かった。各ASタイプの約20％を占めるイベントは、A-BEEグループ間で有意に異なる包含率を示し、複数の排他的例外が有意なイベントの最も高い割合を示した（図5A,B）。合計で1,486の遺伝子が差次的ASイベントに関与しており、そのうち181がSFARI遺伝子セットと、37がSPARK遺伝子セットと交差していた（合計182遺伝子）。興味深いことに、同定された相同遺伝子のほとんどすべてが、ASDと高い信頼性で関連するSFARI遺伝子セットに属していた（図5C）。スプライシングされた遺伝子の濃縮解析の結果、A-BEE群とT-BEE群の脳で制御されているKEGG経路には、グルタミン酸作動性シナプス、セロトニン作動性シナプス、GABA作動性シナプス、ドーパミン作動性経路が濃縮されていた（図5D）。また、濃縮解析の結果、5-HT1（セロトニン受容体）、AC3（アデニル酸シクラーゼ3）、GRD（GABAゲートイオンチャネル）などのいくつかの遺伝子は、神経シナプスに関連する複数の経路に関与しており、これらの遺伝子はA-BEE群とT-BEE群で発現が異なっていた。さらに、1つの遺伝子で異なるAS事象が起こる可能性があり、異なる封入率を示した（図5E）。このように、ASD-CHILDドナーの糞便微生物叢は、ミツバチの脳内で差のある遺伝子発現を誘導すると同時にASを誘導し、それによってミツバチの社会的行動に必須であり、ASDとも関連する遺伝子に影響を与える可能性がある。
図5
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図5. 自閉症児の糞便微生物叢はミツバチの脳のASに影響する。(A) T-BEEグループと比較したA-BEEグループのミツバチの脳における差分ASイベントの数。(B)異なるタイプのAS事象の相対的な存在量を示す積み重ね列グラフ。A3SS：代替3′スプライス部位；A5SS：代替5′スプライス部位；MXE：相互排他的エクソン；RI：保持されたイントロン；SE：スキップされたエクソン。(C) A-BEEグループとT-BEEグループのミツバチの脳内で異なるスプライシングを受けた遺伝子（gnotobiotic bee spliced genes; FDR <0.05）のベン図と、SPARKおよびSFARI遺伝子データセットとのオーバーラップ。(D) スプライス遺伝子の差に基づき、A-BEE群のミツバチの脳で制御されているKEGGパスウェイ（フィッシャー・ エクストレート検定）。(E) SPARKとSFARIの両遺伝子セットに存在する5-HT1、AC3、GRD遺伝子の差次的スプライシングイベント。5-HT1：セロトニン受容体、AC3：アデニル酸シクラーゼ3、GRD：GABAゲートイオンチャネル。
3.5 自閉症児の糞便微生物叢がミツバチの腸内代謝物に影響を与える
ノンターゲットメタボロミクスとガスクロマトグラフィー/質量分析を用いてミツバチの腸内内容物を分析した。A-BEEグループとT-BEEグループのミツバチの代謝プロファイルは、正極性モードと負極性モードの両方で有意に異なっていた（図6A,D）。グループ間の差分代謝産物を決定するため、DESeq2 を使用して、負極性モードと正極性モードの検出で得られたデータの差分分析を行った。次に、T-BEE群とA-BEE群で異なるアップレギュレートおよびダウンレギュレートされた代謝物のKEGG濃縮解析によると（図6B,C,E,F）、A-BEE群でアップレギュレートおよびダウンレギュレートされた経路には、トリプトファン、タウリン、および胆汁酸代謝経路が含まれていたため、これらの代謝経路に関与する変化物質を探索した。両側Mann-Whitney U検定を用いて、これらの経路に含まれる物質に関する群間差を決定した（図6G）。差異のある代謝産物は、主にトリプトファン代謝経路に関与していた。食餌トリプトファンは、腸内微生物によって、3-インドールアクリル酸（IA）やインドール-3-ピルビン酸（IPA）などの様々なインドール誘導体に分解され、これらは腸内の恒常性の重要な構成要素の1つである（Agus et al.、2018）。さらに、トリプトファンは宿主によって、認知能力に関連する物質であるセロトニンとメラトニンに分解される。また、トリプトファンは宿主の酵素を介するキヌレニン経路によっても代謝される。キヌレニンとキヌレン酸の産生に影響を与える可能性がある。T-BEE群と比較して、A-BEE群のメラトニンとセロトニンはセロトニン代謝経路で有意にダウンレギュレートされ、IAとIPAもインドール経路でダウンレギュレートされ、L-キヌレニンはキヌレニン経路で濃縮された。さらに、L-キヌレニン/L-トリプトファン比はA-BEE群でT-BEE群より有意に高かった（p < 0.05）。結論として、ミツバチの腸内常在細菌叢はトリプトファンの代謝に関与しており、おそらくトリプトファンからインドール誘導体、セロトニン、キヌレニンへの変換を制御していると考えられた。
図6
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図6. ミツバチに自閉症児の糞便微生物叢をコロニー形成させると、腸内代謝に影響を与える。(A) ミツバチの腸内で正極性モードで検出されたすべての代謝物に基づく疎部分最小二乗判別分析。サンプルプロットは95%信頼区間でクラスタ化した。(B,C)制御された代謝産物の差に基づき、T-BEE群と比較したA-BEE群のミツバチの血リンパにおいて、制御されたKEGG濃縮パスウェイと制御されたアップレギュレーション。(D) ミツバチの腸内で陰性極性モードで検出されたすべての代謝物に基づく疎部分最小二乗判別分析。サンプルプロットは 95% 信頼区間でクラスタ化した。(E,F)調節された代謝物の差に基づき、T-BEE群と比較したA-BEE群のミツバチの血リンパにおいて、KEGG濃縮パスウェイがダウンレギュレートおよびアップレギュレートされた（Fisher exact検定）。(G) キヌレニン、セロトニン、インドール経路を介したトリプトファン代謝。緑矢印：この過程における腸内細菌の関与。黒矢印：主に宿主が介在する過程。箱ひげ図は、A-BEE群とT-BEE群間の3経路における差分代謝物の差を示す。群間差は両側Mann-Whitney U検定を用いて検定した。(H）タウリン合成経路および胆汁酸代謝経路を介したタウリンの形成に関与する代謝物。箱ひげ図は、A-BEE群とT-BEE群間の2つの経路における差分代謝物の差を示す。群間差は両側Mann-Whitney U検定を用いて評価した。
ミツバチの腸内細菌叢は、神経系機能に関与する代謝産物であるタウリンの代謝経路も制御していた。タウリンはタウリン合成経路または胆汁酸代謝経路から生成される。L-システインとL-システインスルフィン酸はともに、タウリン合成経路におけるタウリンの前駆体である。L-システインレベルは群間で差がなかったが、L-システインスルフィン酸はA-BEE群で発現が上昇した（図6H）。微生物が関与する胆汁酸代謝経路も分析したところ、タウロコール酸はT-BEE群で有意に濃縮されていた。タウロコール酸は微生物と宿主の共同仲介でタウリンに加水分解される。このことは、A-BEE群のミツバチがT-BEE群のミツバチよりも腸内でタウリン合成のための前駆体を多く持っていたにもかかわらず、タウリンを多く持っていなかった理由、すなわち、T-BEE群のミツバチの腸管でA-BEE群のミツバチの腸管よりも胆汁酸代謝経路を介してより多くのタウリンが生産されていたことを一部説明する。
3.6 ミツバチ腸内細菌および腸内代謝産物の差異とミツバチ脳内発現遺伝子の差異の関連性解析
TD-CHILDの糞便微生物叢でコロニー形成されたミツバチと比較して、ASD-CHILDドナーの糞便微生物叢でコロニー形成されたミツバチは、異なる微生物叢構造と腸内メタボロミクスを示すだけでなく、異なる脳関連遺伝子発現と認知能力の低下を示した。これらのグループ間の関係を探るため、ピアソンの相関を用いた関連解析を行った。まず、メタゲノミクスとメタボロミクスのデータを用いた関連解析を行い、異なる菌株と目的のパスウェイに関与する物質の関連解析を行うことで、相関解析サーモグラムをプロットした（補足図S3A）。続いて、メタボロミクスとトランスクリプトミクスのデータを用いた関連解析を行い、目的のパスウェイに関与する物質とMEblackモジュールの遺伝子との関連解析による相関解析ヒートマップをプロットした（補足図S3B）。その結果、A-BEE群の欠損株の中には、腸内細菌が関与するトリプトファン-インドール代謝経路や胆汁酸加水分解経路の代謝物と有意に正の相関を示す株があり、これらの代謝物はMEblackモジュールの一部の遺伝子と有意に正の相関を示した（｜r｜＞0.7、図7）。興味深いことに、同定された菌株のほとんどは、E. eligens、L. gasseri、B. fragilis、B. doreiなどの堅果門とバクテロイデーテス門に属していた。機能的アノテーションにより、シナプス機能に関連する遺伝子が検出された。例えば、E. eligensとB. fragilisはともに3-IAと正の相関を示し、この代謝物はLOC100578939（single Ig IL-1-related receptor, SIGIRR）を含むシナプス機能を制御する遺伝子の発現とも正の相関を示した。さらに、B. doreiはBacteroidetes門に属し、タウリン経路のタウロデオキシコール酸やタウリンと関連していた。これらの代謝産物は、ハチの脳におけるアミノ酸代謝の制御に関与する LOC412890 (A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 3, ADAMTS3) と強く関連していた。
図7
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図 7. ミツバチの腸内細菌叢は代謝産物を通してミツバチの脳に影響を与える。Cytoscapeを用いて描いたマクロゲノム、トランスクリプトーム、メタボロームのネットワーク図。青と赤のエッジはそれぞれ正と負の相関を示し、エッジの幅は相関の強さを表す。緑、紫、青の異なる色合いで示されたノードは、それぞれ異なる系統、異なる代謝経路の代謝物、異なる経路に関与する遺伝子を表す。群間差はスピアマン順位検定を用いて求めた。
4 考察
いくつかの研究により、多くの神経精神疾患が腸内微小生態学と密接に関連していることが確認されている（Petra et al.、2015；Quigley、2017；Generoso et al.、2021）。自閉症の子どもは主に精神神経症状を示し、消化管機能障害と免疫不均衡がこれらの研究で広くみられることから、マイクロバイオームがASDに関与していることが示唆されている（Adamsら、2011；Laiら、2014；Petraら、2015；Madraら、2020）。TD対照群と比較した自閉症児のマイクロバイオームとメタボロームについて、数多くの研究が調査されている（Corettiら、2018；Kangら、2018；Jonesら、2022）。さらに、動物実験では、自閉症の子どもの糞便微生物叢を投与すると、ASDの中核的行動特性に関連するマウスの行動が促進されることが確認されている（Sharon et al.） 本研究では、ミツバチを初めてモデルとして用い、宿主の病態生理と行動に対する自閉症の子どもの糞便微生物叢の影響を調べた。その結果、ASD-CHILDとTD-CHILDの糞便微生物叢がそれぞれコロニー形成されたT-BEE群のミツバチと比較して、A-BEE群のミツバチでは認知能力が低下していることがわかった。特筆すべきことに、我々の知見は、腸内細菌叢とASDの因果関係を立証することなく、自閉症児の腸内細菌叢の変化が宿主の神経系と認知行動に影響を及ぼす可能性があることを示している。
腸内細菌叢は、腸と脳のコミュニケーションにおける重要な因子のひとつである。メタゲノム解析を通じて、ミツバチで観察された行動の違いに寄与する可能性のある細菌候補を特定したい。例えば、B. fragilis、B. intestinalis、B. uniformis、E. eligens、F. prausnitzii、Klebsiella aerogenes、L. gasseri、L. paragasseri、B. doreiなどである。中国のコホート研究では、自閉症児のB. fragilisの存在量はTD児よりも低く、トリプトファン代謝経路のダウンレギュレーションを伴っていた（Zouら、2020年）。さらに、ヒト常在菌であるB. fragilisをASDマウスに経口投与することで、自閉症に関連する腸内生理が調節され、行動異常が改善されることが示唆された（Hsiao et al.） B.ユニフォーミスは、食物中毒ラットの脳の報酬反応に影響を与え、その不安を軽減することがわかった（Agustí et al.） 興味深いことに、2つの無作為化対照二重盲検プラセボ試験で、L. gasseriの補給が慢性ストレスを緩和することが判明し、この知見は複数の動物実験で検証されている（Kangら、2010；Kimら、2018；Nishidaら、2019）。B. intestinalis、E. eligens、F. prausnitzii、B. doreiを含む細菌は、宿主免疫機能の制御に関与し、宿主免疫バランスの維持に重要な役割を果たしている（Chungら、2017；Lopez-Silesら、2017；de Filippisら、2021；Pereiraら、2021；Yasumaら、2021）。興味深いことに、松果体／消化管メラトニンに感受性のあるヒト腸内共生生物として初めて記録されたK. aerogenesは、T-BEE群で濃縮されていた。この種は、メラトニンの分泌を感知し、同時に概日リズムを発現することができるため、腸内微生物叢の生物時計と考えられている（Paulose et al.） これらの結果は、ASD-CHILDドナーの腸内マイクロバイオームによってコロニー形成されたミツバチで観察された行動の変化を部分的に説明するものである。これらの腸内細菌の差と宿主の行動変化との間の決定的な因果関係は立証できないが、実験的証拠から、これらの腸内細菌はASDと腸内細菌叢の相関に関する潜在的な研究価値があることが示唆される。
腸内細菌叢は様々な手段を通じて遺伝子発現や宿主の行動に影響を与えるが、中でも腸内代謝の調節により、腸内細菌叢は宿主の中枢神経系に調節シグナルを送ることができる（Rogersら、2016；Moraisら、2021）。我々は、ASD-CHILDドナーの腸内細菌叢が、トリプトファンおよびタウリン代謝経路を含む複数の経路を通じて、ミツバチの腸内代謝に影響を与えていることを見出した。タウリンは脳の発達に必須である（Benrabhら、1995；Kilb and Fukuda、2017；Oja and Saransaari、2022）。T-BEE群のミツバチの腸内では、A-BEE群のミツバチの腸内よりもタウリン濃度が高いことがわかった。また、T-BEE 群のミツバチの腸内ではタウロコール酸レベルが上昇しており、これは腸内微生物によってさらに加水分解されてタウリンになることがわかった。タウリン代謝経路をアップレギュレートするローヤルゼリーの補給は、老化したミツバチの認知機能低下を改善する可能性を示している (Chen et al., 2017)。さらに、タウリンの補給によるハチの脳感受性の調節は、哺育行動と採餌行動を強化・定着させる可能性がある (Han et al., 2017)。興味深いことに、ある研究では、ASDの糞便微生物叢でコロニー形成されたマウスも、タウリン代謝経路に違いを示すことが、マウス自閉症モデルの研究によって観察された（Golubeva et al.） T-BEE群とA-BEE群間の差分代謝産物は、トリプトファン代謝経路においてより濃縮されていた。T-BEE群のミツバチと比較して、A-BEE群のミツバチの腸内ではL-キヌレニン濃度が高く、メラトニンとインドール経路関連物質の濃度は低下していた。キヌレニン経路の代謝異常は神経系疾患と密接な関係がある（Zhangら、2020；Chenら、2021；Mithaiwalaら、2021）。キヌレニン経路のアップレギュレーションは、ラットにおいて顕著な自閉症様行動、反復的な定型行動、学習・記憶能力の低下、絶望的な気分を引き起こす（Kongら、2022）。免疫調節剤、抗酸化剤、神経保護剤として、メラトニンは脳の炎症や神経変性疾患と逆の関係にある。さらに、いくつかの研究でメラトニンとASDの関係が見つかっている（Hardelandら、2006；Tordjmanら、2017；Hardeland、2019；Cardinali、2021）。メラトニンは、神経原性神経幹細胞の神経新生と可塑性、および胎児の脳の発達に関与している（Jinら、2018；Lordら、2018；Wuら、2020）。中枢神経系に関するfMRI研究では、メラトニンが睡眠様変化を誘導し、それが海馬の言語・記憶処理機能に影響を与え、記憶を改善することがわかった（Gorfineら、2007年）。ミツバチに関する研究では、メラトニンが様々な年齢層のミツバチの社会的行動に大きく影響し、分業の調整に関与していることが判明した（Yang et al., 2007）。さらに、メラトニンはハチの抗酸化能力を高め、集蜜活動中の働き蜂を農薬の影響から守ることが報告された (Li et al., 2022)。本研究では、IA が AhR リガンドを持つインドール経路において、A-BEE 群よりも T-BEE 群の方がより多くの IA および IPA を産生した。我々の以前の研究では、AhRリガンドのレベルが高いほどミツバチの学習・記憶能力が向上するが、AhRを阻害するとこれらの能力が損なわれることを発見した（Zhang et al.） 全体として、腸内細菌叢はより複雑で多面的なメカニズムを含む複数の代謝経路を通じて脳機能に影響を与える。
ミツバチの行動は脳内の遺伝子発現と密接に関連しており、ミツバチとヒトの社会的反応の根底にある相同な分子メカニズムは十分に立証されている（Shpiglerら、2017；Zhangら、2022b）。T-BEEグループと比較して、A-BEEグループのミツバチの脳で発現が低下している遺伝子群が見つかった。例えば、受容体相互作用、トリプトファン代謝、セロトニン作動性およびドーパミン作動性のシナプス経路に関与する遺伝子群で、これらは重要な脳機能に関連している。シナプス可塑性は、高次脳機能の重要なメカニズムであり、シナプス可塑性の一形態は、AMPARの存在量と特性の制御に関連している。遺伝子LOC408965はGRIP1をコードしている。GRIP1は、AMPAR（α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソキサゾールプロピオン酸受容体）結合タンパク質で、AMPARのトラフィックとシナプス標的化の制御に関与している。AMPARレベルはシナプスの興奮強度を決定し、これは学習・記憶機能の維持に必要である（Trotman et al.） これまでの研究で、脳コード遺伝子の発現が低下したマウスは、記憶能力の低下を含むいくつかの神経症を発症することが判明している（Wang G. et al.） さらに、自閉症患者の研究では、脳内のGRIP1をコードする遺伝子がダウンレギュレートされ、神経症状と関連していることが示されている（Åhsgrenら、2005；Mejiasら、2011；Choudhuryら、2012）。注目すべきは、ASD関連遺伝子の発現レベルだけでなく、ミツバチの脳におけるASも破壊されていることで、これまでの研究結果（Changら、2022；Zhangら、2022a,b）と一致している。AS遺伝子はSFARI遺伝子のデータセットと重複していることが判明した。SFARI遺伝子はヒトの自閉症と関連しており、ハチでは社会的反応が乱れている（図6）。A-BEEグループのミツバチの脳では、SPARKとSFARI遺伝子データセットの両方に存在するAS遺伝子が、マウス自閉症モデル研究（Sharon et al.） これに対応して、このデータセットと重複する発現差のあるAS遺伝子のKEGG濃縮解析では、グルタミン酸作動性シナプス、セロトニックシナプス、GABA作動性シナプス、ドーパミン作動性経路のほか、シナプス機能に関連し神経系機能に広く関与する神経活性リガンド-受容体相互作用、味覚伝達、概日リズム経路で遺伝子が有意に濃縮されていることが明らかになった（Chattopadhyaya, 2011； Frenguelli、2022）。濃縮経路の遺伝子は異なる封入率を示したが、例えば、高次脳機能と行動に関与することが知られているセロトニン受容体をコードする5-HT1（Lucki, 1991; Kosari-Nasab et al.） 以前の研究では、5-HT1Bノックアウトマウスは野生型マウスよりも攻撃的で反応性が高く、5-HT1Aノックアウトマウスは野生型マウスよりも不安を示した（Zhuangら、1999）。5-HT1Aアゴニストである8-ヒドロキシ-2-（ジ-n-プロピルアミノ）テトラリンは、バルプロ酸に曝露されたマウスの子孫の自閉症関連行動を改善する（Wuら、2018年）。これらの知見を総合すると、FMTとミツバチの脳における遺伝子発現の変化との関連性が示唆され、自閉症児の糞便微生物叢をコロニー形成したミツバチで観察される学習・記憶能力の低下を説明できる可能性がある。
腸内代謝産物は、腸内細菌叢と中枢神経系との橋渡し役を果たしている（Masseyら、2023；Wang T. et al.） そこで我々は、代謝産物、腸内細菌、脳遺伝子発現の関係を探ろうとした。その結果、トリプトファンとタウリンの代謝経路にある物質が複数の細菌種と関連し、複数の脳遺伝子の発現に関係していることがわかった（｜r｜＞0.7、p＜0.05）。そして、これらの細菌は主にバクテロイデーテス（Bacteroidetes）とファーミキューテス（Firmicutes）に属している。興味深いことに、ある研究では、BTBRマウスの腸は細菌を介した胆汁変換とセロトニン産生に障害を示し、門レベルではバクテロイデーテス門とファーミキューテス門の存在量に変化を示すことも判明した（Golubeva et al.） E. eligens、L. paragasseri、L. gasseriを含むファーミキューテス門に属する細菌と、B. dorei、B. fragilisを含むバクテロイデス門に属する細菌は、A-BEE群の相対存在量が減少し、これらの細菌はトリプトファン経路のいくつかの主要代謝産物と正の相関を示した。我々は、E. eligensとB. fragilisの両方が3-IAと正の相関があることを発見した。3-IAと正の相関を示したSIGIRRなどのハチ脳遺伝子は、シナプス機能に関与している。これらの結果から、E. eligensとB. fragilisはトリプトファン-インドール代謝経路の制御を介して宿主の脳機能に影響を与えることが推測された。また、バクテロイデーテスに属するB. doreiは、タウリン経路においてタウロデオキシコール酸やタウリンと関連していることがわかった。これらの知見は厳密な科学的分析を受けているが、因果関係を立証するというよりは、腸内細菌が宿主に与える潜在的な影響を反映しているに過ぎない。これらの複数のオミックス関連性の根底にある分子メカニズムを解明するためには、さらなる調査が必要である。
ヒトの腸内細菌叢の組成と生理的機能は非常に複雑であり、動物モデルでの再現には困難が伴う。さらに、ASDは主に社会的障害を特徴とする神経発達障害であるため、動物モデルの研究はさらに複雑になっている。本研究は、ASDとマイクロバイオーム構造、腸内代謝、脳発現、認知行動との相互作用を調べるモデルとして、自閉症児の腸内微生物をコロニー形成させたミツバチを利用した先駆的な取り組みである。この研究はASDの微生物叢研究に貴重な洞察をもたらす革新的なプロジェクトであるが、一定の限界もある。前述したように、ミツバチは社会的動物であり、他の既存のモデルと比較してユニークな視点を提供している。しかし、最近開発された実験モデルであるため、ミツバチには一定の限界がある。第一に、ミツバチを実験モデルとして用いた世界的な研究は珍しいため、これらのミツバチモデルに関する知識は乏しく、文献の数も比較調査の数も限られている。第二に、ミツバチとヒトの脳ゲノムは遺伝的にかなり類似しており、数多くの遺伝子が共有されているにもかかわらず、ミツバチのような昆虫と無菌マウスやラットのような哺乳類との進化的距離は依然として相当なものである。第三に、実験に使われたミツバチは働きバチである。働きバチはすべてメスであり、ヒトの病気、特に性差のある病気を研究する上でバイアスがかかる可能性がある。さらに、ミツバチの体が小さいということは、腸の長さが短く、腸の容量が小さいことを意味する。その結果、ミツバチの腸はヒトのような厳密な嫌気性環境が得られず、厳密な嫌気性菌の増殖には不利な環境となる。そのため、大腸菌のような通性嫌気性菌は、ハチの腸内コロニー形成において有利に働く可能性がある。他の昆虫と同様 (Johnson and Barbehenn, 2000)、ハチの腸内における酸素含有量は異なる。我々の研究では、腸内細菌叢分析のためにハチの腸全体のみを採取した。こうした生理学的特性は、FMT を実施したハチの大腸菌レベルが、予想以上に多種多様な細菌種を含ん でいるにもかかわらず、予想以上に高かった理由を説明できるかもしれない。さらに、ハチの食習慣にはヒトとの違いがあり、ミツバチの腸内におけるヒト腸内細菌叢のコロニー形成に影響する可能性がある。しかし、種が異なれば食習慣も異なり、マウスやラットといった広く使われている古典的な動物モデルであれ、ヒトに近い他の動物モデルであれ、ヒトと比べた食習慣の違いには程度の差がある。これは動物モデル研究が直面する共通の問題であり、我々の研究の限界のひとつでもある。ミツバチはヒトの腸内細菌叢を研究するモデルとしての可能性を持っているが、ミツバチ独自の特性により、ヒトの腸内細菌叢で起こるすべてのプロセスを完全に反映しているとは限らない。加えて、本研究ではASD児と健常児の糞便サンプルを用いたが、健常児はハチ本来の微生物叢を持っていないため、ハチの腸に組織損傷のリスクがある。腸の長さはミツバチ集団の腸の炎症を反映する重要な指標となる (Chang et al., 2022)。そのため、我々の研究では、腸の損傷がハチモデルの行動研究に及ぼす影響を最小限に抑えるため、腸の組織構造と長さの両方の影響を考慮した。注目すべきことに、自閉症児の糞便微生物叢をコロニー形成したミツバチと、TD児の糞便微生物叢をコロニー形成したミツバチの間で、腸の構造と長さに有意差は見られなかったことから、ミツバチの腸内ではヒトの糞便微生物叢に対して一定レベルの耐性があることが示唆された。我々の研究では、参加者全員が事前に定義された包含・除外基準に基づいて綿密なスクリーニングを受け、ある程度の代表性を確保したが、糞便ドナーの数が少ないことが研究の限界である。そのため、糞便微生物叢の包括的な比較分析は、子どもやミツバチでは実施されず、客観的な発表にとどまった。さらに、ASD患者の大半は男性であると報告している研究もある（Wang J. et al., 2022; Tofani et al., 2023）。実験蜜蜂の性別特性を考慮し、本研究では性別を考慮しなかったため、本研究に含まれるASD対象者は、ASDにおける既知の男女比を反映していない。また、消化器症状を伴わない患者もまだ存在する。したがって、本研究で対象とした自閉症患者には消化器症状がみられたが、これらはASD患者全体を代表するものではないかもしれない。食事状態は腸内細菌叢に影響を与える重要な因子であり、それを評価する指標として食事嗜好や食事摂取量など多くのものがある（Seo and Je, 2018）。本研究では、食事嗜好の影響は除外したが、食事摂取量は定量化しなかった。食事摂取量の調査は、食事摂取量が研究に与える影響を総合的に評価することができる。本研究では、登録児童の食事摂取量の定量調査は行わず、間接的な評価指標としてBMIを用いた。BMIは食事摂取量を間接的に反映することができるが（Descarpentrieら、2023；Yoongら、2023）、食事摂取量を含めていないことは本研究における限界の1つである。とはいえ、われわれの知見は、自閉症児の腸内細菌叢が宿主の脳機能と行動にある程度影響を与えうるという仮説を支持するものである。さらに、ASDにおける微生物叢-腸-脳の相互作用を研究するための新たなモデルとして、ミツバチを支持する補足的証拠を提示する。我々の研究チームは、より大規模な調査を実施し、メカニズム解明のために興味深い発見をさらに掘り下げていくつもりである。
結論として、この先駆的研究は、ヒトの腸内細菌叢研究のモデルとしてミツバチを探索し、腸内細菌叢とASDの関係について衝撃的な洞察を明らかにした。我々の発見は、自閉症に関連する微生物叢がミツバチの認知と代謝に与える影響を強調するものであり、ヒトのASD遺伝子セットとの有意な重複を浮き彫りにした。したがって、ASDにおける微生物叢-腸-脳軸のメカニズムのさらなる詳細な探求が必要である。
データ利用声明
本研究で発表されたデータセットは、オンラインリポジトリで見ることができる。リポジトリ名とアクセッション番号は論文/補足資料に記載されている。
著者貢献
YL：方法論、視覚化、執筆-原案、執筆-校閲・編集。YZ： データキュレーション、検証、可視化、執筆-校閲・編集。XL：データキュレーション、調査、執筆-校閲・編集。YM：ソフトウェア、執筆-校閲・編集、方法論。ZZ: 方法論、執筆-校閲・編集、検証。HZ：概念化、プロジェクト管理、監督、執筆-校閲・編集。YY: 構想立案、資金獲得、リソース、執筆-校閲・編集。
資金提供
著者は、本論文の研究、執筆、および／または出版に関して、いかなる金銭的支援も受けていないことを表明する。
謝辞
本研究に参加したすべての子どもと家族の協力に感謝する。
利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈されるような商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。
発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。
補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1278162/full#supplementary-material。
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キーワード セイヨウミツバチ 、自閉症、ヒト糞便微生物叢、認知障害、微生物叢-腸-脳軸
引用 LiY、Zhang Y、Luo X、Meng Y、Zhong Z、Zheng H、Yang Y（2023）自閉症児の糞便微生物叢は、ミツバチの腸内代謝と学習・記憶能力に影響を与える。Front. Microbiol. 14:1278162.
受理された： 15 August 2023; Accepted： 2023年10月16日；
発行：2023年11月23日
編集者
リカルド・アラウージョ、ポルト大学、ポルトガル
査読者
ジェラルド・モロニー（アイルランド、コーク大学
アウレリウス・ブロカス、ヴィリニュス大学（リトアニア
シルヴィア・レオンチーニ、セネーゼ大学、イタリア
Copyright © 2023 Li, Zhang, Luo, Meng, Zhong, Zheng and Yang. これはクリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文です。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。
*通信： Yunsheng Yang, sunnyddc@plagh.org; Hao Zheng, hao.zheng@cau.edu.cn
免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、あくまで著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のあるいかなる主張も、出版社によって保証または支持されるものではありません。
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