重症肺炎後の神経障害は、肺から脳への内因性細菌の移行と関連している

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重症肺炎後の神経障害は、肺から脳への内因性細菌の移行と関連している

https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.adi0699

QINGLE MA HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-2483-8540, CHENLU YAO, [...], AND CHAO WANG HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-8054-3472 +10著者著者情報&所属
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2023年10月18日
9巻 42号
DOI: 10.1126/sciadv.adi0699
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要旨
重症急性肺炎から回復した患者には、神経障害がよくみられる。しかし、その根底にあるメカニズムはまだ十分に解明されていない。ここでは、重症急性肺炎後の神経学的症候の一部は、肺炎中に肺から脳へ内因性細菌が移行することに起因することを示す。主成分分析を用いたところ、脳の細菌叢と肺の細菌叢の間に類似性が認められ、脳で検出された細菌は肺に由来する可能性があることが示された。また、肺-血液関門と脳-血液関門の両方が障害され、肺炎の際に内因性の肺細菌が脳に侵入することが観察された。細菌感染に関連した経路を介したミクログリアとアストロサイトの活性化シグネチャーの上昇が観察され、細菌による脳のホメオスタシスの崩壊が示唆された。以上より、我々は、脳のホメオスタシスを変化させる役割を果たす内因性肺細菌を同定し、重症肺炎後の神経学的症候のメカニズムに関する知見を得た。
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はじめに
急性肺炎は、そのほとんどが感染性病原体（細菌、ウイルス、真菌など）によって引き起こされ、肺の炎症状態を引き起こす。急性肺炎はここ数年、主要な死因の一つとなっている。急性肺炎に関連した呼吸不全に加えて、重症急性肺炎後の神経障害は、患者のQOLを低下させる一般的な合併症である。ごく最近の例では、「長いコロナウイルス病（long-COVID）」で起こる「脳霧」がある(1, 2)。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2型（SARS-CoV-2）に感染した人の中には、脳の構造の変化に伴う集中力の問題やその他の認知症状で数週間から数ヶ月苦労する人もいる(3)。重症肺炎後の神経症状は、多くの呼吸器疾患の回復した患者に存在する(4, 5)。ある研究では、コロナウイルス疾患2019（COVID-19）、インフルエンザ、細菌性肺炎の後に、ほとんどの神経学的症状の頻度に差がないことが示され(6)、すべての急性肺炎誘発神経障害に関与する一般的なメカニズムの可能性が示された。重症急性肺炎後の神経症候群に罹患したほとんどの患者や実験モデルでは、脳内でアストロサイトやミクログリアの活動が亢進し、軸索の損傷やβアミロイド（Aβ）の形成を伴って観察される(7, 8)。神経炎症におけるアストロサイトとミクログリアの主要な役割を考えると、脳における有害な免疫反応が重症肺炎後の神経症状の一因であることを示唆する証拠が増えつつある(7)。しかし、脳の変化が肺からの直接的な炎症反応によって誘発されるのか、肺炎のバイスタンダー効果によるものなのかについては、まだ議論の余地がある。急性肺炎と脳活動の関係は解明されていない。
肺-脳軸における双方向の相互作用が報告されている(9)。中枢神経系(CNS)は他のシステムと広範囲に連絡を取り合っている。研究によると、脳と肺は神経解剖学的経路、内分泌経路、免疫経路など、さまざまな方法でコミュニケーションをとっている(10)。通常、肺は微生物叢を含む臓器である(11)。肺の微生物群集は約140の異なるファミリーで構成されているが、健康な個体におけるその機能のほとんどはまだ解明されていない(11)。一方、脳は血液脳関門（BBB）により脳組織への細菌の侵入を防ぐことができるため、通常の状態では無菌環境［あるいは微生物がはるかに少ない環境(12)］と考えられている(13)。
本研究では、重症急性肺炎後の神経障害が、肺から脳への内因性細菌の移行と関連していることを偶然発見した。リポ多糖（LPS）誘発実験的重症肺炎モデルマウスにおいて、我々は脳組織における細菌の出現を検出した。脳の細菌叢は肺の細菌叢と類似しており、肺炎の際に脳内の細菌が肺から来た可能性が示唆された。また、急性肺炎時に肺血液関門とBBBが同時に障害されることが観察され、急性肺炎時に肺の細菌が脳に侵入する仕組みが説明できるかもしれない。脳組織内に細菌が存在すると、特にアストロサイトとミクログリアにおいて、脳の恒常性が破壊される。
血小板由来の細胞外小胞（PEV）は、炎症細胞を標的とした薬物送達のための一般的なプラットフォームとして機能する可能性があり、これは我々のグループによって以前の研究で実証されている（14-17）。ラパマイシンをPEV（ラパマイシン-PEV）に担持させることで、ラパマイシン-PEVの経鼻投与が、重症急性肺炎によるアストロサイトとミクログリアの機能障害を救済し、感染後の神経障害を効果的に緩和することを示した。我々の研究により、重症急性肺炎後の神経学的症候のメカニズムが明らかになった。このメカニズムの一因は、肺炎の際に内因性細菌が肺から脳へ移行することにある。
結果
重症急性肺炎は脳の神経学的障害を引き起こす
外因性病原体との干渉を避けるため、LPS誘発急性肺炎をマウスの神経障害を研究するために確立した（図1A）。気管内LPSチャレンジ（4 mg kg-1）後、マウスは一瞬体重が減少したが、すぐに回復した。投与マウスの体重は、LPSチャレンジ後30日目には無処置マウスと同程度であった（図1B）。血中酸素飽和度や肺内のインターロイキン-1β（IL-1β）、IL-6、腫瘍壊死因子（TNF）などのサイトカインレベルはいずれも徐々に回復し、30日後には無処置マウスと差はなかった（図1、C～F）。このことは、処置マウスの肺の機能は、正常な条件下でLPS誘発肺炎から回復できることを示している。これらのマウスが神経障害に罹患しているかどうかを調べるため、肺炎から回復したマウスの行動を試験した。オープンフィールド実験では、回復したマウスは未処置マウスに比べ、隅にうずくまって動かなくなり、全活動経路、中心活動経路、中心活動時間が減少し、不安様行動も見られた（図1、G～K）。新物体認識実験では、肺炎から回復したマウスでは、新物体に対する弁別指数と選好指数が有意に低下し、認知能力と短期記憶が損なわれていることが示された（図1、L～N）。モリス水迷路実験では、肺炎が回復したマウスはステーションに到達するまでの時間が非常に長くなり（図1、OおよびP）、空間記憶能力の低下を示した。さらに、LPS投与60日後のマウスでも同様の行動異常が観察され、行動や運動機能に長期的な影響があることが示された（図S1）。さらに、回復したマウスの海馬でミクログリアとアストロサイトのAβタンパク質を免疫蛍光法で調べたところ、これらの細胞の機能が変化していることが確認された（図1、Q〜T）。ミクログリアの枝の長さと数の減少は、ミクログリアが活性化状態にあることを示していた（図1、UとV）。肺炎後の脳組織における炎症マーカーが減少したことは注目に値するが、それでもベースラインより高かった（図1、WからY）。これらのデータは、脳機能の欠損が重症肺炎から回復したマウスに共通する特徴であることを示した。

図1. 重症急性肺炎は脳の神経障害を引き起こす。
(A）実験タイムラインの模式図。(B）無処置マウスとLPS投与マウスの体重。(C）無処置マウスとLPS投与マウスの血中酸素飽和度（n = 8）。(D〜F）LPS負荷後の肺組織ホモジネートのIL-1β（D）、IL-6（E）およびTNF-α（F）を含む炎症性因子（n＝4）。(G）オープンフィールドテストの模式図。(H）オープンフィールド試験におけるマウスの代表的な経路。(I）オープンフィールド試験におけるマウスの総距離。(J）オープンフィールド試験におけるマウスの中心距離。(K）オープンフィールド試験におけるマウスの中心時間。(L）新奇物体認識テストの模式図。(M）新奇物体認識における弁別指数。(N）新奇物体認識における選好指数。(O）モリス水迷路画像の代表プロットと（P）脱出潜時の定量化。(Q）ミクログリアにおけるAβタンパク質の共焦点顕微鏡像。赤：Aβ；緑：IBA1；青：4′，6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）。スケールバー、20μm。(R）ミクログリアにおけるAβタンパク質の平均蛍光定量（n = 4）。(S）アストロサイトにおけるAβタンパク質の共焦点顕微鏡像。赤：Aβ；緑：グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）；青：DAPI。スケールバー、20μm。(T）アストロサイトにおけるAβタンパク質の平均蛍光定量（n = 4）。(U）ミクログリアの枝と長さのプロットと（V）対応する定量分析。(W〜Y）LPSチャレンジ後の脳組織ホモジネートのIL-1β（W）、IL-6（X）、TNF-α（Y）を含む炎症性因子（n = 4）。データは平均値±SDで示した。統計的有意性は、Studentのt検定（両側検定）およびTukeyの事後検定を用いた一元配置分散分析（ANOVA）により算出した。*P＜0.05、***P＜0.01、***P＜0.001、***P＜0.0001；UNTX、未処置；i.t.、気管内注射；n.s.、有意差なし；a.u.、任意単位；p.i.、感染後。
急性肺炎では脳内に細菌が観察された
肺組織には、脳の自己免疫を制御する可能性のある微生物群集が存在することが証明されている(18)。われわれは、脳のホメオスタシスの変化が、肺微生物叢の影響によって誘発されるかどうかを検討した。脳と肺の全組織を採取し、ホモジナイズして、LPSチャレンジ後の異なる時点でLuria-Bertani（LB）プレートにプレーティングした（図2A）。細菌コロニーは、コロニー形成単位（CFU）をカウントすることで定量した（図2、B～E）。脳は無菌臓器と考えられているため、LPS投与前のマウスの脳にはコロニーは存在しなかった。予期せぬことに、脳組織のCFUはLPSチャレンジ後1日目と7日目に出現・増加し、肺炎後30日以内に徐々に減少した（消失はしなかった）ことが観察された（図2、BとC）。肺炎寛解の全期間中、肺CFUに明らかな変化は見られなかった（図2、DおよびE）。

図2. 急性肺炎の間、脳内で細菌が観察された。
(A）実験タイムラインの概略図。(B）脳組織ホモジネートの24時間後の細菌コロニー増殖の代表プロット、（C）対応する定量結果（CFU）（n = 4）。(D）肺組織ホモジネートの24時間後の細菌コロニー増殖の代表プロットと（E）対応する定量結果（n = 4）。(F）肺および全脳のゲノムを抽出し、V3-V4検出領域を選択してポリメラーゼ連鎖反応増幅を行った。DNA検出のための代表的なアガロースゲル電気泳動と（G）対応する定量分析結果（n = 4）。標準細菌ゲノムDNAミックスを陽性対照として用いた。(H)肺および脳の細菌生息の門レベルでの相対的存在量[n=5（肺）およびn=6（脳）]。(I)科レベルでの肺と脳の細菌生息数の相対的存在量［n = 5（肺）とn = 6（脳）］。(J) LPSチャレンジ1日後の肺と脳の細菌生息数の主成分分析（n = 5）。(K）実験タイムラインの概略図。(L）脳組織ホモジネートの24時間後の細菌コロニー増殖の代表プロット（n = 4）。(M）1日目と30日目の肺組織ホモジネートの炎症性因子発現（n = 6）。(N）1日目と30日目の脳組織ホモジネートの炎症性因子の発現（n = 6）。(O）ミクログリアにおけるAβタンパク質の共焦点顕微鏡像。赤：Aβ；緑：IBA1；青：DAPI。スケールバー、20μm。(P）ミクログリアにおけるAβタンパク質の平均蛍光定量（n = 4）。(Q）30日目のアストロサイトにおけるAβタンパク質の共焦点顕微鏡像。赤：Aβ；緑：GFAP；青：DAPI。スケールバー、20μm。(右）アストロサイトにおけるAβタンパク質の平均蛍光定量（n = 4）。データは平均値±SDで示す。統計的有意性はStudent's t-test（両側検定）およびTukey post-testを用いた一元配置分散分析により算出した。****i.g., intragavage.
脳組織内の細菌の存在を確認するため、肺と全脳のゲノムを抽出し、V3-V4検出領域［16SリボソームDNA（rDNA）遺伝子の断片］をポリメラーゼ連鎖反応増幅用に選択した。陽性対照として標準細菌ゲノムDNAミックスを用いた。増幅産物をアガロースゲル電気泳動にかけた。その結果、LPSチャレンジ1日後のマウスの脳ゲノムには、明らかな量の細菌遺伝子が存在していた。一方、無処置マウスの脳では、細菌遺伝子はほとんど検出されなかった（図2、FおよびG）。さらに、16S rDNAアンプリコンシークエンシングにより、マウスの脳組織と肺組織中の微生物組成を評価した。データベースに従って、同定された細菌叢の構成を門、綱、目、科、属、種のレベルで解析した（図2、HおよびI、図S2）。その結果、門と科の分類レベルでは、脳内細菌叢と肺細菌叢の種の相対的な存在量はほぼ同じであることがわかった（図2、HおよびI）。LPSチャレンジの前後で肺微生物叢の組成に実質的な変化がないことは注目に値する（図S3）。主成分分析（PCA）はさらに、脳と肺の微生物叢のサンプル組成の類似性を決定し、脳内の新興細菌が肺に由来する可能性を示唆した（図2J）。さらに、糞便微生物叢と脳内微生物叢の組成には有意な差があり、脳内の微生物は腸に由来する可能性が低いことが示唆された（図S4およびS5）。注目すべきは、ヘマトキシリン・エオジン染色により、LPSチャレンジ後の細菌の流入は、脳の病理全体に明らかな影響を及ぼさないことが示されたことである（図S6A）。さらに、グラム染色によって脳内の細菌の存在を確認した（図S6B）。この一連の実験から、肺炎後に肺に由来すると思われる細菌が脳に侵入する可能性があることが示された。
以上の結果から、脳内の変化が侵入した細菌によって引き起こされるのかどうかを調べることにした。我々は抗生物質カクテル処理によって細菌を無差別に除去した（図S7）。その後、マウスに同量のLPSを投与して肺炎を誘発した（図2K）。抗生物質治療を受けたマウスの脳組織には細菌がいないことを確認した（図2L）。30日後、肺と脳の両組織で炎症因子を測定した。注目すべきことに、LPSチャレンジから30日後に肺の炎症が治まると、無菌マウスの脳の炎症もベースラインまで回復した（図2、MおよびN）。脳の海馬の免疫蛍光画像からは、ミクログリアとアストロサイトにおけるAβタンパク質含量の明らかな増加は認められず（図2、O～R）、これらの細胞に機能障害がないことが示された。これらの結果から、脳内の変化は侵入した細菌に関連していることが示唆された。
急性肺炎の際に肺から脳へ移行した細菌は、肺と脳の透過性の亢進と関連している。
次に、細菌が肺から脳へ移行するメカニズムを明らかにしようとした。上記の観察結果は、急性肺炎時に肺血液関門とBBBが漏出し、細菌が移動する経路が開かれているというシナリオを示している。この仮説を検証するために、我々は肺炎後のマウスにおける高分子量（4 kDa）フルオレセインイソチオシアネート（FITC）標識デキストラン（FITC-DXT）の拡散を解析した。FITC-DXTはBBBの完全性を評価する一般的なツールである(19)。BBBの透過性が亢進すると、FITC-DXTが脳に蓄積する。LPS誘発肺炎マウスモデルでは、注射後2時間で早くも脳組織へのデキストランの蓄積が観察された（図3Aおよび図S8）。これはさらに、脳細胞の共焦点イメージングとフローサイトメトリーでも確認された（図3、B～D）。これらの所見は、重症COVIDの最も顕著な徴候はBBBの障害であると報告した先行研究(20)と一致している。さらに我々は、BBB透過性の程度が肺炎反応の大きさと関連していることを見出した。LPS（0.1mg/kg）チャレンジはマウスに呼吸困難を引き起こしたが（図S9A）、脳内にFITC-DXTの明らかなシグナルは見られなかった。しかし、LPSの投与量が1 mg/kgを超えると、FITC-DXTは脳内でより明らかに濃縮された（図S9、B～D）。これは、BBBの透過性が肺炎のレベルと相関していることを示唆しているが、軽度の肺炎ではBBBの障害は誘導されなかった。さらに、LPSの投与量も行動障害と相関していた（図S9、E～L）。異なるLPS投与量下での脳内細菌負荷を解析したところ、細菌負荷はLPS投与量と関連していた。16S RNAシークエンシングにより、LPS投与量の違いによる脳内細菌叢の構成に実質的な差はないことがわかった（図S10）。

図3. 重症急性肺炎は脳と肺の透過性に変化をもたらす。
(A）肺炎後のマウスにおける高分子量（4 kDa）FITC-DXTの拡散を解析した。生体外イメージングにより、4kDa FITC-DXTの生体内分布を示した。LPS誘発肺炎モデルマウスでは、脳組織へのデキストランの蓄積が観察された。(B) マウスの脳組織スライスに異なる処理を施した後の共焦点蛍光イメージング。スケールバー、50μm。(C）4-kDaFITC-DXTシグナルの代表的フローサイトメトリー分析、および（D）FITCの平均蛍光強度（MFI）の対応する定量結果（n = 4）。(E) マウスの肺におけるCD31+血管（紫）およびZO-1（緑）におけるPV1（赤）の検出を示す代表的な共焦点画像。スケールバー、10μm。(FおよびG）対応する定量分析（n = 3）。(H)CD31+(紫)血管におけるPV1(赤)およびZO-1(緑)を示す代表的な共焦点画像。スケールバー、10μm。(IおよびJ）対応する定量分析（n = 3）。データは平均値±SDで示した。統計的有意性は、Studentのt検定（両側検定）およびTukeyの事後検定を用いた一元配置分散分析により算出した。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。
次に、肺炎後1日目の肺と脳の血管内皮バリアと上皮バリアについて調べた。形質膜小胞関連タンパク質1（PV1）は、内皮細胞上の形質膜小胞関連タンパク質であり、炎症による透過性の指標である(21)。LPSチャレンジ後1日目に、肺と脳でPV1の発現が有意に増加し（図3、E～J）、血管バリアが破壊されたことが示された。これらの結果は、内皮細胞が血液からマトリックスへの分子の通過を制御していることから、脳におけるFITC-DXTの蓄積と一致した。また、肺と脳におけるPV1の発現は、LPSチャレンジ後30日目にはベースラインレベルに戻っていることが観察され（図3、E〜J）、この時点で血管バリアが閉じていたことが示唆された。次に、タイトジャンクションタンパク質zonula occludens-1（ZO-1）を調べた（22）。その結果、LPSチャレンジ後1日目と30日目にZO-1レベルの減少が観察され、肺と脳の両方で長期間にわたって上皮バリアのタイトジャンクションが機能不全に陥っていることが示唆された（図3、E～J）。腸内細菌叢は肺内細菌叢よりもバイオマス量が有意に多い。脳内に出現した細菌が腸内細菌叢に由来するものではないことをさらに証明するため、肺炎後1日目の腸管透過性を調べた。その結果、腸管透過性に明らかな変化は見られなかった（図S11）。さらに、FITC-DXTを用いて腸内漏出を検出したところ、肺炎による腸内漏出は見られなかった（図S12）。これらの結果は、肺炎の際には肺血液関門とBBBの両方がリークし、肺から脳への内因性細菌の移行を可能にしているという我々の仮説を裏付けるものである。
脳内ホメオスタシスの変化は細菌の移動によって誘発される
神経障害を発症したマウスの脳内微小環境の特徴をさらに明らかにするため、30日目に肺炎から回復したマウスの全脳細胞の単一細胞RNA配列決定を行った。個々のマウスの脳細胞は、10x Genomics社の液滴ベースシステムを用いてシングルセルRNA配列決定の前にバーコード化した。細胞は、Seurat v4パイプラインを用いた教師なし推論解析により、遺伝子発現に基づいてクラスタ化された。クラスターは、アストロサイト、ミクログリア、オリゴデンドロサイト、T細胞、単球、ニューロン、顆粒球を含む7つの「メタクラスター」に整理された（図4、A、B、および図S13、A～C）。さらに、脳組織への明らかな単球浸潤が見られ、神経炎症が示唆された（図S14）。異なるタイプの細胞の頻度は有意に変化しなかった（図4C）。しかし、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)パスウェイの濃縮解析を行ったところ、すべての脳細胞において、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、逆行性神経シグナル伝達、GABA作動性シナプス経路に関連するシグネチャーが認められた（図4D）。注目すべきことに、KEGG解析でもサルモネラ感染経路との関連が観察された。さらに、ボルケーノマップに示すように、細菌感染経路に関連する遺伝子（Rhog、Il1a、Arf1など）の発現が有意に上昇していた（図4E）。これらのデータは、脳内に細菌が存在するという我々の発見をさらに裏付けるものであった。

図4. 図4. 細菌の移動によって引き起こされた脳の恒常性の変化。
(AおよびB）脳細胞のクラスタリングを示す一様多様体近似投影法（UMAP）と（C）各クラスタの割合。クラスターは、アストロサイト、ミクログリア、オリゴデンドロサイト、T細胞、単球、ニューロン、顆粒球を含む7つのメタクラスターに整理された。(D) 全脳細胞における差異遺伝子のKEGGパスウェイのエンリッチメント解析。(E）脳の様々な遺伝子の発現差のボルケーノプロット。(F）NF-κB経路を介して炎症性因子を産生する細菌感染の模式図。(G）CD14の代表的フローサイトメトリー解析と、（H）それに対応するCD14のMFIの定量結果。(I）脳におけるLPSシグナル伝達経路に関連する発現差遺伝子のドットプロット。(J）Jun、H2-DMa、Cd14、Il1a、Ctsd、Fcgr3、Fcer1g、Fosの代表的遺伝子のハイライトUMAPプロット。データは平均値±SDで示した（n = 4）。統計的有意性は、Studentのt検定（両側検定）およびTukeyの事後検定を用いた一元配置分散分析により算出した。**P < 0.01. TRAM、TRIF-related adaptor molecular; TIRAP、toll-interleukin 1 receptor domain-containing adaptor protein; PGN、peptidoglycan; LTA、lipoteichoicacid; TLR、Toll-like receptor; TCA、tricarboxylic acid; FC、fold change。
細菌に関連した病原体関連分子パターン（PAMPs）は、様々な種類の細胞上のパターン認識受容体（PRR）と結合し、核因子-κB（NF-κB）経路を介して炎症性因子を産生することができる（図4F）(23)。LPSは、グラム陰性菌由来のそのような典型的なPAMP分子の一つである。我々はフローサイトメトリーにより、マウスの脳におけるLPS関連受容体CD14の発現が30日目に有意に増加していることを確認し（図4、GおよびH）、脳組織における細菌に対する炎症性免疫反応の存在を示した。また、LPSシグナル伝達経路に関連する遺伝子（Myd88、Ticam2、Ly96、Tlr4、Nfkb1など）は、いずれも発現が上昇していた（図4、IおよびJ）(24)。注射したLPSの影響の可能性を排除するため、LPSチャレンジの1日後にマウスに抗生物質を静脈内投与し、脳内の細菌叢を除去した（図S15）。このデータから、抗生物質投与（ABx投与）マウスは30日目に脳の炎症反応と低いCD14発現を示さず、行動活性も正常であったことから、LPS関連経路は30日前に注射されたLPSによって誘導された可能性は低いことが示された。
遺伝子ガラス化マップから、細菌感染経路に関連する遺伝子（Jun、H2-DMa、Cd14、Il1a、Ctsd、Fcgr3、Fcer1g、Fosなど）の発現増加は、神経炎症を媒介する2つの主要な細胞型であるミクログリアとアストロサイトに主に分布していることが示された（図4Jおよび図S15D）。ミクログリア細胞は、中枢神経系実質におけるマクロファージの主要なグループであり、脳内細菌に対して非常に敏感である。予想通り、細菌感染経路に関連するミクログリア遺伝子（Rhog、Il1a、Arf1など）の発現が有意に上昇し（図5A）、KEGGパスウェイから、このクラスターがサルモネラ菌およびブドウ球菌感染に関与していることが示された（図5B）。同時に、C1qa、C1qb、C1qc（補体経路遺伝子）、Ctss、Ctsb（リソソーム経路遺伝子）、Ccl3、Ccl4（ケモカイン）、Rtp4、Bst2（インターフェロン応答遺伝子）、Lamp1、Lamp2、H2-D1、P2ry12、Hexb、Trem2（ミクログリア活性化関連遺伝子）など、さまざまなマーカーによって示されるように、ミクログリア細胞が活性化された（25, 26）（図5Cおよび図S9A）。図5Cおよび図S9A）、NLRP3がインフラマソーム経路を支配していた（図S16A）。同様に、アストロサイトにおいても、細菌感染経路に関連する遺伝子（Rhog、Il1a、Arf1など）の発現が著しく上昇していることがわかった（図5D）。アストロサイトのKEGGパスウェイ解析では、このクラスターがハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、逆行性神経シグナル伝達、GABA作動性シナプス、リソソーム経路に関与していることが示され（図5E）、アストロサイトの反応性が神経疾患と関連していることが示された。さらに、アストロサイトの反応性マーカー遺伝子、例えばId3、Npc2、Prdx6(27)、アルツハイマー病のリスク関連遺伝子Ctsb、Ctsd、Ctsl、S100a6、Itgab5、Vsir(28)、インターフェロン刺激遺伝子Gbp3、Gbp2、Irgm1、Iigp1、Igtp、Cxcl10などの発現が、すべて脳のアストロサイトで上昇していた（図5F、図S16B）。5Fと図S16B）（29-31）。これらのデータはすべて、細菌が細菌感染に関連した経路を通じてミクログリアとアストロサイトの両方を静止状態から活性化へと切り替えることにより、脳の恒常性の交代に関与していることを示唆している。一方、ミクログリアとアストロサイトの活性化は神経疾患に関連している。

図5. アストログリアとミクログリアの機能障害。
ミクログリアとアストロサイトは神経炎症を媒介する2つの主要な細胞タイプである。(A）ミクログリアの遺伝子差発現のボルケーノプロット。(B）ミクログリアのKEGG濃縮散布図。(C）ミクログリアクラスターにおける代表的な遺伝子発現差のバイオリンプロット。(D) アストロサイトの遺伝子発現差のVolcano plot。(E）アストロサイトのKEGG濃縮散布図。細菌感染経路に関連する遺伝子の発現が著しく上昇した。(F) アストロサイトクラスターにおける代表的な遺伝子発現差のバイオリンプロット。(G)ミクログリアにおける差次的発現遺伝子のドットプロット。(H) アストロサイトにおける差次的発現遺伝子のドットプロット。(I) 示された様々な処置後の脳細胞における様々な種類のタンパク質の発現のウェスタンブロット分析、および(J) 無処置群と比較したタンパク質の相対発現。(K）哺乳類ラパマイシン標的（mTOR）シグナル伝達経路の模式図。データは平均値±SDで示す（n = 3）。統計的有意性は、Studentのt検定（両側検定）およびTukeyの事後検定を用いた一元配置分散分析により算出した。*P < 0.05および**P < 0.01。
特に、ミクログリアクラスター（図5G）とアストロサイトクラスター（図5H）の両方において、ホスファチジルイノシトール3キナーゼ（PI3K）-AKT-哺乳類ラパマイシン標的（mTOR）シグナル伝達のアップレギュレーションが見られ、これはウェスタンブロッティングアプローチによってさらに検証された（図5、IおよびJ）。PI3K-ACT-mTOR経路は、ミクログリアとアストロサイトが細菌を含む細胞外刺激に応答するために使用する重要なシグナル伝達経路であることが、多くの研究で示されている。この経路は脳の恒常性維持に中心的な役割を果たすと考えられている一方、PI3K-AKT-mTORシグナル伝達の異常は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの様々な神経疾患に関連している。神経ホメオスタシスにおけるPI3K-ACT-mTORシグナル伝達の中心的役割を考えると（図5Kおよび図S17）、肺炎誘発性神経疾患における治療標的となる可能性がある。
ラパマイシンは脳の恒常性と神経障害を救う
ラパマイシンは選択的mTOR阻害薬として広く用いられている。研究では、ラパマイシンがmTORを阻害することによって炎症を抑え、神経変性疾患の病理学的過程を抑制することが示されている(32, 33)。したがって、ラパマイシンを投与することで、肺炎が誘発した神経障害が救済されるかもしれないという仮説を立てた（図6、AおよびB）。ここで用いたラパマイシンは比較的不溶性で不安定であったため（図6A）、予備データでは静脈内注射による脳内分布はかなり制限された。われわれの以前の研究で、PEVはさまざまな炎症細胞や組織を選択的に標的とする万能プラットフォームとして機能することが実証された（14-17）（図6C）。ラパマイシンを脳に効果的に送達するために、PEVをラパマイシンの直接経鼻送達のための担体として用いた。これは、BBBを迂回してCNSに薬物を送達する効果的で信頼性の高い方法である（34）。

図6. ラパマイシン-PEVの特性と脳内蓄積。
(A）ラパマイシンの化学構造と高速液体クロマトグラフィー特性ピーク。(B）mTOR経路の模式図。(C）PEVの調製スキーム。(D）TEMによるPEVの形態。(E）DLSで測定したPEVのサイズ分布。(F）血小板溶解液とPEVのウェスタンブロット結果。(G）PEVへのラパマイシンの薬物負荷量と有効性。(H）リン酸緩衝生理食塩水中での48時間にわたる薬物-PEVのin vitro放出プロファイル。(I）DiR標識PEVの経鼻投与後のマウスの経鼻投与とin vivo蛍光イメージングの模式図。(J) 脳の生体外蛍光イメージングと(K)対応する定量分析。(L) マウスの脳組織スライスの共焦点蛍光イメージング。スケールバー、50μm。(M）DiR-PEVの代表的なフローサイトメトリー分析と、それに対応するDiRのMFIの定量結果。データは平均値±SDで示す（n＝3）。RAPA、ラパマイシン。統計的有意性は、Studentのt検定（両側検定）およびTukeyの事後検定を用いた一元配置分散分析により算出した。P < 0.001および*P < 0.0001。Na+,K+-ATPase、Na+およびK+依存性ATPase。
透過型電子顕微鏡（TEM）および動的光散乱（DLS）分析により、PEVは直径約80～150 nmの円形であることが示された（図6、DおよびE）。PEVは、活性化ミクログリアやアストロサイトに結合できるCD41やP-セレクチンを含む血小板からの接着分子を保持していた（図6Fおよび図S18A）。我々の確立したプロトコール（14-17）によれば、ラパマイシンは疎水性相互作用によってPEVに担持させることができる（図S18B）。この負荷はPEVを有意に変化させなかった（図S18、CおよびD）。ラパマイシン濃度100μg ml-1では、薬物担持率（ラパマイシンの担持／添加）は約11.73％であった（図6G）。一方、ラパマイシンの80.01％が48時間以内にPEVから放出され、持続的な放出プロファイルを示した（図6H）。
次に、経鼻投与によるラパマイシン-PEVの脳内蓄積を調べた（図6I）。実験では、1,1-ジオクタデシル-3,3,3,3-テトラメチルインドトリカルボシインヨウ化物(DiR)で標識したラパマイシン-PEVを1日目に肺炎マウスに経鼻投与した。対照としてナイーブマウスを用いた。マウスは、in vivo近赤外蛍光（NIRF）システムを用いて、実験的に設計された時点で画像化された。予想通り、肺炎マウスの脳ではDiR-rapamycin-PEVの顕著な蓄積が観察され、正常マウスよりも顕著であった（図6I）。これは、活性化したミクログリアやアストロサイトに対するPEVのターゲティング効果によって説明できる。さらに、脳内のPEVは12時間後に最大濃縮に達し、PEVの保持時間は対照マウスよりも有意に長かった（図6I）。生体外NIRFイメージングでも、肺炎マウスの脳内にPEVがかなり蓄積していることが明らかになった（図6、JおよびK）。これらの所見は、共焦点イメージング（図6L）およびフロー解析によって支持され、経鼻投与後に脳内のDiR+細胞数が増加した（図6M）。これらのデータを総合すると、ラパマイシンはPEVの助けを借りて脳組織に効果的に送達できることが示唆された。
次に、肺炎誘発神経障害を患うマウスに対するラパマイシン-PEVの治療効果を評価した（図7A）。LPSチャレンジの1日後、マウスにラパマイシン-PEVを2日に1回、計4回経鼻投与した。ナイーブマウス、無処置マウス、およびPEVまたはラパマイシン単独で処置したマウスを対照として用いた。行動テストは30日目に行った。オープンフィールド実験の結果、ラパマイシン-PEVは未投与マウスの肺炎誘発神経障害による運動活性低下を効果的に緩和した（図7、B～E）。水迷路では、ラパマイシン-PEVの鼻腔内投与は、未処置マウスと比較して、マウスが標的四分円に入る確率を有意に救済し、標的プラットフォームに到達するのに要する時間を短縮したが、遊泳速度には差がなかった（図7、F〜I）。さらに、ラパマイシン-PEVを投与したマウスは、肺炎後の新物体嗜好指数の低下を有意に緩和した（図7、JおよびK）。遊離のラパマイシンまたはPEV単独では、治療効果は劣るか限定的であった（図7、B～K）。これらの結果は、ラパマイシン-PEVの経鼻投与が肺炎誘発行動障害を有意に救済できることを示唆している。

図7. ラパマイシン-PEVの治療効果。
(A）実験の概略図。LPSチャレンジの1日後、マウスにラパマイシン-PEVを2日に1回、計4回経鼻投与した。ナイーブマウス、無処置マウス、およびPEVまたはラパマイシン単独で処置したマウスを対照として用いた（n = 7）。行動検査とサンプル採取は30日目に行った。(B）オープンフィールド試験におけるマウスの代表的な経路と、（C）総距離、（D）中心距離、（E）中心時間の定量分析。(F)モリス水迷路画像の代表プロットと、(G)遊泳速度、(H)総時間に対する標的四分円の時間比率、(I)脱出潜時。(J）新奇物体認識における弁別指数。(K）新規物体認識における選好指数。(L〜N）脳組織ホモジネートのIL-1β（L）、IL-6（M）、TNF-α（N）を含む炎症性因子（n = 6）。(O) 示した様々な処理後の脳細胞における様々な種類のタンパク質の発現のウェスタンブロット分析（n = 3）。(P）ミクログリアにおけるAβタンパク質の共焦点顕微鏡像。赤：Aβ；緑：IBA1；青：DAPI。スケールバー、20μm。(Q）ミクログリア分枝のプロットと（R）対応する定量分析（n = 4）。(S）アストロサイトにおけるAβタンパク質の共焦点顕微鏡像。赤：Aβ；緑：GFAP；青：DAPI。スケールバー、20μm。(TおよびU）ミクログリア（T）およびアストロサイト（U）におけるAβタンパク質の平均蛍光定量（n = 4）。データは平均値±SDで示す。統計的有意性はStudentのt検定（両側検定）およびTukeyの事後検定を用いた一元配置分散分析により算出した。*P＜0.05、**P＜0.01、**P＜0.001。
さらに、ラパマイシン-PEVs投与により、30日目の脳ホモジネート中の炎症性サイトカインIL-1β、IL-6、TNFのレベルも回復した（図7、LからN）。ラパマイシン-PEVs投与後、脳内の細菌数も減少した（図S19）。これは、脳神経炎症が抑制された後、BBBの漏出が回復したことにもよる。さらに、ラパマイシンの標的タンパク質であるmTORの発現が減少し、PI3K、AKT1、コロニー刺激因子1受容体（CSF1R）、およびリン酸化NF-κB（P-NF-κB）の発現が低下した（図7O）ことから、ラパマイシン-PEVs投与は、肺炎後の脳のミクログリアおよびアストロサイトの機能障害を効果的に緩和できることが示された。さらに、ラパマイシン-PEVs投与後、海馬におけるAβタンパク質の発現が減少し、ミクログリアの枝の長さと数が増加したことから、ミクログリアが恒常性を回復したことが示された（図7、PおよびU）。ラパマイシン-PEVs処置はまた、処置したマウスにおいて良好な安全性を示した（図S20）。これらのデータから、ラパマイシン-PEVsの経鼻投与は、細菌の移動によって破壊された脳の恒常性維持プロセスを回復させる上で、印象的な治療効果を示したことが示唆される。
考察
肺炎から回復した患者では、脳に関連した異常がしばしば報告される。例えば、集中力の欠如は、欧米におけるCOVID-19からの回復者の大きな問題である(35)。インフルエンザ(36)や細菌性肺炎(5)のような他の呼吸器疾患の回復者にも神経障害が存在する。本論文では、重症肺炎後の神経障害が、肺から脳への内因性細菌の移行と関連していることを偶然発見した。肺は頻繁に空気にさらされ、肺微生物群を含んでいるが、その機能についてはまだ議論の余地がある。肺微生物群集の変化は肺疾患の進行に関与しているようである(11)。一方、脳はBBBによって脳組織への細菌の侵入を防ぐことができるため、通常の状態では無菌環境にあるはずである。しかし、急性肺炎の状態では、脳組織から細菌が検出された。マウス脳組織ホモジナイズ液を含むLBプレートにおいて、肺炎発症数日後に細菌の増殖を観察した。脳内細菌量のピークは肺炎後約7日目であった。さらに16S rDNA遺伝子の検出と解析により脳組織中の細菌の存在を確認した。手術や操作中の外因性細菌汚染の可能性を排除するため、脳細胞の単細胞RNA配列から、細菌感染経路に関連する遺伝子が30日後でも有意に発現上昇していることが示された。16S rDNA遺伝子解析とPCAから、脳と肺の微生物叢の多様性と存在量に類似性があることがわかり、脳内の新興細菌は肺に由来するというシナリオが示唆された。
これまでの研究では、細菌やその産物が脳-肺軸の直接的なメディエーターとなっていた。クリプトコッカスはヒトに病気を引き起こす真菌病原体で、主に吸入によって体内に侵入する。場合によっては肺炎に進行し、その後感染が中枢神経系に広がって髄膜脳炎を引き起こす(37)。肺のマイクロバイオームが脳関連疾患に関与していることを示唆する証拠もある。慢性閉塞性肺疾患は呼吸微生物叢を変化させ、パーキンソン病やアルツハイマー病のリスクを高める(38)。さらに、LPS誘発性肺炎では、気管支肺胞洗浄液と血液の両方で同様のマイクロバイオームが検出されることが確認されており、肺から血液循環への細菌の移行が示唆されている（39, 40）。われわれの研究では、肺炎の際に肺-血液関門とBBBの両方が漏出し、肺から血流を介して脳への細菌の移行を可能にしていることをさらに検証した。
さらに、BBBの漏出レベルは肺炎の重症度と高い相関があり、肺炎が重症であるほどBBBの漏出も多くなる。この現象は、多くの先行研究のデータを説明できるかもしれない。例えば、米国の退役軍人の医療記録を対象とした研究では、COVID-19感染後6ヵ月間のさまざまな健康負担を分析した結果、重症（入院を要する）患者では、軽症（入院を要しない）患者よりも神経学的異常が有意に高いことが示された(41)。別の研究では、2020年と2021年の長期にわたるCOVID症状を分析し、後遺症の割合が感染時の肺炎の重症度と関連していることが再び示された(35)。
脳組織内に細菌が存在すると、脳の恒常性、特に神経炎症を媒介する2つの主要な細胞種であるアストロサイトとミクログリアが破壊される(42)。自動化された単一細胞RNAシーケンス研究によると、COVID-19の脳では、調節不全のアストロサイトとミクログリアのシグネチャーが示された(43)。活性化したミクログリアとアストロサイトは、細菌を殺すのに有益なサイトカイン、ケモカイン、活性酸素種を産生することで、細菌感染に敏感に反応する(44, 45)。しかし、この局所炎症の副産物として、CNSへの短期的な損傷や神経疾患が生じる(46, 47)。細菌の侵入は脳の炎症を促進し、脳の炎症とAβタンパク質の増加には正の相関関係がある。脳内の細菌は活性化した免疫系によって完全に排除されるが、ミクログリアやアストロサイトが活性化から静止に切り替わるには、より時間がかかる。ある研究によると、COVID-19後の脳霧患者は6～9ヵ月かけて完全に回復することが示されている(48)。このことは、これらの神経障害が一定期間後に回復する可能性を示しており、われわれの所見と一致している。
正常な中枢神経系への潜在的な損傷を防ぎ、ミクログリアとアストロサイトの活性化から静止への過程を早めるために、治療薬としてラパマイシンを用いた。単細胞RNAシーケンスデータから、ミクログリアとアストロサイトの両クラスターでPI3K-ACT-mTORシグナル伝達のアップレギュレーションを発見した。一方、PI3K-ACT-mTORは脳の恒常性維持に重要なシグナル伝達経路である。これらのデータは、mTORが肺炎による脳機能障害の治療標的となる可能性を示唆している。選択的mTOR阻害剤であるラパマイシンは、神経変性変化の病理学的過程を治療することが以前に証明されている（32, 33）。さらに、ラパマイシンを脳組織に効果的に送達するためのドラッグデリバリープラットフォームとしてPEVを使用し、全身へのラパマイシンの投与量と潜在的な副作用を減少させた。マウスの行動障害は、ラパマイシン-PEVの鼻腔内投与によって緩和され、それによって、肺炎時の脳の潜在的な損傷を軽減する効果的な低コストアプローチを提供した。ラパマイシン-PEVs投与後、脳内の細菌数も減少した（図S19）。これは、細菌の浸潤を防ぐことができる脳神経炎症が減少した後、BBBの漏れが回復したことにもよる。今後、臨床的に承認されている他の抗炎症剤についても検討することが可能である。
この研究にはいくつかの限界がある。第一に、われわれは肺炎モデルを確立するためにLPSを用いただけである。しかし、ウイルス誘発肺炎が同様の効果を持つかどうかについては、さらなる検討が必要である。第二に、SARS-CoV-2のような一部のウイルスは、神経症状を呈する患者の脳脊髄液中にはほとんど検出されないが（49, 50）、他の外因性病原体が脳内に移行する可能性は否定できない（51）。さらに、短鎖脂肪酸や細菌外膜小胞のような微生物の栄養素やその誘導体も、アストロサイトやミクログリアの活性化に影響を与える可能性があり、その特徴について調べる必要がある。
結論として、重症肺炎後の神経障害は、肺から脳への内因性細菌の移行と関連していることがわかった。また、脳組織内に細菌が存在することが観察されたが、これは肺炎の際に肺血液関門とBBBの両方が漏出した結果かもしれない。単一細胞RNA配列決定技術を用いて、ミクログリアとアストロサイトの両クラスターにおけるPI3K-AKT-mTORシグナル伝達経路の破綻を同定した。ラパマイシン-PEVの投与は、脳の恒常性の回復を早め、重度の肺炎誘発脳症状を患うマウスの行動障害を緩和することができた。我々の研究は、重症肺炎後の神経学的症候のメカニズムに洞察を与えるものであり、その一部は肺から脳への内因性細菌の移行に起因している。
材料と方法
材料
本研究で使用したラパマイシンおよび抗体を表S1に示す。
動物
4週齢の雌性昆明（KM）マウスをNanjing Peng Sheng Biological Technology Co. Ltd.から購入した。マウスが実験室の環境に慣れるように、購入から実験まで少なくとも7日間の間隔をあけた。マウスは20°±2°C、湿度55％、12時間明期／12時間暗期、餌と水への自由アクセスに維持されたビバリウムに収容された。各群のマウスの最大収容数は5匹であった。すべての動物実験は、関連する倫理・道徳基準に従い、スーチョー大学実験動物センターおよび施設審査委員会の承認を得て実施した（No.SUDA20200512A01）。
動物実験報告書（Animal Research： Reporting in Vivo Experiments（ARRIVE）報告ガイドラインを使用した。本研究の目的は、重症肺炎後の神経障害と肺微生物群集との関係を調査することであった。動物実験は、実験の目的、方法、倫理性を明確にした上で、動物福祉審査委員会の承認・監督を受ける。マウスは無作為に群に分けた。研究対象から除外された動物はなく、研究者が独自に実験を行い、結果を評価した。マウスは実験終了時または健康上の問題が生じた時に安楽死させた。すべての実験は少なくとも3回繰り返された。
動物モデルの導入と治療
LPS投与のために、健康なマウスをイソフルランで麻酔した。各マウスを空気麻痺室に入れ、酸素流量計を0.6～1.2リットル/分に調節した。完全に麻酔をかけた後、マウスを仰臥位に固定した。マウスの口を開け、舌を鉗子で摘んで側臥位にし、露出した気管孔をスポットライトの下で観察した。合計50μlのLPS（4mg/kg；バイオシャープ）を注射器で気管に注入した。LPSを投与したマウスと対照として無処置の健常マウスの体重を同時に測定し、モデル化から30日後まで2日ごとにモニターした。さらに、血中酸素飽和度をMouseOx（STARR社製）酸素検出器でLPSチャレンジ後-1、0、7、14、30日目に測定した。血中酸素飽和度が著しく低下したマウスを試験対象とし、これらのマウスを無作為に4群に分け、それぞれラパマイシン（1mg/kg；Energy Chemical社製）またはラパマイシン-PEV（1mg/kgと等量のラパマイシン）を経鼻／肺投与した。対照として、何も処置していない同年齢の健常マウスを用いた。
抗生物質カクテル療法
アンピシリン（1 mg/ml；アラジン社製）、ゲンタマイシン（1 mg/ml；アラジン社製）、メトロニダゾール（1 mg/ml；エナジーケミカル社製）、バンコマイシン（0.5 mg/ml；アラジン社製）を10日間連続投与し、無菌マウスを作製した。さらに、急性肺炎モデルマウスとして6匹の無菌マウスを選択し、モデル化1日後および30日後に適切な実験を行った。残りの無菌マウス6匹はコントロールとして用いた。また、別途8匹の急性肺炎モデルマウスを作製した。モデル化の1日後に4匹の急性肺炎マウスを無作為に選んで尾静脈抗生物質投与を行い、投与1日後と30日後に適切な実験を行った。残りの4匹の急性肺炎マウスをコントロールとした。
サイトカイン検出
組織サンプルをあらかじめ冷却したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄した後、同重量のサンプルを秤量し、組織粉砕機で粉砕して10％組織ホモジネートを作製した。調製したホモジネートを6000gで10分間遠心した。各ホモジネートサンプルの上清を回収し、各組織ホモジネートサンプルの総タンパク質含量をビシンコニン酸（BCA）アッセイ法により測定した。その後、プレコートした酵素標識プレート上で反応を行い、洗浄、酵素標識抗体のカップリング、基質反応、反応操作の終了を行った。最後に、多機能酵素標識装置を用いて波長450nmと570nmで検出を行った。
行動試験
各群7匹のマウスは、オープンフィールド試験、新物体認識試験、モリス水迷路試験を順番に行った。実験に先立ち、マウスは実験室で馴化させた。実験は連日行い、同じバッチのマウスを試験に使用する。テストは1日目と同じ順番で行った。また、行動試験自体が脳に影響を与えるため、行動試験を受けなかったマウスの脳組織分析を行った。
オープンフィールド試験
実験装置は立体的な空白の長方形のオープンフィールド箱（60cm×60cm×60cm）を用いた。マウスを実験箱の中央部に素早く配置し、追跡ソフトウェアを開いて、箱内でのマウスの行動を10分間自動的に記録した。オープンフィールドの箱は各試験グループの間に拭き取り、マウスの残留臭を除去した。トラッキングソフトウェアを用いて、以下のデータを収集した：中心移動時間、中心移動距離、総移動距離、移動速度。
新規物体認識試験
訓練前日、マウスは習慣形成のため、対象物のないオープンフィールドの箱に10分間曝露された。訓練段階では、2つの同じ物体がある状態で、マウスをオープンフィールドの箱に入れ、5分間物体を探索させた。24時間後、片方の物体を新しい物体に交換し、マウスを再びオープンフィールドに置き、5分間探索させた。識別指数と選好指数は新規物体認識を評価するために用いられ、この指数は探索時間の違いを示している。追跡ソフトウェアを用いてマウスの行動データを収集し、統計的時間を用いてマウスの選好行動を評価した。識別指数は、新奇物体の探索時間から慣れ親しんだ物体の探索時間を差し引いた時間を、全探索時間で割った値として算出した。嗜好性指数は、新旧の物体の探索に費やされた合計時間の割合として計算された。[識別指数＝Tnovel - Tfamiliar/(Tnovel + Tfamiliar)、選好指数＝TnovelまたはTfamiliar/Tnovel + Tfamiliar）］。弁別指数は-1～+1の間、選好指数は0～1の間である。
モリス水迷路試験
水迷路は、実験が静かで影響を受けないように、別の実験室に設置された。プールは4つの象限に分けられ、迷路の空間的手がかりとなるよう、各象限の壁に異なるシンボル（円、五芒星、三角形、四角形）が貼られた。水温は23°±1℃に維持し、すべての水迷路実験は毎日同じ時間に行った。実験前に、マウスは水迷路室で2時間コンディショニングを受けた。各マウスは1日2回、4時間の試行間隔をおいて、5日間隠れた標的プラットフォームを見つける訓練を行った。マウスはプールの四分円のいずれかに静かに置かれ、人間の影響から保護され、プールの壁に背を向けた。訓練中、60秒以上マウスがプラットフォームを見つけると、マウスはプラットフォームに誘導され、10秒間そこにとどまった。トレーニングから24時間後、プラットフォームが取り除かれ、60秒探索テストが開始された。マウスは水中で標的の象限と反対側の象限を向いて置かれた。空間記憶の指標として、標的象限での滞在時間とプラットフォームの位置に到達するまでの時間が記録された。
免疫蛍光分析
組織を4％パラホルムアルデヒドで固定し、最適切断サービス温度（OCT）化合物を用いて一晩埋めた。埋め込んだ臓器は、クライオスライサーを用いて4μmのスライスに切断した。10％ウシ胎児血清で20分間密封した後、スライスをウサギ抗Aβ、抗イオン化カルシウム結合アダプター分子1（IBA1）、抗グリア線維酸性タンパク質、抗CD31、抗PV1、抗ZO-1（1:500、各抗体に適用、Serviceio）と4℃で一晩インキュベートした。日目に室温で30分間置いた後、スライスを蛍光ヤギ抗ウサギ二次抗体（1：500；Serviceio）で2時間インキュベートし、4′，6-ジアミノ-2-フェニルインドール（DAPI；1μg／ml；Beyotime）で10分間インキュベートした。画像は共焦点顕微鏡で取得し、画像データはImageJソフトウェアパッケージで処理した。また、行動試験自体が脳に影響を与える可能性があるため、行動試験を受けなかったマウスの脳組織の免疫蛍光分析を行った。
組織サンプルプレートのコーティング
マウスに1％ペントバルビタールナトリウムを腹腔内注射して麻酔し、滅菌PBSを左心室から注入して組織中の循環血球を除去した。取得した臓器（全脳、肺、結腸）を滅菌スーパークリーンテーブル上で秤量し、5％組織ホモジネート液に粉砕した。サンプルは滅菌水で希釈した。一定量のサンプル液を滅菌ピペットで吸収させ、あらかじめ高温滅菌しておいたLB培地（ベヨタイム）を含むプレートに均一に塗布した。すべての試薬と消耗品は使用前に滅菌し、すべての操作は細菌汚染のないことを保証するためにウルトラクリーン台上で行った。LB培地をインキュベーター内で24時間転倒培養し、コロニーカウンターを用いて定量的なCFUを分析した。
16S rDNAアンプリコンシークエンシング
16S rDNAアンプリコンシークエンシングは、Genesky Biotechnologies Inc. つまり、全脳および肺の全ゲノムDNAは、FastDNA SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals, Santa Ana, CA）を用いて、製造者の指示に従って抽出した。ゲノムDNAの完全性と品質はアガロースゲル電気泳動で決定し、ゲノムDNAの濃度と純度はNanoDrop 2000とQubit3.0 Spectrophotometerで決定した。16S rDNA遺伝子のV3-V4超可変領域は、プライマー341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）および805R（5′-GACTACHVGGTATCTAATCC-3′）を用いて増幅した後、Illumina NovaSeq 6000シーケンサーを用いて塩基配列を決定した。
4-kDaデキストラン分子に対する脳透過性アッセイ
実験計画に従って、各群3匹のマウスを用意し、それぞれ無処置マウス、1日後にLPS（0.1、1、4mg/kg）を投与したマウス、30日後にLPS（4mg/kg）を投与したマウスとした。合計500μgの4-kDa FITC-DXT（MedChemExpress, MCE）をマウスの尾静脈に注射した。注射から12時間後、NIRFイメージングのためにマウスの主要臓器を採取した。その後、脳組織をOCTで切片化し、DAPI染色を施した共焦点顕微鏡で観察した。BD FACSCaliburフローサイトメーターを用いて脳細胞の蛍光ヒストグラムを記録し、Flowjo_V10ソフトウェアを用いて10,000ゲートのイベントに基づいてFITC蛍光を検出した。
脳の単一細胞RNA配列決定
マウスは1％ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射で麻酔し、滅菌PBSを左心室から注入して組織内の循環血球を除去した。未処置あるいはLPS投与30日後のマウスの脳全体から、単細胞RNA配列を得た。組織を酵素で消化し、単細胞懸濁液に処理した。オリゴ(dT)ベースの相補的DNAデータベースは、National Cancer Institute- Center for Cancer Research (NCI-CCR)の単細胞解析ツールのChromium Single Cell Controller (10-fold genomics)システムを用いた液滴分割バーコードである。死細胞の除去を実施し、必要な濃度に調整したところ、約8000個の細胞が装置上で検出された。シーケンシングはNCI-CCRのシーケンシング施設でNovaSeq（Illumina）を用いて行った。バイオインフォマティクス解析は、www.omicstudio.cn/tool のOmicStudioツールを用いて行った。
ウェスタンブロッティング
各実験群の脳組織を得た後、ラジオアイソトープ免疫沈降アッセイライセートとフェニルメチルスルホニルフルオリド（100：1）の混合溶液を加えた。氷浴中で溶解後、12,000rpmで遠心してタンパク質上清を得、BCAタンパク質定量キットを用いてタンパク質を定量した。変性したタンパク質を5×ロードバッファーと混合し、12.5% SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）ゲル（エピザイム社製）電気泳動（60V、30分、120V、90分）で単離した。その後、氷浴で100分間ポリフッ化ビニリデン膜に転写し、5％脱脂粉乳溶液で1時間ブロッキングした。その後、β-アクチン抗体（1:2000; Serviceio）、抗mTOR抗体（1:1500; Serviceio）、抗PI3K抗体（1:1500; Abclonal）、AKT1抗体（1:1500; Serviceio）、CSF1R抗体（1:1500; Abclonal）、P-NF-κB抗体（1:1500; Abclonal）と4℃で一晩インキュベートした。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ウサギ二次抗体（1:5000; Absin）を室温で1時間インキュベートし、バンドを化学発光現像で表示し、ImageJソフトウェアパッケージでデータの定量解析を行った（図S12）。
PEVの作製
血小板由来の細胞外小胞は、自然な血小板活性化分泌と超高速遠心濃縮により採取した。つまり、健康なKMマウスの眼底静脈叢から新鮮血液を採取し、100gで15分間遠心分離して上清の血小板豊富血漿（PRP）を抽出した。ペレット化したPRPを、血小板の活性化を防ぐためにプロスタグランジンE1（2μM；Absin）とEDTA（5mM；Sigma-Aldrich）を含むPBSに再懸濁し、PRPを800gで20分間遠心分離した後に血小板を得た。PEVを抽出するため、血小板濃縮液をトロンビン（2U ml-1、Solarbio社製）で室温、低速振盪機で30分間活性化し、800g、20分間遠心して上清濃縮PEV溶液を得た。その後、上清を100,000gで70分間遠心した。小胞を含む粒子をPBSで洗浄し、100,000gで70分間遠心した。精製小胞を含む粒子を200μlの滅菌PBSに再懸濁した。各遠心は4℃で行った。その後、DLSを用いて水溶液中のPEVの粒度分布とゼータ電位を測定した。PEVの形態はTEMで観察した。血小板溶解液とPEVのタンパク質発現は、SDS-PAGEとウェスタンブロッティングで測定した。
ラパマイシン担持PEVの調製と特性評価
不溶性のラパマイシンをまず少量のジメチルスルホキシドに溶解し、PEVとインキュベートした。ラパマイシン担持PEVは、高速遠心分離によって再び分離された。ラパマイシン担持PEVのサイズ分布とゼータ電位をDLSで測定した。さらに、高速液体クロマトグラフィーにより薬物負荷と薬物放出の特性を測定した。クロマトグラフィーカラムC18、移動相V（アセトニトリル）：V（水）＝51：49、流速1.0ml/分、UV検出波長278nm、注入量20μl、カラム温度27℃。薬物濃度が100μg ml-1のときのラパマイシン-PEVの質量分率は11.73％であった。
PEVの経鼻投与
酸素を含むイソフルランガスによる浅麻酔後、マウスが数分以内に回復するように、各群7匹ずつラパマイシン-PEVをマウスに経鼻投与した。各マウスを空気麻痺チャンバーに入れ、酸素流量計を0.6～1.2リットル/分に調整した。完全に麻酔した後、動物を60°の角度で仰向けに寝かせ、一定の呼吸数をモニターした。その後、20μlのPEVを1滴あたり5μlの割合で鼻孔にゆっくりと注入した。各投与の3～4分後、マウスが滴を吸入し、安定した速度で呼吸していることを確認するため、薬剤の投与を中止し、鼻孔の閉塞や炎症の徴候がないか注意深く観察した。全量投与後、各マウスは麻酔から回復してからケージに移した。
PEVの生体内分布
マウスはまず酸素と混合したイソフルランで麻酔し、続いてDiR標識PEVまたは遊離DiRを各群4匹ずつ経鼻投与した。IVIS Spectral Imaging System（PerkinElmer Ltd.）を用い、24時間にわたって異なる時点の異なる群のNIRFイメージングをモニターした。その後、in vitro NIRF イメージングのために主要臓器を採取した。蛍光強度はIVIS Living Image 4.2を用いて平均放射輝度（photons s-1 cm-2 sr-1）として定量した。さらに、PEVs取り込みのフロー解析のために脳単細胞懸濁液を調製した。脳組織におけるDiRの発現レベルは共焦点イメージングにより観察した。
組織学的解析
投与後、各群のマウスの主要臓器を採取し、PBSで洗浄して余分な血液を除去した後、4％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、パラフィンに包埋した。パラフィン試料を4μm厚のスライスに切り出し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。その後、光学顕微鏡でサンプルの病理状態を観察・分析した。また、行動試験自体が脳に影響を与えるため、行動試験を行わなかったマウスの脳組織解析を行った。
マウス組織のフローサイトメトリー免疫測定
実験群に応じてマウスの脳組織を採取し、組織粉砕機を用いて組織細胞懸濁液を得た。次に、単細胞懸濁液をフィルタースクリーンで除去し、PBSで洗浄・遠心分離した後、蛍光活性化細胞選別緩衝液（3％ウシ血清アルブミンを含むPBS）に再懸濁した。さらに、細胞を抗CD45-フィコエリトリン、抗CD14-アロフィコシアニン（BioLegend）で染色した。染色された細胞は、BD Accuri C6フローサイトメーターを用い、Flowjo_V10ソフトウェアを用いて、100,000ゲートイベントに基づいて解析した。
統計解析
本研究のデータはすべて平均値±SDである。2群間の差の有意性は、両側対応のないStudentのt検定により算出した。さらに、分散分析（ANOVA）比較とTukeyのpost hoc検定を2つ以上の群間で行った（多重比較）。すべての統計解析はGraphPrism（v5.0）を用いて行った。P = 0.05以下を有意とした。実験におけるすべての蛍光発現強度は、さらにImageJソフトウェアで計算した。標準記号はP < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、***P < 0.0001で示した。
謝辞
FUNSOMおよびSoochow Universityの機器設備の利用に感謝する。
資金提供： 本研究は、中国国家重点研究開発プログラム（2022YFB3808100）、中国国家自然科学基金（第32022043号、第2321005号、第32371476号）、中国江蘇省高等教育機関自然科学基金（助成金第22KJA180003号）の助成を受けた。本研究の一部は、蘇州ナノ科学技術共同イノベーションセンター、江蘇省高等教育機関重点学術プログラム開発（PAPD）、111プロジェクトの支援を受けている。
著者の貢献 C.W.がプロジェクトをデザインした。Q.M.、C.Y.、Y.W.、H.W.が実験を行い、データを収集した。すべての著者がデータの分析と解釈を行い、原稿執筆に貢献し、結果とその意味について議論し、すべての段階で原稿を編集した。
競合利益： 著者らは他に競合する利害関係がないことを宣言する。
データおよび資料の入手： 本論文の結論を評価するために必要なすべてのデータは、論文および/または補足資料に記載されている。
補足資料
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図S1～S21
表S1
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参考文献
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