過敏性腸症候群における低FODMAP食の効果は、腸内細菌叢ではなく、糞便および尿中代謝物によって予測できる可能性がある
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過敏性腸症候群における低FODMAP食の効果は、腸内細菌叢ではなく、糞便および尿中代謝物によって予測できる可能性がある
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/apt.17609
Bridgette Wilson、菅野徳和、Rachael Slater、Megan Rossi、Peter M. Irving、Miranda C. Lomer、Chris Probert、A. James Mason、Kevin Whealan
初出：2023年6月14日
https://doi.org/10.1111/apt.17609
この論文のハンドリングエディターはPeter Gibson教授で、完全な査読の後、出版に受理されました。
試験登録サイトと ID: https://www.isrctn.com/ ISRCTN16562415 国際標準ランダム化比較試験番号、ISRCTN、16562415。本研究は、キングス・カレッジ・ロンドン、ガイズ・アンド・セント・トーマスNHSファウンデーション・トラスト、バーツ・ヘルスNHSトラストで行われ、サンプルはリバプール大学および英国レディングのクラサド・バイオサイエンス社でも分析されました。
概要
セクション
概要
背景
低FODMAP食（LFD）は、過敏性腸症候群（IBS）患者の50～80%で臨床的効果をもたらすとされている。しかし、なぜ一部の患者にしか効果がないのかは不明である。
目的
ベースラインの糞便微生物叢、糞便および尿中の代謝物プロファイルの違いにより、食事療法に対する臨床的反応者と非反応者を分けることができるかどうかを確認し、予測アルゴリズムを提案すること。
方法
IBSのRome III基準を満たす成人を対象に、盲検化ランダム化比較試験を実施した。患者は、プラセボを添加した偽食（コントロール）、またはプラセボ（LFD）または1.8g/日のB-ガラクトオリゴ糖を添加したLFD（LFD/B-GOS）に4週間ランダムに割り付けられた。臨床的反応は、介入後4週間における十分な症状緩和と定義された（global symptom question）。便中微生物叢（FISH、16S rRNA配列）、便中（ガス液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフ質量分析）および尿中（1H NMR）代謝物の反応者と非反応者の間の差異が分析された。
結果
4週間後の臨床効果は3グループ間で異なり、十分な症状緩和はコントロール群で30％（7/23）、LFD群で50％（11/22）、LFD/B-GOS群で67％（16/24）でした（p = 0.048）．コントロール群およびLFD/B-GOS群では、微生物叢と代謝物によって反応者と非反応者が分かれることはありませんでした。LFD群では、ベースラインの糞便中プロピオン酸（感度91%、特異度89%）、シクロヘキサンカルボン酸エステル（感度80%、特異度78%）および尿代謝物プロファイル（Q2 0.296 vs. ランダム化-0.175）が高いほど、臨床反応を予測しました。
結論
ベースラインの糞便および尿中代謝物は、LFDに対する反応を予測することができる。
1 はじめに
過敏性腸症候群は、腹痛と腸内環境の変化を特徴とする慢性的で衰弱した機能性胃腸（GI）疾患であり、全世界の成人の1.5～4.1％が発症しています1。
微生物叢と糞便代謝物の変化はIBSの病態生理の一部であるが、その変化がIBSの原因であるか特徴であるかは不明である。24件の研究のシステマティックレビューでは、腸内細菌科、乳酸菌科、バクテロイデス属は健常対照者に比べてIBSで高いことが示され、一方、クロストリジウム属、フェカリバクテリウム属、ビフィドバクテリウム属、フェカリバクテリウム・プラウスニツィー（種）は低いことが示されました2。IBSにおける微生物相と短鎖脂肪酸（SCFA）産生の変化は、下痢優勢型IBS（IBS-D）で報告された低悪性度炎症、タイトジャンクションタンパク質の配置の変化、空腸液性免疫の増加に寄与していると考えられる5、6）。
IBSの食事管理における主要なアプローチは、低FODMAP食（LFD）と呼ばれる発酵性オリゴ糖、ジ糖、モノ糖、ポリオール（FODMAP）の制限であり7、IBSの重症度、腹痛、全症状を著しく軽減し、腸習慣と生活の質を改善する8、 9 22の研究を含むシステマティックレビューでは、LFDによる二項対立の臨床反応（IBS-SSSスコアが50ポイント以上減少するか、症状が十分に緩和されるかで測定）の割合は61%-69%であり、食事療法を行う患者の31%-39%は反応しないことが確認されています8。
LFDは、食事内容を完全に変更する必要があるため、従うには負担が大きい。ビフィズス菌は、大腸のpHを調整し、免疫調節や病原体の排除に役立つことから、胃腸の健康に役立つと考えられており13、14、酪酸は大腸細胞の上皮の完全性に寄与しています13。したがって、LFD を実施することによる患者の負担と胃腸の生態系を乱す可能性があることから、LFD に対する症状の反応を予測することができれば、患者と医療従事者の双方にとって大きなメリットがあると考えられる。
LFDに対する反応を示す様々な生物学的マーカーが提案されている。市販の「ディスバイオシス検査」では、LFDへの反応を予測するための個々の微生物種について、相反する結果が示されている。ある研究では、反応者のベースライン時のアクチノバクターとストレプトコッカスが高いことがわかり15、別の研究では、反応者のベースライン時のこれらの値がいずれも低いことがわかった16。揮発性有機化合物（VOC）は、大腸の代謝の多くの側面を反映する代謝経路の中間体/終点である17-19。便中VOCプロファイルは、LFDの反応者と非反応者の間で異なることが実証されている20。
本研究では、既報の3群並行プラセボ対照試験のデータを用いて、IBSにおけるLFDの反応者と非反応者の間の糞便微生物叢、糞便および尿中代謝物の差異を検討したものである。原著論文では、異なる食事介入間のエンドポイントを比較しており12、これらについてはここでは記述していない。
2 方法
試験デザインおよび参加者
原著論文では、LFD単独またはプレバイオティクスサプリメントとの併用によるIBS症状および腸内細菌叢への影響を調査することを目的とし、群間比較は以前に報告されている12。簡単に説明すると、Rome III IBS（下痢が主体、混合型、未分類）の成人外来患者を英国ロンドンで消化器科外来診療所を通じて募集し、プラセボサプリメント付き偽食（コントロール）、プラセボサプリメント付きLFD（LFD）、またはLFDにB-GOSサプリメント（LFD/B-GOS、Clasado Biosciences）を4週間1日1個加えた3群にランダムに割り付けられました。研究倫理委員会の承認は、Wales Research Ethics Committee-4（文献15-WA-0119）から受け、すべての患者は参加前にインフォームドコンセントを行った。本試験は、優れた臨床実践の原則およびヘルシンキ宣言（1996年）を遵守して実施された。RCTはISRCTNに前向きに登録された（Reference ISRCTN16562415）。すべての著者が試験データにアクセスでき、最終原稿を確認・承認した。
参加者はLFDに対してナイーブであり、腸内細菌叢に影響を与える可能性のある病状（例：炎症性腸疾患、セリアック病、糖尿病）、重度の精神疾患や現在の摂食障害などはなかった。試験中にプロトコルに違反した患者は、プロトコールごとの解析から除外された。
試験プロトコール
簡単に説明すると、患者は1週間、習慣的な食事摂取量を記録し、グローバル症状の質問（「過去7日間で、IBS症状が十分に緩和されたと感じますか」）に答えた後、ベースラインの診察に出席し、便および尿サンプルを提供し、コンピュータによる無作為化でIBS-Dと性別で層別化した6つのブロックに分けられました。患者は、この研究に関与していない研究者によって、3つのグループに1：1：1の割合で無作為に割り付けられた。
患者は、偽の食事（制限食の複雑さを模倣するが、栄養素、繊維、FODMAPの摂取量を変えないように設計されており、食事アドバイスのプラセボとなる）12または低FODMAP食（単盲検）、プレバイオティクスまたはプラセボサプリメント（二重盲検）を毎日4週間摂取するように指示された。食事とサプリメントの割り当ては、データ収集、実験室での分析、データ入力を通して、説明したようにマスクされていた。試験最終週には、ベースライン時と同じ1週間の食事日記を記入し、グローバル症状質問データ、便および尿サンプルを収集した。
アウトカム
4週間後の臨床的反応（「十分な症状の緩和」）を用いて、参加者を反応者と非反応者に分類した。便のビフィズス菌種（蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を用いて定量化）、糞便微生物叢の存在量（16S rRNAシーケンス）、糞便SCFA（ガス液体クロマトグラフィー）およびVOC（ガスクロマトグラフィー質量分析、GC-MS）、尿代謝物（1H NMR）について、ベースライン時および4週目のそれぞれの介入に対する反応者と非反応者間で比較して、IBSにおける食事介入に対する反応のメカニズムを予測または支持する特徴を明らかにした。
栄養素、エネルギーおよびFODMAP摂取量は、それぞれNutritics®および特注ソフトウェア（Monash University）を用いて算出した。
2.3.1 糞便および尿の分析
新鮮な便サンプルを密封可能な滅菌バッグに採取し、すぐに氷の上に置き、患者は研究訪問の最後に処理するためにサンプルを1時間以内に研究室に届けるよう求められた。サンプルはストマッカーで4分間ホモジナイズされ、アリコートは分析まで-80℃で保存されました。値は、既知の重量の便を100℃で24時間、または0.01g以内の一定の重量になるまで乾燥させることにより、便の水分量を調整した。
21 簡潔に言えば、保存前に、凍結融解時に細胞を保存するために、50% w/v グリセロールを便のアリコートに添加した。ビフィズス菌（Bif16422）および全菌（EUB338、EUB338II、EUB338III23）に特異的な蛍光オリゴヌクレオチドDNAプローブとのハイブリダイゼーションの前に、細菌細胞を便から抽出してパラホルムアルデヒドで固定した。細胞は、治療配分の盲検化された独立した研究者によって、Nikon Eclipse E400顕微鏡で1000倍の倍率で手動でカウントされた。
配列決定は、Illumina MiSeqプラットフォームを用いてPCRとIlluminaアダプター配列を用いた細菌16S rRNAのV4領域の増幅により行い、Quantitative Insights Into Microbial Ecology（QIIME）1.9.0 に基づくカスタムパイプライン、分類の割り当てにはGreengenesを用いた24．微生物の相対的存在量の主要な違いを特定するため、統計解析の前に、すべての患者サンプルで存在量が1％未満の属を削除した。反応者と非反応者の間の差は、ノンパラメトリック検定で評価した。
糞便 SCFA は、緩衝液（0.1% 水銀、1% リン酸、0.0045% 2,2-dimethylbutyric acid 内部標準（Sigma））を用いて抽出し、7890A ガスクロマトグラフ（Agilent Technologies）および Agilent Chromatogram データベース（Agilent Technologies）を用いた検量線を用いて標準手法で定量化した26。
揮発性有機化合物（VOC）分析は、ベースラインと4週目に採取したすべての便サンプルについて、PerkinElmer Clarus 500 GC-MS 四重極ベンチトップシステム（Beaconsfield）とCombi PALオートサンプラー（CTC Analytics）でガスクロマトグラフ質量分析（GC-MS）により実施した。GC-MS分析の前に、固相マイクロ抽出（SPME）を用いて、10mLヘッドスペースバイアル（Sigma-Aldrich）の450-500mgの便のヘッドスペースからVOCを抽出した。SPMEのファイバーコーティングには、DVB-CAR-PDMS 50/30 μm (1 cm) (Sigma-Aldrich) を使用しました。最適化された SPME 抽出方法と GC-MS の条件は、Reade らによって以前に発表されたものと同じであった19 。個々の VOC が分析に残るためには、少なくとも 1 つの実験条件において、少なくとも 50%のサンプルに存在する必要があった。
尿の代謝物は、水素核磁気共鳴（1H NMR）を用いて分析された。その日の最初の尿サンプル（中流域）を採取し、1mLアリコートを分析まで-80℃で保存した。2:1の尿：リン酸緩衝液（0.2M二塩基性ナトリウム、0.05Mリン酸一塩基性ナトリウム二水和物、2mMアジ化ナトリウム、1mM3-（トリメチルシリル）プロピオン酸ナトリウム-d4含有50：50 MilliQ H2O： 重水酸化物）を準備した（以前の研究27から適応した）。1H NMRは、Bruker Avance II 700 NMR spectrometer（Bruker BioSpin）を用いて、298ケルビンおよび700MHzで自動化下で実施した。スペクトルは、Topspin™ソフトウェア（Bruker Biospin）に取り込んだ。スペクトルはMVAPACKで正規化し、アライメントした28。
統計解析
糞便および尿代謝物の統計解析は、微生物叢および代謝物解析がサンプルの提供に依存するため、プロトコル（サンプルを提供したすべての参加者）ごとに実施されましたが、臨床反応データは、反応を予測するためのベースラインデータを完全に与えるために、研究を完了しなかった参加者のために繰り越されました。カテゴリーデータはn（％）で示し、χ2検定で比較した。連続データは平均（SD）または中央値（IQR）で示し、すべての一対比較にt検定またはノンパラメトリック分析を用いた。差はp≦0.05の場合、有意とみなした。統計解析はIBM SPSS Statistics version 24.0を用いて行い、微生物叢データの多重比較の調整はR Core Team (2022)を用いて行った。
VOCデータは、米国国立標準技術研究所（NIST）の質量スペクトルライブラリ（バージョン2.0、2011）と結合したAutomated Mass Spectral Deconvolution System（AMDIS-version 2.71, 2012）を用いて処理し、VOCを仮に特定しました。データのアライメントには、RパッケージのMetab29を使用した。主成分分析（PCA）とヒートマップを用いて、グループ間のVOCプロファイルを視覚的に比較し、グループ間のVOC存在量の差をt検定で評価し、多重比較のためにp値を補正した。
教師なし解析のパターンおよびt検定の結果に基づいてVOCを選択し、ROC曲線モデルに含めてLFD群の反応者と非反応者を分類した。感度および特異度の値は、100 回のクロスバリデーションで予測された各サンプルのクラス確率の平均に基づいて算出した。ROC 曲線の p 値は、他で述べたように 100 回の順列に基づいて算出した。
Sプロットを用いて、グループ間の分離に最も寄与する代謝物のスペクトル座標を特定しました。この座標は、Chenomx® ソフトウェアを使用して既知の代謝物に割り当てられました。
3 結果
被験者募集と臨床反応
2015年7月から2016年7月にかけて、69名の患者が本試験で無作為化されました。合計130名の患者がスクリーニングされ、そのうち61名が除外され、69名がコントロール群、LFD群、LFD/GOS群のいずれかにランダム化されました。4週間後の臨床反応者数は、コントロール群で7/23（30%）、LFD群で11/22（50%）、LFD/B-GOS群で16/24（67%）とグループ間で有意差がありました（χ2 (2, N = 69) = 6.175, p = 0.048 ）（図1）。6名の患者が試験を完了せず、intention to treat解析のための非応答者に分類された。食事やサプリメントの有害なGI効果による離脱を報告した参加者はいなかった。
図1
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キャプション
反応者と非反応者の人口統計学、栄養学、FODMAP摂取量
ベースラインの人口統計学、IBSのサブタイプ、または薬の使用は、どのグループでも反応者と非反応者の間に差はなかった（表1）。
表1. 偽の食事アドバイス（コントロール）低FODMAP食事アドバイス（LFD）または低FODMAP食事アドバイス+B-GOSプレバイオティック（LFD/B-GOS）の反応者と非反応者のベースラインの人口統計学的情報。
コントロール低FODMAP食（LFD）低FODMAP＋B-GOS（LFD/B-GOS）反応者（n＝7）非反応者（n＝16）p値反応者（n＝11）非反応者（n＝11）p値反応者（n＝16）非反応者（n＝8）p値*女性、n（％）3 (43)9 (56)0.6677 (63. 6)6 (54.5)0.6659 (56.3)4 (25.0)0.772 年齢、年、平均 (SD)26.7 (4.8)31.7 (10.9)0.26240 (11)37 (8)0.53032 (8)35 (8)0. 363BMI, kg/m2、平均（SD）23.6 (1.9)24.2 (4.7)0.73526.5 (3.8)25.9 (4.9)0.75124 (4.5)23.4 (3.4)0.764White British, n (%)4 (57)10 (63)1. 0004 (36.4)6 (54.5)0.39211 (68.8)7 (43.8)0.317IBS-D, n (%)5 (71)10 (63)1.0007 (63.6)8 (72.7)0.64710 (62.5)5 (31.3)1. 000携帯電話、n(%)4 (57)5 (31)0.3632 (18.2)3 (27.3)0.6114 (25.0)0 (0.0)0.121 薬、n (%)4 (57)8 (50)1.0006 (54. 5)8 (72.7)0.3759 (56.3)5 (31.3)0.770 鎮痛1 (14)2 (12.5)1.0000 (0.0)2 (18.2)0.1382 (12.5)1 (6.3)1.000 下痢止め0 (0)1 (6)1. 0000 (0.0)2 (18.2)0.1381 (6.3)2 (12.5)0.190 抗痙攣0 (0)1 (6)1.0000 (0.0)1 (9.1)0.3062 (12.5)1 (6.3)1.0000
p値は、連続データについてはt検定、カテゴリーデータについてはχ2検定の結果である。
ベースライン時、コントロール群とLFD群の反応者と非反応者の間で、エネルギーやマクロ栄養素、FODMAP摂取量に差はなかったが、反応者はLFD/B-GOS群の非反応者より繊維（AOAC）と総オリゴ糖摂取量が少なかった（Table 2）。
TABLE 2. 偽の食事アドバイス（コントロール）低FODMAP食事アドバイス（LFD）または低FODMAP食事アドバイス+B-GOSプレバイオティック（LFD/B-GOS）の反応者と非反応者の間で比較したベースラインおよび試験終了時（4週間）のエネルギー、栄養素およびFODMAP摂取量。
1日あたりの摂取量、平均（SD）コントロール低FODMAP食（LFD）低FODMAP＋B-GOS（LFD/B-GOS）反応者（n = 7）非反応者（n = 14）p値a反応者（n = 11）非反応者（n = 10）p値a反応者（n = 16）非反応者（n = 5）p値aベースラインエネルギー（kcal）1849 (526)1985 (578)0. 6072041（501）1827（467）0.3261997（476）2379（579）0.152総蛋白（g） 82.6（22.4）90.1（27. 7)0.54584.4 (26.0)75.9 (19.8)0.41281.1 (29.0)95.7 (46.0)0.403Fat (g)77.2 (31.7)78.3 (24.2)0.92882.5 (18.6)72.9 (18.2)0.24483.4 (21.3)94.3(22.3)0.335Carbohydrate (g)172.3(43.7)202. 6 (75.9)0.343212.5 (66.9)188.6 (55.1)0.385208.4 (60.3)252.3 (54.7)0.164NSP englyst (g)12.2 (6.3)13.0 (4.3)0.74115.7 (5.7)15.0 (6.3)0.76913.2 (4.3) 17.5 (6.4) 0.93Fibre AOAC (g)16. 6 (8.3)19.2 (6.1)0.41721.4 (7.2)19.2 (7.7)0.49118.5 (5.3)26.1 (10.0)0.035 総FODMAPsb15.30 (3.75)17.84 (5.38)0.27116.80 (7.21)17.14 (5.35)0.90324.06 (14.24)20.40 (9.16)0. 599フルクタン(g/d)0.24 (0.36)0.37 (0.44)0.5270.23 (0.26)0.20 (0.18)0.7840.18 (0.25)0.48 (0.64)0.131 オリゴ (g/d) 0.62 (0.31)0.63 (0.37)0.9710.68 (0.29)0.54 (0.31)0.2880.48 (0.22)0.93 (0.39)0. 004乳糖(g/d)0.66 (0.64)0.85 (0.54)0.4910.67 (0.64)1.20 (1.30)0.2472.87 (3.03)0.74 (0.71)0.141Sorbitol (g/d)6.73 (4.88)7.22(3.71)0.8017.14 (4.04)6.01(4.90)0.5695.44(4.25)7.7 17 (2.98)0.412 マンニトール(g/d)0.33 (0.24)0.36 (0.41)0.8930.48 (0.41)1.03 (1.60)0.2920.55 (0.68)0.77 (0.80)0.558GOS (g/d)2.66 (1.82)2.58 (1.17)0.8992.55 (1.04)2.03 (1.09)0.2732.51 (0.98)3.0 31 (1.54)0.182 過剰果糖（g/d）4.00 (1.13)5.84 (2.83)0.1185.04 (2.77)6.15 (2.62)0.35812.02 (10.75)7.02 (4.92)0.332 試験終了エネルギー（kcal）1689 (678)1703 (472)0.9571538 (455)1696(672)0. 531743 (572)1629 (336)0.679総蛋白質(g)72.5 (43.3)81.9 (23.6)0.52271.9 (25.3)73.9 (29.3)0.87275.0 (23.5)81.8 (34.0)0.618 脂肪 (g) 720 (45.5)68.9 (17.7)0.823.1 69. 1 (35.8)0.87573.3 (28.5)71.4 (21.5)0.889Carbohydrate (g)153.2 (40.2)159.0 (44.6)0.777142.2 (44.6)162.0 (59.4)0.395174.3 (77.3)133.2 (24.0)0.263NSP englyst (g)12.3 (8.4)11.9(3.9) 0. 88510.2 (5.0)12.5 (5.7)0.32611.1 (3.9)9.9 (4.4)0.582Fibre AOAC (g)16.9 (11.2)16.9 (6.1)0.98716.9 (8.6)18.1 (8.8)0.7517.9 (7.6)15.8 (8.2)0.589Total FODMAPsb12.03 (5.83)15.13(6.89)0.0 3216.46 (6.17)10.84 (7.95)0.17310.99 (12.07)9.23 (4.21)0.755 フルクタン (g/d)0.07 (0.08)0.26 (0.26)0.0820.05 (0.13)0.01 (0.03)0.4540.03 (0.08) 0.07 (0.16)0.461 オリゴ (g/d)0.45 (0.27)0. 63 (0.30)0.1930.09 (0.09)0.08 (0.12)0.8240.15 (0.22)0.05 (0.04)0.339Lactose (g/d)0.22 (0.13)0.87 (0.78)0.0440.07 (0.12)0.23 (0.48)0.2861.13 (2.30) 0.01 (0.02)0.298Sorbitol (g/d)6. 82 (4.41)5.32 (4.27)0.4613.20 (5.07)4.50 (5.21)0.572.72 (2.89)7.43 (3.69)0.008Mannitol (g/d)0.30 (0.56)0.35 (0.49)0.8220.06 (0.14)0.07 (0.09)8490.11 (0.18)0.03 (0.03)0.321GOS (g/d)1. 59 (0.72)2.42 (0.73)0.0230.34 (0.26)0.57 (0.57)0.2360.46 (0.35)0.22 (0.07)0.148 果糖過剰 (g/d)2.58 (2.14)5.28 (4.72)0.172.67 (2.12)5.38 (5.31)0.1346.39 (8.37)1.42 (1.42)0.21
略語 AOAC, 公定分析化学者協会; NSP, 非デンプン多糖類.
a p値は、各グループの反応者と非反応者をt検定で比較し、pは<0.05の場合に有意である。
b 総FODMAPsは、過剰なフルクトースを含む個々の炭水化物の合計として計算されます（総フルクトースではありません）。
試験終了時、対照群の反応者は非反応者よりも乳糖とGOSの摂取量が少なかった。LFD群では反応者と非反応者の間に差はなく、LFD/B-GOS群反応者は反応者よりソルビトール摂取量が少なかった（表2）。
微生物叢のエンドポイント
排泄から便の処理までの平均時間は72.4分であり、便の処理時間にはどのグループでも反応者と非反応者の間に有意差はなかった（表S1）。
便中ビフィズス菌の絶対量（log10 cells/g dry weight）は、ベースライン時および4週間後のいずれのグループにおいても、反応者と非反応者の間に差はなかった。便中ビフィズス菌の絶対量（log10 cells/g dry weight）の変化は、LFD/B-GOS群でのみ観察され、反応者は非反応者（0.0%（0.3））よりもビフィズス菌（平均：-0.5%、SD：0.3）の低下が有意に大きかった（p = 0.008）.
門および属レベルのデータ（相対的存在量、16S rRNAシーケンス）は、コントロール（反応者＝6、非反応者＝10）、LFD（反応者＝10、非反応者＝8）、LFD/B-GOS（反応者＝14、非反応者＝5）群においてベースラインで比較しました。どのグループでも、応答者と非応答者の間で、多様性の指標に差はなかった（データ示さず）。反応者と非反応者の間の差分存在量検定（ノンパラメトリック）では、ベースライン時、デルタ時、試験終了時に差が見られたが、多重検定で補正すると、以下に述べるような差はいずれも有意ではなかった。
ベースライン時、対照群では、Lachnospiraceae科の1属が非対応群より高く（中央値：2.4%、IQR：1%）、Bilophilaが非対応群より高かった（0.05%、0.1%、p = 0.044 、q = 0.906 )。LFD群では、反応者は非反応者より連鎖球菌が高い（0.3%、0.4%）（0.2%、0.1%、p = 0.048, q = 0.927）ことがわかった。LFD/B-GOS群では、反応者は非反応者よりメガモナが低い（0％、0％）（2.9％、18.8％、p = 0.002, q = 0.408）ことがわかった。
微生物叢の変化を解析した結果、Verrucomicrobia属の変化は、LFD群の非対応者（-0.3%、1%、p = 0.025, q = 1）よりも対応者（0%、0.2%）で少ないことがわかった。各グループの反応者と非反応者の間で属の変化に差があり、それらを図2に示した。
図2
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試験終了時、コントロールグループの反応者は、非反応者（5.3%、3.9%、p = 0.045, q = 0.906）よりもCoprococcus（7.5%、1.9%）を多く含んでいました。LFD群では、反応者（n=11）（0.0%, 0.0）は非反応者（n=9）（0.0%, 0.2, p = 0.027, q = 927）よりクロイソカイメン科の植物が少なかった。LFD/B-GOS群では、反応者は非反応者よりメガモナスが低く（0%、0%）、セラチアも非反応者より低く（0%、0%）、p = 0.046, q = 0.754、アシダモノコッカスが低く（0%、0%）、0.1%、 0.4%, p = 0.048, q = 0.754） 、反応者より、非反応者よりメガモナが低い（3%、 21.1%、p = 0.004,q = 0.408 ）ことが示された。
糞便中の短鎖脂肪酸
ベースライン時、コントロールグループの反応者と非反応者の間で、糞便短鎖脂肪酸（mg/100g乾燥重量）に差はなかった（Table 3）。
表3. 偽の食事アドバイス（コントロール）低FODMAP食事アドバイス（LFD）または低FODMAP食事アドバイス＋B-GOSプレバイオティック（LFD/B-GOS）の反応者と非反応者を比較したベースラインおよび4週目の糞便短鎖脂肪酸（mg/100g乾燥重量）。
平均（SD）SCFA値（mg/100g）コントロール低FODMAP食（LFD）低FODMAP＋B-GOS（LFD/B-GOS）反応者（n = 5）非反応者（n = 13）p値反応者（n = 11）非反応者（n = 9）p値反応者（n = 16）非反応者（n = 5）p値ベースラインAcetate1341． 4 (854.0)1298.3 (683.0)0.8821868.5 (827.8)1342.6 (1134.4)0.0531934.9 (2219.7)1563.6 (1122.0)0.804Propionate421.6 (242.0)480.9 (323.0)0.82771.3 (743.6)381.1 (359.7)0.009790.6 (1174.9)418.2 (183.0)0.009790.5 (1174.9)417.3 (194.4)0.0 2)0.741Butyrate365.5 (236.6)396.8 (303.4)0.961578.7 (315.6)520.6 (624.4)0.184663.8 (811.6)458.9 (490.5)0. 215バレレート37.6 (12.6)60.6 (37.5)0.21865.6 (35.7)40.4 (21.7)0.102121.6 (223.8)35.7 (23.0)0.058 イソブチレート 45.4 (14. 8)46.5 (16.6)0.65751.4 (23.1)31.9 (14.0)0.06373.5 (52.6)26.8 (12.1)0.008Isovalerate54.6 (11.4)56.1 (19.9)0.80558. 3 (24.5)46.1 (18.8)0.239104.9 (117.7)35.2 (18.8)0.010Total SCFA2266.1 (1302.6)2339.2 (1250.0)0.9613393.8 (1731. 0)2362.7 (2085.6)0.0533689.3 (4559.1)2538.4 (1719.8)0.869 試験終了Responder (n = 7)Non-responder (n = 13)pResponder (n = 11)Non-responder (n = 10)pResponder (n = 15)Non-responder (n = 5)pAcetate1734.9 (963.3)1593.0 (716.0) 6)0.8231306.5 (865.4)1408.0 (1063.1)0.8881364.2 (718.3)1144.5 (733.7)0.407Propionate484.0 (296.2)634.1 (420. 9)0.551418.5 (294.1)428.2 (334.2)1.000444.5 (230.2)353.3 (331.2)0.106Butyrate715.8 (576.4)542.6 (356.0)0.654399. 0 (280.7)435.1 (319.3)0.622419.4 (246.2)240.0 (145.2)0.106 バレレート44.5 (21.8)80.2 (38.8)0.03050.8 (34.3)50. 2 (32.1)1.00063.6 (44.8)38.7 (27.4)0.239Isobutyrate33.0 (8.4)58.6 (22.3)0.00657.8 (29.8)38.9 (17.0)0.10560.3 (27. 9)32.2 (24.0)0.040Isovalerate43.0 (12.3)65.7 (21.6)0.01167.1 (33.7)52.7 (19.7)0.57371.2 (31.1)38.0 (20.0)0. 032総SCFA3055.1 (1681.1)2974.3 (1391.7)0.8812299.6 (1498.4)2413.1 (1664.3)0.9442423.3 (1208.8)1846.6 (1237.2)0.106
略号 B-GOS, β-galactooligosaccharide、LFD, low FODMAP diet.p は <0.05 で有意。非正規分布のデータセットにはKruskal-Wallis検定を使用した。
LFD群では、ベースライン時のプロピオン酸は、反応者（平均：771.3、SD：743.6）で非反応者（381.1、359.7、p = 0.009）より高く、総SCFAは反応者（3393.8、1731.0）で非反応者（2362.7、2085.6）より高かったが統計的には有意ではない（p = 0.053）となった。ROC曲線は、ベースラインのプロピオン酸がLFDの反応者と非反応者を識別することを決定し（AUC: 0.85, 95% CI: 0.64-1.0; p = 0.009） 感度91%、特異度89%、陽性予測値（PPV）91%、陰性予測値（NPV）89%である。
LFD/B-GOS群では、反応者は非反応者に比べてベースライン時のイソ酪酸（73.5、SD 52.6 vs. 26.8 SD: 12.1, p = 0.008） とイソバレレート（104.9、SD 117.7 vs. 35.2, SD 18.8, p = 0.010 ）がそれぞれ高くなりました。ROC曲線では、ベースラインのイソブチレート（AUC： 0.90, 95% CI: 0.77-1.0; p = 0.008, 感度 100%, 特異度 63%, PPV 81%, NPV 100%) とイソバレレート (AUC： 0.89, 95% CI: 0.74-1.0; p = 0.010, sensitivity 100%, specificity 82%, PPV 100%, NPV 82%）は、LFD/B-GOSに対する反応者と非反応者の間に優れた識別性を示しました。
試験終了時、反応者は対照群の非反応者よりバレレート、イソ酪酸、イソバレレートが低く、LFD群では反応者と非反応者の間に差はなく、イソ酪酸、イソバレレートともに反応者はLFD/B-GOS群の非反応者より高いままだった（表3）。
糞便中の揮発性有機化合物
ベースライン時のVOC化合物のPCA分析では、LFD群では反応者と非反応者の分離が良好であったが、コントロール群やLFD/B-GOS群ではそうではなかった（図3）。コントロール群、LFD群、LFD/B-GOS群について、PC1のプラス方向とマイナス方向にサンプルを駆動する原因となるVOCのリストを表S2に示している。LFD群では、PCAローディングスコアとヒートマップの可視化（図3、4、表S2）により、類似したVOCの特定のクラスターが明らかになった。ベースライン時に非反応者よりも反応者で濃度が高かったシクロヘキサンカルボン酸のエステルが3つ存在したのだった。LFDグループのベースラインでは、シクロヘキサンカルボン酸エチルエステル（未調整p = 0.03）、シクロヘキサンカルボン酸プロピルエステル（未調整p = 0.08） およびシクロヘキサンカルボン酸ブチルエステル（未調整p = 0.12） はすべて、反応者に多く含まれる傾向が示された。すべてのベースラインのt検定結果を表S3に示す。ベースラインVOCの差は、多重比較で補正すると有意性が失われた（Table S3）。
図3
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図4
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ROC曲線では、これら3つのシクロヘキサンカルボン酸エステルのベースライン値を組み合わせることで、反応者と非反応者の優れた識別が可能となった（AUC = 0.84, 95% CI: 0.52, 1 p = 0.04, sensitivity 80%, specificity 78%, PPV 80%, NPV 78%）．存在／不在のデータを用いても、結果は同様で、これらのVOCを1つ以上持つ患者の80％が反応者であり、それらのいずれかを持たない患者の75％が非反応者であった。これらのエステルの1つ以上の存在は、80％の陽性予測値を示しました。
試験終了時、VOCプロファイルはどのグループでも反応者と非反応者の明確な分離をもたらさず（図3、表S4）、単変量解析ではどのグループでも反応者と非反応者の間のVOCの有意な変化を明らかにしなかった（表S5）。さらに、3つのシクロヘキサンカルボン酸エステルに対するクラスタリングは、試験終了時にはほとんど見られなかったため、LFD反応者には見られなかった（図4）。
尿中
尿中メタボロームには、対照群、LFD/B-GOS群ともに、ベースライン時、試験終了時のいずれにおいても、反応者と非反応者の間に差は見られませんでした。
LFD群では、ベースライン時、反応者の尿中メタボロームが非反応者と異なりました（Q2 = 0.296 vs. randomised -0.175）（図5）。Sプロットにより、この差に最も寄与した2つの代謝物は、反応者のクレアチニン濃度の低さとトリメチルアミンN-オキシド（TMAO）の濃度の高さであることが確認されました（図S1）。
図5
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LFD群では、試験終了時に、反応者の尿メタボロームが非反応者と異なり（Q2 = 0.485 vs. randomised -0.203）（図3）、Sプロットにより、この差に最も寄与した2つの代謝物は、反応者ではヒプリントの濃度が低く、クエン酸が高いことが確認できた（図S1）。
4 考察
LFDがIBSの効果的な管理戦略であることは確立されているが、現在のところ、反応を予測することは不可能である。本研究は、低FODMAP食に臨床的に反応する可能性が最も高い患者の特定のプロファイルを特定することにより、糞便および尿中代謝物がLFDの反応者と非反応者を区別するというこれまでの知見を支持するものである20, 33。しかし、本研究は、糞便微生物叢がLFDに対する反応を予測するというこれまでの知見を支持しない15、16、34が、比較対象のサンプルサイズが小さかったためである。
LFDへの反応を予測するための糞便微生物叢の使用については、相反する結果が報告されており、本研究では、LFDへの反応者と非反応者の間で異なる分類群は存在しなかった。しかし、糞便と尿の代謝物の違いから、反応を決定する上で微生物叢の機能がより重要である可能性が示唆されました。これは、SCFA産生に関連する微生物（Ruminococcaceae UCG-002、Ruminococcus 1、Anaerostipes）が食事への反応が高い人により多く存在する可能性を示すサブ解析にもかかわらず、微生物叢プロファイルよりも便中代謝物の方が反応を予測しやすいと報告した5つの別々のLFD介入研究からのデータの最近の解析結果33を支持しています。
ベースライン時、糞便中のプロピオン酸は高く、総SCFAはLFDに反応した人ほど高い傾向を示していた。これらの知見は、ベースライン時の反応者のSCFA吸収障害を示している可能性があります。また、ベースライン時に糖分解菌が多いことが反応の要因である可能性を示す先行研究35、36も支持しており、複数の研究からのデータを分析した先行研究では、大腸メタンおよびSCFA産生の多さが低FODMAP食への反応の予測因子であることが示されています33。さらに、複数の介入研究の分析により、ベースラインのSCFA産生量が多いほど、LFDに対する症状反応が大きいことが確認されている33。ベースラインの糞便中プロピオン酸およびSCFAが多いことは、腸内の炭水化物代謝のマーカーであると考えられる。介入前のSCFA、ひいてはガスの高生産は、食事によるFODMAP制限によって減少し、したがって、症状反応をもたらす可能性がある。全体として、我々のデータは、微生物群の炭水化物代謝能力が低FODMAP食への反応性の重要な特徴であるという証拠を確認するものである。他の研究のように、炭水化物代謝能力を持つ特定の分類群がLFDへの反応を予測するという証拠は、今回のデータでは示されなかったが、34-36のサンプルサイズでは、このような違いを検出するには限界があった。
3つのシクロヘキサンカルボン酸エステルは、LFDへの反応を予測する上で、高感度かつ特異的であることが示されました。さらに、これらの特定のVOCは、健常対照者や炎症性腸疾患患者よりもIBS患者の便に多く含まれることが示されています18。以前の研究と現在の研究の両方で、3つのシクロヘキサンカルボン酸エステルはIBS患者のほとんどの便サンプルに含まれていましたが、興味深いことにLFD後に多くのサンプルから消失しました。シクロヘキサンカルボン酸エステルの起源は不明であるが、大腸内の様々なアルコールによる酸のエステル化から生じる可能性がある38, 39。本研究のサンプルサイズが限られていたため、細菌分類とシクロヘキサンカルボン酸エステルの間の特定の相関を調べることはできなかったが、これは今後の研究の焦点となるはずである。シクロヘキサンカルボン酸またはそのエステルの複合的な存在が鍵になる可能性があり、さらなる調査と外部検証が必要である。
LFD/GOSの介入により多くの患者さんが症状反応を示した（67%）一方で、シクロヘキサンカルボン酸エステルとの関連性は見られず、4週間後の他のエステルの減少も見られなかった。しかし、このグループでは、ベースライン時にシクロヘキサンカルボン酸エステルを有していた患者はほとんどいなかったため、これらの潜在的なバイオマーカーのベースライン時の差を検出するには、本試験は力不足であった可能性があります。
糞便代謝物に加えて、尿中メタボロームもLFDの反応者と非反応者の間で差がありましたが、やはりコントロールやLFD/B-GOSでは差はありませんでした。ベースライン時の差は、反応者がクレアチニンを低く、TMAOを高くしていることでほぼ説明できました。尿中TMAOは、動物性タンパク質を多く含む食事を摂るヒトで高く、これは、食事のコリンやカルニチンから作られる腸内細菌生成TMAから肝臓で変換されるためである40, 41クレアチニンは、筋肉量の指標となりうるため、女性よりも男性で高い27。今回の研究では、尿中代謝物のこれらの違いを説明できる人口動態や栄養摂取量の違いは、反応者と反応しなかった者の間になかった。しかし、TMAOは腸内細菌叢の代謝の副産物であり27、ベースライン時の細菌叢の代謝活動の違いにより反応者の代謝物が異なるという説を支持する可能性がある。
LFD群では、ベースライン時と試験終了時の尿中代謝物の違いにより、反応者を非反応者と区別することができました。ベースライン時と試験終了時で区別できる代謝物が異なるということは、反応のメカニズムに関する知見を得ることができるかもしれません。試験終了時、LFD反応者は非反応者に比べ、ヒップレートが低く、クエン酸が高いことがわかりました。ヒップレートは安息香酸のグリシン抱合体で、植物ベースの食事をしているヒトの尿中に多く含まれ、果物や野菜、カフェインなどのポリフェノール化合物の摂取量の指標となる。41-43 今回の研究では、反応者のヒップレートの低下は植物ポリフェノールの摂取量が少ないことを示していると考えられるが、果物や野菜の摂取量のバイオマーカーであるクエン酸も高かった43、 44 もし、この差が反応者のカフェイン摂取量の減少によるものであれば、カフェインは腸を刺激する作用があるため、症状改善のメカニズムになる可能性があります45。しかし、栄養データもこの仮説を支持していないため、結果的にこの結果は説明できないままです。
一般に、ベースライン時の多くの因子がLFDへの反応を予測したが、LFD/B-GOSへの反応は予測しなかった。
複合療法群では、介入に対する反応は、LFD（食事療法のみ）、プレバイオティクス（プレバイオティクスのみ）、またはその両方の効果として起こる可能性があります。したがって、LFDとLFD/B-GOSの間で反応予測に一致が見られないのは、後者における反応を予測しうる様々な要因（食事単独またはプレバイオティクス単独、あるいはその両方）が、LFD単独（食事単独）に対する反応予測の効果を不明瞭にしているためと考えられる。
長所と限界
本研究は、IBSにおける食事介入への反応を予測できるものを決定するために、一連の生物学的マーカーを調査したものである。対象集団は十分に特徴づけられ、注意深くモニターされた。代謝プロファイルによって反応者と非反応者を分けることができることを明らかにした以前の研究20, 36に続き、特定の代謝物が反応を識別する可能性があることを追加したが、これらは外部からの検証を必要とする。限界としては、サンプル数が少ないため、正当なマーカーが検出できなかった可能性と、データのオーバーフィッティングの可能性があることが挙げられる。より大規模な研究では、今回発見された代謝物を含む幅広い代謝物を調査する必要があります。尿と糞便の代謝物、および16S rRNAシーケンスの間の数学的モデリングは、これらの異なる特徴がLFDへの反応を予測するモデルを構築する方法についてより深い洞察を提供するでしょうが、これはより大きなサンプルサイズを必要とします。最後に、患者が低FOAMP食を摂取していない場合のみ対象であるにもかかわらず、乳糖といくつかのオリゴ糖の平均摂取量は比較的低く、これは参加前にいくつかの食品を自己制限したことを反映している可能性があります。
5 結論
我々は、微生物活性のマーカーがLFDへの反応を予測する可能性があることを実証し、反応に対する機能的根拠を提供した。これらの予測マーカーを検証するためには、さらに十分な検出力を持つ研究が必要であり、IBS患者に対する個別栄養指導につながる可能性がある。
著者の貢献
Bridgette Wilson： 概念化（同等）、データキュレーション（主導）、正式解析（主導）、資金獲得（同等）、調査（主導）、方法論（主導）、プロジェクト管理（主導）、執筆-原文（主導）。菅野徳和：正式な分析（同等）、執筆-レビューと編集（支援）。レイチェル・スレーター（Rachael Slater）： 形式的分析（同等）、ライティング-レビューおよび編集（サポート）。Megan Rossi: 概念化（同等）、方法論（サポート）、ライティング-レビューおよび編集（サポート）。ピーター・アーヴィング 概念化（同等）、執筆-レビューおよび編集（支援）。ミランダ・C・E・ロマー 概念化（同等）、執筆-レビュー・編集（支援）。Chris Probert：形式的な分析（サポート）、ライティング-レビューと編集（サポート）。A.James Mason： 形式的な分析（サポート）、ライティング-レビューと編集（サポート）。Kevin Whelan：概念化（同等）、形式分析（同等）、資金獲得（同等）、方法論（同等）、監督（リード）、可視化（同等）、執筆-レビューと編集（リード）。すべての著者が最終版の原稿を確認し、承認した。
謝辞
個人的利益の宣言： 糞便短鎖脂肪酸の解析と解釈について協力してくれたRobert Greyに感謝する。FODMAP摂取量の解析のためにFODMAP食品組成データベースを利用させていただいたMonash University（オーストラリア、メルボルン）に感謝します。また、Royal London Hospitalでの試験設定にご協力いただいたQasim Aziz教授、募集をサポートしていただいたGareth Parkes博士（Royal London Hospital）とSimon Anderson博士（Guy's & St Thomas' Hospital）に感謝いたします。
資金提供情報
本試験は、Clasado Biosciences LtdおよびKing's College Londonから資金提供を受けました。
利益相反声明
BWは、Clasado Biosciences Ltdの博士研究助成金の支援を受け、IBSの診断と食事管理における揮発性有機化合物の共同発明者である。TKは、ジョンソン・エンド・ジョンソンの従業員であり、株主である。MRは、カリフォルニア州アーモンド委員会、ダノン、国際ナッツ・ドライフルーツ協会より資金提供を受けており、IBSの診断と食事管理における揮発性有機化合物の共同発明者である。PMIは、Clasado Biosciences Ltd.の研究助成金の共同申請者である。MCLは、クラサド・バイオサイエンス社からの研究助成金の共同申請者です。KWはダノンのコンサルタントを務め、クラサド・バイオサイエンス社、カリフォルニア州アーモンド委員会、ダノン、国際ナッツ・ドライフルーツ協議会から研究資金を得ており、IBSの診断と食事管理における揮発性有機化合物の共同発明者である。CPは、IBSの診断と食事管理における揮発性有機化合物の共同発明者である。AJMとRSは何も公表することはない。
著作権者
論文の保証人 ケビン・ウィーラン教授
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