腎機能と循環トリメチルアミンN-オキシドとの因果関係および修正可能な関係の証拠

2023年9月22日 15:16

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出版：2023年9月20日
腎機能と循環トリメチルアミンN-オキシドとの因果関係および修正可能な関係の証拠

https://www.nature.com/articles/s41467-023-39824-4

Petros Andrikopoulos, Judith Aron-Wisnewsky, MetaCardis Consortium, ...Marc-Emmanuel Dumas 著者一覧を見る
ネイチャーコミュニケーションズ14巻、記事番号：5843（2023）この記事を引用する

11 Altmetric

メトリクス詳細

要旨
宿主-微生物叢共代謝産物であるトリメチルアミンN-オキシド（TMAO）は心血管リスクの上昇に関連しているが、その循環レベルがどのように制御されているかは不明である。我々は、MetaCardis研究の1,741人の成人ヨーロッパ人において、空腹時血漿TMAO濃度と多数の表現型について、「説明可能な」機械学習、単変量解析、多変量解析、および媒介解析を適用した。ここでは、年齢に次いで、腎機能が循環TMAOを予測する主要な変数であり、微生物叢組成と食事は、重要ではあるが、小さな役割を果たしていることを示した。仲介分析により、TMAOと腎機能との間に因果関係があることが示唆され、TMAO暴露が腎臓の瘢痕化を増加させる前臨床モデルでそれを裏付けることができた。われわれの所見と一致して、腎保護作用のあるグルコース低下薬を投与されている患者は、傾向スコアをマッチさせた対照群と比較して、循環TMAOが有意に低い。われわれの解析は、腎機能とTMAOの間に双方向の関係があることを明らかにし、それはレノプロテクト作用を有する抗糖尿病薬によって改善される可能性があり、TMAOに関連する過剰な心血管リスクを減少させるための臨床的に実行可能な介入を示唆するものである。

はじめに
過去20年以上にわたり、動脈硬化や2型糖尿病（T2D）などの病態における常在腸内細菌叢の中心的役割が注目されてきた1。腸内細菌叢は、代謝を直接変化させる分子や細胞シグナル伝達を調節する分子を産生することにより、宿主の病態生理に影響を及ぼす可能性がある。

トリメチルアミンN-オキシド（TMAO）は、トリメチルアミン（TMA）の肝臓N-オキシドである。TMAは、微生物3,4,5,6（主にファーミキューテス属）によるホスファチジルコリン7,8、コリン8、L-カルニチン9,10,11の代謝産物である。TMAは腸から肝門脈経由で取り込まれ、宿主のフラビンモノオキシゲナーゼ312によってTMAOに酸化される。循環血中TMAO濃度が高いと、既知の心血管危険因子で調整した後でも、動物およびヒトの研究において血栓性および心血管リスクが上昇することが報告されている7,8,9,13。そのため、TMAOは赤身肉や脂肪の大量摂取に伴う心血管リスクの上昇を媒介すると考えられている14。魚の摂取は心血管疾患14の発症率低下と関連しているが、魚もまたTMAOの豊富な供給源である15。すなわち、TMAOは腸内細菌科の微生物によってTMAOに還元され、肝臓で再びTMAOに還元される16。食事や微生物叢の構成と同時に、TMAO血漿レベルは年齢17、性別18、腎機能19,20,21、慢性疾患7,22も反映する。現在までのところ、循環TMAOレベル、ひいては心血管リスクの上昇に対するこれらの各要因の相対的な寄与は不明なままである。血清TMAO濃度がどのように調節されているかを理解することにより、宿主TMAOの機序的標的が明らかになり、循環TMAO濃度を低下させるための修正可能で実用的な治療因子が同定される可能性がある。

ここでは、データ駆動型の "説明可能な "機械学習（ML）戦略23、疫学データの多変量解析および単変量解析、培養細胞やげっ歯類を用いたメカニズム研究を用いて、欧州の多施設共同MetaCardis研究参加者における血清TMAO値に影響を及ぼす変数を客観的に同定することを試みた。さらに、MetaCardis研究のユニークな横断的デザインを利用し、循環TMAOに影響を与える変数が、心代謝性疾患のさまざまな段階でどのように現れるかを調べた。ML解析を活用して、我々は、(i)新規の宿主TMAO関連機序標的を同定し、(ii)循環TMAOレベルを低下させ、それによって関連する過剰な心血管リスクを低下させうる将来の介入の根拠を同定することを目的とした。

疫学的研究では、腎機能が空腹時血清TMAO濃度を一貫して制御する主な修正可能因子であることが観察され、われわれの前臨床研究は、上昇した循環TMAOが腎線維傷害を増加させることによって腎機能に悪影響を及ぼすという示唆と一致している。腎機能と空腹時血中TMAOの間に強い相互作用があることをさらに裏付けるものとして、腎保護作用25が証明された新世代の抗糖尿病薬（GLP-1受容体作動薬24；GLP-1RA）を処方されたコホートのT2D患者は、傾向スコアをマッチさせた対照群と比較して、血清血中TMAO濃度が低かった（図1）。

図1：試験デザインの概要と主な所見。
図1
ここでは、多施設共同ヨーロッパMetaCardis研究において、血漿中TMAO濃度に寄与する宿主パラメータを客観的に特徴付けるために、機械学習（ML）、多変量解析、単変量解析、媒介解析からなる統合的アプローチを用いた。その結果、腎機能が空腹時血清TMAO濃度を一貫して調節する主な修正可能因子であることが観察され（図2-4）、TMAOが腎臓の瘢痕化を増加させる前臨床モデルにおける疫学的知見が裏付けられた（図5）。さらに、腎機能と空腹時循環TMAOとの間に強い相互作用があることを裏付けるように、腎保護作用を有する新世代の抗糖尿病薬（GLP-1受容体作動薬；GLP-1RA）を処方されたコホートのT2D患者は、傾向スコアでマッチさせた対照群と比較して、血清循環TMAO値が低かった（図6）。BioRender.comで作成。

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結果
最初の解析では、MetaCardis集団の疾患分類によってTMAO濃度がどのように変化するかを調べた。その結果、循環TMAOは、これまでの報告7,22と同様に、心代謝性疾患の重症度に応じて有意に増加することが確認された（補足図1A）。心代謝性疾患の前駆期に発現する循環TMAOの決定因子を同定するために、我々はMetaCardisコホートのうち、メタボリックシンドロームの様々な特徴を呈するが、明らかなT2Dや虚血性心疾患（IHD）ではない肥満/過体重の人からなるMetaCardis Body Mass Index Spectrum subset（BMIS26; N = 837）と呼ばれるサブセットに注目した（補足表1）。

BMIS MetaCardis集団におけるTMAOの空腹時血清濃度と心代謝プロファイルの悪化との関連
われわれは、BMIS集団において、TMAOが心代謝系の健康に関連する生物臨床的変数とどのように相関するかを検討した。この集団では、循環TMAOは、年齢、性別、採用国（その後の人口統計学）、肥満度（BMI）で調整した後、推算糸球体濾過量（eGFR、スピアマンのrho＝-0.124、pFDR＝0.06）の減少値および尿酸の空腹時濃度の上昇（rho＝0.114、pFDR＝0.09）と関連していた（補足図1B）。TMAOの高値はまた、人口統計学的に調整した後、BMI（rho＝0.107、pFDR＝0.09）、内臓体脂肪率（rho＝0.122、pFDR＝0.09）およびウエスト周囲径（rho＝0.119、pFDR＝0.09）を含む中枢性脂肪率の指標とも正の相関を示した（補足図1C）。さらに、高血圧（収縮期血圧140mmHg以上、または高血圧治療を受けている；「方法」）のBMIS患者では、血漿TMAOが高かった（P = 0.01、Mann-Whitney検定；補足図1D）。先行研究7,20と同様に、k-means27を用いてBMIS参加者をTMAOクラスターに客観的に分けたところ、TMAO濃度が最も高いクラスターに属する者は、TMAO濃度が最も低いクラスターに属する者と比較して、一貫して心代謝形質が悪く、有意に高齢であった（補足図1Eおよび補足表2）。心代謝リスクの形質には、eGFRの変化、肝酵素の上昇、収縮期血圧が含まれた（補足図1F-I）。

年齢と腎機能の変化がBMISにおける循環TMAOの主な要因である。
どの変数（補足データ1）が循環TMAOに最も影響を与えるかをよりよく理解するために、極端な勾配ブースト決定木モデルを訓練した。5重クロスバリデーションを用いて、100回の反復後に、BMIS参加者の血漿TMAOに対する各変数群の説明分散（EV）を予測した（図2A）。微生物叢組成だけでは、TMAO産生に大きく寄与するとされるもう一つの要因である食事の説明がTMAO分散の5％未満であったのに対して（EV 2％）、低い結果であった。TMAOとその前駆体TMAを除いた血清メタボロミクスは最良の予測因子（EV 12％）であり、人口統計学は2番目で、循環TMAO変動の10％を説明した。TMAOとジメチルアミンを除いた1H-NMR尿メタボロミクスは、TMAO分散の1.5%を説明する最悪の予測因子であり、1H-NMRによって計算された尿クレアチニンを補正しても（「方法」）、TMAO分散の平均1%を説明する予測値は改善しなかった（補足図2A）。すべての変数群を含むフルモデルは、平均してTMAO変動の18.4％を説明した。フルモデルによる平均予測TMAO値は、測定TMAO値と有意に相関した（rho = 0.473, P < 2.2 × 10-16; 補足図2B）。

図2：BMIS MetaCardis参加者では、年齢と腎機能に関連するパラメータが循環TMAOの主な要因となっている。
図2
A 各特徴カテゴリーからの変数（各グループに含まれる変数については補足データ1）、またはフルモデル（全変数）のみを用いて訓練した左アウトグループ（n数およびxgboostパラメータについては補足表3）における5重クロスバリデーション後、xgboostアルゴリズムによって決定された予測循環TMAOレベルの決定係数（説明分散；EV）、100反復後。B (A)と同様にトレーニングした血漿TMAOのフルモデル予測に対する各特徴カテゴリーの平均独立予測寄与度。100回反復後、各特徴グループに属するすべての変数を除去した後、フルモデル（100％に設定）に対して達成されたEVの平均削減量として計算。C 各特徴カテゴリで訓練されたxgboostアルゴリズムによって決定された、正則化TMAO標準偏差のモデル予測に4%以上寄与するすべての変数に対する、完全な表現型データを持つ各BMIS個体（N = 582）のモデル出力（SHAP値）への影響の群プロット。すべてのBMIS参加者（N = 582）の平均絶対SHAP値が、各変数の横に（降順で）示されている。各参加者を表す個々の点は、対応する変数の逆正規化値で色付けされている。Uは尿中代謝物を示す。D BMIS（N=837）の各個人について、生物臨床変数で訓練されたアルゴリズムから計算されたeGFR値（x軸）対モデル結果（y軸）へのそれらの影響の従属プロット、垂直赤線は90mL/分/1.73m2を示す。曲線は局所重み付け散布図平滑化（LOWESS）を用いて描かれ、斜線部分は95％信頼区間（CI）を示す。E BMIS参加者の循環TMAOのEV（R2）を、臨床的危険因子29、完全モデル、またはSHAP分析によって決定された、予測値に対する正則化TMAO標準偏差の4％以上に寄与する24変数すべてについて、100回反復した後のアルゴリズムから計算した箱ひげ図。有意性は両側Matt-Whitney検定により決定した。F血清TMAO（対数変換）と推定糸球体濾過量（eGFR、ml/分/1.73 m2）の相関を示す線形回帰ベースの散布図。挿入；未調整Pearsonのr、P値および説明分散（R2）。網掛け部分は95％信頼区間を示す。A、E 中央線は中央値、枠線は25パーセンタイルと75パーセンタイル、ひげは最小値と最大値を示す。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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次に、我々は、上記のようにアルゴリズムをトレーニングするが、100回の反復で一度に1つの特徴グループを除去することにより、完全モデルの予測力に対する各変数グループの独立した寄与を評価した。フルモデルの説明可能な分散（100％に設定）のほぼ40％が血清メタボローム変数によって寄与され、生物学的変数、食事変数、微生物叢分類学的変数がそれぞれ5.5％、4％、3.4％の独立に説明可能な分散を追加した（図2B）。その他の変数カテゴリーでは予測への寄与はごくわずかであり、メタボローム、メタゲノム、生物学的および食事データセットとの情報重複がかなりあることが示唆された。

特徴帰属分析（SHapley Additive exPlanations; SHAP23,28）を用いて、個々の変数がTMAO予測モデルをどのように駆動するかを評価した。SHAP分析により、正則化TMAO標準偏差（SD）の4％以上がモデル結果に寄与した24変数が同定された。その中で、年齢が最も予測に影響を与え、次いでeGFR、尿中ベタイン、内臓脂肪率、血清ブチリルカルニチンが続いた（図2C）。eGFRの他に、血漿尿素29、尿毒症性毒素p-クレゾール30、腎機能低下マーカー（血清アルブミン29）を含む腎機能に関連する変数が、モデルの結果に最も影響を与えた。この分析は、腎機能が循環TMAOの主要な決定因子であることを示唆している。BMIS個体のモデル結果に対するeGFRの影響は二峰性で、成人の腎機能正常の臨床的カットオフ値25である90mL/分/1.73m2以上の値は血漿中TMAOの減少を予測し、それ以下の値は予測循環中TMAOの増加をもたらした（図2D）。

次に、SHAP解析で同定された24の変数を用いてTMAOを予測するアルゴリズムを訓練し（「top SHAP」モデル）、従来の臨床的危険因子31やフルモデルで訓練したモデルと比較した（図2E）。トップSHAP」モデルは、フルモデルと比較して有意に（P＜2.2×10-16、Mann-Whitney検定）予測値を向上させた（平均でEV 21％対18％）。これはおそらくノイズを除去したためであり、SHAP分析によって同定された変数の重要性を裏付けている。

ツリーベースのMLモデルが我々の分析に最も適切であることを確認するために、我々はまた、BMISの入力として利用可能なすべての変数（フルモデル）を使用して、再び5重クロスバリデーションを使用して、左アウト群における循環TMAOを予測するためにLeast Absolute Shrinkage and Selection Operator（LASSO）モデルを構築した（N = 582; "方法"）。LASSOは、100回の反復後、循環TMAOの分散の平均14.9%を説明した（補足図3A；各反復のλとR2値についてはソースデータを参照）のに対し、フルモデルのブーストツリーでは18.4%であった（図2A）。この分析結果は、我々の集団における循環TMAOの予測にツリーベースのMLモデルが適切であることを裏付けている。

TMAOおよびMLモデルでTMAOレベルと最も強く関連した他の代謝物（図2C；ブチリルカルニチン、ベタイン、p-クレゾール、ベタイン_U、オキサロアセテート_U）の分散のうち、eGFRによってどの程度説明されるかを調べるため、各代謝物を従属変数、eGFRを独立変数とする線形回帰モデルを構築した。腎機能はBMISにおけるTMAOの分散の7％を説明した（図2F；Pearsonのr = -0.26、P = 5.4 × 10-14、N = 837）が、他の代謝物の説明された分散は、p-クレゾールと尿中オキサロ酢酸でそれぞれ6％～1.4％であった（補足図4A～E）。代謝物とeGFRのさまざまな関係をさらに評価するために、TMAOと同様の方法で、血清メタボロミクスを入力変数としてeGFRを予測するブーストツリーモデルを計算しました。血清メタボロミクスは、100回の反復後にeGFR分散の平均25%を予測した。TMAOは、糸球体への排他的分泌が報告されている32と同様に、我々の分析におけるすべての代謝物の中で、eGFR予測に最も強く影響する微生物叢由来化合物のトップであった（補足図4F）。この分析を総合すると、我々の集団ではTMAOがeGFRと強く関連していることが示唆される。

TMAOと腎機能との間には逆相関があり、主に慢性腎臓病（CKD）10,19,20,32,33,34の患者において顕著であった。本研究の新規性には、循環TMAOレベルに寄与する多数の因子の順位付けと、非CKD集団における心臓代謝疾患スペクトルにわたる修正可能な因子のトップとしての腎機能の同定が含まれる。

食事と微生物叢組成は、BMIS患者の空腹時血清TMAO値に緩やかな影響を与える。
我々のMLモデルは、食事が循環TMAOを決定する上でささやかな役割を果たしていることを示唆した。これを裏付けるために、BMIS参加者において、TMAO食餌性前駆体3を多く含む食品の摂取が循環TMAOにどのように影響するかを、食物摂取頻度調査票35（FFQ；N＝763）を用いて評価した。人口統計およびBMIで補正した結果、脂っこい魚（rho = 0.125、pFDR = 0.03）を除いて、循環TMAOは赤身肉、卵、牛乳の習慣的摂取とも、微量栄養素であるコリン、カルニチン、ベタインの推定食事摂取量とも有意な関連はみられず、先行研究3とほぼ一致した（図3A）。さらに、これらの食品の摂取量とTMAO前駆体であるコリン、ベタイン、γ-ブチロベタインの血清レベルとの間に有意な相関は認められなかった36。逆に、循環TMAOは血漿コリン、ベタイン、γ-ブチロベタインと正の相関を示し、TMAO前駆体の血清濃度との関連を示唆した。我々の集団において、食事、特に肉類の摂取はTMAO濃度の上昇と関連しないという知見は、肉類の摂取またはL-カルニチンの補充とTMAOの循環濃度との間に明確な関連を立証した、多くの十分にデザインされたヒト介入試験9,10,11と矛盾するものではない。その代わりに、我々の解析を総合すると、ほとんどの人が毎日肉を摂取している非介入的な環境（ヨーロッパの成人で75-233g/日37）では、TMAO前駆体の食事摂取量ではなく腎臓によるクリアランスが、空腹時TMAO循環レベル、したがってTMAO上昇に関連する過剰な心血管リスクの主要な決定因子であることが示唆される（ベジタリアンや厳格な菜食主義者は別として、MetaCardisコホートでは65/1741人の参加者だけが赤肉摂取がないと報告しており、頻度は低い）。

図3：BMIS MetaCardis被験者において、食事と微生物叢組成が循環TMAOに及ぼす影響はわずかである。
図3
A 血中TMAOとその前駆物質と、TMAO前駆物質を多く含む食品の習慣的摂取（N = 763；左パネル）またはその前駆物質自体との関連（右パネル）。B 種レベル（入力；BMIS集団の少なくとも20％に存在する699種）でk-meansアルゴリズム（1が最低、4が最高）によりTMAOクラスターに層別化した参加者（N = 834）のBray-Curtis非類似度行列の主座標分析。挿入；年齢、性別、および採用国を共変量とした、正規化TMAOレベルと関連する分類学的Bray-Curtis非類似度行列のPERMANOVA（999反復）。C BMIS参加者（N = 763）における、循環TMAO（年齢、性別、採用国、BMIで調整したスピアマン偏相関）およびTMAO前駆物質を多く含む食品の摂取と有意に関連するマイクロバイオーム分類群の重なり。D最低TMAOクラスター（N = 101）と最高TMAOクラスター（N = 147）におけるBMIS参加者間の細菌種存在量の差のボルケーノプロット（青；有意に枯渇した分類群、赤；それぞれ高TMAOクラスターで有意に濃縮された分類群、両側Mann-Whitney U検定、pFDR<0.05）。E我々の3つの補完的分析（SPCスピアマン相関、ML機械学習および特徴帰属分析、MU：高TMAOクラスターと低TMAOクラスター間の両側マン・ホイットニーのU検定）に従って、循環TMAOに関連する分類群間の重複をまとめたベン図。すべて*pFDR <0.05、**pFDR <0.0.01。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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血清血漿TMAOに影響を及ぼす推定微生物分類群を同定するために、多変量解析と単変量解析を行った。TMAOクラスターに層別化したBMIS個体について、種レベルのBray-Curtis非類似度行列の主座標分析を行ったところ、クラスター間で微生物叢組成に有意差があることが明らかになった（P = 0.033；図3B）。以前の報告3,38および我々のMLモデルと一致して、多変量PERMANOVA解析では、人口統計学的調整後に、循環TMAOと微生物叢組成との間に、弱いながらも有意な関連があることが明らかになった（P = 0.001; R2 = 0.008、図3B）。TMAOレベルは、人口統計学とBMIで補正した後、BMIS個体における65種の細菌（細菌負荷で補正）の量的存在量と有意に関連し、主に（44/65）固形化門の細菌であった（図3C）。Liら3.と一致するように、BMIS参加者（N = 761；図3C）において、循環TMAOと関連する細菌と、赤肉、牛乳、卵の摂取量が多いこととの重複は確認されなかった。低TMAOクラスターと高TMAOクラスターを比較したところ、これら2つのグループ間で215の異なる細菌種が存在することが明らかになった（図3D；マン・ホイットニー検定）。

さらに、予測モデルにおいてTMAO SDの少なくとも4%に寄与し、相関分析および存在量差分析ともに有意（pFDR <0.05）であった唯一の細菌種、分類学的にruminoccociに近縁な未知の細菌（CAG01909）の循環TMAOへの影響を分析した（図3E）。CAG01909は、TMAOが低いクラスターと比較して、TMAOが高いクラスターでより豊富で広く見られた（補足図5A、B）。最後に、CAG01909を保有するBMIS個体は、それを保有しない個体よりも有意に循環TMAOが高く（補足図5C）、CAG1909の存在量はTMAO濃度と有意に相関した（補足図5D）。

この解析は、循環TMAOに対する微生物叢の変異の寄与は小さいが有意であることを示唆するMLモデルを裏付け、BMISにおいて血清TMAOの上昇と新たに関連する細菌を同定した。

異なる疾患群における循環TMAOシフトを予測するシグネチャー
異なる疾患群における循環TMAOレベルを駆動する推定共通の変数を同定するために、T2D（N = 561）とIHDサブ集団（N = 356）についてMLアルゴリズムを訓練した。BMISと同様に、微生物叢組成と食事変数だけでは、T2DとIHDでは、TMAOの分散のそれぞれ平均2％と1％を説明する程度であった（それぞれ図4Aと補足図6A）。T2Dコホートでは、血清メタボロミクスが再び最良の予測因子となり（EV 12.8%）、次いで生物臨床変数（EV 9.6%）、人口統計変数（EV 8.7%）となり、フルモデルでTMAO分散の16.2%が説明された。IHDの場合、血清メタボロミクス（EV 19.5%）を除く個々の特徴カテゴリーは、フルモデルが循環TMAO分散の16.1%を占めるという低い結果であった（補足図6A）。特徴帰属分析により、T2Dコホートでは19変数、IHDコホートでは10変数が、正則化TMAO SDの4％以上をモデル結果に寄与していることが明らかになった（それぞれ図4Bおよび補足図6B）。T2D患者では、モデル結果はほとんどeGFRに影響され、次いで年齢と、同じく腎機能を示す尿毒症毒素p-クレゾール30とD-threitolの血清濃度に影響された39。IHD患者では、血清ブチリルカルニチン、次いで年齢、白身肉と赤身肉の摂取量比に関連するalternative healthy eating score（aHEI）、有害な心臓リモデリング40のマーカーである炎症性サイトカインIP10の値が上位変数となった。BMISの場合と同様に、臨床的危険因子やフルモデルでトレーニングしたモデルと比較すると、"トップSHAP "モデルは予測値を有意に改善した（T2DではEV24％対16.2％；図4C、IHDではEV21.3％対16.1％；補足図6C）。

図4：異なる疾患群における循環TMAOシフトを予測するシグネチャーと、加齢に伴うeGFR低下をTMAOが仲介する因果関係。
図4
A T2D MetaCardis患者において100回反復した後、各変数カテゴリーからの変数（各グループに含まれる変数のリストについては補足データ1）、またはフルモデル（すべての変数を含む）のみを用いて訓練されたブースト決定木（変数グループごとのN数および最適化されたxgboostパラメータについては補足表4）によって決定された予測血清TMAOレベルの説明分散（EV）。B 完全な表現型データを持つ各T2D MetaCardis参加者（N = 387）のSHAP値（モデル結果への影響）の群プロット；各特徴カテゴリで訓練されたxgboostアルゴリズムから計算された、正則化TMAO標準偏差のモデル予測に4%以上寄与するすべての変数について、個々の点で表される。数字は、対応する変数の隣にある、すべてのT2D参加者の平均絶対SHAP値（降順）を示す。ドットは、対応する変数の逆正規化値で色付けされている。C臨床的危険因子31、すべての変数を含む完全モデル、またはSHAP解析によって決定されたT2Dモデル予測に正則化TMAO標準偏差の4％以上に寄与するすべての変数を含むアルゴリズムによって計算されたT2D個体における循環TMAOの説明分散（EV；R2）を100回反復後に描いた箱ひげ図。D MetaCardis疾患群の少なくとも1つにおいて、SHAP分析によって決定されたモデル予測において、正則化TMAO標準偏差の少なくとも4％に寄与するすべての変数を描いたヒートマップ。*Μ平均SHAP絶対値＞0.04。E Mediation analysis（「Methods」参照）：BMIS（青）、T2D（赤）またはIHD（オレンジ）のMetaCardis参加者における、加齢に伴うeGFR低下に対するTMAOの直接効果を計算する。ADE：（eGFRに対する加齢の）平均直接効果；ACME：（eGFRに対するTMAOの）平均因果媒介効果；合計効果：（eGFRに対する加齢とTMAOの累積効果（ADE＋ACME））；媒介効果：（eGFRに対する加齢の効果のうちTMAOに起因する割合）。A, C 中央線は中央値、枠線は25パーセンタイルと75パーセンタイル、ひげは最小値と最大値を示す。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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TMAOのSDの4％以上を占める8つの変数がBMISとT2Dの間で共有されており、その中にはeGFR、年齢、p-クレゾールが含まれていた一方、BMISとIHDの間には6つの共通点があった（eGFR、尿素、年齢、ブチリルカルニチンを含む）。3つの変数（eGFR、年齢、ブチリルカルニチン）のみが、3つの疾患群すべてにおいて予測因子として強く寄与した（図4D）。

こうして、年齢と腎機能が空腹時循環TMAO値に影響を及ぼす顕著な変数であることが明らかになった。この関係をさらに立証するために、eGFRが年齢によるTMAO濃度の上昇を因果的に媒介するモデルにデータが適合するかどうかを評価した。このモデルでは、腎機能はBMISにおける年齢と循環TMAO濃度との正の相関の20％程度を媒介する有意性を示し、その影響はT2D（55％）およびIHD（51％）疾患群でさらに強まり（補足図6D）、ML解析の裏付けとなった。

微生物叢組成はT2Dにおける血漿TMAO濃度に緩やかに影響する
T2D患者において、ML解析およびSHAP解析は、糞便中のRomboutsia timonensisの定量的存在量（細菌負荷で補正）と循環TMAOとの間に逆相関があることを明らかにした（図4B）一方、IHDサブコホートではTMAO予測値に強く影響する分類群はなかった（補足図6B）。R. timonensisはTMAO濃度と逆相関し（rho = -0.140、P = 0.0009；補足図7A）、R. timonensisが検出されたT2D患者はTMAO濃度が有意に低く（補足図7B）、R. timonensisはBMIS参加者と比較してT2Dで枯渇しており（補足図7C）、循環TMAOと一致していた（図1A）。逆に、T2DおよびIHDでは、BMISとは異なり、CAG01909の存在量またはその存在は、循環TMAOの上昇とは関連しなかった（補足図7D-5F）。さらに詳しく調べたところ、CAG01909の存在量はメトホルミン摂取量と逆相関していた（rho = -0.141、pFDR=0.042；補足図7G）。TMAOと個々の生物種との関連とは無関係に、BMISと同様に多変量PERMANOVA分析では、人口統計学で調整した後、循環TMAOと微生物叢組成との間に弱いながらも有意な関連（P = 0.001; R2 = 0.005）が明らかになった。

これらの解析を総合すると、腸内細菌叢の組成は、T2D患者におけるTMAOの循環レベルにわずかな影響しか及ぼさない可能性があり、IHDまたはT2Dの被験者においては、CAG01909分類群の豊富さは血清TMAOと関連しないことが示唆される。

推論解析は、TMAOが加齢によるeGFRの低下を因果的に媒介する可能性を示唆している。
ML解析では、TMAOに影響を及ぼす最も顕著な変数として年齢と腎機能が同定された。そこで、TMAOが加齢に伴うeGFRの低下を媒介するかどうかという逆相関を検証した43。BMISでは、TMAOは有意ではあるが、年齢とeGFRの逆相関をわずかに調節した（媒介効果3％、P = 0.018）。一方、T2DとIHDでは、加齢に伴う腎機能低下に対するTMAOの影響が強まった（媒介効果13％、P < 2.2 × 10-16および7.1％、P < 2.2×10-16；図4E）。このように、TMAOは傍観者ではなく、直接的に腎機能に悪影響を及ぼすことが媒介分析によって示された。この知見は、ベースラインのTMAOがeGFRの低下率と正の相関があることを報告した前向き研究21や、TMAO食の補充が腎障害を増加させ44,45、eGFRを低下させたCKDの動物モデルにおける研究と一致している。

興味深いことに、仲介分析によると、TMAOの腎機能に対する悪影響は、心代謝性疾患の重症度が高いほど強まることが示され、TMAOと既存の病態との相乗効果が示唆された（これにより「2ヒットモデル」が提供される）。そこで次に、TMAOと腎機能との相互作用の可能性と、2ヒット目の分子的性質と推定されるものについてのメカニズム的洞察を得るために、腎障害の前臨床モデルを用いた。

TMAOは、TGF-β1シグナル伝達と連動して、ヒト初代腎線維芽細胞の筋線維芽細胞へのトランス分化を亢進させる
TMAOは、腎線維症46と同様に、様々な病因の腎障害19,20と有害な関連があることから、ヒト初代腎線維芽細胞（HRF）に対するTMAOの影響を調べた。HRFでは、血小板47とは異なり、TMAO刺激は急激な[Ca2+]iの増加をもたらした（図5A）。内皮細胞では、ERK1/2経路がCa2+依存的に活性化され48,49、ERK1/2の活性化は腎線維症を悪化させる50。そこでわれわれは、同様の経路がHRFでも働いているかどうかを調べた。TMAOを負荷すると、ヒトの疾患に関連した濃度（10～100μM）で、時間依存的（図5B）および用量依存的（図5Cおよび補足図8A）にリン酸化ERK1/2レベルが上昇した（CKD患者では最高150μM）19。TMAO誘導性のERK1/2活性化はMEK阻害剤で阻害されたことから、活性化はRas-Raf-MEK50の下流で起こることが示唆された。さらに、TMAOに応答したERK1/2活性化は、細胞内Ca2+をキレートした場合（補足図8B）、または細胞外Ca2+を除去した場合（補足図8C）に抑制された。さらに、Ca2+の流入はHRFのERK1/2を活性化するのに十分であり（補足図8D）、TMAOによるCa2+流入がERK1/2の活性化に必要であることが示された。我々は、ERK1/2のリン酸化が、TGF-β150に応答したHRFの筋線維芽細胞へのトランス分化に必要であることを報告した。短期間の適用（30分まで）とは異なり、48時間のTMAO刺激は、ERK1/2またはSMAD3のリン酸化（図5Dおよび補足図8E、F）、あるいは筋線維芽細胞マーカーαSMAの発現（図5Eおよび補足図8G）にほとんど影響を及ぼさなかった。逆に、TMAOをTGF-β1と併用した場合、TGF-β1またはTMAO単独と比較して、ERK1/2経路の活性化と筋線維芽細胞のトランス分化を、SMAD3リン酸化に影響を与えることなく、TMAOの用量依存的に増強した（図5D、Eおよび補足図8E、F）。

図5：TMAOは筋線維芽細胞の分化を促進し、腎線維性傷害を悪化させる。
図5
A Ca2+指示薬Fura-2を負荷し、100μM TMAOで刺激したヒト腎線維芽細胞（HRF）の代表的なレシオメトリック・トレース（340/380nm）。B 血清飢餓状態のHRFを、MEK阻害剤トラメチニブ（10 nM）と30分間プレインキュベートした後、100 µM TMAOで標記時間刺激した。Phospho-ERK1/2レベルはウェスタンブロットでプローブし、膜は剥離して総ERK1/2について再プローブした。C 血清を除去したHRFを指示濃度のTMAOで刺激し、(B)と同様にphospho-ERK1/2レベルと総ERK1/2レベルを測定した。完全培地中のHRFを指示濃度のTMAOで30分間プレインキュベートし、TGF-β1（5nM）またはビヒクルで24時間刺激した。phospho-ERK1/2、phospho-SMAD3（D）およびα-平滑筋アクチン（αSMA）（E）レベルをウェスタンブロットでプローブした。D,E）のΒ-アクチンレベルは、並行してウェスタンブロットでプローブした。B-Eについては、3回の独立した生物学的反復から得られた代表的な画像を示す。F 閉塞腎（UUO；術後5日）または対側の偽手術腎（コントロール）の腎切片（倍率20倍）のαSMAによる免疫染色。動物には通常飼料（コントロール）、0.12% w/wのTMAOを含む飼料（TMAO）、または1% w/wのコリンを含む飼料（コリン）を手術前6週間、指示通りに与えた。G αSMA陽性染色の定量は、染色面積／視野の（％）として、1匹につき5枚の画像を平均した。H 全腎ライセートのウエスタンブロットでαSMAとビメンチンの発現を調べた。ローディングコントロールとしてのチューブリンは、並行してウェスタンブロットでプローブした。コントロール（非結紮腎、チャウ食；C）についてはn＝1匹、他のすべての群についてはn＝6匹を用いたn＝2ウェスタンブロットからの代表的な顕微鏡写真を示す。(H)の(I)αSMAおよび(J)ビメンチンバンドのODをチューブリンに対して正規化。偽コントロールサンプルの正規化密度は任意に1とした。すべてのグラフについて、エラーバーは各群n=4-6匹のデータの平均±SEMを表す。*P<0.05対UUOコントロール。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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TMAOは腎線維症を増加させる：雄マウスにおける介入から得られた証拠
TMAOが直接筋線維芽細胞のトランス分化を増加させることを示唆するin vitroの知見を裏付け、in vivoでの関連性を確立するために、TMAOの影響も受ける可能性のある他の併存疾患51のない腎線維化を評価するモデルであるマウスで、片側尿管閉塞（UUO）手術を行った。雄マウスにコリン（1％w/w）またはTMAO（0.12％w/w）添加食を6週間与えた20。その後、片方の腎臓の尿管を結紮し、もう片方の腎臓は閉塞しないようにした（補足図9A）。閉塞していない（対照）腎臓では、αSMA染色は食事の影響を受けなかった。予想通り、5日間のUUOにより、損傷腎の腎αSMA染色は有意に増加した。しかし、障害を受けていない腎臓とは異なり、TMAOまたはコリン食の補充は、筋線維芽細胞の有意な拡大をもたらした（図5F、G）。腎臓溶解液のウェスタンブロッティングにより、TMAOまたはコリン食を投与されたマウスの損傷腎臓では、αSMAとビメンチン（筋線維芽細胞のもう一つのマーカー50）の発現が増大したことが裏付けられた（図5H-J）。αSMAと同様に、線維性腎障害のもう一つの指標46であるコラーゲン沈着やマクロファージ浸潤は、障害を受けていない腎臓ではTMAOやコリン食の影響を受けなかった（補足図9B-E）。逆に、TMAOまたはコリン食を摂取したマウスのUUO腎から採取した腎スライドのコラーゲン染色およびマクロファージ染色は、コントロールと比較して有意に亢進していた。このように、腎線維症モデルマウスにおける我々の実験では、TMAOまたはコリン食の摂取は、ERK1/2、mTORC1、SMAD3の線維化促進シグナル伝達の「亢進」をもたらした46,50（補足図9F）。

In vivoとin vitroで得られた知見を総合すると、TMAOはERK1/2の高活性化によって腎線維症を相乗的に悪化させ、おそらくTGF-β1を介したSMAD3経路の活性化によって、我々の疾患モデルで二次的な打撃を与えたということになる。

グルカゴン様ペプチド-1受容体アナログ（GLP-1RA）の摂取は、MetaCardis T2D参加者における血清TMAO濃度の低下と関連する。
血清TMAOとeGFRの間に強い双方向の関係があることが明らかになったことから、我々は、レノプロテクト薬の使用が循環TMAOの低下と関連している可能性があると仮定した。適切な薬剤を同定するために、TMAOが腎機能に最も大きな影響を与えると思われるT2Dのメタカーディス患者において、処方された薬剤を入力としてeGFRを予測するアルゴリズムをトレーニングした。SHAP解析の結果、降圧剤と抗コレステロール剤が予測eGFRにマイナスの影響を与えることがわかったが、これはおそらく病気がより進行していることを反映している（図6A）。逆に、抗糖尿病治療はプラスの効果を示し、GLP-1RAが予測eGFRに最も大きなプラスの影響を与える薬剤であった（図6A）。GLP-1RAを投与されたT2D患者は、年齢、性別、高血圧、および疾患群をマッチさせた患者と比較して、循環TMAO（図6B）が有意に低かった（補足図8A-Eおよび補足表6）。この探索的解析は、GLP-1RAが血清TMAO濃度を低下させ、それによって関連するIHDの高いリスクを低下させる可能性を示唆している。

図6：T2Dを有するMetaCardis参加者において、リノプロテクション薬物療法は循環TMAOの減少と関連している。
図6
A MetaCardis T2D患者（N=561）において、処方された薬のみについて学習させたxgboostアルゴリズムによって決定された上位15薬についての、モデルのeGFR予測値（SHAP値）への影響の群プロット。T2Dの参加者の平均絶対SHAP値が、各変数の横に（降順で）示されている。各参加者を表す個々の点は、対応する薬剤変数の逆正規化値で色付けされている。B GLP-1受容体作動薬（GLP-1Ras）を処方されたT2D被験者（N = 59）と、年齢、性別、疾患群、高血圧の状態について傾向一致させたT2D非GLP-1Ras治療被験者（N = 59）との間の循環正則化TMAOレベルの比較（グループ特性については補足表6）。P値は両側Mann-Whitney U検定により決定した。中央の線は中央値、ボックスの限界は25パーセンタイルと75パーセンタイル、ひげは最小値と最大値を示す。C 本研究の主な所見のまとめ。我々は、病期に関係なくeGFRが循環TMAOの主要な修飾因子であることを証明した。TMAOは傍観者であるどころか、年齢による腎出量の減少速度を有意に加速し、その影響は病期が進むほど大きくなる。TMAOは、確立された病態生理と連動して腎線維化を促進し（2ヒットモデル）、腎クリアランスにさらに悪影響を及ぼす。したがって、GLP-1RAのような腎保護作用（赤矢印）を有する薬剤は、循環TMAO濃度を低下させ、腎機能への悪影響を緩和する可能性がある。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。

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考察
疫学的研究、探索的細胞実験およびマウス介入を組み合わせた我々のアプローチにより、腎機能が空腹時血清TMAO濃度を一貫して制御する修正可能な主要因子であること、およびTMAOは、腎組織のTGF-β1シグナル伝達を上昇させる既存の病態生理学と相乗的に腎瘢痕化を増加させることにより、少なくとも部分的にeGFRに悪影響を及ぼすことが示された。我々の所見と一致して、腎保護薬であるGLP-1RA25の使用は、T2DのMetaCardis参加者において循環TMAOの低下と関連していた（図5C）。

心代謝性疾患の重症度に関係なく、腸内細菌叢組成はMetaCardis集団において血清TMAOレベルと有意ではあるが緩やかな（R2 < 0.01）関連を示し、これは最近のヒトの研究3,38と一致した。我々は、循環TMAOとファーミキューテス3,4,5の関連を再現し、未知の細菌（CAG01909）とR. timonensisの間の新しい関連を発見した。しかし、TMAOと関連する分類群は、疾患様式によって異なっていた。このことは、少なくとも部分的には薬物療法が原因である可能性があり、TMAO産生を種レベルで標的化しても効果がないことを示唆している。

最近の研究3とも一致するが、赤肉の習慣的摂取とTMAOの空腹時血清レベルとの間に有意な関連は認められなかった。いくつかの顕著な例外を除いて3、介入後に上昇を示すTMAOレベルに対する食事、特に赤肉とL-カルニチンの寄与は、主に代謝的に健康なボランティアで検討されてきた9,10,11。このような介入では、多くの場合L-カルニチンが栄養補助食品として提供されているが、これは食事性L-カルニチン（～71％）53とは対照的に小腸での吸収率が低く（～12％）、そのため上部消化管や大腸での微生物による異化に利用されやすく、TMA、ひいてはTMAO産生におけるL-カルニチンの役割が過大評価される可能性がある。我々の観察結果は、文献3の報告と同様である。3）の報告と同様、非介入的な環境では、個人が習慣的に肉類を摂取しているため（ヨーロッパの成人で75～233g/日37）、空腹時のTMAO循環変動への寄与はごくわずかであり、厳格な菜食主義者やベジタリアンは別として、非介入的な環境では、TMAOレベルに対する食事操作の単独効果は限定的である可能性が示唆された。

さらに、我々の解析から、循環TMAO濃度の上昇、ひいては心血管リスクの上昇に関連するマルチオミクスシグネチャーは、BMIS、T2D、IHD疾患群で構築されたモデルにおいて、3つの変数（年齢、eGFR、血清ブチリルカルニチン）のみが一貫して強力な寄与因子であり、インスリン抵抗性の上昇を伴う肥満から明らかなT2DおよびIHDへとシフトしていることが明らかになった。このことは、代謝異常のマーカーの大部分が心代謝性疾患発症の初期に現れるという我々の最近の報告と一致している31。ブチリルカルニチンの蓄積は、T2D54におけるミトコンドリアの脂質β酸化異常と関連しており、TMAOとミトコンドリア機能障害との関連を示唆している。これは、TMAOがプロテインキナーゼR様小胞体キナーゼに結合し、ミトコンドリアストレスを増加させるという知見と一致している55。

TMAOは傍観者ではなく、加齢による腎機能低下の速度を有意に加速し、その影響は病期が重くなるほど大きくなることが媒介解析で示された。これと一致して、われわれの前臨床研究では、TMAOが腎線維芽細胞をプライミングして、腎臓の主要なコラーゲン産生細胞である筋線維芽細胞に転換させ46、腎線維症に寄与することが明らかになった。しかし、腎線維芽細胞を筋線維芽細胞に変化させるには、TMAO刺激だけでは不十分であり、既存の病的状態、すなわち、最も顕著な線維化促進サイトカインであるTGF-β1刺激による線維化促進シグナル（「セカンドヒット」）との相乗作用が必要であった46。TGF-β1の発現は、結紮したUOOマウスの腎臓56や糖尿病性腎症患者の腎臓57で増加し、循環TGF-β1は高血圧、脂質異常症、T2D58などCKDの危険因子となる病態で上昇する。したがって、TMAOが既存の線維化促進シグナル（すなわちTGF-β1；「セカンドヒット」）と協調してeGFRの低下を促進することは、CKDの動物モデル44,45やヒト20,21における観察と一致している。

TMAOは、少なくとも部分的には腎臓に影響を与えることによって、既存の病態とともに心血管系疾患の進行を促進するという我々の主張を裏付けるように、TMAOはeGFRが90mL/min/1.73m2未満の人においてのみ全死亡を増加させ（文献59参照）、健康な成人の循環TMAOレベルは将来のアテローム性動脈硬化負荷の指標とはならなかった60。

TMAOは、確立したIHDまたはCKD患者18,19における心血管疾患と死亡の独立した危険因子であり、直接的な因果関係を示唆する証拠が蓄積されている47。われわれの研究は、TGF-β1シグナルを増加させることが知られている危険因子（すなわち、高血圧やT2D58）が存在し、循環TMAOが高い患者において、レノプロテクション戦略が循環TMAOを低下させ、腎機能を維持する可能性があることを示唆している。実際、我々は、心血管系を保護し、有益な効果をもたらすことが報告されているGLP-1RA24,25を処方されたT2D患者は、傾向スコアをマッチさせた対照群に比べ、空腹時血漿中TMAO濃度が有意に低いことを観察した。微生物叢組成の違いはGLP-1RA摂取に対する血糖反応の予測因子であり61、血糖コントロールの改善とは無関係と思われるGLP-1RAによる腎保護作用に影響する因子を決定するためにはさらなる研究が必要である62。

これらの知見を総合すると、eGFRは病期に関係なく、循環TMAOの主要な修飾因子であり、このTMAOは確立された病態生理学（"second-hit "モデル）と連動して腎線維化を促進することにより、腎機能にさらに悪影響を及ぼすことが明らかになった。従って、我々は、GLP-1RAの摂取が循環TMAOレベルの低下と関連していることを観察し、それによって、TMAOの腎機能に対する悪影響を緩和する可能性があり、大規模な医薬品臨床試験で腎保護作用が観察されたこれらの薬剤の推定されるメカニズムを示唆している25。

我々の研究は、非介入的な環境において、様々な心代謝性疾患負荷のあるヒトにおいて、TMAOレベル（およびそれに関連する心血管リスク）がどのように調節されているかについての理解を、概念的に前進させるものである。さらに、高血圧やT2Dなどの既存の合併症（TGF-β1シグナルを上昇させることが知られている）と関連して、TMAOと腎線維症との間に直接的な機序的関連があることを明らかにした。さらに、我々の知見は、危険因子（T2D、高血圧、メタボリックシンドローム）が存在し、TMAOの循環量が多い患者において、腎機能を維持する治療法が心血管リスクを著しく低下させ、有益であることを示唆している。このことは、縦断的な独立臨床試験で早急に検証する価値がある。

研究方法
MetaCardis試験のデザインと募集
MetaCardisは横断研究であり、2013年から2015年にかけてデンマーク、フランス、ドイツで募集された18～75歳の代謝異常とIHD重症度（代謝的に健康、メタボリックシンドロームおよび/または肥満、T2D、IHDの範囲）の段階が上がる患者を対象とした。本試験の組み入れ基準を満たす参加病院の管理下にある患者に登録を呼びかけた。健康な対照者は一般広告で募集した。研究参加者は書面によるインフォームド・コンセントを提供し、研究はヘルシンキ宣言IIに従って実施された。倫理的承認は、CPPイル・ド・フランス倫理委員会、デンマーク首都圏倫理委員会（H-3-2013-145）、ライプツィヒ大学医学部倫理委員会（047-13-28012013）から得た。試験デザイン、募集および除外基準については広く述べられている26,31,41,63。この試験の包括的な目標は、腸内細菌叢の質的および量的な変化が、心代謝性疾患（CMDs）とそれに関連する併存疾患の病態に及ぼす影響を調査することであった（ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02059538）。本研究では、患者を3群に分類した： BMIスペクトラム患者（BMIS26；N＝837）は、メタボリックシンドロームに関連する危険因子または状態（米国心臓協会64の定義による高血圧、世界保健機関65の定義による肥満、国際糖尿病連合66の定義によるメタボリックシンドローム）を有するMetaCardis参加者を含み、2型糖尿病（米国糖尿病協会67の定義によるT2D；N＝561）または虚血性心疾患（IHD；N＝356）と診断された患者を含む。IHD群は、急性（15日未満）冠症候群（ACS；N＝106）、慢性IHD（CIHD；N＝157）で心エコー検査による左室駆出率（LVEF）が正常の患者、および心不全患者（HF；N＝93、LVEF＜45％）で構成された。心代謝性疾患は、上記のすべての症例の包括的な用語として用いられ、心代謝性疾患の重症度は、この原稿では、肥満のような単一の危険因子から明白なT2Dおよび心臓の表現型（虚血性心疾患および心不全）への進行を意味する。

サンプルと表現型情報の収集
生体流体および生体物質の収集については、他の文献に記載されている26,31,41,63。簡単に説明すると、血液サンプルは一晩絶食の後、朝に採取し、糞便サンプルは参加者が自宅で採取し、直ちに凍結し、48時間以内にドライアイスで研究センターに移送した。病歴、投薬、表現型の情報は、26,31,41,63の記述に従って、各センターで標準化された手順で収集された。参加者は、カスタマイズした食物摂取頻度調査票（FQQ）を用いて習慣的な食物摂取を報告した。FQQに対する参加者の回答は、確立された慣行35に従って、研究参加者のサブセット（N = 324）について3回のウェブベースの食事リコールにより検証された。生物臨床的変数は、標準的な手順31に従って単一施設で測定された。推算糸球体濾過量（eGFR）は、民族調整なしのCKD-EPI式で算出した68。

代謝プロファイリング
1H-核磁気共鳴（1H-NMR）分光法
スペクトルの取得はAvance spectrometer（Bruker）を用いて600MHzで行った。絶対定量は、"In Vitro Diagnostics for research" (IVDr) 定量化 BI-Quant-UR アルゴリズム (Bruker, https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr-clinical-research-solutions/b-i-quant-ur.html, v1.1) を用いて行った。一部の分析代謝物については、絶対定量値をクレアチニン濃度で割りました。

ガスクロマトグラフィー結合質量分析（GC-MS）
血清サンプル（100 µl）は、31,41の記載に従って調製、分析、処理された。簡単に説明すると、タンパク質をメタノール沈殿させ、メタノールを蒸発乾固し、誘導体化した後、サンプルを Agilent 7890B-5977B Inert Plus GC-MS システムに注入した。クロマトグラフィーカラムは Agilent ZORBAX DB5- MS (30 m × 250 µm × 0.25 µm + 10 m Duragard) を使用しました。温度勾配は37.5分で、質量分析計は50～600 m/zの間でフルスキャンモードで操作した。ピークは、Fiehn ライブラリ (Agilent G1676AA Fiehn GC/MS Metabolomics RTL Library, User Guide, Agilent Technologies, https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G1676-90001_Fiehn.pdf)を使用してアノテーションしました。再現性または直線性の低い代謝フィーチャーはデータセットから削除され、102 の代謝フィーチャーがアノテーションされました。

超高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析 (UPLC-MS/MS)
UPLC-MS/MSは、Acquity BEH HILIC（2.1 × 100 mm、1. 7 µm）クロマトグラフィーカラムを使用し、TMA、TMAO、コリン、ベタイン、γ-ブチロベタイン、ベタインアルデヒド、ブチリル-カルニチン、イソバレリル-カルニチン、OH-イソバレリル-カルニチン、ステアロイル-カルニチン、オレオイル-カルニチン、リノレイル-カルニチン、ミリストイル-カルニチン、ラウロイル-カルニチン、デカノイル-カルニチンを既述の方法で測定した31,41。すべてのMetaCardis参加者のTMAO循環値は対数10変換され、その後中央値が差し引かれ、標準偏差23（SD；全体を通して正規化されたTMAO値）で割られた。データの取得と解析には、MassLynxTM ソフトウェア（Waters 社、v4.2）を使用した。

メタゲノム解析
文献26,31,41,63に広く記載されているように、細菌負荷量を補正した後、文献69で考案されたプロトコルを用いて、系統的な微生物叢プロファイルを構築した。69で考案されたプロトコルに修正を加えた。簡単には、国際ヒトマイクロバイオーム標準（IHMS）ガイドライン（SOP 07 V2 H）に従って全糞便DNAを抽出し、イオンプロトンテクノロジー（ThermoFisher Scientific）を用いてサンプルの塩基配列を決定した。遺伝子アバンダンスプロファイリングは、ヒトマイクロバイオームの990万遺伝子統合リファレンスカタログを用いて、記載26,31,41,63のように行った。メタゲノムデータの処理には以下のライブラリを使用した： METEOR (v.3.2; https://forgemia.inra.fr/metagenopolis/meteor)、Alientrimmer v0.4.0、Bowtie2 v2.3.4、MetaOMineR (momr、v1.31)、Omixer-RPM (v1.0)。

カスタマイズ微生物モジュール解析 (GMM)
ヒト腸内細菌叢に関連する嫌気性細菌および古細菌の発酵プロセスに焦点を当て、手動でキュレーションしたカスタマイズモジュールセットを、以前に広く記述された26,31,41,63に従って組み立てた。

統計解析
統計解析はR（v4.03; R Core Team (2020). R: A language and environment for statistical computing. R (v4.03) Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL: https://www.R-project.org/）を用いた。2群の比較にはMann-Whitney U、多群の比較にはKruskal-Wallis検定を用いた。非調整スピアマン相関はRを、調整スピアマン相関はppcor（v1.1）を用いて計算した。P値はBenjamini-Hochberg法を用いて多重比較の補正を行った。

機械学習（ML）分析
変数グループ
患者の表現型変数は10のグループに分けられた（補足データ1）。具体的には、生物学的パラメータには、脂質、糖化ヘモグロビン、クレアチニン、eGFRを含む生化学的および臨床的血清検査値が含まれた。臨床的パラメータは、病歴、BMI、収縮期および拡張期血圧、人体計測値、便の回数と種類であった。人口統計学的情報には、年齢、身体活動、教育水準、所得水準、喫煙の有無、民族性、採用国が含まれた。薬剤変数には、一般的な薬剤の摂取状況41、過去5年間の抗生物質の服用回数、降圧剤、抗糖尿病剤、脂質低下剤の服用回数が含まれた。食事パラメータには、37の食品項目の習慣的摂取量、これらの食品項目から算出される1日の栄養素摂取量35、alternative Healthy Eating70（aHEI）、Dietary Approaches to Stop Hypertension71（DASH）、Dietary Diversity72（DDS）スコアが含まれた。臨床的危険因子の変数には、年齢、収縮期および拡張期血圧、糖化ヘモグロビン値、空腹時コレステロール値、喫煙状況、ウエスト周囲径が含まれた31。血清メタボロミクスは、GC-MSまたはUPLC-MS/MS31,41によって測定された116種類の循環代謝物の絶対値または相対値で構成された。尿メタボロミクスには、IVDrアルゴリズムで計算された1H-NMRスペクトルから47の尿代謝物の絶対定量が含まれた。微生物叢変数には、微生物負荷量を補正したMetaCardis患者の少なくとも20%に存在する699の細菌種の存在量と、相対的微生物遺伝子存在量のPCAによる最初の10主成分が含まれた31,41。マイクロバイオーム（モジュール）グループには、116の手動でキュレーションした細菌モジュールの存在量が含まれた31。すべての場合において、カテゴリー変数はcaret (v6.0.86)を用いてダミー変数に変換した。

ブースト決定木（Xgboost）
xgboostアルゴリズム（v1.3.2.1）73に基づく勾配ブースティング決定木を使用し、文献23の戦略を共用して、正則化された循環TMAOレベルを予測した。Xgboostは、表形式データのKaggleコンペティションにおいて、常に他のアルゴリズムを凌駕している。10個の変数グループ（補足表5）のそれぞれについて、5重クロスバリデーションと早期停止を伴う2つの逐次ハイパーパラメータグリッド検索（各特徴グループに対して合計972通りのパラメータの組み合わせ）を用いてxgboostモデルを最適化し、平均二乗誤差（RMSE）を用いて左アウトグループの平均中心および単位分散スケール（正則化）TMAOレベルを予測し、モデルの結果を評価した。パラメータ最適化後、各群の変数またはすべての変数（フルモデル）を入力として、5重クロスバリデーションを用いて100回反復し、循環TMAOを予測した。各ラウンドについて、yardstick(v0.0.7)のrsq関数と予測された正則化TMAO値を用いて決定係数を計算した。クロスバリデーション中に各患者グループ参加者の80％で訓練されたXgboostモデル（各ラウンドで5つ）は保存され、取り残されたグループの特徴帰属分析に使用された（下記参照）。

オーバーフィッティングのリスクを最小化するため、4つのステップを踏んだ：

1.モデル・パラメータ最適化ステップの間、予測が10ラウンド改善されない場合、トレーニングは停止された（early_stopping_rounds = 10）。

正則化パラメータλとγをモデルに組み込み、モデルをより保守的にした23。

3.オーバーフィッティングを最小化する方法として、各変数グループの利用可能な変数の0.8-0.9（パラメータ最適化によりcolsample_bytree=0.8-0.9、具体的なモデルパラメータは補足表4-6）を各ツリーのトレーニングに使用することで、ランダム性を導入した。

すべての結論は、導入されたランダム性とサンプル外予測（5重クロスバリデーション）との組み合わせにより、我々のモデルを保守的にするアンサンブルモデル（100回の独立した実行の平均）に基づいている。

モデル・パラメータに関する追加情報については、XGBoostのドキュメントも参照してください (https://xgboost.readthedocs.io/en/latest/index.html)。

SHapley additive exPlanations (SHAP)分析
ツリーベースのMLモデル28で拡張され、ヒトの代謝物血漿中濃度を駆動する因子を客観的に評価するために最近使用されたSHAP値23を使用することで、MLモデルを解釈し、循環TMAOレベルに影響を与える変数に相対的な重要性を割り当てました。簡単に説明すると、各予測について、特定の変数のSHAP値は、この変数が含まれる場合と除外される場合のモデル出力の差である。変数はすべての可能な順序でモデルに追加され、SHAP値はモデル結果の平均から計算される28。SHAPforxgboost(0.1.0)を使用して、各変数グループの残りの80%の参加者で訓練された対応するxgboostモデルから、5つの取り残されたグループの各個人の変数SHAP値が抽出され、100回の反復にわたって平均された。参考文献23と同様に、各疾患グループの全個体についてSHAP絶対値の平均を計算することで、各変数の相対的重要度を割り当てた。各個体の参加者のSHAP値を描いた群プロットでは、変数値をRNOmni（v1.0.0）パッケージを用いて逆正規化した。

最小絶対縮小・選択演算子（LASSO）
glmnet（v4.1）パッケージに実装されているLASSOアルゴリズムを使用し、利用可能なすべての変数を入力（フルモデル）として使用して、BMIS（N = 582）参加者の正則化TMAO値を予測した。最初に、5重クロスバリデーションを用いて、左遷群における循環TMAOの予測に最適な正則化パラメータλ（10-3から105までの100個の値から）を決定した。次に、最適なλパラメータを用いて、対応する脱落群を除くBMIS参加者の80％で5つのLASSO回帰モデルをトレーニングした。これらのモデルを用いて左脱落群の正則化TMAOを予測し、続いてyardstick（v0.0.7）のrsq関数を用いて決定係数を算出した。このプロセスは、xgboost分析と同様に100回繰り返した。

クラスタリング
クラスタリングは、説明27 にあるように、25 個のランダム集合を使用する Hartigan-Wong アルゴリズムで、R 組み込みの k-means 関数を使用して実行した。

多変量解析
TMAOクラスターに分割された個体間の微生物相組成の差異を同定するために、Bray-Curtis非類似度行列の多変量同質性分析を種レベルで実施し（集団の少なくとも20％に存在する699種）、vegan（v2.5.7）パッケージを使用して、並べ替えANOVA検定（999反復）で統計的有意性を決定した。正則化循環TMAO対Bray-Curtis分類学的非類似度行列の並べ替え分散分析（PERMANOVA）を、vegan（v2.5.7）を用いて、年齢、性別、およびリクルート国を共変量として999反復行った。

媒介分析
加齢に伴う血漿TMAOの増加に対するeGFRの推定上の影響、および逆に加齢に伴うeGFRの減少に対するTMAOの影響を評価するために、媒介分析74を実施した。Mediation (v4.5.0) Rパッケージ75に実装されているPreacher and Hayesブートストラップ法を用い、性別と採用国を共変量とする一般線形モデルを用いた。信頼区間とベイズP値は、999回のシミュレーション後に計算した。

傾向スコアマッチング
T2Dを有するMetaCardis参加者は、RパッケージMatchIt76（v.4.1.0）を用いて、年齢、性、疾患群、高血圧状態を共変量とし、一般化線形モデルにより決定される最近傍マッチングを用いて傾向スコアマッチングを行った。すべての共変量に等しい重みが与えられた。

前臨床モデル
in vitro実験
細胞培養とタンパク質抽出
単一ドナー（DV Biologics、AU009-F）から得た初代ヒト成人腎線維芽細胞を、1% Pen/Strep抗生物質（Sigma）を加えた10% FCS低グルコースDMEM中で培養した。急性（30分まで）のTMAO刺激では、細胞（10万個/条件）を既述のように生理的無血清緩衝液中で1時間無血清にした50。線維芽細胞は、TMAO（シグマ社）刺激の前に、Tramenitib（10nM、Shelleckchem社）、BAPTA-AM（20μM、Molecular Probes社）またはビヒクルと30分間プレインキュベートした。より長期間（24時間）の刺激では、線維芽細胞を無血清低グルコースDMEMに一晩浸し、その後TMAO、TGF-β1（5 ng/ml、R&D）、またはそれらの組み合わせで刺激した。実験終了後、線維芽細胞を溶解し、-80℃で保存した50。

細胞質[Ca2+]の測定
線維芽細胞を低グルコースDMEM中で一晩無血清にし、その後Ca2+とMg2+を含むpH7.4のHanks Balanced Salt Solution（HBSS；シグマ社製）中で5μMのfura-2-AM（Molecular Probes社製）を負荷した。測定は、20倍の蛍石対物レンズを装着した落射蛍光倒立顕微鏡で行った。単細胞の細胞内Ca2+（[Ca2+]i）は、モノクロメーター（Cairn Research社製）を通して340nmと380nmで励起してモニターした。放出された光は515 nmのフィルターを通してQImaging Retiga CCDカメラ（Cairn Research）に反射され、12ビットの解像度でデジタル化された。すべての撮像データは、Andor社のソフトウェアを用いて収集・解析した。

動物実験
すべての動物実験は、地域の倫理委員会の承認（Project License 70/8356）を得て、United Kingdom Home Office Animals 1986 Scientific Proceduresに従って行われた。6～8週齢の雄性C57BL/6 Jマウス（Charles River）に、コントロール、0.12% w/w TMAO-または1% w/w コリン含有飼料（Teklad Global 18% Protein Rodent Diet (Cat. #2018 ); 6匹/群）を6週間与えた20。餌と水は自由摂取とし、マウスは標準的な個別換気ケージ（各ケージ5～6匹）内で、20～23℃、湿度40～60％の条件下、12～12時間の明暗サイクルで飼育した。その後、一側尿管閉塞(UUO)を既述のように確立した50。このモデルで一般的な方法であるため、雄マウスのみを使用した50。簡単に説明すると、マウスをイソフルランで麻酔し、正中開腹で腹腔を露出させ、右尿管を分離して骨盤から0.5cmのところで縛った。左尿管はクランプせずに残し、偽手術対照とした。5日目にケタミンによる終末麻酔と心臓穿刺でマウスを安楽死させ、その後腎臓を採取した。各動物（UUOと偽薬）の両腎を縦半分に切断した。各腎の半分を液体窒素でスナップ凍結し、ウェスタンブロッティングのために-80℃で保存した。もう半分は10％ホルマリン（シグマ社製）で4℃で16時間固定し、70％v/vエタノール溶液に移してさらに24時間保持した後、免疫組織化学用にパラフィン包埋した。

ウェスタンブロット
NuPAGE電気泳動およびバッファーシステム（Invitrogen）を用いて、腎臓サンプルまたは細胞溶解液のイムノブロット解析を行った48,49。AmershamTM RainbowTMフルレンジ分子量（MW）マーカー（Merck, GERPN800E）を用いてMWを決定し、特異的抗体でプローブするために膜を切断した。タンパク質はECL Prime（GE Healthcare）で可視化した。目的のバンドの光学濃度をImageJ 1.46r (NIH)を用いて決定し、ローディングコントロールに対して正規化した。正規化コントロールサンプルの値は任意に1とした。膜はRestore Plus試薬（Fisher Scientific）を用いて剥離し、適切なローディングコントロール（total ERK1/2）で再プローブした。ローディングコントロールと目的のタンパク質の間にMWの重なりがある場合、ローディングコントロールを平行ゲルで行った。以下の抗体が本研究で使用され、括弧内は希釈倍率である： Cell Signaling Technologyより、Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) Antibody (1:3000) #9101 、p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody (1:5000) #9102 、Phospho-Smad3 (Ser423/425) (C25A9) Rabbit mAb (1. 1000)#9520、Phospho-Smad3 (Ser423/425) (C25A9) Rabbit mAb (1： 1000）#9520、Phospho-p70 S6 Kinase (Thr389) Antibody (1:1000) #9205 、Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) Antibody (1:1000) #2211 、Phospho-4E-BP1 (Ser65) Antibody (1:1000) #9451 、Vimentin (R28) Antibody (1:1000) #3932 。Sigma-Aldrichより、モノクローナル抗アクチン、α-平滑筋（クローン1A4）A2547（1:10,000）、モノクローナル抗α-チューブリン抗体（クローンDM1A；1:10,000）T9026、抗β-アクチン抗体（クローンAC-74、1:10,000）A2228。

免疫組織化学染色
ホルマリン固定した腎臓をパラフィンに包埋し、Barts Cancer Institute病理学ユニットで4μm切片を切り出した。シリウスレッド、α-平滑筋アクチン（αSMA）、およびF4/F80の染色は、DISCOVERY XT（Ventana社製）自動スライド処理装置を用い、OmniMap試薬（Ventana社製）を用いて、メーカーの推奨に従って記載50のように行った。画像は、AxioCam HRcカメラを装着したZeiss AxioPhot顕微鏡を用い、倍率20倍で撮影した。マウス1匹につき腎皮質の画像を5枚撮影し、ImageJ 1.46r (NIH)を用いて染色を総面積に対する割合で定量した。Biorad社の抗F4/F80（Cl:A3-1）抗体（1:50）（MCA497）を使用した。

報告概要
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの利用可能性
本研究の結果を裏付ける生のショットガンシーケンスデータは、European Nucleotide Archiveにアクセッションコード "PRJEB37249"、"PRJEB38742"、"PRJEB41311"、"PRJEB46098 "で寄託されている。血清NMRおよび尿NMRメタボロームデータはMetabolightsにアクセッション番号 "MTBLS3429 "でアップロードされています。本研究で使用した血清GC-MSおよび同位体定量血清代謝物（UPLC-MS/MS）は、それぞれアクセッション番号 "MSV000088042 [https://doi.org/10.25345/C5CV76]"および "MSV000088043 [https://doi.org/10.25345/C58246]"でMassIVEに寄託されています。EUおよび各国のプライバシーに関する法律を遵守するため、本研究では患者の表現型データに無制限にアクセスすることはできない。個々の表現型データへのアクセスを希望する研究者は、関連する国家データ保護機関に申請書を提出する必要がある。デンマークで募集された研究参加者の表現型データについてはデンマークデータ保護庁（https://www.datatilsynet.dk/english）、ドイツで募集された研究参加者の表現型データについては連邦データ保護委員会（https://www.bfdi.bund.de/EN/Home/home_node.html）、フランスで募集された研究参加者の表現型データについては国家情報自由委員会（https://www.cnil.fr/en/home）である。申請手続きは各ウェブサイトに記載されている。許可された場合、5週間以内に対応する著者が表現型データを提供する。ソースデータは本論文とともに提供される。

コードの利用可能性
本研究で行った解析では、カスタムコードやアルゴリズムは使用していない。本研究で示した解析を再現するためのコードと関連する表現型データは、対応する著者に連絡することで入手できる（Data availability statementも参照）。

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謝辞
本研究は、欧州連合（EU）の第7次研究・技術開発・実証枠組み計画（HEALTH-F4-2012-305312）の助成を受けた。Assistance Publique-Hôpitaux de Paris（AP-HP）は臨床研究（メタカルディス）の推進者である。K.C.とJ.A.-W.への部分的な資金援助は、Leducq財団（TransAtlantic grant）、SFN（Société Française de Nutrition）、F-CRIN-FORCEネットワークからの支援、ITMOとJPI-Microdiet studyを介したINSERM、Novo Nordisk財団（Jacobaus prize）からも得ている。S.K.F.は、Deutsche Forschungsgesellschaft SFB1365（「RENOPROTECTION」）およびSFB1470（「HFpEF」）の支援を受けた。P.A.とK.Ch.はWellcome ISSF Fellowship (ISSF204834/Z/16/Z)を受けている。M.- E.D. は、NIHR Imperial Biomedical Research Centre、GutsUK、Diabetes UK、およびフランス国立研究庁（ANR-10-LABX-46、European Genomics Institute for Diabetes）、フランス国立研究庁（ANR-18-IBHU-0001）が共同で支援するNational Center for Diabetes Precision Medicine-PreciDIABからの助成金を受けている、欧州連合（FEDER）、オー＝ド＝フランス地域評議会（協定20001891/NP0025517）およびリール欧州大都市圏（MEL、協定2019_ESR_11）、および同じくANR（ANR16-IDEX-0004-ULNE）、オー＝ド＝フランス地域評議会（20002845）およびリール欧州大都市圏（MEL）が共同出資するIsite ULNE（R-002-20-TALENT-DUMAS）。本研究は、CNRS-Imperial International Research Project METABO-LICの一環として実施された。ノボノルディスク財団基礎代謝研究センターは、コペンハーゲン大学の独立研究機関で、ノボノルディスク財団からの無制限寄付金により一部運営されている。MetaCardis試験に参加してくれた被験者、特に患者会（Alliance du CoeurおよびCNAO）の意見とインターフェース、および血漿脂質プロファイルの分析をしてくれたDominique Bonnefont-Rousselot博士（Pitié-Salpêtrière病院代謝生化学科）に感謝する。また、患者の調査については、心臓代謝栄養研究所の臨床調査プラットフォームの看護師、技術者、臨床研究アシスタント、データ管理者に、健常対照の調査については、CRNH（Centre de recherche en Nutrition Humaine CRNH-Ile de France）およびピティエ・サルペトリエール病院の臨床調査センター（Clinical Investigation Center：CIC）に感謝する。Quanta Medical社は、臨床試験の規制監督を行い、電子データの処理および管理に貢献した。

著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Petros Andrikopoulos、Judith Aron-Wisnewsky、Rima Chakaroun、Antonis Myridakis、Sofia K. Forslund。

これらの著者は共同で本研究を監督した： Muhammad M. Yaqoob、Michael Stumvoll、Oluf Pedersen、S. Dusko Ehrlich、Karine Clément、Marc-Emmanuel Dumas。

著者および所属
インペリアル・カレッジ・ロンドン、代謝・消化・生殖科、生体分子医学部門、英国、ロンドン

ペトロス・アンドリコプロス、アントニス・ミリダキス、ジュリアン・シルー、カンタ・チェチ、マイケル・T・オラニペクン、ルビー・コズロフスキー、ローラ・マルティネス＝ギリ、アナ・ルイサ・ネヴェス、アンドレア・ロドリゲス＝マルティネス、マルク＝エマニュエル・デュマ

インペリアル・カレッジ・ロンドン、英国、国立心肺研究所、ゲノム・環境医学部門

ペトロス・アンドリコプロス、カンタ・チェチ、マルク＝エマニュエル・デュマ

ソルボンヌ大学、INSERM、栄養と肥満；全身的アプローチ（NutriOmics）、フランス、パリ

ジュディス・アロン＝ウィスネスキー、ソリア・アドリアッシュ、ファブリツィオ・アンドレリ、エウジェニ・ベルダ、リシャール・イスナール、クリスティーヌ・ルオー、エディ・プリフィティ、ロヒア・アリリ、ジャン＝フィリップ・バスタード、ピエール・ベル＝ラッセン、ミカエル・カミュ、マリアンヌ・グレーヌ、ティモシー・D・スワーツ、ジャン＝ダニエル・ザッカー、カリーヌ・クレマン

パリ公共病院、ピティサルペトリエール病院、パリ、フランス

ジュディス・アロン＝ウィスネフスキー、ジョー＝エリー・サレム、ファブリツィオ・アンドレリ、ジェラール・ヘルフト、リシャール・イスナール、オリヴィエ・バルテルミー、ジャン＝ポール・バティス、ランダ・ビタール、フレデリック・ボスケ、ラシッド・ブブリット、オリヴィエ・ブロン、セシル・シアングラ、ジャン＝フィリップ・コレ、モラッド・ジェバル、アニエス・ハルトマン、ソフィー・ジャケミネ、ジル・モンタレスコ、フランソワーズ・プセット、ヨハン・シルヴァン、ジャン＝ミシェル・オペール、カリーヌ・クレマン

ライプツィヒ大学医療センターIII内分泌・腎臓・リウマチ科（ドイツ、ライプツィヒ

Rima Chakaroun、Arne Dietrich、Caroline Grünemann、Judith Kammer、Tatjana Schütz、Stefanie Walther、Matthias Blüher、Michael Stumvoll

ヨーテボリ大学医学研究所分子・臨床医学部門、ワレンベリ研究所、スウェーデン、ヨーテボリ

リマ・チャカロン＆フレドリック・ベッケド

インペリアル・カレッジ・ロンドン公衆衛生大学院MRC環境と健康センター環境研究グループ（英国、ロンドン、W12 0BZ、ウッドレーン86番地

アントニス・ミリダキス

構造・計算生物学、ヨーロッパ分子生物学研究所（ドイツ・ハイデルベルク

Sofia K. Forslund、Renato Alves、Luis Pedro Coelho、Michael Kuhn、Ivica Letunic、Lucas Moitinho-Silva、Sebastien Schmidt、Lucas Silva & Peer Bork

実験・臨床研究センター、シャリテ医科大学とマックス・デルブリュックセンターの共同研究、ドイツ、ベルリン

ソフィア・K・フォルスルンド

マックス・デルブリュック分子医学センター（MDC）、ドイツ・ベルリン

ソフィア・K・フォルスルンド、ラヨシュ・マルコ、ピア・ボーク

シャリテ大学病院（ドイツ・ベルリン

ソフィア・K・フォルスルンド

DZHK（ドイツ心臓血管研究センター）、パートナーサイト・ベルリン（ドイツ・ベルリン

ソフィア・K・フォルスルンド

ノボ・ノルディスク基礎代謝研究センター、コペンハーゲン大学健康医学部、デンマーク・コペンハーゲン

トリネ・ニールセン、エーム・アストリッド・アンダーソン・ガリヤトヴィッチ、ライン・エンゲルブレヒトセン、ボーレット・ハルトマン、マレーネ・ホーンバク、ヨハン・ユステセン、ニコライ・カルプ、マティルデ・スヴェンドストラップ、フレドリック・ベッケド、ヘンリック・ヴェスターゴー、トルベン・ハンセン＆オルフ・ペデルセン

ダノンリサーチ、パレゾー、フランス

ブリジット・ホームズ

分子細菌学研究室、レガ研究所微生物学・免疫学部門、KUルーヴェン、ルーヴェン、ベルギー

サラ・ヴィエイラ＝シルヴァ、グウェン・ファロニー、イェルーン・レーズ

微生物学センター、VIB、ルーヴェン、ベルギー

サラ・ヴィエイラ・シルヴァ、グウェン・ファロニー、イェルーン・レーズ

ドイツ、マインツ、ヨハネス・グーテンベルク大学大学医療センター、医療微生物学・衛生学研究所および免疫療法研究センター（FZI）

サラ・ヴィエイラ・シルヴァ＆グウェン・ファロニー

分子生物学研究所（IMB）／ドイツ・マインツ

サラ・ヴィエイラ・シルヴァ＆グウェン・ファロニー

ソルボンヌ大学、IRD、複雑系数理情報化ユニット、UMMISCO、F-93143、ボンディ、フランス

エウジェニ・ベルダ、エディ・プリフティ、ジャン・ダニエル・ザッカー

糖尿病性腎臓病センター、バーツヘルス国民保健サービストラスト、ロイヤル・ロンドン病院、腎臓ユニット、英国、ロンドン

ジュリアス・キースウィッチ＆ムハンマド・M・ヤクーブ

バーツ・アンド・ザ・ロンドン医科歯科大学ウィリアム・ハーヴェイ研究所、トランスレーショナル医学・治療学センター、ロンドン大学クイーン・メアリー校、英国、ロンドン

ジュリアス・キースウィッチ、ムハンマド・M・ヤクーブ

欧州糖尿病ゲノム研究所、EGENODIA、INSERM U1283、CNRS UMR8199、リール・パスツール研究所、リール大学病院、リール大学、フランス・リール

フランセスク・プイグ＝カステルヴィ、ミカエル・シュヴァリエ、フィリップ・フロゲル、マルク＝エマニュエル・デュマ

フランス、パリ、メタゲノポリス、INRA、アグロパリテック、パリサクレー大学

Emmanuelle Le Chatelier, Magalie Berland, Hervé Blottière, Angélique Doré, Sebastien Fromentin, Nicolas Pons, Hanna Julienne, Véronique Lejard, Florence Levenez, Robin Massey, Nicolas Maziers, Laetitia Pasero Le Pavin & Thierry Vanduyvenboden

ノッティンガム・トレント大学科学技術学部バイオサイエンス学科（英国、ノッティンガム

レズリー・ホイルズ

フランス、パリ、INSERM、1166、ICAN、心臓代謝栄養研究所

ジェラール・ヘルフト

デンマーク、コペンハーゲン、コペンハーゲン大学、Rigshospitalet循環器科

Lars Køber

INSERM UMR 1124、パリ大学、45 rue des Saint-Pères, 75006, Paris, France

ドミニク・ゴーギエ

マギルゲノムセンター、マギル大学、740ドクターペンフィールド通り、モントリオール、QC、H3A 0G1、カナダ

ドミニク・ゴーギエ、マルク・エマニュエル・デュマ

デンマーク、コペンハーゲン、コペンハーゲン大学、Rigshospitalet、臨床生化学科

Jens Peter Gøtze & Niklas Rye Jørgensen

インペリアル・カレッジ・ロンドン、代謝・消化・生殖学部、遺伝学・ゲノム学部門、ロンドン、W12 0NN, UK

フィリップ・フロゲル

デンマーク、ローヌ、ボーンホルムス病院、医学部

ヘンリック・ヴェスターゴー

スウェーデン、イェーテボリ、チャルマース工科大学、生物工学科

イェンス・ニールセン

ドイツ、ヴュルツブルク、ヴュルツブルク大学バイオセンター、バイオインフォマティクス学科

ピア・ボーク

延世大学延世フロンティアラボ（YFL）、ソウル、03722、韓国

ピア・ボーク

デンマーク、コペンハーゲン、ゲントフテ大学病院、臨床代謝研究センター

オルフ・ペデルセン

ユニヴァーシティ・カレッジ・ロンドン臨床運動神経科学科（イギリス、ロンドン、NW3 2PF

S. Dusko Ehrlich

栄養疫学研究チーム（EREN）、ソルボンヌ・パリ・シテ疫学・統計研究センター、Inserm（U1153）、Inra（U1125）、Cnam、パリ第13大学、COMUEソルボンヌ・パリ・シテ、93017、ボビニー、フランス

レオポルド・フェゼウ

MoISA、モンペリエ大学、CIHEAM-IAMM、CIRAD、INRAE、農業研究所、IRD、モンペリエ、フランス

エリック・O・ベルジェ

コンソーシアム
メタカルディスコンソーシアム
Rohia Alili、Ehm Astrid Andersson Galijatovic、Olivier Barthelemy、Jean-Philippe Bastard、Jean-Paul Batisse、Pierre Bel-Lassen、Magalie Berland、Randa Bittar、Hervé Blottière、Frederic Bosquet、Rachid Boubrit、Olivier Bourron、Mickael Camus、 Cecile Ciangura, Jean-Philippe Collet, Arne Dietrich, Morad Djebbar, Angélique Doré, Line Engelbrechtsen, Leopold Fezeu, Sebastien Fromentin, Nicolas Pons, Marianne Graine, Caroline Grünemann, Agnes Hartemann, Bolette Hartmann, Malene Hornbak、ソフィー・ヤケミネ、ニクラス・ライ・ヨルゲンセン、ハンナ・ユリエンヌ、ヨハンヌ・ユステセン、ジュディス・カンマー、ニコライ・カルプ、ルビー・コズロフスキー、ミヒャエル・クーン、ヴェロニク・レジャール、イヴィツァ・レトゥニッチ、フローレンス・レヴェネス、ラヨシュ・マルコ、ラウラ・マルティネス＝ギリ、ロビン・マッセイ Nicolas Maziers, Lucas Moitinho-Silva, Gilles Montalescot, Ana Luisa Neves, Laetitia Pasero Le Pavin, Francoise Pousset, Andrea Rodriguez-Martinez, Sebastien Schmidt, Tatjana Schütz, Lucas Silva, Johanne Silvain, Mathilde Svendstrup, Timothy D. Swartz, Thierry Vanduyvenboden, Eric O. Verger & Stefanie Walther
貢献
P.A.、K.C.、M.E.-D.は本プロジェクトのコンセプトとプロトコルを開発した。K.C.（コーディネーター）、O.P.、M.S.、S.D.E.、P.B.、J.R.、M.-E.D.、F.B.、J.N.はMetaCardisイニシアチブの全体的な目的と研究デザインを考案した。MetaCardisコホートのリクルート、フェノタイピング、ライフスタイル： J.A.-W.、R.C.、T.N.、J.-E.S.、F.A.、L.K.、H.V.、T.H.、G.H.、R.I.、J.-M.O.、M.B.およびK.C.、M.S.、O.P.が監修：定量的微生物叢プロファイリング：血清および尿メタボロームプロファイリング：S.V.S.、G.F.：生化学的分析：A.M.、J.C.、M.T.O.、L.H.： J.P.G.およびC.R.。バイオインフォマティクスおよび統計解析： P.A.、S.K.F.、G.F.、S.V.S.、R.A.、E.L.C.、L.P.C.、E.P.、E.B.、D.G.、K.Ch.、P.F.、F.P.-C.、M.C.、J.-D.Z. 食生活FFQ分析：表現型データのモデリング：細胞in vitro実験：P.A：原稿は、P.A.、K.C.、M-E.D.が執筆し、J.-A.W.、R.C.、S.K.F.、M.M.Y.、M.S.、O.P.、S.D.E.が意見を提供した。

対応する著者
Petros Andrikopoulos、Karine Clément、Marc-Emmanuel Dumasのいずれかにご連絡ください。

倫理申告
競合利益
K.C.はDanone Research社、Ysopia社、CONFO therapeutics社のコンサルタントであり、本研究とは無関係である。K.C.はMetaCardisプロジェクトにおいてDanone Research社と共同研究契約を締結した。F.B.はImplexion Pharma ABの株主。M.B.はAstraZeneca、Boehringer-Ingelheim、Lilly、Novo Nordisk、Novartis、Sanofiから講演料やコンサルタント料を受け取っている。残りの著者は、競合する利害関係はないと宣言している。

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Andrikopoulos, P., Aron-Wisnewsky, J., Chakaroun, R. et al. 腎機能と循環トリメチルアミンN-オキシドとの因果関係および修正可能な関係の証拠。Nat Commun 14, 5843 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39824-4

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受領
2022年11月02日

受理
2023年6月30日

出版
2023年9月20日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41467-023-39824-4

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ネイチャー・コミュニケーションズ（Nat Commun） ISSN 2041-1723（オンライン）

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