グルコース代謝の選択的利用が哺乳類の胃形成を導く

哉百名

本文へスキップ

  • コンテンツ

  • 出版について

  • 掲載

  1. 記事

  2. 記事

PDFダウンロード

グルコース代謝の選択的利用が哺乳類の胃形成を導く


Nature(2024)この記事を引用する

概要

発生過程における生物の形態パターン形成に関する一般的なドグマは、転写因子ネットワークとシグナル伝達モルフォゲンの複合的な入力のみによって、空間的・時間的に異なる発現パターンが生成されるというものである。しかし、代謝もまた、エネルギー生産や成長における機能とは独立した、重要な発生制御因子として浮上してきた1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。in vivoの発生中の哺乳類胚を形成する細胞プログラムの指示における栄養利用のメカニズム的役割は、まだ不明である。われわれは、発生中のマウス胚、幹細胞モデル、胚由来組織摘出物の単一細胞解像度の定量的イメージングを用いて、哺乳類の胃形成期における、空間的に分解された、細胞タイプおよびステージに特異的なグルコース代謝の2つの波を明らかにした。その結果、グルコース代謝の時空間的な第一の波は、ヘキソサミン生合成経路を介して発生し、上胚葉における運命獲得を促進すること、第二の波は、解糖系を用いて中胚葉の移動と側方拡大を誘導することを明らかにした。さらに我々は、グルコースが細胞シグナル伝達経路を通じてこれらの発生過程に影響を及ぼし、それぞれの波においてグルコースとERK活性を結びつけるメカニズムが異なることを明らかにした。我々の発見は、遺伝的メカニズムや形態形成勾配と相乗的に、コンパートメント化された細胞代謝が、発生過程における細胞運命や特殊な機能を導く上で不可欠であることを強調している。この研究は、細胞代謝の一般的で維持的な性質という見解に疑問を投げかけるものであり、様々な発生過程における細胞代謝の役割について貴重な洞察を与えるものである。

主な内容

単純な多細胞構造からボディプランが形成されるのは、胚発生の重要な過程である胃形成期である。局所的な形態形成シグナルは、胚を形成するために細胞運命の決定と行動を導くが、これらの重要なシグナルが適切なタイミングと場所で統合され、胃形成の形態形成を媒介する正確なメカニズムは完全には解明されていない。このプロセスの驚くべき忠実性は、複数の制御層が強固な胚パターニングを保証していることを示している。

生物が発生と再生の間にどのようにして位置の同一性を確立できるかを説明するために、「勾配理論」-胚軸に沿って勾配をつけた代謝が組織のパターニングと形態形成を指示する-が1915年に初めて実験的に導入された（refs. 11,12. このモデルを機構論的な枠組みに組み込むことは困難であったが、現在では、代謝酵素や代謝産物そのものが生体エネルギーを超えて機能し、細胞や発生のプログラムを能動的に調節したり指示したりするという、最近の代謝シグナリングの概念化によって支持されている13。ニワトリやマウスの胚では、解糖勾配が局所的に変化しており、様々な組織の発生や幹細胞の分化において、解糖がエネルギー産生とは無関係に機能することが示されている1,2,3,6,9,10 。これらの知見にもかかわらず、哺乳類の胚が本当に一様に栄養素を処理しているのか、代謝シグナルが形態形成シグナル伝達経路とどのように関連しているのか、そしてこれらのシグナルがどのように統合されて着床後早期の形態形成においてより広範な細胞機能を調節しているのかについては疑問が残る。さらに、移植後に解糖が亢進することは知られているが、グルコースの取り込みが多いからといって、必ずしも解糖経路での利用が亢進するわけではない。

生きた初期胚の単一細胞レベルで代謝と形態形成シグナルの動態を同時にプローブするという課題は、これらの経路がどのように連携して複雑な分化と形態形成の事象を支えているのかを理解する努力を妨げてきた。本論文では、in vitro幹細胞モデルおよび胚由来組織摘出モデルを用いて、発生中の胚におけるマウス胃形成の時間的・空間的調整における細胞代謝活性の有益な役割を明らかにする。われわれは、グルコースという単一の栄養素が、異なる代謝経路を通じて、細胞型とステージに特異的な方法で、局所的・全体的な胚の形態形成を指示するために選択的に利用されることを発見した。具体的には、マウスの胃形成が始まる着床後早期の上胚葉細胞で始まる、グルコース取り込みの時空間的に分離した2つの波を同定した。この段階的な代謝活性は、発生が進むにつれて上胚葉組織の遠位に広がり、間葉系細胞が原始縞を出て中胚葉の翼の中を側方に移動する際に、間葉系細胞内に再び出現する。これらのグルコースを介したイベントは、高いERK活性と連関しているが、それぞれの波において明確に制御されていることがわかった。このことは、哺乳類の発生過程において、グルコース代謝とERKシグナルの間に重要なつながりがあり、それが組織パターニングを成功に導いていることを示唆している。全体として、代謝とシグナル伝達の軸を統合的に調べることで、動物の一生において最も基本的で進化的に保存された段階の一つである胃形成を導くメカニズムを理解するための包括的な枠組みが得られた。

胚における局所的なグルコースの波

着床期、哺乳類の胚は、急速な形態変化、増殖、分化を支えるために、グルコースに大きく依存するようになる14。この代謝シフトが、着床後の胚形成の進化的景観とどのように整合しているのかは、依然として不明である。われわれはまず、子宮内で解剖されたマウス胚のグルコーストランスポーターGLUT1の発現を解析し、蛍光グルコースアナログ（2-NBDG）を用いたグルコース取り込み解析を行った。GLUT1タンパク質の発現と2-NBDGシグナルの比測から、2つの異なる領域でグルコースの取り込みがコンパートメント化されていることが明らかになった：1つ目は、我々が「移行期上胚葉」と呼ぶ、原始縞を形成するよう運命づけられた後方に位置する上胚葉細胞の小さな集団内、2つ目は、細胞が原始縞から出て移動性間充織を形成する際に発達する側方中胚葉翼内である（図1a-cおよびExtended Data Fig.） 注目すべきことに、原始縞内の細胞はグルコース（2-NBDG）の取り込みを全く、あるいは最小限に抑えており、細胞が縞に入るにつれてGLUT1の発現が徐々に減少している（図1bおよび拡張データ図1a-c）。

図1：マウスの胃形成に先立つグルコース活性の波。

a, 胃形成期マウス胚の模式図。b 、上段と中段は、上胚葉と側中胚葉翼（オレンジ破線領域）におけるコンパートメント化された2-NBDG取り込みとGLUT1発現を示す、in vivoおよびex vivoマウス胚の直交横断面。FijiのLUTによるヒートマップ強度カラー。下は、上胚葉から中胚葉への移行を通じたグルコース取り込み「波」表現型の図解。画像は15回の独立した実験の代表図。Epiは上胚葉；Mesoは中胚葉；PSは原始条；VEは内臓内胚葉。c, 2-NBDGをインキュベートした縞状胚中期の最大（Max.)投影像で、上胚葉（ピンクのアスタリスク）と移動性中胚葉（白のアスタリスク）におけるグルコース取り込みの勾配が明らかになった。FijiのLUTによるヒートマップ強度カラー。d、GLUT1およびSNAI1で染色した、子宮内で解剖した胃原期胚の単一z-切片（上；n= 53 胚：初期ストリーク、n= 8；中期ストリーク、n= 26；後期ストリーク、n= 19）。中、生体外で2-NBDGを2時間インキュベートした後の胚盤葉期胚（n= 27個：初期縞、n= 5；中期縞、n= 13；後期縞、n= 9）。上胚葉は白の破線で示し、原始縞はマゼンタの破線で示す。FijiのLUTによるヒートマップ強度カラー。下は、マウス胃形成の進行段階を通じたグルコース取り込み波の表現型の概略図。ESは初期ストリーク、MSは中期ストリーク、LSは後期ストリーク。e, 上胚葉における観察可能なGLUT1およびGLUT3（GLUT）の発現範囲（図1b,d,f）の平均角度を、原始梗条の遠位長さの平均値に対してプロットしたもの（Methods, '画像解析'）。発生が進むにつれて、上胚葉のGLUT発現領域は前方に広がっている。f, 子宮内で解剖した中期胚をGLUT3で染色した（n= 15 胚）（拡張データ図2cも参照）。FijiのLUTによるヒートマップ強度カラー。g, グルコース活性の読み出しとして、TCF/LEF:H2B-GFP（原始縞を示す）レポーター胚における内因性NAD(P)Hのライブ多光子イメージング（n= 12 胚：初期縞、n= 7; 中期縞、n= 5）。上胚葉は白の破線で、原始筋は緑の破線で示す。スケールバーは40μm。

フルサイズ画像

このグルコース取り込みの地域的急増がどのように進展するかを解析するために、3つのストリーク期（初期ストリーク（ES；胚6.25日目（E6.25）-E6.5）、中期ストリーク（MS；E6.5-6.75）、後期ストリーク（LS；E6.75-7.25）を通して、胃形成の時間的順序を解析した（図1d）。この時空間分析から、グルコース活性には2つの異なる波があることがわかった。最初の「epiblast wave」では、グルコース取り込みの前後勾配が観察され、胃形成開始時に最も後方から近位に移行するepiblast細胞で始まった。胃形成が進み、原腸絨毛が遠位に発達するにつれて、このグルコース活性のパターンは、原腸絨毛の伸長に直接先行するように、前-遠位軸に向かって上胚葉組織内で拡大した（図1d,eおよびExtended Data Fig.） 原始縞を抜けた後、細胞はグルコース依存的なプログラムに切り替わり、間充織で高い代謝活性が観察され、グルコース活性の第二の「中胚葉の波」が始まったことを示している（図1b,cおよび拡張データ図1a,b）。この空間分布は、もう一つのグルコーストランスポーターであるGLUT3の発現パターンにも反映されていた（図1fおよび拡張データ図2b,c）。

次に、TCF/LEF:H2B-GFPレポーターの発生胃漿において、多光子顕微鏡を用いて、解糖活性の内因性自己蛍光読み出し15であるNADHとNADPH（総称してNAD(P)H）のラベルフリーライブイメージングを行った（Methods）。その結果、NAD(P)Hの強度もまた、胃形成の過程で本質的に漸増し、中胚葉前駆細胞の拡大する原始縞集団の前方にある上胚葉細胞に局在することがわかった（図1g ）。このNAD(P)H強度勾配は、2-NBDG取り込み領域と重なり、生きた胃瘻の代謝活性をイメージングする上で、このアッセイの特異性が確認された（Extended Data Fig.）

最後に、グルコース代謝に関与する主要遺伝子について、マウス胃瘻16の空間トランスクリプトームデータセットをプローブした。解糖経路のSlc2a1、Gpi1、Pfkb、Ldhbや、ヘキソサミン生合成経路（HBP；グルコース代謝の一分野）のOgt、Gnpnat1などの転写産物は、胃形成の進行段階において、上胚葉と中胚葉の羽の中で段階的に変化していた（Extended Data Fig.）

これらの観察結果は、細胞運命決定と形態形成過程の両方に影響を及ぼす可能性のある、胃形成期の時空間的な代謝制御が細かく調整されていることを示唆した。

HBPは上胚葉の運命転換を導く

原始縞の伸展に先立ち、上胚葉細胞で観察されたグルコース取り込みの時空間パターンから、これらの細胞が縞への進入を準備する際のグルコース代謝の役割を調べることになった。これを評価するために、我々はグルコース代謝の異なる酵素段階を標的とする阻害剤で、生体外の発生中のマウス胚を処理した（図2a ）。これらの摂動実験では、ES期（E6.5頃）に胃胞を採取した。この時点で胚はすでに対称性を破り、原始縞の形成を開始していた（図2bの培養前コントロール参照）。その後、原始縞の進行に対する影響を明らかにするために、選択的阻害剤で12～18時間培養した。

図2：HBPを介したグルコース代謝は、中胚葉運命の獲得と維持に必要である。

a 、グルコース代謝の3つの分岐の概略図：HBP、解糖経路、ペントースリン酸経路（PPP）。GFAT, グルタミン・フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ；PFK, ホスホフルクト-1-キナーゼ；TCA, トリカルボン酸。b, 12時間の生体外培養後、示した条件下での胚の代表的なz-切片。グルコース代謝阻害（2-DG＋BrPA）およびHBP阻害（アザセリン）は原始縞の伸長を阻害し（破線シアン）、T-box転写因子T（ブラキリーとしても知られる）の発現を減少させる（シアン）。下は、以下のように処理した胚の原基遠位伸長長を定量化したもの： 培養前コントロール（n= 7）、コントロール（培養12時間後、n= 44）、グルコース代謝阻害（2-DGとBrPA、n= 16）、2-DGとBrPAとガラクトースレスキュー（n= 8）、解糖阻害（YZ9、n= 9）、解糖阻害（シコニン； n＝9）、HBP阻害（アザセリン；n＝21）、グルコースなし、グルタミンなし（栄養まばら）＋ガラクトース（n＝6）、ペントースリン酸経路阻害（6-AN；n＝4）、ATP合成酵素阻害（オリゴマイシン；n＝8）、乳酸脱水素酵素阻害（ガロフラビン；n＝6）。データは平均値±s.e.m.。通常の一元配置分散分析に続くTukeyの多重比較検定；P値を示す。c, 上胚葉におけるGLUT1（フィジーのLUTによるヒートマップ強度カラー）の発現は、ラミニン染色によって同定された無傷の基底膜の領域に共局在している（n= 28 胚）。スケールバー、40μm。d 、ラミニン発現から同定された基底膜（BM）遠位破壊長（黄色の矢印）の定量化。培養前コントロール（n= 7）、コントロール（培養12時間後；n= 42）、糖代謝阻害（2-DGおよびBrPA；n= 16）、GlcNAcレスキューを伴う2-DGおよびBrPA（n= 14）、解糖阻害（YZ9；n= 12）、解糖阻害（シコニン； n＝3）、HBP阻害（アザセリン；n＝11）、GlcNAcレスキューを伴うアザセリン（n＝7）、ペントースリン酸経路阻害（6-AN；n＝4）、ATP合成酵素阻害（オリゴマイシン；n＝6）、および乳酸脱水素酵素阻害（ガロフラビン；n＝6）。データは平均値±s.e.m.である。通常の一元配置分散分析の後、Tukeyの多重比較検定を行い、P値を示した。e, 分化期（2日目）のエピブラスト様幹細胞（EpiSCs）にDQゼラチンを塗布したin vitro EMTアッセイの代表的結果（Extended Data Fig.） 下図は、画像フィールドごとに同定されたDQ+クラスターの数である（n= 25フィールド、2つの独立した実験反復で定量）。通常の一元配置分散分析に続くダネットの多重比較検定；P値を示す。スケールバー、100μm。

出典データ

フルサイズ画像

まず、すべてのグルコース依存性経路をブロックするために、ヘキソキナーゼとグルコースリン酸イソメラーゼの競合的阻害剤である2-デオキシ-d-グルコース（2-DG）と3-ブロモピルビン酸（BrPA）を用いた（図2a ）。一方、2-DGとBrPAで処理した胚盤胞は著しく遅延し、ほとんどがLS期を過ぎて進行しなかった（Extended Data Fig.） より短時間（12時間）の処理では、2-DGとBrPAで処理することでグルコース代謝全体を阻害すると、遠位への伸長と原始縞の発達が著しく阻害されることが明らかになり、上胚葉細胞が中胚葉移行にグルコース代謝を必要としていることが示唆された（図2b ）。

次に、原始縞特異的表現型の原因となる特定の代謝経路を明らかにするため、グルコース代謝の主要な枝をそれぞれ標的とした。この効果は、グルコース代謝とHBPをつなぐ律速段階である、フルクトース-6-リン酸からグルコサミン-6-リン酸への変換を阻害するアザセリンを用いて再現された（図2a,b）。経路阻害の程度を、原始縞の発生表現型を読み取り値として間接的に評価する濃度反応解析では、2-DGまたはアザセリン阻害下で用量依存的な効果が示された（Extended Data Fig.） アザセリンは二峰性の反応を示したが、これは処理した胚の感受性が不均一であることを示しており、細胞の状態や時間的な発生ダイナミクスの違いに起因している可能性がある（Extended Data Fig.） 対照的に、YZ9（PFKFB3を標的とする）またはシコニン（ピルビン酸キナーゼM2を標的とする）を用いて、HBP分岐を迂回する解糖系酵素（我々は「後期段階の解糖系」成分と呼ぶ）を阻害しても、原始縞の進行には影響を与えなかった（図2a,bおよびExtended Data Fig. 同様に、乳酸脱水素酵素阻害剤（ガロフラビン）、ペントースリン酸経路阻害剤（6-アミノニコチンアミド（6-AN））、ATP合成酵素阻害剤（オリゴマイシン）も、縞の発生に影響を与えなかった（図2bおよび拡張データ図3e）。

阻害剤のオンターゲット効果をさらに確認し、エピブラストにおけるグルコース依存性を機能的にテストするために、胚をさまざまな栄養補給培地または栄養欠乏培地で培養してレスキュー実験を行った。グルコース、ピルビン酸、グルタミンを含まない培地で培養した胚の一部は、2-DGやBrPAで処理した胚と同様に、原始縞の発達に欠損を示した（Extended Data Fig.） グルコースまたはグルタミンを選択的に再投入すると、原始縞の伸長は改善されたが、ピルビン酸では改善されなかったことから、非解糖系グルコース代謝枝の重要性が示唆された（Extended Data Fig.） どのグループもSOX2+上胚葉を維持していたが、SOX2発現レベルはグルタミン再導入条件では低いままであった17（Extended Data Fig.） さらに、2-DGとBrPAによる阻害をグルコース-6-リン酸への変換によって回避し、HBPへの炭素流束を回復させるガラクトースの補給（図2a ）は、阻害剤投与および栄養不足の両条件下で、原始縞の発生を救済した（図2b ）。最後に、2-DGとBrPA、アザセリンのいずれの処理も、発育中の胚内の細胞増殖を阻害しなかったことから、安定した成長と生体エネルギーが確認された（Extended Data Fig.）

高度に保存されたHBP代謝枝は、グリコシル化やN-アセチルグルコサミン18,19(GlcNAc)の結合など、タンパク質の翻訳後修飾に重要な基質を生成することから、原始縞誘導初期の胚盤胞におけるグルコース取り込みは、生体エネルギーを超えた重要な役割を担っている可能性が示唆された。全体として、これらの知見は、マウスの胃形成初期における原始縞形成に必要な細胞運命の転換をサポートする上で、HBPを通して機能する、発生中の上胚葉におけるグルコース代謝が極めて重要であることを強調している。

胚モデルでHBPと運命転換を関連づける

これらのin vivoでの発見を支持し、他の組織との相互作用から切り離して、中胚葉の運命獲得における上胚葉のパターニングに対する主要な代謝効果を確認するために、我々は幹細胞ベースの胚モデルを利用した。2-DGで処理したガストルロイド（マウス胚性幹細胞の3次元凝集体20,21）は、中胚葉様細胞を特定せず、T（ブラキユリーをコードする）の発現低下と不完全な伸長を示した（Extended Data Fig.） Sox2はどのグループでも維持されていたが、中胚葉の指定に関与する線維芽細胞増殖因子（FGF）-ERK標的遺伝子22であるEtv4は、2-DG処理下でダウンレギュレートされた（Extended Data Fig.） 後期解糖を阻害するYZ9処理下の胃胞は正常に発育したことから、中胚葉の仕様におけるグルコース代謝の役割は、後期解糖枝とは無関係であることが強調された。

また、マウス胚外内胚葉（mXEN）細胞を、胚で用いたのと同じ代謝阻害剤で24時間処理した（図2a ）。これらの阻害剤はいずれも、内胚葉の同一性（GATA6の発現で示される）や増殖（ヒストンH3のリン酸化で示される）に影響を与えなかった（Extended Data Fig.） in vitroのXEN細胞とin vivoの内臓内胚葉との潜在的な違いは否定できないが、これらの結果は、内臓内胚葉におけるGLUT1の発現と2-NBDGの取り込みにもかかわらず、グルコース代謝が内胚葉において組織自律的な役割を持たないことを示唆している（Extended Data Fig.） オリゴマイシン処理したmXEN細胞は増殖の減少を示し（Extended Data Fig. このことは、酸化的リン酸化を行う内胚葉細胞を好むことを示しており、これまでの証拠と一致している23。

次に、マウス胚性幹細胞の中胚葉指向性分化を行った。我々は、上胚葉から中胚葉への移行状態をターゲットとする選択的阻害剤を1日目から4日目まで、あるいは主にすでに中胚葉状態に達している細胞をターゲットとする選択的阻害剤を3日目から4日目まで適用した（Extended Data Fig.） 胚およびガストルロイドで得られた知見と一致して、2-DGとBrPAまたはアザセリン処理によって、マウス胚性幹細胞のエピブラスト様幹細胞（EpiLSC）から中胚葉状態への移行（1-4日目）が有意に阻害されたのに対し、YZ9による後期糖化特異的阻害は影響を及ぼさなかった（Extended Data Fig.） 日目から4日目にかけて、2-DGとBrPAまたはアザセリンで処理したマウス胚性幹細胞コロニーは、時間の経過とともにサイズが大きくなったが、コントロールと比較して、パターン形成前の上胚葉遺伝子（Sox2、Rex1、Klf2）の高発現は維持され、中胚葉遺伝子（T、Eomes、Mesp1、Pdgfra）の低発現は維持された（Extended Data Fig.） 逆に、すでに中胚葉状態に達している細胞（3-4日目）を対象とした処理期間では、表現型に有意な差は見られず、中胚葉分化した細胞は、コントロール条件と同様に、培養したプレートを覆い続けた（Extended Data Fig.） どの阻害剤も、またどの処理期間も、細胞死を誘発しなかった（Extended Data Fig.）

ERK活性化を介したFGFシグナル伝達は、マウスの胃形成において中胚葉の特定に重要な役割を担っており24 、25 、妊娠後期のニワトリ胚の発生前中胚葉におけるグルコース活性と関連している6 。中胚葉の初期運命転換に対するグルコース代謝阻害とシグナル伝達阻害の効果を比較するため、線維芽細胞成長因子受容体（FGFR）阻害剤SU5402またはERK阻害剤PD0325901を中胚葉指向性分化アッセイに適用した。その結果、これらのシグナルの阻害とHBPの阻害の間で、中胚葉遺伝子のレベルが有意に低く、分化前の上胚葉遺伝子のレベルが高いという重複した表現型が明らかになった（Extended Data Fig.

これらの結果は、HBPを介したグルコース代謝が、上胚葉細胞が安定した中胚葉アイデンティティを獲得するために必須であるという考えを支持するものである。グルコースの取り込みは、in vivoの内胚葉系譜において、組織非自律的な役割をさらに担っている可能性があるが、我々の3Dガストルロイドアッセイと中胚葉指向性分化アッセイから、観察された胚の表現型は、主に上胚葉と原始縞誘導体への影響から生じることが示唆された。

HBPと後上胚葉のEMTとの関連

原始縞に入る前の上胚葉細胞ではグルコース活性が高いことから（図1b）、上皮間葉転換（EMT）の代謝制御がマウスの胃形成中に起こるかどうかを調べた。子宮内で解剖した胚は、無傷のラミニン+基底膜に隣接してGLUT1に富む後上胚葉細胞を示し、MMP14が強く共発現していた。このことから、グルコースの取り込みが基底膜の破壊に関与している可能性が示唆され、これはEMTと上胚葉細胞の原始縞への進入に必須である（図2cおよびExtended Data Fig.） E-カドヘリン（ECADとしても知られる）の発現が弱い移行期の上胚葉細胞は、GLUT1とGLUT3の活性を示し、グルコース取り込みの亢進が初期段階のEMTに及ぶことを示している（Extended Data Fig.） さらに、E6.5からE8.5までのマウス胚26の単細胞RNAシーケンスから再解析した結果、EMTの開始時に、解糖系酵素をコードする遺伝子（Eno1、Gapdh、Ldha、Slc2a1、Slc16a3）の発現が上昇する一方、クレブスサイクル遺伝子（Aco2、Mdh2、Sdha、Sdhb）の発現は安定したままであることが明らかになった（Extended Data Fig.）

次に、胚を2-DGとBrPAまたはアザセリンで処理した。これらの処理によって基底膜の破壊が阻害されたが、この結果は特に、GlcNAc（HBPの最終産物）の補充によって有意に回復した（図2d）。対照的に、後期解糖阻害剤、ATP合成酵素阻害剤、乳酸脱水素酵素阻害剤、ペントースリン酸経路阻害剤では、基底膜にそのような効果は見られなかった（図2d）。

次に、タンパク質分解部位で蛍光を発する基質であるGFPタグDQゼラチンを用いたin vitroタンパク質分解活性アッセイを行った27。このアッセイとEMTを受ける着床後の上胚葉の状態とを関連づけるため、分化EpiLSCコロニーが中胚葉に移行する過程を調べた（Extended Data図5aの模式図）。対照群では、多くのGFP+ EpiLSCクラスターが存在することから、細胞が局所的なマトリックスメタロプロテアーゼ27の放出を介して中胚葉へ活発に移行している領域がプレート上に存在することが示された（図2e）。2-DGとBrPAまたはアザセリンで処理すると、GFPシグナルが消失したことから、異常なグルコース代謝、特にHBP分枝阻害がEMTのプロセスを機能的に障害していることが示された（図2e）-ERK阻害（PD0325901処理）25と同様の結果である（Extended Data Fig.） 最後に、胚性幹細胞から中胚葉への分化過程における定量的PCR（qPCR）解析から、Cdh2（NCADをコードする）、Mmp2、Vimを含む明確なEMT遺伝子の発現が、2-DGとBrPA処理後に有意に減少することが示された（Extended Data Fig.）

これらの知見を総合すると、マウス上胚葉の初期EMTは、HBPを介してグルコース代謝と密接に関連しており、グルコースフラックスの細胞内シフトが、細胞および分子制御ネットワークを直接調節して、上胚葉細胞の運命決定を主に制御し、二次的には、その後の原始縞への侵入を可能にすることが示された。前方上胚葉細胞は前方内臓内胚葉の影響を受け、後方化を防ぎ、EMTを抑制する。したがって、後期におけるグルコース活性の前方領域へのシフト（図1d）は、これらの細胞がグルコース代謝を延長していることから、外胚葉運命への移行を反映していると考えられる4。

HBPは中胚葉移行においてERKを仲介する

ERK（ERK1およびERK2）シグナルは、様々な受容体チロシンキナーゼ（RTK）によって活性化される重要な下流経路であり、マウスを含む脊椎動物において、中胚葉の指定と胃形成細胞の移動に重要な役割を担っている24,25,28,29,30,31 。グルコース代謝の基質を利用するタンパク質修飾酵素を阻害すると、RTKの機能が損なわれることが示唆されている32,33。そこで次に、マウスの胃形成期におけるERKシグナル伝達に対するグルコース取り込み波の影響を調べた。

その結果、移行期の上胚葉細胞と新しく形成された中胚葉層で、グルコース取り込みパターン（図1b）と相関する高レベルの二リン酸化ERK（dpERK）を発見した（Extended Data Fig.） dpERKの量は、2-DGとBrPAで処理した胚で減少し、グルコース代謝とERKシグナル伝達の機能的関連を示した（Extended Data Fig.） ウェスタンブロットから、2-DGとBrPAまたはアザセリンで処理したEpiLSCではpERKレベルが減少していることが確認されたが、総ERKレベルは変化しなかった（図3aおよび補足図1）。PD0325901またはSU5402で処理した胚は、2-DGとBrPA処理で見られた発育遅延を模倣した（Extended Data Fig.

図3：グルコース代謝は、表胚葉におけるERKシグナル伝達を調節する。

a, 指定した処理12時間後のEpiSCsにおける総ERK1/2とリン酸化(p-)ERK(T202/Y204)を示すウェスタンブロット。b 、左は4倍体相補アッセイの模式図。このアッセイでは、胚の全細胞がERK-KTRmClover2Nマウス胚性幹細胞に由来する。右は、4倍体相補アッセイから生成された代表的な胚におけるERK-KTRmCloverシグナルのライブイメージング。コントロール（n= 10）、2-DGとBrPA（n= 8）、NaClO3（n= 4）、アザセリン（n= 8）、およびGlcNAcレスキューを伴うアザセリン（n= 8）処理下でのERK-KTRmCloverシグナルの代表的な胃胞を示す。スケールバー、20μm。また、Extended Data Fig.8d,eも参照。d, 示したように処理したEpiSCsにおけるERK-KTRmCloverの核：細胞質比。データは平均値±s.e.m.。コントロール（n＝310細胞を定量）は、他のすべての条件（PD0325901（PD）、n＝188細胞；2-DG、n＝166細胞；アザセリン、n＝193細胞；NaClO3 、n＝120細胞；PD0325901＋FGF2、FGF4およびFGF8（FGFs）、n＝201細胞；2-DG＋FGFs、n＝178細胞；アザセリン＋FGFs、n＝186細胞；NaClO3＋FGFs、n＝132細胞）と有意に異なっていた。e,f, コントロール（n= 75細胞）、アザセリン、2-DG、PD0325901（各n= 50細胞）の条件下で中胚葉に分化したERK-KTRmClover胚性幹細胞の代表的な画像（e ）とmCloverシグナルの核：細胞質比（f ）。黒い横線は平均値を表す。通常の一元配置分散分析に続くDunnettの多重比較検定；P値を示す。P値を示す。g 、栄養欠乏培地（グルコース、ピルビン酸、グルタミンを含まない）およびレスキュー条件（除かれた栄養素を選択的に再導入）で6時間、誘導分化した中胚葉細胞。通常の一元配置分散分析に続くダネットの多重比較検定；P値を示す。コントロール、n=83細胞；栄養欠乏、n=41細胞；グルコースのみ、n=70細胞；グルタミンのみ、n=66細胞；ピルビン酸のみ、n=47細胞。

出典データ

フルサイズ画像

ERKシグナル活性を定量的にリアルタイムで読み取るために、ERKキナーゼ転座レポーター（KTRmClover ）マウス胚性幹細胞34,35,36を用いて、4倍体相補アッセイ37,38を行った（図3bおよび拡張データ図8a）。ライブイメージングにより、ERKの活性化を示すKTRの細胞質局在が、胚盤⾯の前後軸に沿って段階的に増加するパターンが⾒られた（図3bおよび拡張データ図8a-c）。多光子顕微鏡を用いて、ERK-KTRmCloverとNAD(P)H活性を同時にライブイメージングしたところ、NAD(P)HシグナルがKTRmClover活性部位よりも前方に偏っていることが示され、グルコース代謝の波がERKシグナルの動態よりも胃形成胚内で先行するという我々の仮説が支持された（Extended Data 図8c）。

予想通り、ERK（PD0325901）またはFGFR（SU5402）を阻害すると、核と細胞質の区別がはっきりしないまま細胞質のERKシグナルが減少するか、核のシグナルが高くなり、どちらもERK活性が低いことを示した（Extended Data Fig.） 2-DGとBrPAまたはアザセリンを用いたHBP阻害もまた、上胚細胞において細胞質ERKシグナルを減少させたが、この場合も核と細胞質の明確な区別は見られなかった（図4cおよびExtended Data Fig.） 注目すべきことに、アザセリンを含む培養液にGlcNAcを補充すると、細胞質KTR局在の増加によって示されるように、上胚葉における活性ERKシグナルが回復した（図4cおよびExtended Data Fig.） これらの結果は、上胚葉組織におけるグルコース取り込みとHBPフラックスの波が、ERKを介したシグナル伝達を機能させるために不可欠である可能性を支持するものである。

図4：グルコース代謝は中胚葉の適切な移動に必要である。

a, 移動動態のライブイメージングのための中胚葉摘出株の分離の概略図。b、4時間のライブイメージング後のコントロール、PD0325901またはYZ9処理した中胚葉摘出株。赤いアスタリスクは、イメージング開始以降に分裂した娘細胞を示す。核のセグメンテーションと追跡にはTCF/LEF:H2B-GFPシグナル（シアン）を用いた。スケールバーは40μm。プロットは、AIVIA細胞追跡ソフトウェアから得られた、独立した2つの実験反復（PD0325901）または3つの実験反復（他のすべてのグループ）にわたる移動指標を表示する。細胞変位と平均速度のデータポイントは、一意の細胞トラックを表す。データは平均値±s.e.m.である。通常の一元配置分散分析に続くDunnettの多重比較検定；P値を示す。すべての比較はコントロールに対するものである（コントロール、n=104細胞の変位、n=105細胞の速度、2-DGおよびBrPA、n=41細胞、PD0325901、n=85細胞の変位、n=87細胞の速度、YZ9、n=20細胞の変位、n=61細胞の速度、アザセリン、n=33細胞の変位、n=39細胞の速度）。c, 2-DG、BrPA、YZ9、PD0325901処理した中胚葉摘出株のインバダポディアアッセイ。黄色の矢印は、基質分解を示す個々の点状の例を示す。スケールバー、100μm。データは平均値±s.e.m.である。通常の一元配置分散分析に続くDunnettの多重比較検定；P値を示す。コントロール（n=20圃場）；2-DGとBrPA（n=7圃場）；PD0325901（n=35圃場）；YZ9（n=38圃場）；アザセリン（n=26圃場）。全群について3回の独立した実験。e、PD0325901処理およびYZ9処理した中胚葉摘出株における差次発現遺伝子（DEG）のKEGGパスウェイ濃縮解析で、特に発現が低下した項を示した。両側フィッシャーの正確検定によるベンジャミニ調整P値を示す。f, マウス胃形成における細胞プロセスを選択的に制御するグルコース代謝活性の2つの異なる波の概要図。AVE、前内臓内胚葉。

出典データ

フルサイズ画像

HBP特異的代謝中間体であるGlcNAcがアザセリン処理胚の原始縞形成とERKシグナルの両方をレスキューする能力を観察した（図2dと 4c、拡張データ図8e）。胚を含む哺乳動物細胞におけるRTKシグナル伝達は、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）の存在に依存している。HSPGは、形態形成因子の保持、安定性、細胞外拡散を制御することにより、共受容体として機能する32,33,39 。これらのHSPGは、コアタンパク質と、グルクロン酸や特にGlcNAcの繰り返し二糖単位から合成されるヘパラン硫酸鎖から構成されている。HBP阻害胚におけるHSPG形成を評価するために、まずヘパラン硫酸鎖10E4の発現を調べた。コントロールの胚では、上胚葉細胞の基底側、内臓内胚葉および中胚葉26に予想される10E4の発現が見られたが、HBP阻害後の胚では、コントロールと比較して、10E4のレベルは消失はしていないものの、全体的に減少していた（Extended Data Fig.） HSPG細胞表面結合コアタンパク質であるシンデカン-1は、内臓内胚葉や中胚葉と同様に、間葉系移行を起こすと思われる上胚葉細胞の細胞表面領域で高い発現を示した26 。

次に、プロテオグリカンの硫酸化阻害剤であり、HSPGや形態形成因子の結合に影響を与えることが知られている塩素酸ナトリウム（NaClO3）で胚を処理した39,40。NaClO3処理胚では、10E4とシンデカン-1の発現が減少した（Extended Data Fig.） 注目すべきことに、これらの胚ではERKシグナルが減少し（図4cおよびExtended Data Fig. 最後に、ERK-KTRmクローバー分化-EpiLSCコロニーでこれらの観察を確認したところ、PD0325901、アザセリン、2-DG、BrPAまたはNaClO3で処理した細胞では、ERK活性が有意に低下していた（図4dおよび拡張データ図8g ）。最後に、ERKシグナルがHSPGとは無関係に機能する場合にのみ、リガンド補充が正常な発生を回復させることができるという論理で、FGF2、FGF4、FGF8を補充して、HBP阻害胚の表現型をレスキューしようと試みた。FGFリガンドを補充しても、胚と細胞の両方でこの表現型を救うことはできなかった（図4dとExtended Data Fig.） このことは、胚盤胞におけるERK活性がFGFR以外のRTKに反応する可能性を否定するものではないが、先行研究32,39から得られた同様の観察結果を反映している。

これらの所見を総合すると、HBP、HSPG、およびERK活性が、中胚葉の運命獲得を開始するために、胚形成期の上胚葉内で直接的にリンクしているという有力な証拠となる。

中胚葉の形成はHBPに依存しない

われわれの観察から、胚が胃形成の時系列を進むにつれて、上胚葉と中胚葉の両翼が、コンパートメント化されたグルコース取り込みを示すことが明らかになった（図1およびExtended Data Fig.） 上胚葉における最初のグルコース取り込みの波が原始縞を指定する役割を確立した後、我々は次に原始縞から出る間葉系細胞におけるグルコース代謝の機能を調べた。

間充織におけるグルコース代謝の第二の波に関する我々の知見（図1b）と一致して、NCAD+の中胚葉翼で高いGLUT3発現が観察された（拡張データ図9a ）。次に、分化した中胚葉においても、上胚葉で見られたようなグルコース代謝とERKシグナルの関係が残っているかどうかを調べた。このことを調べるために、まずERK-KTRmCloverマウス胚性幹細胞を中胚葉に分化させ、グルコース代謝（2-DGとBrPAで）、HBP（アザセリンで）、ERKシグナル伝達（PD0325901で）を阻害した。阻害剤の投与は、中胚葉移行におけるHBPの役割との混乱を避けるため、細胞が安定した中胚葉状態にある分化4日目の2.5時間に限定した（Extended Data Fig.） ライブイメージングにより、PD0325901処理によって予想された有意なERK不活性化が明らかになった（図4e,f）。注目すべきことに、グルコース代謝の阻害（2-DGとBrPA）でも有意なERK不活化が引き起こされたが、アザセリン処理細胞はERK活性を保持していたため、これはHBPに起因するものではなかった（図4e,f ）。我々は、グルコース、ピルビン酸、グルタミンを含まない培地で6時間、有向性分化中胚葉細胞を維持することにより、このことを機能的に検証した。その結果、ERKシグナルはグルコースを再添加した後にのみ再活性化した（図4g ）。

このことは、グルコース代謝が胚の上胚葉組織と中胚葉組織で異なる制御を受けていることを示唆している。形態形成因子の活性が様々な発生過程で変化することがあるように、グルコース利用もまた、胚形成中の異なるプロセスを導くために変化する可能性があると推測される。我々のデータは、HBPを介した最初のグルコース利用が上胚葉でのERKシグナル伝達に重要であり、階層的な制御を示す一方、グルコース代謝は、細胞が中胚葉運命にコミットすると、おそらく直接的ではない別のメカニズムでERKシグナル伝達と相関することを示唆している。

側方中胚葉における後期解糖

まず原始線条体形成前の後上胚葉細胞で、次いで間葉系細胞の移動中である24,28,29 。様々なRTKを介して活性化されるこの経路は、後胚葉における運命の移行を制御し、中胚葉前駆細胞内に局在して中胚葉へのコミットメントと原始縞から離れる前方への移動を促進する。マウス胃原基のFGFR1変異体の表現型は、中胚葉前駆細胞が原基から移動できないためと解釈されるように、原基の後方に細胞が蓄積していることが以前に示されている25 、31、あるいは細胞侵入の様式が損なわれている41 、42 。

これらの観察と一致して、E6.75の頃にマウスの胃瘻をSU5402（FGFR阻害剤）またはPD0325901（ERK阻害剤）で処理したところ、同様の原始縞特異的表現型が観察された（Extended Data Fig.） しかし、HBP阻害下の胚では、SU5402またはPD0325901処理胚で観察された原始縞の形成は観察されなかった（Extended Data Fig.） 一方、胚、ガストルロイドおよび中胚葉指向性分化アッセイでは、YZ9処理（解糖の後段の律速酵素を阻害する）が中胚葉の仕様および原始縞の伸長に特異的な影響を及ぼさないことが総合的に示された（図2bおよびExtended Data Fig. 2bおよびExtended Data Figs4aおよび5a,b）、YZ9処理またはPD0325901処理した胃瘻の矢状断面の原始条-中胚葉表面積を定量すると、これらの胚で有意な増加が見られた（Extended Data Fig.） これらの結果は、HBPが上胚葉内での細胞運命の移行を誘導するのに関与している一方で、HBPは一旦筋に侵入して中胚葉に向かう細胞にとっては重要ではないことを示唆している。その代わりに、後期の解糖系酵素が重要になるのは、細胞が安定した中胚葉性運命を獲得し、胚の正中線から離れる横方向への移動を開始した時かもしれない（Extended Data Fig.） YZ9またはPD0325901で処理した胚では、原始縞内のリン酸化ヒストンH3発現細胞数の増加が観察されたが（Extended Data Fig. 最後に、PD0325901処理によるERK阻害は、後期胃形成期（E7.5）において中胚葉翼へのグルコース取り込みを増加させることが観察された（Extended Data Fig.） ERKシグナル伝達と後期解糖との関係を示唆するこの一見中胚葉特異的なメカニズムは、ニワトリの発生におけるこれまでの観察結果6を支持するものであるが、解糖の後期段階とERKシグナル伝達との正確な関連を調べる今後の研究は、これらの現象を理解する上で有益であろう。

解糖は中胚葉の移動をサポートする

これらのデータに導かれ、我々は次に、中胚葉特異的な細胞行動（運動性など）に糖分解の後期段階が影響を及ぼすかどうかを調べた。実際、YZ9あるいはPD0325901で処理した胚では、SNAI1+側方中胚葉の移動距離がコントロールと比較して減少した（Extended Data Fig.）

このことをさらに調べるために、TCF/LEF:H2B-GFPレポーターマウスを用いて、E7.25/7.5胚から中胚葉摘出片を縞状から無芽の後期に単離し、フィブロネクチンでコートしたディッシュ上で24時間人工培養した（図4a ）。ex situ培養中の摘出細胞表面の膨張は、全グルコース代謝阻害（2-DGおよびBrPA）により有意な減少を示し、摘出中心からの細胞移動が損なわれていることが示された（Extended Data Fig.） しかしながら、ERK（PD0325901）、後期解糖系（YZ9）またはHBP（アザセリン）の阻害は、コントロールと比較して、摘出片表面積の拡大に有意差をもたらさなかった（Extended Data Fig.） タイムラプスライブイメージングで細胞の動きを定量化したところ、PD0325901およびYZ9処理後は増殖率は増加したが、細胞の変位は減少した（図4bおよび拡張データ図10c ）。このことは、PD0325901およびYZ9投与群における摘出片の拡大は、実際の移動よりもむしろ、細胞分裂の増加によって主に引き起こされたことを示している。このことから、PD0325901およびYZ9処理胚（Extended Data Fig. アザセリンで処理した胚ではこのような効果は見られなかったことから、HBPは胚発生後の中胚葉細胞の移動には必要ないことが再度示唆された（図4bおよびExtended Data Fig.） おそらく2-DGとBrPAの組み合わせが、複数の分岐グルコース代謝経路に影響を与え（図2a）、増殖効果を緩和するためであろう。

解糖系経路の阻害が中胚葉細胞の遊走に影響を及ぼすかどうかを機能的に調べるため、野生型胚から単離した中胚葉組織を、FITC-フィブロネクチン（遊走する間葉系細胞がその下の細胞外マトリックスを分解するために突起を伸ばした蛍光欠損領域を明らかにする蛍光基質）上に移植した43（図4c）。このinvadopodiaアッセイでは、2-DGとBrPA、YZ9またはPD0325901で処理した移植片では基質の分解が有意に少なかったが、アザセリンで処理したものでは差がなかったことから、後期解糖とERKシグナルが中胚葉の移動に影響を与えるのに対し、HBPはこのプロセスから切り離されていることが示された（図4c）。後期解糖系阻害下でのイムノラベリングでは、間葉系マーカー NCAD、EOMES、LEF1（参考文献44）を保持したまま、接着マーカー ECAD（図4d）のアップレギュレーションが示された（Extended Data 図10d,e）。

最後に、PD0325901またはYZ9で処理した中胚葉摘出片のRNA配列決定をその場で行った。パスウェイ濃縮解析により、発現の差のある遺伝子が同定され、「ECM-受容体相互作用」や「MAPKシグナル伝達経路」と同様に、細胞移動45に直接的な役割を持つ「フォーカルアドヒージョン（focal adhesion）」を含むKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）パスウェイ用語のダウンレギュレーションが明らかになった（図4e）。GO (Gene Ontology)用語の差分解析によると、有意に発現が低下した過程は、後期糖化群とERK阻害群の間で類似しており、フォーカルアドヒージョンやインテグリンシグナルなど、中胚葉機能の重要な側面を含んでいた（Extended Data Fig.）

これらのデータを総合すると、確立された中胚葉における後期解糖は、マウス胚の三倍体形成の成功に重要な細胞運動を制御しているという仮説が支持される。

考察

哺乳類胚は、着床時にグルコース代謝への保存された代謝シフトを受ける。これは歴史的に、異なる組織で同じ代謝経路が採用され、空間的・時間的スケールにわたって均一な代謝表現型を示すと考えられてきた。しかし我々の発見は、このグルコースシフトが、胃形成を制御する明確な細胞分化と形態形成プロセスを推進するために、決定的に細かく調整されていることを明らかにした。我々のデータは、胚の特定の組織内において、糖処理に対する選好性と代謝依存性の違いがあることを示しており、これらの特定の代謝要求が満たされない場合、重要な形態形成過程が妨げられることを示している（図4f）。代謝と細胞の運命を結びつけるin vitroの証拠が増えている。われわれの研究は、代謝の変化が、in vivoでの重要な発生過程を損なう細胞シグナル伝達の欠損を模倣し、また救済することができることを示しており、グルコース代謝が初期胚発生において「生命を維持する」だけでなく、「生命を方向づける」ものであるという新たな視点を明らかにしている。

実際、カーボントレーシングや改良された生体外胚培養などの実験手法の進歩により、胚発生における代謝の潜在的な指導的役割が浮き彫りになってきた8 、10 。その結果、発生過程における代謝誘導という概念は勢いを増し、最近の知見によって、20世紀初頭に初めて提唱された「勾配理論」への関心が再び高まっている11。われわれの研究は、この理論を発展させ、代謝勾配が発生過程をどのように形成するかを説明するものである。広い意味では、ひとつの栄養素の選択的利用が、発生過程における分子シグナル伝達ネットワークとどのように相互作用するかを実証し、より統合的な、代謝に導かれた胚発生の見方を支持している。メタボリックシグナル」は、生物のアイデンティティーが初めて獲得される時期である発生初期に、どのようにしてボディプラン全体が確立されるかを理解する上で有用なパラダイムを提供する。

我々の研究は、グルコース代謝の分岐とシグナル伝達制御の関連を明らかにした。栄養感知経路であるHBPはUDP-GlcNAcを産生するが、このUDP-GlcNAcはHSPGの生合成と、細胞運命の移行に不可欠な翻訳後修飾に必須である32,33,46,47 。ERKシグナル伝達が上胚葉細胞のグルコース取り込みに追随し、HBP阻害がHSPG発現を低下させるのと同時に、GlcNAcの補充によって救済されるという我々の観察は、上胚葉組織におけるシグナル伝達におけるUDP-GlcNAcの役割を強調している。実際、この当初印刷された原稿48が修正中であった間に、in vitro系としてマウスのガストルロイドを用いた研究から、グルコースのエピマーであるマンノースが、中胚葉の仕様と軸索伸長におけるグリコシル化に必須であることが明らかにされた7。マウス胃原細胞とその派生体である幹様構造体において2-DG処理を行った最近の2つの研究49,50もまた、細胞シグナル伝達を調節し、神経と中胚葉の適切な形成を促進するグルコース代謝の役割を強調している50。これらの知見は、上胚葉の細胞運命移行に対するグルコースの影響に関する我々の結論を支持するものである。

我々は、コンパートメント化されたグルコースの利用が、発生状況や関与する細胞タイプによって異なることを実証し、生体における初期胚発生の全体像を提供した。HBPによる転写後修飾18 、19 、解糖系転写産物の制御6、あるいはその両方の組み合わせによるものなのか、ERKシグナルがどのようにグルコース代謝のステップと相互作用するのか、その詳細についてはまだ解明されていない。今後の研究では、特にHBP阻害胚におけるSDC1と10E4の発現の全体的な減少を考慮すると、外胚葉、内胚葉、中胚葉系譜間のクロストークを胃形成後期または胃形成後に探索することができる。我々の実験は、一般的な間葉系の移動ダイナミクスがHBPに依存しないことを示しているが、HBPは中胚葉において、移動の方向性や最終的な移動場所など、我々が調査しなかった他の役割を担っている可能性がある。また、グルタミンや脂肪酸のような他の基質からの炭素源（どちらもHBPに供給される）が、細胞の挙動に影響を与えるために、間葉系細胞が好むようになることも考えられる。

FGF8やFGF4のようなシグナル伝達リガンドは、着床後の時期に原始縞、結節、中胚葉組織に局在し、局所的な細胞タイプの特定と胃形成パターニングに極めて重要である。我々の発見は、グルコース代謝のコンパートメント化された活性が、細胞が主要なモルフォゲンに応答するために必要な中間体を提供することを示唆しており、胚領域におけるグルコース代謝とシグナル伝達活動との相乗的な関係を示している。上胚葉から中胚葉への分化は、細胞の代謝状態と、中胚葉の運命を誘導する特定のシグナル伝達リガンドの存在との複合的な影響によって推進されると考えられる。このように、局所的な代謝活性とシグナル伝達の相互作用は、上胚葉から中胚葉への移行をサポートするだけでなく、積極的に方向づける。

今後の研究は、現在の進歩と我々の研究のある種の限界から恩恵を受けるであろう。化学的阻害剤は迅速な制御が可能であり、遺伝的代謝異常と通常関連する胚致死を緩和する。しかしながら、特定の代謝反応阻害によるシステムレベルの影響を予測することは、依然として困難である。われわれの研究では、これらの阻害剤によって達成された阻害の程度を正確に測定する定量的データが不足しているが、その主な原因は、着床後の哺乳類胚において、細胞および組織レベルの分解能で代謝フラックス解析を行うことが困難なためである。部分的な阻害は、完全な阻害のもとでは見られない代償的な細胞応答を引き起こす可能性があり、このことが今回の結果のばらつきを説明しているのかもしれない。このような課題にもかかわらず、われわれの研究は、同じ表現型の異なる程度を示す用量反応関係を確立し、観察された効果は阻害レベルに関係なく一貫して有意であるという見解を補強した。また、in vivoでの機能的レスキュー実験を通じてその特異性を実証し、幹細胞や組織摘出モデルを用いて組織特異的効果を明らかにした。シングルセルメタボロミクスや空間メタボロミクスがより現実的になるにつれて、今後の研究によって、代謝プロセスやその発生生物学や関連分野への影響について、より深い洞察が得られると思われる。

諺にもあるように、マウス（そしてヒト）の最善の計画はしばしば失敗に終わることがある。発生生物学の観点からすれば、今回の研究結果は、生後間もない時期にどのようにしてボディプランが作られるのか、また、シグナル伝達の調節不全や代謝の乱れから生じる発生致死のメカニズムについて、極めて重要な洞察を与えるものである。これらの結果は、胚のパターン形成と発生の成功における代謝の重要性を強調するものであり、がん生物学や再生など、細胞の移行や移動が起こる他の文脈にも大いに応用できる。

研究方法

データ報告

サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は用いていない。実験は無作為化されておらず、研究者は実験中および結果評価中の割り付けについて盲検化されていなかった。

マウス胚の回収

マウスは国内外のガイドラインに従って維持された。動物を対象とした実験はすべてYale School of MedicineのInstitutional Animal Care and Use Committeeの承認を受け、承認された動物取り扱いプロトコル（プロトコル番号：2023-20352）に従って実施された。すべての実験用マウスは、12時間：12時間明期：暗期サイクルの温度管理された施設（20～26℃、湿度30～70％）で、水と餌に自由にアクセスできる特定の病原体フリー条件下で維持され、6週齢から使用された。すべてのマウスはCD1アルビノバックグラウンドで飼育された。V. GrecoはH2B-GFP:Tcf-LEF51レポーターマウス系統を提供した。

胃形成期のin vivo胚を採取するため、5～7週齢の雌性CD1マウスを12～24週齢の雄性CD1マウスと自然交配させ、生後6.5、6.75、7.0または7.25日目に犠牲とした。子宮を回収し、5% FBS、20mM HEPES、1× Penicillin-Streptomycin (Gibco)を含むDMEM培地を37°に加温した中で、胚を剥離した。胚の性別は決定しなかった。

胚形成期の胚培養

胚は、DMEM F/12（Gibco）とラット血清（Envigo）を1：1の割合で混合し、1×Glutamax（Gibco）、0.2×Penicillin-Streptomycin（Gibco）、0.2×MEM NEAA（Gibco）を加え、37℃、20％O2、5％CO2で培養した。培地は培養前に15分以上5%CO2で平衡化した。

四倍体補完

着床前2細胞期（E1.5）のマウス胚は、10 IU妊娠雌馬血清ゴナドトロピン（ProSpec）を注射し、48時間後に10 IUヒト絨毛性ゴナドトロピン（Sigma）を注射して過排卵させた5～6週齢のCD1雌から、卵管を洗浄することによりKSOM培地で回収し、CD1雄と交配させた。二細胞期胚は、BTX胚操作電気細胞融合システムを用いて四倍体を誘導するために融合された。融合胚はミネラルオイル（FUJIFILM）で覆われたアドバンスドKSOM（Sigma）に移され、胚性幹細胞を注入するまで胚盤胞期まで培養された。各宿主4倍体胚盤胞に10-15個のマウスES細胞を注入し、注入された胚盤胞を、精管切除したCD1雄マウスに栓をして準備した2.5日目のCD1偽妊娠サロゲート（6週齢）の子宮に移植した。これらのマウス胚性幹細胞由来胚は、子宮解剖により、その後の実験のために一定の発生タイムラインで回収された（上述）。

代謝およびシグナル調節実験

化学阻害剤は、特に断りのない限り、以下のように投与した： 2 mM2-DG52（SantaCruz Biotechnology）、20 µM BrPA（Santa Cruz Biotechnology）、10 µM PD0325901（StemCell Technologies）、10 µM SU5402（StemCell Technologies）、200 µMgalloflavin53（CaymanChemical）、 100 µMoligomycin54A（Santa Cruz Biotechnology）、5 µM6-AM55（CaymanChemical）、10 µMYZ98（CaymanChemical）、5 µMshikonin56（CaymanChemical）、および 5 µMazaserine57（CaymanChemical または Santa Cruz Biotechnology）。胚は4時間、7時間、12時間または18時間処理し、中胚葉摘出物は3時間、12時間または16時間処理した。プロテオグリカン硫酸化阻害剤NaClO3（シグマ社製）を20 mMで添加した。FGF2、FGF4、FGF8（いずれもペプロテック社製）は50 ngml-1 で投与した。

栄養欠乏実験とレスキュー実験

d-グルコース、l-セリン、l-グルタミン、ピルビン酸ナトリウムを除いたAdvanced DMEM/F-12培地（Caisson Laboratories）に、25mMの炭酸水素ナトリウム（シグマ）、0.2×ペニシリン-ストレプトマイシン（ギブコ）、0.2×MEM NEAA（ギブコ）を加えて、栄養欠乏培地を調製した。各実験条件に応じて、以下の栄養素を添加した： 17mMグルコース（ギブコ）、0.5mMピルビン酸ナトリウム（ギブコ）、および/または1×Glutamax（ギブコ）。ガラクトースレスキュー実験では、20 mMガラクトース（Sigma）を培地に添加した。GlcNAcレスキュー実験では、1 mMまたは2 mM GlcNAc（Sigma）を培地に添加した。すべての胚は、カスタマイズしたDMEMとラット血清（Envigo）の1：1の比率で培養した。

細胞培養、ガストルロイドおよびin vitro中胚葉指向性分化アッセイ

全てのマウス胚性幹細胞は、20% O2、5%CO2、37℃で培養され、80%のコンフルエントに達した時点で継代された。細胞は定期的にPCRでマイコプラズマ汚染について検査された。マウス胚性幹細胞は、2i/LIF（1μM MEK阻害剤PD0325901、3μM GSK-3阻害剤CHIR99021および10ng ml-1 LIF）を添加したFBS含有DMEM培地中で、ゲル化した組織培養グレードのプレート上で培養した。FBS含有DMEM（ギブコ社製）培地： 18％不活化FBS（ギブコ）、1.2×ペニシリン-ストレプトマイシン（ギブコ）、1.2×グルタミン酸（ギブコ）、1.2×MEM NEAA（ギブコ）、1.2mMピルビン酸ナトリウム（ギブコ）、および120μM 2-メルカプトエタノール（ギブコ）。この研究で用いたERK-KTRマウス胚性幹細胞は、Simonら34（JAX 035333）から入手した。

in vitroマウスガストルロイド実験では、記載されたプロトコールに従った20,21 。ガストルロイドは、Dingareら7.に記載されているように、培養3～4日目に指示された薬剤で処理し、その後のHCR染色またはqPCRアッセイのために固定した。

in vitroでの中胚葉指向性分化実験では、記載58 のプロトコールに従った。細胞は80％コンフルエントに達した後（0日目）、10 ngml-1Fgf2（R＆D Systems社製）を添加したFBS含有DMEM培地中で、6ウェル培養プレートまたは8ウェルμスライド（Ibidi社製）に20,000個/cm2の密度で継代した。細胞は1日目に10 ngml-1FGF2で、2日目に10 ngml-1FGF2と5μM CHIR99021（StemCell Technologies）で、3日目と4日目に5μM CHIR99021で処理した。薬物処理は、1日目にFGF2処理を開始してから少なくとも12時間後、あるいは3日目に細胞が中胚葉状態に移行した時点で培養に加えた。

in situ中胚葉摘出アッセイ

E7.25マウス胚からの中胚葉単離は、記載されているプロトコールに従った59 。胚は上記のように採取した。羊膜近傍の胚外組織を除去し、カップ状の胚を0.5% Trypsin EDTA（Gibco） と2.5% Pancreatin（Thermo Scientific Chemicals）からなる解離培地に4℃で15分間移した。胚を収集培地（前述）で洗浄し、注射器に取り付けた昆虫ピン（Roboz）を用いて中胚葉組織を剥離した。胚をフィブロネクチンでコートした18ウェルスライドプレート（Ibidi）に移し、ラット血清と胚培養液の比を1：4とした培地（前述）中で3～4時間接着させた。遊走動態のライブイメージングでは、3時間まで5分ごとに摘出片を撮影した。免疫蛍光染色では、摘出片を17時間まで培養し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）を含むPBSで20分間固定した。RNA配列決定には、摘出株を27時間培養した後、滅菌虫ピンで掻き取り、瞬間凍結した。

グルコース摂取アッセイ

多光子顕微鏡観察では、胚を直ちにライブイメージングした。共焦点顕微鏡では、胚を4% PFAを含むPBSで15分間固定し、PBS-T（0.05% Tween-20を含むPBS）で5分間洗浄後、直ちに画像化した。

DQゼラチンアッセイ

細胞は、前述のように8ウェルμスライド（Ibidi）上で中胚葉指向性分化を受けた。細胞がEpiSCステージにある2.5日目に、50μgml-1DQゼラチン（Invitrogen）を含む分化培地で培養し、3.5日目に4%PFAを含むPBSで20分間、遮光して固定した。細胞をDAPIを含むブロッキングバッファー（後述）中でインキュベートした（4℃で一晩、または室温で20分間）。

インバドポディアアッセイ

FITC-Fibronectin（Sigma-Aldrich）および0.1％ゼラチンを用いて18ウェルμスライド（Ibidi）を製造元の2日間プロトコールに従って調製し、遮光した。4%PFAを含むPBSで20分間固定する前に、これらのプレート上で16時間培養した。エクスプラントを、DAPIを含むブロッキングバッファー（後述）中でインキュベートした（4℃で一晩、または室温で20分間）。

活性ミトコンドリアのラベリング

マウス胃胞をES期で採取し、200 nM MitoTracker Deep Redまたは100 nM tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate（TMRM）で培養した。胚はそれぞれの色素で30分間培養した後、37℃、5％CO2の加湿チャンバー内で、以下に述べるライブイメージングと同じパラメーターに従ってイメージングした。

免疫蛍光染色

サンプルは、4％PFAを含むPBSで室温20～45分間、またはメタノールで4℃20分間固定した。固定後、サンプルをPBS-T（0.05% Tween-20を含むPBS）で2回洗浄し、1 mMグリシンと0.3% Triton X-100を含むPBSで室温で20-60分間透過処理した。一次抗体のインキュベーションは、ブロッキングバッファー（10％ウシ胎児血清（FBS）、10％Tween-20を含むPBS）中、4℃で一晩行った。ブロッキングバッファー中4℃で二次抗体インキュベーションを行う前に、サンプルをPBS-Tで2回洗浄した。最終日、サンプルをPBS-Tで2回洗浄した後、PBS-A液滴（0.75%ウシアルブミンフラクションV（ギブコ）入りPBS）に移し、35 mmガラス底ディッシュ（MatTek）にミネラルオイル（Sigma-Aldrich）で蓋をしてから共焦点イメージングを行った。PBS-Tによる洗浄はすべて室温で10分間行い、室温でのインキュベーションや洗浄はすべてロッキングプラットフォーム上で行った。本研究で使用したすべての抗体を補足表1に示す。

画像データの取得と処理

サンプルはLeica STELLARIS 5 顕微鏡で、HC PL APO CS2 40×/1.10またはHC FLUOTAR L 25×/0.95 W VISIR 0.17水対物レンズ、z間隔0.75 µm～5µm、Alexa 405、Alexa 488、Alexa 546、Alexa 633またはそれらの組み合わせに適したレーザーとフィルターを用いて画像化した。胚イメージング中のz軸に沿った蛍光減衰を補正するために、コントロール胚で「AOTFとPMTによるz補正」を定義し、そのイメージングセッション中のすべての実験条件にわたって適用した。生データは、オープンソースの画像解析ソフトウェアFiji/ImageJ2 2.9.0またはAIVIA 10.5.1 AI Image Analysis Softwareを使用して処理し、Photoshop 2021 22.3.1（Adobe）またはIllustrator 2024 28.6（Adobe）で組み立てた。横断面図は、ImageJの直交ビューアを使用して、1 µmz--spacing imageから作成した。デジタル定量化および免疫蛍光シグナル強度グラフは、Image Jのプロットプロファイル測定値を用いて取得し、GraphPad Prism10.2.3.ソフトウェアで可視化した。

タイムラプスライブイメージング

Leica STELLARIS 5 顕微鏡を用い、25×（HC FLUOTAR L 25×/0.95 W VISIR 0.17）または40×（HC PL APO CS2 40×/1.10） の水対物レンズと、Alexa 488、Alexa 546、Alexa 633、またはそれらの組み合わせに適したレーザー／フィルターを用いて、胚、中胚葉摘出物、中胚葉分化細胞培養物の共焦点タイムラプスイメージングを行った。サンプルは、37℃、5％CO2の加湿チャンバー下で撮像した。前処理を施したイビジディッシュ（Ibidi）上で4時間まで、2μmz-間隔の平面で5分間隔でエクスプ ラントを撮像した。画像は、後述の「画像解析」で説明するAIVIAを用いて処理した。

NAD(P)H自家蛍光の多光子ライブイメージング

NAD(P)H動態の胚ライブイメージングにマルチカラー二光子顕微鏡を用いた。胚は、20mM HEPESを添加した生体外培養液（前述）で飼育した。画像は、Chameleon Vision IIとDiscovery超高速レーザー（Coherent社製）を搭載したLA Vision TriM Scope II（LaVision Biotec社製）レーザー走査型顕微鏡で取得した。NAD(P)Hには750 nm、H2B-GFP:Tcf-LEFまたはERK-KTRmCloverレポーターには940 nmの波長を用いた。NAD(P)HとGFPの励起範囲は重なっているが、発光はバンドパスフィルターで分離した：青色範囲（425-475 nm; NAD(P)H）と緑色範囲（500-550 nm; FAD）。核内GFPシグナル（H2B-GFP:Tcf-LEF胚）をNAD(P)Hチャンネルから除外することで、NAD(P)HとGFPの発光シグナルの分離が確認された。胚は40×水浸レンズ（Nikon; NA 1.15）を用いて、ピクセルサイズ0.2 µmまたは0.3 µm、zステップ1または1.5 µmで400 Hzで撮像した。最適なS/N比を得るため、すべてのNAD(P)H画像について2のライン平均を行った。この方法で還元された代謝物から検出される蛍光は、NADH と NADPH の両方を捉えている（したがって、NAD(P)H と呼ばれる）61 。リン酸化されていないNADHとNAD+の細胞内濃度は、NAD(P)HとNADP+よりもはるかに高いことに注意すべきである（参考文献62）。さらに、胚のNAD(P)H蛍光シグナルが2-NBDGの取り込みと密接に共局在し、追従することを確認した。

画像解析

すべての胚は、定量を容易にするために、画像化中、A-P軸（図参照）に沿って正確に配置された。

胚盤葉におけるGLUT発現の角度

GLUT1およびGLUT3を染色し、DAPIで染色した胚の中胚矢状切片を、Fiji/ImageJ2でのグルコース取り込み定量に用いた。各胚について、角度の頂点は上胚葉と胚体外外胚葉の最も近位側の境界で、上胚葉の最も後方（0°）と最も前方（180°）の中間点に割り当てた。すべての胚について2つの角度値（「GLUT開始」と「GLUT終了」）を計算し、上胚葉で観察可能なGLUT発現の範囲を捕らえ、Theiler病期分類（上述したように、ES、MSまたはLS）を割り当てるための胚の原始縞遠位長とともに計算した。GLUT start」と「GLUT end」の平均値を各ステージについて計算し、RStudioを用いてバラ図で可視化した。

原始縞遠位伸長率

DAPI染色した胚の胚中期矢状断面を用いて、Fiji/ImageJ2で原始条条遠位伸長を定量した。各胚について、0％カットは前部上胚葉の形態で、100％カットは最遠位の上胚葉細胞で、「PS」（原始ストリーク）は原始ストリークの形態が伸長する最遠位点でマークした（図2b ）。各胚の原始ストリークの伸長率（0-PS÷0-100）がその胚の大きさに合わせて調整されるように、0％から100％の間の垂直距離と、0％から「PS」の間の垂直距離を測定した。したがって、コントロール胚の原始条線遠位伸長率95％（図2b）は、「この胚は原始条線が上胚葉の高さの95％まで伸長した」と解釈できる。ESは50以下、MSは50以上100以下、LSは100以上である。

基底膜の破壊

ラミニンとDAPIで染色した胚の中胚矢状断面をFiji/ImageJ2で基底膜の計算に用いた。各胚について、0％カットオフを前部上胚葉の形態でマークし、100％カットオフを最遠位上胚葉細胞に割り当て、「無傷のBM」をラミニンがまだ無傷である最遠位点でマークした（図2d ）。各胚の基底膜破壊率（0対BM÷0対100）をその胚の大きさに合わせるため、0％と100％の間の垂直距離、および0％と「BM」の間の垂直距離を測定した。したがって、コントロール胚の基底膜破壊率96％（図2d）は、「この胚は垂直基底膜長の96％を破壊した」と解釈できる。

FITC-フィブロネクチン侵入胞アッセイ

40×対物レンズで撮影したDAPI染色中胚葉のz-切片をフィブロネクチン穿孔の計算に用い、1つの胚葉につき3枚以上の画像を撮影した。すべての画像について、細胞数と穿孔数を計算した。インバダポディアの分解はパーセンテージ（穿孔数÷細胞数）で表した。

ERK-KTR核：細胞質比の定量化

ERK-KTR胚の矢状断面を用いてERK活性を定量した。ERK-KTRと明視野チャンネルを用いて細胞の形態を確認しながら、核と細胞質の領域を画定するために、Fiji/ImageJ2で各細胞を手動でセグメンテーションした（Extended Data Fig.） 各細胞について、以下の測定値を定量した：核面積na 、細胞質面積ca（核を含む）、核ERK-KTR強度ni 、および核-細胞質ERK-KTR強度ci 。核：細胞質比を計算するには、平均核強度（ni/na ）を平均細胞質強度（ci/（ca-na ））で割った。

増殖の定量化

TCF-LEFレポーター中胚葉の増殖カウントには、40倍の対物レンズで撮影したライブイメージングビデオを用い、Fiji/ImageJ2を用いて手作業で定量した。各抽出片について、最初のフレームで「開始集団」の全体的な細胞数を計算し、「細胞分裂」イベント（TCF-LEFのテロフェーズの観察）も、ビデオの経過にわたってフレームごとに注意深く評価することで割り当てた。次に、各抽出物について増殖指数（細胞分裂数/開始集団）を求め、最高指数1が「動画の開始時点のすべての細胞が、動画の終了時点までに分裂した」と解釈できるようにした。次に、この指標を動画の総フレーム長に調整し、異なる実験反復と動画の長さにわたる摘出物を比較できるようにした。したがって、16.5%（図4b）という読み出し値を持つコントロールの摘出物は、「映像の最初 にあった中胚葉細胞の16.5%が、映像の終わりまでに分裂した」と解釈できる。

AIVIAベースの画像解析

AIVIA10.5.1AI画像解析ソフトウェアを用いて、中胚葉の遊走動態を調べた。核のセグメンテーションは、「細胞追跡」レシピを用い、各実験レプリケートの各処置群の動画からTCF-LEF核蛍光チャンネルで学習させたピクセル分類器を適用して作成した（図4b ）。核のセグメンテーションの精度を保証するために、パラメータ値はピクセル分類器の「プレビュー」とトレーニングのラウンドの間に変更された。検出精度を確認するため、すべてのトラックを明視野チャネルに対して手動で検査した。不正確な系統は'track editor'で修正されるか、最終データセットから破棄され、親トラックと娘トラックは独立して扱われた。興味のあるすべてのトラック測定値をExcelにエクスポートし、検出長を正規化した（「最初のフレーム」から「最後のフレーム」を引いた）。したがって、すべてのデータポイントはμmmin-1またはμms-1でプロットされている。

分化中胚葉細胞の計数

Imaris 10.0.1ソフトウェアを用いて、T陽性細胞、全細胞、およびピクノーティック細胞をカウントした。核のセグメンテーションは「Surfaces」機能を用いて作成した。バックグラウンドサブトラクションや形態学的分割などのパラメータは、最適なアルゴリズム設定を特定するために、作成ウィザードツールを使用して調整した。DAPIシグナルを用いて健常細胞をカウントする場合よりも、バックグラウンドサブトラクションのしきい値を大きくし、セグメンテーションの直径を小さくして、DAPIチャンネルで分節化細胞をカウントした。表面は、正確さを保証するために、作成中および最終状態を通して、元の染色との相対的な関係を調べた。

ウェスタンブロット

RIPA buffer（Thermo Scientific 89900）を用いてタンパク質を抽出した。試薬には、抽出中のタンパク質の分解と脱リン酸化を防ぐため、1×プロテアーゼ阻害剤（Thermo Fisher Scientific, 87786）と1×ホスファターゼ阻害剤（Phos Stop Roche 4906845001）を加えた。タンパク質濃度は、Pierce BCA. protein assay kit (ThermoFisher, 23225)を用いて、製造者の指示に従って定量した。タンパク質を、10% v/v β-メルカプトエタノール（Millipore Sigma, M6250）を含む1×NuPAGE LDSサンプルバッファー（ThermoFisher, NP0007）中、95-100℃で5分間変性させた。タンパク質の電気泳動は、1×Tris/Glycine/SDSバッファー（Bio-Rad, 1610732から希釈）中の4-20%プレキャストポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad, 4568095）を用いて、110Vで1時間、すべてのタンパク質について行った。タンパク質をゲルからニトロセルロース膜（ThermoFisher, IB301032）に、Bio-Rad Mini Trans-Blot Cellを用い、100Vで1時間、製造元の指示に従って湿式転写した。ウェットトランスファーバッファーは20%メタノール、200mMグリシン、250mM Trisであった。メンブレンはTBST中の5％牛乳で室温で1時間、穏やかに振盪しながらブロッキングした。一次抗体を推奨濃度で、室温1時間または4℃で一晩、穏やかに振盪しながらメンブレンとインキュベートした。メンブレンをTBSTで5分間ずつ3回洗浄した後、TBST中5%脱脂乳で1:5,000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体と室温で1時間インキュベートした。その後、ブロットをTBSTで5分間ずつ3回洗浄した。ブロットをSuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (ThermoFisher, 34094)で室温で2-5分間処理した。ブロットをCCDカメラベースのイメージャーProteinSimple FluorChem Eシステムを用いて画像化した。

逆転写によるqPCR

RNeasy Micro Kit（Qiagen社製）を用い、製造者の指示に従って細胞から全RNAを抽出した。High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（AppliedBiosystems社製）を用い、製造者の指示に従って全RNA1μgを用いてcDNA合成を行った。mRNAの量は、PowerUp SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）を用いて測定した。転写産物発現の相対レベルは、Gapdhを内因性コントロールとして、ΔΔCt法により評価した。逆転写を伴うqPCRで使用したプライマーについては、補足表2を参照のこと。

RNA配列決定サンプルの収集とデータ解析

PicoPure RNA Isolation Kit（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、中胚葉から全RNAを抽出した。RNAサンプルはYale Center for Genome Analysisに提出され、品質評価、ライブラリー調製、配列決定が行われた。各RNAサンプルには2個の胚からの摘出物が含まれ、1条件につき2サンプルが提出された。ペアエンドリードをStar（v2.7.9a）を用いてEnsembl transcriptome（release 109）63を用いてマウスゲノム（GRCm38）にアライメントした。遺伝子発現差の解析はDESeq2（v1.40.1）を用いて行った。下流解析のためにサンプル間で差次的に制御された遺伝子を同定するために、log2-変換したfold changeが0.7以上または-0.7未満で、調整P値<0.01の遺伝子を選択した。遺伝子オントロジー解析は、topGO (v2.52.0)を用い、R studio (version 2023.12.1 + 402)上でFisherの正確検定のための'weight01'アルゴリズムを用いて行った。KEGGパスウェイ解析はDAVID(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)64,65 を用いて行った。

シングルセルシーケンスデータの再解析

MouseGastrulationData (v1.12.0)(https://github.com/MarioniLab/MouseGastrulationData)を用いて、過去に発表されたマウス胚の単細胞RNAシーケンスデータにアクセスした。E6.5～E8.5（サンプル1～10、12～20および23～37；サンプル11、21および22は、「混合胃形成」とラベルされたサンプルなど、ステージングが曖昧であったため解析から除外された）の全サンプルから、「epiblast」、「primitive streak」および「nascent mesoderm」の細胞状態のみを含むようにデータをサブセットした。数はSeurat（v.4.3.0）66,67,68,69,70 を用いて対数正規化した。細胞はまず、可視化のために1細胞種につき400細胞まで無作為にダウンサンプリングした。SingleCellExperiment（v1.22.0）72とscater（v.1.28.0）73は、仮数時間にわたる遺伝子発現の可視化に使用した。その後、主曲線を最初の2つの主成分にわたってトレースし、擬似的な時間組織を推定した。

統計と再現性

統計検定はGraphPad Prism 10.2.3ソフトウェアで行った。2群間の比較には、両側対応のないt検定を適用した。3群以上の比較には、特に断りのない限り、一元配置分散分析を用い、コントロールとの比較にはDunnettの多重比較検定を、全群間の比較にはTukeyの多重比較検定を適用した。P値は図パネルまたは凡例に表示した。すべての実験は、方法および図の説明に特に記載がない限り、少なくとも3生物学的複製で行った。図中の凡例は、胚、細胞、摘出片、幹細胞構造体の数、および関連する場合は各解析で実施した実験数を示す。統計的検出力の計算はサンプルサイズの決定には用いなかった。

報告概要

研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの利用可能性

本研究で作成された中胚葉摘出株のRNA-seqデータは、Gene Expression Omnibusにアクセッション番号GSE271973で寄託されている。本研究で使用したマウス胚単細胞RNA-seqデータセットは、Pijuan-Salaら26からアクセッション番号E-MTAB-6967で入手した（処理済みデータはhttps://github.com/MarioniLab/EmbryoTimecourse2018 ）。ソースデータは本論文とともに提供される。

参考文献

  1. Agathocleous, M. et al. 胚網膜における代謝分化。Nat. Cell Biol. 14, 859-864 (2012).Article CAS Google Scholar

  2. Bhattacharya, D., Azambuja, A. P. & Simoes-Costa, M. 代謝リプログラミングは、Yap/Teadシグナルを介して神経堤の移動を促進する。Dev. Cell 53, 199-211.e196 (2020).Article CAS Google Scholar

  3. Bulusu, V. et al. マウス胚中胚葉発生に関連する解糖系活性勾配の時空間的解析。Dev. Cell 40, 331-341.e334 (2017).Article CAS Google Scholar

  4. MYCは代謝フラックスの制御を通じてヒト多能性幹細胞の運命決定を制御する。Cell Stem Cell 21, 502-516.e509 (2017).Article CAS Google Scholar

  5. Moussaieff, A. et al.解糖を介したアセチルCoAとヒストンアセチル化の変化は、胚性幹細胞の初期分化を制御する。Cell Metab. 21, 392-402 (2015).Article CAS Google Scholar

  6. Oginuma, M. et al. 解糖活性の勾配が、無脊椎動物胚の体軸伸長におけるFGFおよびWntシグナル伝達を調整する。Dev. Cell 40, 342-353.e310 (2017).Article CAS Google Scholar

  7. Dingare, C., Cao, D., Yang, J. J., Sozen, B. & Steventon, B. Mannose controls mesoderm specification and symmetry breaking in mouse gastruloid. Dev. Cell 59, 1523-1537.e6 (2024).Article CAS Google Scholar

  8. 哺乳類の胚発生において、解糖に依存しないグルコース代謝はTEとICMの運命を区別する。Dev. Cell 53, 9-26.e24 (2020).Article CAS Google Scholar

  9. Oginuma, M. et al.無脊椎動物胚における細胞内pHは解糖の下流でWNTを制御する。Nature 584, 98-101 (2020).Article ADS CAS Google Scholar

  10. マウスの胚中胚葉発生は、解糖系フラックスシグナルによって制御されている。

  11. Child, C. M.Patterns and Problems of Development(Univ. Chicago Press, 1941);https://doi.org/10.5962/bhl.title.6415.

  12. Child, C. M.Individuality in Organisms(Univ. Chicago Press, 1915).

  13. 発生過程における代謝の役割の再検討。Development 145, dev131110 (2018).Article Google Scholar

  14. Malkowska, A., Penfold, C., Bergmann, S. & Boroviak, T. E. A hexa-species transcriptome atlas of mammalian embryogenesis delineates metabolic regulation across three different implantation modes. Nat. Commun. 13, 3407 (2022).Article ADS CAS Google Scholar

  15. Hemalatha, A. et al. 異なる代謝適応が、in vivoにおける皮膚表皮の勝者と敗者のがん原性変異幹細胞の応答を規定する。preprint atbioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.11.21.517380(2022).

  16. Peng, G. et al. マウス胃中胚における系統運命と細胞アイデンティティの分子アノテーションのための空間トランスクリプトーム。Dev. Cell 36, 681-697 (2016).Article CAS Google Scholar

  17. Vardhana, S. A. et al. グルタミン非依存性は多能性幹細胞の選択可能な特徴である。Nat. Metab. 1, 676-687 (2019).Article CAS Google Scholar

  18. Tian, E., Hoffman, M. P. & Ten Hagen, K. G. O-グリコシル化は、基底膜成分の分泌に影響を与えることで、インテグリンおよびFGFシグナル伝達を調節する。Nat. Commun. 3, 869 (2012).Article ADS CAS Google Scholar

  19. Czajewski, I. & van Aalten, D. M. F. 発生におけるO-GlcNAcylationの役割。Development 150, dev201370 (2023).論文 CAS Google Scholar

  20. マウス胚性幹細胞の多軸自己組織化特性。Nature 562, 272-276 (2018).記事 ADS CAS Google Scholar

  21. van den Brink, S. C. et al. マウス胚性幹細胞の凝集体における対称性の破れ、生殖細胞層の特定、および軸方向の組織化。Development 141, 4231-4242 (2014).Article Google Scholar

  22. マウス胚の軸伸長には、FGF4とFGF8によるシグナル伝達が必要である。Dev. Biol. Biol. 371, 235-245 (2012).Article CAS Google Scholar

  23. Choi, J. et al. 3種類の胚盤胞由来幹細胞におけるミトコンドリア形態、エネルギー代謝、および遺伝子発現シグネチャーの比較解析。Redox Biol. 30, 101437 (2020).Article CAS Google Scholar

  24. McFann, S. E., Shvartsman, S. Y. & Toettcher, J. E. Erkを入れる：成長因子シグナル伝達と中胚葉形態形成。Curr. Top. Dev. Biol. Biol. 149, 263-310 (2022).Article CAS Google Scholar

  25. Ciruna, B. & Rossant, J. FGFシグナルは、原始線条における中胚葉細胞の運命決定と形態形成運動を制御する。Dev. Cell 1, 37-49 (2001).論文 CAS Google Scholar

  26. Pijuan-Sala, B. et al. マウス胃形成と初期器官形成の単一細胞分子マップ。Nature 566, 490-495 (2019).Article ADS CAS Google Scholar

  27. Mook, O. R., Van Overbeek, C., Ackema, E. G., Van Maldegem, F. & Frederiks, W. M. in situ localization of gelatinolytic activity in the extracellular matrix of colon cancer metastases of rat liver using quenched fluorogenic DQ-gelatin. J. Histochem. Cytochem. 51, 821-829 (2003).Article CAS Google Scholar

  28. ESCおよびマウスにおけるFGF/ERKシグナル活性をモニターするSprouty4レポーター。Dev. Biol. 441, 104-126 (2018).論文 CAS Google Scholar

  29. Lunn, J. S., Fishwick, K. J., Halley, P. A. & Storey, K. G. A spatial and temporal map of FGF/Erk1/2 activity and response repertoires in the early chick embryo. Dev. Biol. 302, 536-552 (2007).Article CAS Google Scholar

  30. Ciruna, B. G., Schwartz, L., Harpal, K., Yamaguchi, T. P. & Rossant, J. 線維芽細胞増殖因子受容体-1（Fgfr1）機能のキメラ解析：原始筋を通る形態形成運動におけるFGFR1の役割。Development 124, 2829-2841 (1997).Article CAS Google Scholar

  31. Sun、X., Meyers、E. N., Lewandoski、M. & Martin、G. R. Fgf8の標的破壊は、マウスの胃形成胚における細胞移動の失敗を引き起こす。Genes Dev. 13, 1834-1846 (1999).Article CAS Google Scholar

  32. Shimokawa, K. et al. 細胞表面のヘパラン硫酸鎖はマウス胚におけるFGFシグナルの局所受容を制御する。Dev. Cell 21, 257-272 (2011).論文 CAS Google Scholar

  33. Garcia-Garcia, M. J. & Anderson, K. V. マウス胃形成過程におけるFGFシグナル伝達におけるグリコサミノグリカンの重要な役割。Cell 114, 727-737 (2003).Article CAS Google Scholar

  34. マウス胚盤胞におけるERK活性のライブ可視化により、系統特異的なシグナル伝達動態が明らかになった。Dev. Cell 55, 341-353 e345 (2020).Article CAS Google Scholar

  35. Pokrass, M. J. et al. 哺乳類の着床前胚において、細胞周期に依存したERKシグナル動態が運命の特定を指令する。Dev. Cell 55, 328-340 e325 (2020).Article CAS Google Scholar

  36. マウス胚性幹細胞におけるFGF下流の断続的なERK振動。Development 149, e199710 (2022).論文 Google Scholar

  37. レトロウイルスベクターによって培養多能性細胞に導入された遺伝子の生殖細胞系列伝達。Nature 323, 445-448 (1986).Article ADS CAS Google Scholar

  38. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W. & Roder, J. C. 初期通過胚性幹細胞からの完全細胞培養由来マウスの誘導。Proc. Natl Acad. USA 90, 8424-8428 (1993).Article ADS CAS Google Scholar

  39. Lanner, F. et al. ヘパラン硫酸化依存性線維芽細胞増殖因子シグナル伝達は、分化に向けた胚性幹細胞を不均一な状態に維持する。Stem Cells 28, 191-200 (2010).論文 CAS Google Scholar

  40. ヘパラン硫酸の硫酸化に対する塩素酸ナトリウム処理の選択的効果。J. Biol. Chem. 274, 36267-36273 (1999).論文 CAS Google Scholar

  41. fgfr-1 はマウスの胃形成期における胚の成長と中胚葉のパターニングに必要である。Genes Dev. 8, 3032-3044 (1994).Article CAS Google Scholar

  42. Najera, G. S. & Weijer, C. J. 胃形成形態の進化。Development 150, dev200885 (2023).論文 CAS Google Scholar

  43. Artym, V. V., Yamada, K. M. & Mueller, S. C. 局所細胞浸潤解析のためのECM分解アッセイ。Methods Mol. Biol. 522, 211-219 (2009).論文 CAS Google Scholar

  44. Probst, S. et al. マウス胃形成過程における中胚葉および内胚葉系列分離の時空間的シーケンス。発生 148, dev193789 (2021).論文 CAS Google Scholar

  45. Gupton, S. L. & Waterman-Storer, C. M. アクトミオシン系とフォーカルアドヒーシヨン系の時空間的フィードバックは、迅速な細胞移動を最適化する。Cell 125, 1361-1374 (2006).Article CAS Google Scholar

  46. Hart、G. W., Slawson、C., Ramirez-Correa, G. & Lagerlof, O. O-GlcNAcylationとリン酸化のクロストーク：シグナル伝達、転写、慢性疾患における役割。Annu. Rev. Biochem. 80, 825-858 (2011).Article CAS Google Scholar

  47. Hull, R. L. et al. WAS-406およびアザセリンによるグリコサミノグリカン合成およびタンパク質グリコシル化の阻害は、in vitroで膵島アミロイド形成を減少させる。Am. J. Physiol. 293, C1586-1593 (2007).Article CAS Google Scholar

  48. Cao, D. et al. グルコース代謝の時空間的コンパートメント化が哺乳類の胃形成の進行を導く。Preprint atbioRxiv https://doi.org/10.1101/2023.06.06.543780(2023).

  49. Stapornwongkul, K. S. et al. NodalおよびWntシグナルの制御による生殖細胞層の割合の代謝制御。bioRxivhttps://www.biorxiv .org/content/10.1101/2023.12.04.569862v1(2023)にプレプリント。

  50. Luque, A. V. et al. 分子-表現型統合プロファイリングにより、胚盤胞における形態変異の代謝制御が明らかになった。bioRxivhttps://www.biorxiv .org/content/10.1101/2023.12.04.569921v1(2023)にプレプリント。

  51. マウスにおけるWnt/β-カテニンシグナル伝達の高感度かつ高輝度な1細胞解像度のライブイメージングレポーター。BMC Dev. 10, 121 (2010).論文 CAS Google Scholar

  52. 培養ヒト細胞の増殖と代謝に対する2-デオキシグルコースの影響。J. Biol. Chem. 236, 1887-1890 (1961).Article CAS Google Scholar

  53. ガロフラビン（CAS 568-80-9）：乳酸脱水素酵素の新規阻害剤。ChemMedChem 7, 311-317 (2012).Article CAS Google Scholar

  54. オリゴマイシン（H+ -ATP合成酵素のF0部分の阻害剤）は、TNF誘導アポトーシスを抑制する。Oncogene 21, 8149-8157 (2002).Article CAS Google Scholar

  55. Kohler, E., Barrach, H. & Neubert, D. NADPの6-アミノニコチンアミドアナログによるNADP依存性酸化還元酵素の阻害。FEBS Lett. 6, 225-228 (1970).Article CAS Google Scholar

  56. Chen, J. et al. シコニンとその類似体は、腫瘍ピルビン酸キナーゼ-M2を標的としてがん細胞の解糖を阻害する。Oncogene 30, 4297-4306 (2011).論文 CAS Google Scholar

  57. Marshall, S., Bacote, V. & Traxinger, R. R. グルコース輸送系のグルコース誘導脱感作を媒介する代謝経路の発見。インスリン抵抗性の誘導におけるヘキソサミン生合成の役割。J. Biol. Chem. 266, 4706-4712 (1991).Article CAS Google Scholar

  58. Gouti, M. et al. In vitroで神経中胚葉前駆細胞を作製したところ、脊髄と傍軸中胚葉の同一性の決定におけるwntシグナルの役割が明らかになった。PLoS Biol. 12, e1001937 (2014).論文 Google Scholar

  59. Burdsal, C. A., Damsky, C. H. & Pedersen, R. A. The role of E-cadherin and integrins in mesoderm differentiation and migration at mammalian primitive streak. Development 118, 829-844 (1993).Article CAS Google Scholar

  60. Zou, C., Wang, Y. & Shen, Z. 2-NBDGは直接グルコース取り込み測定のための蛍光インジケーターである。J. Biochem. Biophys. Methods 64, 207-215 (2005).Article CAS Google Scholar

  61. Skala, M. C. et al. 前癌上皮におけるNADHおよびFADの酸化還元状態、蛍光寿命、細胞形態のin vivo多光子顕微鏡観察。Proc. Natl Acad. USA 104, 19494-19499 (2007).Article ADS CAS Google Scholar

  62. Pollak, N., Niere, M. & Ziegler, M. NADキナーゼレベルはヒト細胞のNADPH濃度を制御する。J. Biol. Chem. 282, 33562-33571 (2007).Article CAS Google Scholar

  63. Cunningham, F. et al. Ensembl 2022. Nucleic Acids Res. 50, D988-D995 (2022).論文 CAS Google Scholar

  64. DAVID：遺伝子リストの機能エンリッチメント解析と機能アノテーションのためのウェブサーバー（2021年更新）。Nucleic Acids Res. 50, W216-W221 (2022).論文 ADS CAS Google Scholar

  65. DAVIDバイオインフォマティクスリソースを用いた大規模遺伝子リストの系統的・統合的解析。Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).論文 Google Scholar

  66. Hao, Y. et al. 統合的、マルチモーダル、スケーラブルなシングルセル解析のための辞書学習。Nat. Biotechnol. 42, 293-304 (2024).論文 CAS Google Scholar

  67. Hao, Y. et al. マルチモーダルシングルセルデータの統合解析. Cell 184, 3573-3587.e3529 (2021).論文 CAS Google Scholar

  68. Stuart, T. et al. シングルセルデータの包括的統合。Cell 177, 1888-1902.e1821 (2019).Article CAS Google Scholar

  69. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E. & Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nat. Biotechnol. 36, 411-420 (2018).Article CAS Google Scholar

  70. 単細胞遺伝子発現データの空間再構成。Nat. Biotechnol. 33, 495-502 (2015).Article CAS Google Scholar

  71. Street, K. et al. Slingshot: cell lineage and pseudotime inference for single-cell transcriptomics. BMC Genomics 19, 477 (2018).論文 Google Scholar

  72. Amezquita, R. A. et al. Orchestrating single-cell analysis with Bioconductor. Nat. Methods 17, 137-145 (2020).論文 CAS Google Scholar

  73. RにおけるシングルセルRNA-seqデータの前処理、品質管理、正規化および可視化。

参考文献のダウンロード

謝辞

共焦点顕微鏡のサポートをしてくれたK. Sumigray、マイクロインジェクションおよび4倍体相補性アッセイ用の擬妊娠マウスの準備のサポートをしてくれたZ. SmithおよびSmith研究室のメンバー、4倍体相補性実験のサポートをしてくれたYale Genome Editing Center、マウス実験およびExtended Data Fig.1cに示した図のサポートをしてくれたT. Finkelstein、プロジェクトを通して議論してくれたSozen研究室のメンバー、原稿について有益なフィードバックをくれたZ. J.B.はNIH NRSA F31 pre-doctoral fellowshipの支援を受けている。A.H.はNYSCF-Druckenmiller Fellowであり、New York Stem Cell Foundationの支援を受けている。V.G.はNIHグラント番号1R01AR063663、1R01AR067755、DP1AG066590の支援を受けている。B. SteventonはWellcome Trust Discovery Award（225360_Z_22_Z）の支援を受けている。Steventon研究室での研究は、C.D.とB.Steventonが共同で保有するMRC Research grant MR/ V009192/1の助成を受けている。Sozen研究室はNIH Early Innovators Award (DP2HD112040)、Richard and Susan Smith Family Foundation、Reprogrants、American Society of Reproductive Medicine (ASRM)の助成を受けている。内容は著者の責任によるものであり、必ずしも米国国立衛生研究所の公式見解を示すものではない。

著者情報

著者メモ

  1. これらの著者は同等に貢献した： Dominica Cao, Jenna Bergmann

著者および所属

  1. 米国コネチカット州ニューヘブン、イェール大学医学部遺伝学科

  2. Dominica Cao、Jenna Bergmann、Liangwen Zhong、Anupama Hemalatha、Tyler Jensen、Andy L. Cox、Valentina Greco & Berna Sozen

  3. ケンブリッジ大学遺伝学科、ダウニングサイト、ケンブリッジ、UK

  4. Chaitanya Dingare & Benjamin Steventon

  5. 米国コネチカット州ニューヘブン、イェール大学MD-PhDプログラム

  6. タイラー・ジェンセン

  7. 米国コネチカット州ニューヘイブン、イェール大学幹細胞センター

  8. ヴァレンティーナ・グレコ & ベルナ・ソーゼン

  9. ハワード・ヒューズ医学研究所、イェール大学医学部、米国コネチカット州ニューヘイブン

  10. ヴァレンティーナ・グレコ

  11. 米国コネチカット州ニューヘイブン、イェール大学医学部産科・婦人科・生殖科学科

  12. ベルナ・ソーゼン

貢献

D.C.とJ.B.は、B. Sozenの協力を得て、マウス胚と幹細胞に関する実験を行い、データを解析した。D.C.は中胚葉摘出実験を行った。J.B.はRNA-seqデータセットの解析を行った。L.Z.はマウス4倍体相補アッセイを行った。A.H.とD.C.は胚におけるNAD(P)Hの多光子ライブイメージングを確立・実施し、A.H.とV.G.はデータ解釈に協力した。C.D.とB.Steventonはガストルロイド実験を行い、批判的な討論を行った。T.J.はウェスタンブロット実験を行い、データを解析した。A.L.C.は批判的議論とイラストを提供し、原稿執筆に協力した。B.Sozenは、D.C.とJ.B.の協力を得て、このプロジェクトを発案・監督し、原稿を執筆した。

責任著者

Berna Sozen まで。

倫理申告

競合利益

著者らは競合する利益はないと宣言している。

査読

査読情報

本論文の査読にご協力いただいた匿名の査読者に感謝する。

追加情報

出版社注：Springer Natureは、出版された地図における管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

図表

Extended Data 図1 マウスの胃形成は、コンパートメント化されたグルコース活性によって先行される。

(a-c) 2-NBDG（蛍光グルコースアナログ）のライブイメージングによる、初期発生期（a）および中期から後期発生期（b, c）のマウス胃胞におけるグルコース取り込みの可視化。イラストは発生段階と撮像面を示す。15回の独立した実験。(a) 2-NBDGシグナルは原始条線遠位の胚の後側の移行上胚葉で高い。(b, c) 2-NBDGは原始条線遠位の移行期上胚葉で高値を維持し（図の紫色の細胞、波1）、原始条線自体では低値であり（図の灰色の細胞）、原始条線から間充織として出た側方中胚葉で高値を示す（図の黄色の細胞）。スケールバーは20μm。

Extended Data Fig. 2 胃形成期のマウス胚における、コンパートメント化されたグルコース活性の特徴。

(a-d) マウスの胃形成中期（MS）または後期（LS）ステージにおける、注目する細胞タイプに関連したGLUT1（a, d）およびGLUT3（b, c）タンパク質発現の代表的なz-切片（FijiのLUTによるヒートマップ強度カラー）。右は上胚葉と原始縞の境界のズームインセット。Aは前方、Pは後方。a（n=21胚）、b（n=7胚）、c（n=8胚）、d（n=14胚）。スケールバーは40μmを表す。(e) MS期マウス胚葉におけるNAD(P)Hと2-NBDGの代表的z-切片。上胚葉と原始縞の境界のズームインセットを右側に示す。スケールバーは40μmを表す。(f)上：レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによるトランスクリプトーム空間座標を示すマウス胚横断面の模式図下：オンラインe-gastrulation Geo-seqデータベース（Peng et al.16）から目的の遺伝子をクエリーして作成した、原始縞遺伝子T、解糖系遺伝子Slc2a1、Gpi1、Pfkp、 Ldhb、およびHBP遺伝子Ogtと Gnpnat1のコーンプロット。Aは前方、Pは後方、AEは内胚葉前方、EPは内胚葉後方、Mは中胚葉、Lは左、Rは右。

Extended Data 図3 HBPを介したグルコース代謝は中胚葉の運命獲得を制御する。

(a)左：グルコース代謝とその3つの分岐の模式図：薄い灰色＝ヘキソサミン生合成経路（HBP）；ピンク＝コア／後期解糖；緑＝ペントースリン酸経路（PPP）。赤文字は化学阻害剤、青文字はその代謝酵素標的を示す。 (b) 2-DG+BrPAで18時間生体外処理した胚におけるSOX2、T/BRA、LEF1タンパク質の発現パターンを示す代表的なz-切片と、(c) Theiler発生結果： 対照（n = 17）、2-DG+BrPA（n = 24）、6つの実験反復；初期株（ES）、中期株（MS）、後期株（LS）、無芽（OB）、初期芽（EB）、後期芽（LB）、初期頭折り（EHF）。スケールバーは40µm。プロットは平均±SEMを示す。平均して、コントロール胚の約53％がOB期まで発生したのに対し、2-DG+BrPA処理胚の約73％はMS期までしか発生しなかった。(d）阻害剤2-DGの有効性を示す用量反応曲線（左；培養前、n＝7；コントロール、n＝42；0. 5mM、n=5；1mM、n=4；2mM、n=7；3mM、n=4；5mM、n=5胚）およびアザセリン（右；前培養、n=7；コントロール、n=42；1μM、n=3；3μM、n=4；5μM、n=12；7μM、n=4；10μM、n=3胚）。プロットは平均値とSDを示す。通常の一元配置分散分析に続くTukeyの多重比較検定。****P < 0.0001。培養前 vs. 1 mM 2-DG **P = 0.0066、培養前 vs. 5 mM 2-DG **P = 0.0036、1 mM 2-DG vs. 2 mM 2-DG **P = 0.0016、1 mM 2-DG vs. 3 mM 2-DG *P = 0.0173、2 mM 2-DG vs. 5 mM 2-DG *P = 0.0152、3 mM 2-DG vs. 5 mM 2-DG *P = 0.0217。前培養 vs. 1 μM Azaserine *P = 0.0522、前培養 vs. 3 μM Azaserine *P-0.0435、コントロール vs. 5 μM Azaserine ***P = 0.0006、1 μM Azaserine vs. 10 μM Azaserine ***P = 0.0001、5 μM Azaserine vs. 7 μM Azaserine ***P = 0.0001、5 μM Azaserine vs. 10 μM Azaserine ***P = 0.0009。培養前」の条件とは、すでにある程度の原始縞形成を示す実験開始時の胚を指すことに留意されたい。胚の生存率が全体的に低下する薬物濃度は毒性があると考えられる。この研究で用いられた濃度（赤枠）は、胚の生存率を損なうことなく原始縞の伸長を変化させた。(e) 代表的な画像は、12時間の代謝阻害剤処理後のマウス胃の発生結果を示す。図2bも参照。Aは前方、Pは後方。スケールバーは40μmを表す。(f) 栄養欠乏培地（グルコース、ピルビン酸、グルタミンを含まない）、およびレスキュー条件（除かれた栄養素を選択的に再導入）で培養し、化学的阻害剤の特異的効果を機能的に検証したマウスガストルーラ。Aは前方、Pは後方。スケールバーは40μmを表す。左のグラフはSOX2発現強度の平均値±SEM（DAPIで正規化）。通常の一元配置分散分析に続くDunnettの多重比較検定。コントロール（n＝4胚）と、無栄養（n＝3胚）、グルコース（n＝5胚）、ピルビン酸（n＝5胚）、グルタミン（n＝4胚）、グルコース＋グルタミン（n＝5胚：前胚葉、n＝3胚：PS＋中胚葉）の比較。右のグラフはPS遠位伸長％を示す（コントロール、n=7胚；栄養なし、n=6胚；グルコース、n=8胚；ピルビン酸、n=9胚；グルタミン、n=7胚）。プロットは平均＋SDを示す。(g) 2-DG-BrPAおよびアザセリン処理胚における、対照胚と比較した胃形成のMS期における同様のPHOSPHO-HISTONE H3局在（シアン）を示す代表的なz-切片。スケールバーは40μmを表す。プロットは平均＋SD。通常の一元配置分散分析。P値を示す。

出典データ

Extended Data Fig. 4 幹細胞モデルは、中胚葉運命獲得におけるグルコース代謝の直接的な影響を示している。

(a) 2-DGとYZ9で処理したマウス胃捻転の代表的な画像。2-DGで処理した胃瘻は伸長せず、Tを発現しない。 YZ9で処理した胃瘻は伸長し、コントロールと同程度のT発現を示す。(b）定量的RT-PCRにより、2-DG処理胃小胞におけるTおよびEtv4の有意な減少が示された。プロットは平均＋SDを示す。一元配置分散分析後のDunnettの多重比較検定。P値を示す。N = 3反復。(c) 2-DG+BrPA、アザセリン、YZ9、ガロフラビン、および6ANで24時間処理し、オリゴマイシンで6時間処理したmXEN細胞の代表的な画像で、いずれも内胚葉マーカーGATA6（赤）の発現を維持していることを示す。各条件についてN = 3個の独立した実験反復を調べた。(d) 活性ミトコンドリア色素（MitoTracker、上）およびミトコンドリア膜電位（TMRM、下）を用いてインキュベートした初期縞状胃胞のライブイメージングによる代表画像。エピブラスト-VE境界を可視化した拡大パネル。FijiのLUTによるヒープマップ強度カラー。各染料について、N≧3個の胚を調べた。

出典データ

Extended Data 図5 中胚葉指向性分化は、中胚葉運命の獲得と維持におけるグルコース代謝の直接的な影響を明らかにする。

(左上：mESCからの中胚葉定向分化ステップの模式図。右上： 開始mESC集団とDay(D)4に固定したコントロール細胞のT（赤）染色明視野像。下： D1-D4 2-DG+BrPA、アザセリン、PD、SU処理群の代表的な画像は、T/BRA（赤色）の消失を示す。スケールバーは200μm。左下のボックスは各画像を2倍に拡大したもの。グラフは、(b)ではT/BRA発現細胞数、(c)では細胞死を示すピクノーティック細胞数を、いずれも対照処理条件の全細胞数に対する相対値で示す： コントロール（6つの独立した実験から得られたn=12）、2-DG+BrPA（2つの独立した実験から得られた各処理長につきn=3）、アザセリン（2つの独立した実験から得られた各処理長につきn=5）、YZ9（2つの独立した実験から得られた各処理長につきn=3）、PD（2つの独立した実験から得られた各処理長につきn=3）、およびSU（2つの独立した実験から得られたD1-D4処理につきn=4、D3-D4処理につきn=3）。グラフは平均値±SEM。通常の一元配置分散分析に続くDunnettの多重比較検定。図はP値を示す。(d)中胚葉多能性遺伝子（D1-4またはD3-4からの処理）における転写産物の変化を、3つの独立した実験複製（D1-4コントロールおよびアザセリンでは全多能性遺伝子について4複製、D1-4 2-DG+BrPAおよびD1-4 PDではSox2およびKlf2について4複製、D3-4アザセリンではPdgfraについて2複製）にわたって問い合わせた、定向分化実験のqPCR解析。プロットは平均値±SEMを示す。一元配置分散分析に続くDunnettの多重比較検定。****P < 0.0001. コントロールと比較した1-4日目： Mesp12-DG *P = 0.0309、Mesp1アザセリン *P = 0.0103、Rex1PD *P = 0.0326、Klf2PD *P = 0.0395。コントロールと比較した3-4日目の阻害： Pdgfra1PD **P = 0.0052、Sox2 PD *P = 0.0354、Klf2PD ***P = 0.0003。

出典データ

Extended Data 図6 上胚葉のグルコース代謝は、上皮間葉転換（EMT）プログラムと関連している。

(a)MS期胚の矢状z-切片の代表的なモンタージュは、LAMININ（マゼンタ）免疫染色で同定されたように、上胚葉GLUT1（Fiji's LUTによるヒートマップ強度カラー）発現が無傷の基底膜領域に共局在していることを示している（n = 28胚）。Aは前方、Pは後方。スケールバーは100μm。(b)GLUT1とMMP14を染色した同じ胚の前部および後部のエピブラスト（Epi）インセット（両タンパク質発現のFijiのLUTによるヒートマップ強度カラー）。後方領域では、GLUT1の発現はMMP14の高活性領域と共局在しており（n = 3 胚）、特に原始条線（PS）に接するEpi細胞において顕著であった（白アスタリスク）。スケールバーは40μmを表す。(c)MS期後期胚のZ-断面。GLUT1とGLUT3がCADHERINに共局在しており、特にエピブラストとPS細胞に隣接している（ECAD、白アスタリスク）。FijiのLUTによるヒートマップ強度カラー。スケールバーは40μmを表す。P値を示す。(d)in vivoマウス胚のEMT、グルコース代謝、クレブスサイクル遺伝子の擬似時間（エピブラストから原始縞、新生中胚葉の状態）にわたる主曲線。

Extended Data Fig. 7 上胚葉のグルコース代謝は、上皮間葉転換（EMT）プログラムと関連している。

(a) DQゼラチン（マゼンタ）を用いたPD処理in vitroEMTアッセイの代表的結果。定量化は、各画像フィールドで同定されたDQ+クラスターの数を示す（n = 25フィールドを2つの独立した実験反復で定量化）。両側パラメトリックt検定。**P = 0.0011. (b)分化誘導実験のqPCR結果は、2-DG+BrPA処理により主要なEMT転写産物のダウンレギュレーションを示した。プロットは平均値＋SD。両側パラメトリックt検定。全群でN = 3実験反復。(左：対照マウス胚の上胚葉（緑点線）の矢状断面図、正面断面図、および横断面図の単一z-切片は、GLUT1発現（FijiのLUTによるヒートマップ強度カラー）がdpERK発現（緑）の前方および遠位にあることを示している。） プロットプロファイルは、上の直交画像の前後軸を横切る上胚葉における発現強度を示す。右：2-DG+BrPA処理により、上胚葉内の細胞におけるdpERK活性が消失した（緑点線）： コントロール（n = 6胚）、2-DG+BrPA（n = 5胚）。グラフは各胚の上胚葉における平均発現強度を示す。スケールバーは40μmを表す。プロットは平均＋SD。両側パラメトリックt検定。P値を示す。(d) 図は実験デザインを示す。ERK（PD）およびHBP阻害（2DG+BrPAまたはアザセリン）を12時間培養した後の胚の表現型。T/BRAは原始筋を示す。(e）生体外で2-DG+BrPAまたはPDを用いて18時間培養したマウス胃胞は、同等の発生遅延を示した： コントロール（n = 21）、2-DG+BrPA（n = 24）、PD（n = 16）。プロットは平均値±SEM。

出典データ

Extended Data Fig. 8 HBPは中胚葉移行期の上胚葉におけるERK活性を媒介する。

(a ）左：4倍体相補アッセイにより、胚本来の細胞がERK-KTRmClover2 N mESCのみに由来する胚を作製した。スケールバーは40μmを表す。右： ES期胚（4倍体相補により作製）の核および細胞質手動分割を用いて、ERK活性の核-細胞質比（N:C）を定量した。スケールバーは40μmを表す。(b) 上胚葉組織におけるN:C比を計算したERK活性の定量。発生が進むにつれて、ERK活性は前後軸にわたって段階的に変化する。プロットは代表的なES（R2 = 0.24）とMS（R2 = 0.40）における上胚葉のN:C比を示す。(c) NAD(P)Hの多光子ライブイメージングにより、グルコース代謝活性が上胚葉のERK活性化の前方で起こることが確認された（核を除いた領域）。FijiのLUTによるヒートマップ強度カラー。(d) E6.5で採取し、SUまたはPDで7時間培養したERK-KTR胚の代表的な画像は、ERK阻害条件下で細胞質と核のレポーターレベルがほぼ均一であることを示している。(e)代表的なMS消化管期胚の2-DG+BrPA、NaClO3、Azaserine、Azaserine+GlcNAcレスキュー処理により、後上胚葉領域におけるERK活性の核排除表現型の強度が減少した。ERK-KTR核排除をよりよく可視化するためにヒートマップ強度の色を用いた。(f) 示した条件で12時間培養した後のマウス胃瘻の胚領域におけるSYNDECAN1（SDC1）（上のパネル）と10E4（下のパネル）の発現。N = 各条件につき最低6個の胚。(g) 培養中のOTX2タンパク質発現の亢進によるEpiLSC状態の確認。ナイーブmESC多能性状態はOTX2発現を欠く2iLifで示す（n = 2独立実験）。(h)胚中期矢状Z-切片は、12時間培養におけるPSの伸長（点線、T/BRA発現）を示す。グラフは平均±SEMを表示した、示した条件下で培養した胚のPS遠位伸長の長さの比較を示す。通常の一元配置分散分析の後、Dunnettの多重比較検定を行った。図はP値を示す。Azaserine（n=13）、NaClO3（n=9）、Azaserine+FGFs（n=7）は、それぞれ3つの独立した実験を通してControl（n=9）と比較した。

出典データ

Extended Data 図9 コミットされた中胚葉内の代謝反応。

(a) 3回の独立した実験における、GLUT3とNCAD+側方中胚葉（n = 10胚）を標識したE6.75マウス胚の横断面。(b) 阻害剤で処理したマウス胃胞の代表的な矢状断面（独立した実験： アザセリン（n = 11）、YZ9（n = 10）、SU（n = 4）またはPD（n = 13））を生体外で12時間投与した。Aは前方、Pは後方。スケールバーは40μm。(c) 原始線条（PS）を出たときの時空間的な中胚葉の移動を示す胚の図。 (d) コントロール（n = 12）、YZ9（n = 18）および2DG+BrPA（n = 12）処理胚のNAD(P)Hシグナル強度を定量化した。グラフは平均値を黒棒で示す。通常の一元配置分散分析に続くDunnettの多重比較検定。図はP値を示す。データ点は、胚上胚葉内で測定された異なる領域を示し、各胚は色分けされている。(e) 胚中期の矢状z-切片から計算したPS表面積は、コントロール（n = 35 胚）と比較して、PD（n = 18 胚）およびYZ9（n = 8 胚）処理群で有意なサイズの増加を示した。プロットは平均値＋SD。通常の一元配置分散分析に続くDunnettの多重比較検定．図はP値を示す。(f)代表的な単一z-切片は、PDおよびYZ9処理胚（マゼンタの点線で示した領域）においてPS表面領域（T/BRAで示した領域）が拡大し、それらの領域においてPHOSPHO-HISTONE H3（シアン）が高発現していることを示している： コントロール（n = 7）、PD（n = 6）、YZ9（n = 7）。スケールバーは40μmを表す。(g)横断面切片から、PSの表現型が拡大し、PHOSPHO-HISTONE H3がPSに局在していることが確認された（赤矢印）。スケールバーは40μmを表す。定量化により、PSにおけるリン酸化ヒストンH3数（形態またはT発現で示される）は、コントロール（n = 8）およびアザセリン（n = 3）処理胚と比較して、PD（n = 7）およびYZ9（n = 7）処理胚で有意に増加していることが示された。SU（n＝7）およびPD＋YZ9（n＝7）処理胚では有意差は認められなかった。プロットは平均値±SEMを示す。通常の一元配置分散分析の後、Tukeyの多重比較検定を行った。図はP値を示す。(h) PD + YZ9二重処理胚の代表画像。(i) ストリーク後期（E7.5）胚の4時間のコントロールおよびPD処理後の2NBDG取り込み。

出典データ

Extended Data 図10 適切な中胚葉移動には解糖系経路が必要である。

(a)側方中胚葉マーカーSNAI1で染色した、コントロール、PDおよびYZ9処理胚の代表的な表面像。(b)17時間人工培養後の中胚葉摘出片の表面積の変化から、2-DG-BrPA処理（n = 3摘出片）のみが、他のグループ（コントロール、n = 4; PD、n = 3; YZ9、n = 3; Azaserine、n = 3摘出片）と比較して、サイズが有意に減少することが示された。プロットは平均値±SEM。両側パラメトリックt検定。通常の一元配置分散分析に続くDunnettの多重比較検定。図はP値を示す。(c)AIVIA「細胞追跡」ソフトウェアは、ライブイメージングビデオの自動分割を可能にし、異なる処理群間でのTCF/LEF-GFP中胚葉摘出片の移動速度（左のグラフ）と移動速度（右のグラフ）を追跡する。個々のデータ点は固有の細胞トラックを表す（コントロール、n = 104; 2-DG+BrPA, n = 41; PD, n = 85; YZ9, n = 60; Azaserine, n = 39 cells）。3回の独立実験。プロットは平均値±SEM。通常の一元配置分散分析に続くDunnettの多重比較検定。図はP値を示す。(d) 中胚葉摘出におけるNCAD発現（Fiji's LUTによるヒートマップ強度カラー）は、異なる処理群間で保持されている。全群で3回の独立実験。スケールバーは40μmを表す。(e) 中胚葉摘出片におけるLEF1（マゼンタ）とEOMES（シアン）の発現は、16時間後の処理群（アザセリン、2-DG-BrPA、YZ9、PD）間で一貫して発現している。スケールバーは40μmを表す。(f)PDまたはYZ9処理後の中胚葉移植片でダウンレギュレートされた遺伝子のGO生物学的プロセス濃縮。X軸はFisherの正確検定によるP値。

出典データ

補足情報

補足情報

このファイルには補足図1、補足表1、2が含まれている。補足図1：本研究で示したウェスタンブロットの切り抜きなし画像。図3dで使用した生データ。グラフは平均値±SEMを示す。補足表1： 本研究で使用した抗体のリスト。表は使用した抗体と色素を示す。補足表2： 本研究で使用したqPCRプライマーのリスト。表は使用したqPCRプライマー。

報告概要

ソースデータ

ソースデータ Fig.

ソースデータ Fig.

ソースデータ Fig.

ソースデータ 図3

ソースデータ 拡張データ Fig.

ソースデータ 拡張データ 図5

ソースデータ 拡張データ 図7

ソースデータ拡張データ Fig.

ソースデータ拡張データ Fig.

ソースデータ拡張データ 図10

権利と許可

オープンアクセスこの記事は、クリエイティブ・コモンズ表示-非営利-改変禁止4.0国際ライセンスの下でライセンスされています。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、ライセンスされた素材を改変した場合を示す限り、いかなる媒体や形式においても、非営利目的での使用、共有、配布、複製を許可するものです。本ライセンスに基づき、本記事またはその一部から派生した翻案物を共有する許可はありません。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。この記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれていない素材で、あなたの意図する利用が法的規制により許可されていない場合、または許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ をご覧ください。

転載と許可

この記事について

この記事を引用する

Cao, D., Bergmann, J., Zhong, L.et al.グルコース代謝の選択的利用が哺乳類の胃形成を誘導する。Nature(2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-08044-1

引用文献のダウンロード

  • 2023年7月19日受領

  • 受理2024年9月12日

  • 2024年10月16日発行

  • DOIhttps://doi.org/10.1038/s41586-024-08044-1

この記事を共有する

以下のリンクを共有した人は、このコンテンツを読むことができます：

提供：Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブ

テーマ

ネイチャー (Nature)ISSN 1476-4687 (オンライン) ISSN 0028-0836 (印刷)


サイトマップ

ネイチャー・ポートフォリオについて

コンテンツを見る

出版ポリシー

著者・研究者サービス

図書館・機関

広告とパートナーシップ

プロフェッショナル育成

地域ウェブサイト

© 2024 シュプリンガー・ネイチャー・リミテッド


いいなと思ったら応援しよう！