グリホサート暴露は、マウスにおいて6ヶ月の回復期間にもかかわらず、神経炎症とアルツハイマー病様病態を悪化させる
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公開日：2024年12月04日
グリホサート暴露は、マウスにおいて6ヶ月の回復期間にもかかわらず、神経炎症とアルツハイマー病様病態を悪化させる
Samantha K．Bartholomew, Wendy Winslow, ...Ramon Velazquez 著者を表示
Journal of Neuroinflammation 21巻, 記事番号：316（2024） この記事を引用する
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Abstract
背景
米国（US）におけるグリホサートの使用量は、1996年にグリホサート耐性作物が導入されて以来、年々増加しているが、脳への影響についてはほとんど知られていない。我々は最近、グリホサートを14日間投与したC57BL/6Jマウスにおいて、脳組織にグリホサートとその主要代謝物であるアミノメチルホスホン酸が存在し、それに伴って脳と末梢血漿中の炎症性サイトカイン腫瘍壊死因子⍺（TNF-↪So_237A）が増加することを見出した。TNF-⍺はアルツハイマー病（AD）のような神経変性疾患で上昇することから、本研究では、グリホサート暴露がAD発症の促進因子となるかどうかを検討した。さらに、グリホサートとアミノメチルホスホン酸が回復後も脳内に残存するかどうかについては、まだ検討されていない。
方法
我々は、グリホサート暴露がコントロールマウスでは神経炎症を誘発し、ADマウスでは神経炎症を悪化させ、アミロイドβとタウの病理学的上昇を引き起こし、回復後に空間認知能力を悪化させるという仮説を立てた。我々は、4.5ヶ月齢の3xTg-ADマウスと非トランスジェニック（NonTg）対照マウスに、グリホサート0、50、500mg/kgのいずれかを毎日13週間投与し、その後6ヶ月間の回復期間を設けた。
その結果
、3xTg-ADおよびNonTgグリホサート投与マウスの脳では、6ヶ月の回復期間にもかかわらずアミノメチルホスホン酸が検出された。グリホサート投与3xTg-ADマウスは、生存率の低下、モリス水迷路におけるThigmotaxiaの増加、アミロイド生成処理のβセクレターゼ酵素（BACE-1）の有意な増加、アミロイドβ（Aβ）42不溶性画分、Aβ42プラーク負荷量とプラークサイズ、エピトープThreonine 181、Serine 396、AT8（Serine 202、Threonine 205）におけるリン酸化タウ（pTau）を示した。注目すべきは、3xTg-ADとNonTgの脳組織、および3xTg-ADの末梢血漿において、炎症性サイトカインとケモカインが増加していることである。
結論
今回の結果は、回復期間が長くなるにもかかわらず、グリホサートへの曝露が長期にわたる病理学的影響を引き起こすことを初めて示したものである。グリホサートの使用量が増加の一途をたどるなか、この除草剤とその代謝物がヒトの脳に及ぼす影響と、神経変性疾患にみられる機能障害に関与する可能性を明らかにするために、さらなる研究が必要である。
はじめに
アルツハイマー病（AD）のような神経変性疾患の有病率の増加は、米国だけでも670万人以上がこの疾患に罹患しており、2060年にはこの数が1,400万人に達する可能性があることを考えると、憂慮すべきことである [1]。AD患者は、重度の記憶喪失、意思決定能力の低下、日常生活に影響を及ぼすその他の行動変化を呈する [1] 。ADでは、認知障害につながる神経細胞機能の障害として、(1)細胞外のアミロイドβ（Aβ）斑、(2)細胞内の神経原線維性タウもつれ（NFT）、(3)神経炎症の蓄積が重要な病態である [1,2,3]。AD罹患者の95％以上を占める散発性ADでは、環境因子が関与していることが多くの研究から明らかになっている [4, 5]。大気汚染、食事、毒物への曝露、感染症などの因子は、炎症 [6] や酸化ストレスのレベルを上昇させることが知られており、これらはいずれもADや他の神経変性疾患の発症リスクを高める可能性がある [4,5,6]。
除草剤は私たちの環境のいたるところに存在し、その結果、人の健康に害を及ぼす可能性がある。グリホサート（N-(ホスホノメチル)グリシン）は、米国で最も大量に使用されている除草剤である [7]。全米の農業地域で年間約3億ポンドが使用されている [8]。グリホサートは、植物のシキミ酸経路にあるエノルピルビルシキミ酸-3-リン酸という酵素を阻害することで、生存に不可欠な芳香族アミノ酸の生産を阻害する。2020年現在、米国環境保護庁（EPA）は、グリホサートは人間の健康に懸念されるリスクはないと述べている。しかし、世界保健機関（WHO）の国際がん研究機関は、この除草剤を「ヒトに対して発がん性がある可能性がある」と分類した［10］。さらに最近の研究では、グリホサートへの暴露に関連する疾患はがんだけではない可能性が浮き彫りになっており [11]、脳を含む様々な臓器や組織に対するグリホサートの影響を読み解く複数の報告がある [6, 12, 13]。我々のグループが最近発表した論文では、グリホサートが血液脳関門（BBB）を通過し、曝露されたマウスの脳組織から検出され、腫瘍壊死因子⍺（TNF-↪237A）などの炎症性サイトカインを上昇させる可能性があることが示された［6］。さらに、グリホサートは、炎症性サイトカインの上昇を介して、長期増強などのシナプス強化に重要なメカニズムを破壊する可能性があることが、他の研究者によって明らかにされている。注目すべきは、最近の報告で、NHANES研究に参加したヒトの83.87％がグリホサートの尿中濃度が検出可能であり、濃度が高いほど認知機能が低下することがわかったことである [14] 。これらの知見を総合すると、脳に関連した機能障害におけるこの除草剤の役割を理解することが急務であることが示唆される。
最近の研究では、グリホサートへの曝露が、特にADに関連する機序を介して、神経細胞の機能障害に関与している可能性が示されている。最近の研究では、尿中グリホサート濃度と血中血清ニューロフィラメント軽鎖（NfL）濃度との間に正の相関が観察された [15]-NfLは神経細胞軸索損傷のマーカーであり、グリホサート濃度の上昇が神経細胞損傷に関連している可能性を示している [16]。特筆すべきことに、この関連は、40歳以上、肥満度が25～30の被験者でより顕著であり、ADのリスクが高いサブグループであった [1]。NfLは血中バイオマーカーであり、ADの継続的な認知機能低下を予測する [16]。さらに、以前に発表された研究では、ADのAPP/PS1モデルマウスの一次皮質ニューロンにグリホサートを曝露すると、可溶性Aβレベルが上昇することが示された [6]。これらの知見を総合すると、ADに関連するメカニズムに対するグリホサート暴露の影響を明らかにするためには、さらなる研究が必要であることが浮き彫りになった。
哺乳類にはシキミ酸経路がないため、摂取されたグリホサートはほとんど代謝されずに排出されると考えられてきた [17,18,19] 。しかし、最近の研究では、腸内細菌叢がグリホサートをその主要代謝物であるアミノメチルホスホン酸に代謝できることがわかっている [20, 21]。さらに、慢性的な神経炎症は、学習や記憶などの行動に重要な細胞メカニズムを大きく変化させ [22]、神経炎症が蔓延する神経変性疾患の一因となる可能性がある [23, 24]。このことから、グリホサートとアミノメチルホスホン酸は、曝露が中止された数ヵ月後も、検出可能なレベルで脳内に残存しているかどうかが重要な検討課題である。出生前の暴露研究から、グリホサートへの暴露により、後年、発達遅延、頭蓋顔面異常、認知障害を持つ子供が生まれることが明らかにされており、早期暴露が長期にわたる影響をもたらす可能性があることが示されている［25,26,27］。(1)グリホサートとアミノメチルホスホン酸が回復期を過ぎても脳内に残存するのか、および/または(2)成人期早期の暴露期間が長期にわたる有害な結果をもたらすのかについては、まだわかっていない。グリホサートとアミノメチルホスホン酸はBBBを通過することができることから［6, 28］、これらの分子が脳内に残存し、神経炎症、Aβ、タウ病理などの病態を促進するかどうかを明らかにする必要がある。
本研究の目的は、成人期早期から13週間グリホサートに曝露し、その後6ヵ月間の回復期間を経て、その影響を明らかにすることであった。具体的には、グリホサートとアミノメチルホスホン酸が脳内に残存しているかどうかを調べ、グリホサート曝露からの回復にもかかわらず、3xTg-ADマウスADモデルでは神経炎症とAD様神経病理の増悪、およびそれに伴う認知障害が観察されるという仮説を立てた。
方法
動物と研究デザイン
3xTg-ADホモ接合体マウスは、以前に記載されたように作製された[29, 30]。C57BL6/129S6マウスを非トランスジェニック対照（NonTg）として用いた。特に、3xTg-ADマウスはメスのみを使用した。オスは一貫した神経病理を示さないため[30,31]、オスの使用には注意が必要であり[32]、このモデルを使用した発表された研究とも一致している[30,33,34,35]。マウスは23℃で12時間の明暗サイクルで飼育され、餌と水は自由摂取とした。マウスは、生後4.5ヵ月から3種類のグリホサート投与量のいずれかに無作為に割り付けられた。グリホサートの投与開始年齢は、3xTg-ADマウスで6ヵ月齢で検出される病態であるAβ斑やタウの病態が現れる前に開始するように選択された[30, 33]。投与は生後7.5ヶ月で中止し、合計13週間投与したが、これは過去の発表と一致して慢性暴露に分類される[12, 36]。3xTg-ADマウスでは、この月齢でAβとタウの病態が皮質と海馬の脳領域で広範に進行しているため[30, 33]、すべての動物を行動試験のために12ヵ月齢にした。血液は13.5ヵ月齢でマウスから採取し、その後、3xTg-ADマウスの病理がかなり進行した時点で、すべての動物を安楽死させて組織を採取した[33]。すべての動物実験は、アリゾナ州立大学の Institutional Animal Care and Use Committee（プロトコール番号 22-1933R）の事前承認を得た。
グリホサート投与量の正当化
我々のグループによって以前に記述されたように[6]、化学的に純粋なグリホサート（N-(ホスホノメチル)グリシン；C3H8NO5P）をSigma-Aldrichから購入し（製品番号P9556）、1.89 M水酸化ナトリウムで0.107 g/Lに調製した。このストック溶液を脱イオン水で希釈し、pHを7に調整した。マウスは4.5ヵ月齢から、ビヒクル（0 mg/kg）、50 mg/kg、500 mg/kgの3種類の投与量のいずれかを受けるように無作為に割り付けられた。マウスは13週間の暴露期間中、毎日投与された。高用量（500 mg/kg）は、EPA [37] が定めたマウスの慢性（90日）暴露における観察可能な悪影響のない限界値（NOAEL）に基づいており、神経認知および末梢臓器の変化に対するグリホサート暴露の影響を決定するための論文で使用されている [12, 36, 38, 39]。低用量の50 mg/kgを選択したのは、NOAEL [37] より10倍少なく、ヒトに対する慢性参照用量1.75 mg/kg/日 [37] の計算に用いられた値175 mg/kg [40] よりも少ないからである。このため、グリホサート暴露と神経認知への影響を評価した過去の発表研究 [12, 36, 38] と比較することができる。各群のマウス数は、0 mg/kg（n = 14 3xTg-AD; n = 15 NonTg）、50 mg/kg（n = 13 3xTg-AD; n = 15 NonTg）、500 mg/kg（n = 15/3xTg-ADとNonTgの両群）であった。各分析に使用したマウスの数は、過去に発表された研究 [31, 33, 41]と同様であった。
行動試験
生後12ヶ月で、すべてのマウスに海馬依存性の空間学習と記憶を評価するため、以前に記載されたようにモリス水迷路(MWM)課題を試験した[42, 43]。すべてのマウスは1日4回の訓練を5日間受けた。隠れプラットフォームの位置は一定であったが、開始位置は試行によって擬似的にランダムに変化した。マウスは60秒/回の試行を与えられ、隠れたプラットフォームの位置を特定した。最後のトレーニングセッションから24時間後、プラットフォームは取り除かれ、マウスは空間参照記憶を評価するために60秒間MWMに戻された。データはEthoVisionXT（Noldus Information Technology）を用いて収集した。
採血と血漿抽出
13.5ヵ月齢の安楽死前に顎下静脈から採血した。150～200μL（対象体重の1%以下）の血液を採取し、EDTAライニングチューブ（BD K2EDTA #365974 ）に入れ、抗凝固を確実にするために8回転倒させた。チューブを氷上で60～90分間静置した後、455g、4℃で30分間遠心分離し、相を分離した。上層を回収し、-80℃で凍結した。
循環グリホサートおよびアミノメチルホスホン酸の定量
グリホサートおよびアミノメチルホスホン酸は血漿中0～3 ng/mLの濃度範囲にあり、以下のように定量した：短時間でプールした凍結乾燥ヒト血漿（Innovative research, Novi, MI）を用いて、可変濃度のグリホサートおよびアミノメチルホスホン酸をスパイクし、検量線および品質対照を作成した。検量線、品質管理、および内部標準物質（6.26 ng/mL濃度の13C15Nグリホサートおよび13C15Nアミノメチルホスホン酸）をスパイクしたマウス血漿（5～20 µL）を、500 µLの10 kDa分子量カットオフ（MWCO, Millipore Sigma, Burlington, MA）スピンカラム（10,000 g, 20 min, 4 ℃）を用いてタンパク質除去を行った。ろ液はギ酸で最終濃度0.1%(v/v)に酸性化し、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析（LC-MS/MS）分析に使用した。血漿中の測定値は、グリホサートとアミノメチルホスホン酸の両方で、R2 > 0.99 (Supplemental Fig. 1)、精度 < 15% 相対標準偏差 (RSD)、精度 > 87% と優れた直線性を示した。観察された定量下限（LOD）と定量限界（LOQ）は、グリホサートとアミノメチルホスホン酸でそれぞれ10 pg/mLと50 pg/mLであった。
組織の採取と処理、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）
マウスは平均13.5ヶ月齢で安楽死させた。すべてのマウスを新鮮な1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で灌流し、脳から血液を除去した。脳を取り出し、左半球を4％パラホルムアルデヒドで48時間固定した。右半球からは大脳皮質全体を単離し、海馬（Hp）を除去した。大脳皮質（Ctx）分画は、皮質板（等皮質、嗅覚野、海馬後皮質を含む）と皮質下板を表す。解剖されたCtx組織は、グリホサート、アミノメチルホスホン酸、サイトカイン/ケモカインの測定に優先された。Hpと残りのCtxは、Aβと病理学的タウの測定に優先された。これは、ADで影響を受ける主要な領域におけるグリホサートへの早期曝露によるAD様病態の増悪効果を明らかにすることが主な目的であったためである。Hp組織とCtx組織は、タンパク質アッセイ用に既述の方法で調製した[42, 43]。解剖した組織は、プロテアーゼ（Roche Applied Science, IN, USA）とホスファターゼ阻害剤（Millipore, MA, USA）を添加した組織タンパク質抽出試薬中でホモジナイズした。ホモジナイズした組織を21,130g、4℃で30分間遠心し、上清（可溶性画分）を-80℃で保存した。ペレットを70％ギ酸でホモジナイズした後、4℃で30分間遠心分離し、不溶性タンパク質を抽出した。ウェスタンブロットは、以下の抗体を用いて、前述[44]と同様に還元条件下で行った： Biolegend, 6E10 (Full length (FL)-amyloid precursor protein (APP), Catalog #9320 -02, 1:1,000); Abcam, Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH, Catalog #ab8245 , 1:3,000). Licor Image Studioソフトウエアを用いて、各ブロット内の目的タンパク質の強度をローディングコントロールのGAPDHで正規化し、定量分析を行った。平均密度値は、各実験バンド密度をHpおよびCtxの平均3xTg-AD 0 mg/kg密度で割ることにより、各免疫ブロットについて正規化した。実験者はグループ割り当てを盲検化した。Hpタンパク質ホモジネートの可溶性画分を、市販のELISAキットを用いて、アミロイド前駆体タンパク質の99アミノ酸C末端フラグメント（C99、MyBioSourceカタログ#MBS7612253）およびβセクレターゼ1（BACE-1、LSBioカタログ# LS-F7271）についてプローブした。HpとCtxの可溶性画分と不溶性画分を、市販のELISAキット（Invitrogen-ThermoFisher Scientificカタログ#KMB3481、KMB3441、KHB7031）を用いて、ヒトAβ40とAβ42、およびスレオニン181（Thr 181）とセリン396（Ser 396）残基でリン酸化されたタウ（pTau）について、既述のようにプローブした[42]。すべてのサンプルは二重ウェルで行った。
脳内グリホサートおよびアミノメチルホスホン酸の測定
グリホサートおよびアミノメチルホスホン酸の測定は、以前に記載された [6] とおりに実施した。サンプルには10 ng/gの13C215Nグリホサート（Toronto Research Chemicals）と13C15Nアミノメチルホスホン酸（Toronto Research Chemicals）をスパイクインした。脂質の除去は1ccのSep-Pak C18固相カートリッジ（Waters, Milford-MA）を用いて行い、フロースルー（400μL）はギ酸で酸性化した。サンプル、検量線標準物質および品質管理標準物質は、50 µL または 100 µL の注入量で、Thermo TSQ Altis 装置に接続した Vanquish Duo Ultra 高圧液体クロマトグラフィー（UHPLC）システムを用いて、多重反応モニタリング（LC-MRM）付き液体クロマトグラフィーにより分析した [6, 45]。グリホサートとアミノメチルホスホン酸の0～60 ng/gの範囲でマウスの脳マトリックスで実施した検量線は、優れた直線性を示した（R2 > 0.99、補足図2）。グリホサートとアミノメチルホスホン酸のそれぞれについて、平均精度が80～120％、精度が20％RSD未満で、スパイクインされた最低標準物質として定義されたアッセイで観察されたLOQは0.4 ng/gであった[6, 46]。
マルチプレックスサイトカインアッセイ
Bio-Plex mouse cytokine 23-plexキット（Bio-Rad、カタログ番号M60009RDPD）を用いて、血漿および皮質タンパク質ホモジネートでグリホサートの長期にわたる炎症作用を試験した。簡単に説明すると、15μlの血漿を35μlの希釈液で希釈した。ウェルあたり100μgの総タンパク質を含む可溶性皮質タンパク質ホモジネートを96ウェルプレートに二重に加え、製造元の指示に従ってアッセイした。測定値は Bio-Plex Manager ソフトウェアで算出した。標準曲線は 5 パラメーターのロジスティック回帰を用いてプロットし、濃度はそれに応じて算出した。製造限界に基づいて検出されなかったレベルは、統計解析に含めなかった。
組織切片作成、組織学、ImageJ解析
脳半球をビブラトームで50μmの冠状切片に切り出し、0.02%アジ化ナトリウムを加えた1X PBS中に保存した。Aβ42染色には、Aβ42斑を染色する抗体（抗Aβ42、1:200希釈、Millipore、カタログ# 5078P）を用い、Hpの腹側範囲を含む1動物につき1切片を、既述のように免疫組織化学的に染色した[44]。一次抗体でインキュベートする前に、切片を88%ギ酸で7分間透過処理した。Zeiss Axio Imagerで5倍で撮影した明視野写真をAdobe photoshopでつなぎ合わせ、ImageJ analyze particle functionで閾値0/70で解析した。チオフラビンS染色では、Hpの腹側範囲を含む1匹あたり4切片を分析に含めた。組織切片を4％パラホルムアルデヒドで15分間インキュベートし、1％チオフラビンS水溶液を室温で10分間濾過し、80％エタノールで2回、95％エタノールで1回、二重蒸留水で3回洗浄した。画像は、Leica Application Suite X（LAS X）ソフトウェアを用いて、蛍光顕微鏡（Leica DMi8）で5倍で撮影し、ImageJを用いてHp中の粒子の面積％を既述のように定量化した[42, 48]。AT8免疫組織化学は、Ser 202, Thr 205でタウを発現する細胞を染色する抗体（1:500希釈、Invitrogen, catalog# MN1020）を用いて、既述のように行った [42, 43]。Hpの背側および腹側の範囲を含む一連の冠状組織切片を、1頭につき7切片を作成し、AT8を評価した。
AT8＋神経細胞定量化のための偏りのないステレオ検査
Stereoinvestigator software V17（Micro-BrightField, Cochester, VT）光分画法を用いて、既述のようにHpのAT8＋CA1細胞を定量化した[42, 43]。グリッドサイズ（XとY＝158μm）、カウントフレーム（XとY＝50μm）、組織切片のライブ画像に重ね合わせ、所定の間隔でカウントを行った。冠状組織切片は、63×1.4PlanApo油浸対物レンズを使用して分析した。Gundersonのスコアは0.07以下であった。平均組織厚は18.6μmであった。ディセクタの高さは15μmとし、上部2μm、下部2μmのガードゾーンを設けた。Zeiss Axio Imagerで明視野顕微鏡写真を撮影した。AT8抗体は切片の全深さに浸透し、すべての対象物を等確率で数えることができた。
統計解析
実験データの解析には、二元配置分散分析（ANOVA；遺伝子型と投与量）を用い、その後、Graph Pad PRISM（バージョン10）を用いて、必要に応じて推奨される補正後ホック検定を行った。MWM データの解析には反復測定分散分析を用いた。一元配置分散分析（One-way ANOVA）は、ヒト化マウスにのみ存在する神経病理学的指標について、3つの用量の3xTg-ADマウスを比較するために利用した。分散の均質性の違反は、ノンパラメトリック解析で追跡した。統計的外れ値はROUTおよびGrubbs法を用いて同定した。有意性はp < 0.05とした。
結果
グリホサートへの13週間の曝露と6ヶ月間の回復により、体重は変化しないが、早死の発生率は増加した
。 グリホサートへの曝露と回復により、神経炎症、神経病理、および関連する認知障害が悪化するかどうかを調べるため、NonTgおよび3xTg-ADマウスを0mg/kg（n = 14 3xTg-AD； n = 15 NonTg）、50 mg/kg（n = 13 3xTg-AD; n = 15 NonTg）または500 mg/kg/日（n = 15/群）のグリホサートを4. 生後5ヵ月。生後7.5ヶ月で回復期とし、その後の投与は中止した（図1A）。投与期間中のマウスの体重は変化しなかった（Fig.） 回復期には、7.5～13.5ヶ月齢の間に、発表された研究[30, 42]と一致して、体重変化率に遺伝子型の有意な主効果が認められ、3xTg-ADマウスはNonTgマウスよりも有意に体重が増加した（F(1,70) = 7.914, p = 0.0064；図1D）。最後に、投与期間中の早期死亡を調べたところ、NonTg 0 mg/kgマウスがn=1匹、NonTg 500 mg/kgマウスがn=1匹死亡した（図1E）。残りのNonTgマウスは試験期間中生存した。投与期間中、n=1匹の3xTg-AD 0 mg/kgマウスとn=2匹の3xTg-AD 500 mg/kgマウスが死亡し、回復期間中、n=4匹の3xTg-AD 50 mg/kgマウスとn=2匹の3xTg-AD 500 mg/kgマウスが死亡した（図1F、G）。これらの結果を総合すると、グリホサートへの曝露は体重には影響しないが、特に3xTg-ADマウスでは早死にに寄与したことが浮き彫りになった。
Fig. 1
図1
グリホサート暴露後の回復期間は体重には影響しないが、3xTg-ADマウスの生存率を低下させる。(A）実験デザイン。(B）投与期間中の体重。(C,D）投与期間中の体重変化率、および回復期（投与終了から試験終了まで）の体重変化率。(E, F)投与期間中および回復期間中の生存曲線。(G）試験開始時と終了時のマウス数の要約表。折れ線グラフと棒グラフは平均値±SEM。**p < 0.01
フルサイズ画像
グリホサート暴露は3xTg-ADマウスにおけるモリス水迷路課題でのThigmotaxiaを増加させる
グリホサート暴露が空間認知を損なうかどうかを決定するために、マウスを6日間連続してMWMで試験した（0 mg/kg n = 13 3xTg-AD, n = 14 NonTg; 50 mg/kg n = 12 3xTg-AD, n = 15 NonTg; 500 mg/kg n = 12 3xTg-AD, n = 14 NonTg）。最初の5日間、マウスは1日4回の訓練を受けた。その結果、隠れたプラットフォームを見つけるために移動した距離には、学習を示す有意な主効果が認められた（F(4, 74) = 35.884, p < 0.0001;図2A）。また、遺伝子型による有意な主効果（F(1, 74) = 16.670, p = 0.0001）も見いだされ、3xTg-ADマウスはNonTgマウスよりも有意に隠れたプラットフォームを見つけるために移動した。3xTg-ADマウスはNonTgマウスよりも有意に遠くまで移動した。距離については有意な投与量の主効果や交互作用は認められなかった。次に、壁際に留まる傾向であるThigmotaxiaの分析を行った。特に、Thigmotaxiaは不安の指標として同定されている[49]。学習段階において、日による有意な影響が認められ（F(1, 74) = 49.490, p < 0.0001；図2B）、マウスは日をまたいでThigmotaxia%の減少を示した。また、有意な遺伝子型と投与量の交互作用も見られた（F(2, 74) = 3.463, p = 0.0365）。ポストホック解析の結果、3xTg-AD 500 mg/kg群は3xTg-AD 0 mg/kg群と比較して、MWMの学習段階においてより多くのThigmotaxiaを示し（p = 0.0123）、不安の増大を示唆した。6日目、プラットフォームは取り除かれ、マウスは空間記憶を評価するために60秒間のプローブ試行でテストされた。その結果、遺伝子型による有意な主効果（F(1, 74) = 4.043, p = 0.048；図2C）が認められ、3xTg-ADマウスはNonTgマウスに比べてプラットフォームの場所を横切る回数が有意に少なかった。また、泳ぐ速度についても遺伝子型の有意な主効果（F(1, 74) = 9.778, p = 0.0025;図2D）が認められ、3xTg-ADマウスはNonTgマウスに比べて速度が上昇していた。これらのデータから、グリホサートに曝露した3xTg-ADマウスは、全体的な成績は投与群間で同等であったが、不安様行動の悪化を示すThigmotaxiaの増加を示した。
Fig. 2
図2
グリホサート曝露後、回復期間を置くと、皮質組織にアミノメチルホスホン酸が存在するようになり、モリス水迷路（MWM）におけるThigmotaxiaが増加する。(A-D) MWMの学習および記憶段階における成績 (E, F) 回復期間後のマウスの血漿中のグリホサートおよびアミノメチルホスホン酸。(G）試験終了時のマウスの脳重量。(H）アミノメチルホスホン酸はグリホサート暴露の数ヵ月後に大脳皮質脳組織に存在した。折れ線グラフと棒グラフは平均値±SEM。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001
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アミノメチルホスホン酸はグリホサート回収の数ヵ月後にもかかわらず脳組織で検出される
グリホサートとアミノメチルホスホン酸が暴露の数ヵ月後も血液と脳組織に存在するかどうかを調べるため、マウスの血漿と皮質組織ホモジネート（n = 5-6/群）についてUPLC-MSを行った。血漿中では、グリホサートとアミノメチルホスホン酸の両方が検出されたが、これはおそらく餌にグリホサートが含まれていたためであろう。脳重量を調べたところ、遺伝子型による有意な主効果が認められ、3xTg-ADマウスはNonTgマウスに比べて有意な減少を示した（F(1,68) = 51.83, p < 0.0001; Fig. また、投与量の有意な主効果（F(2,68) = 3.607, p = 0.0325）も認められ、50 mg/kg投与群は0 mg/kg投与群よりも脳重量が低かった（p = 0.0277）。皮質組織からはグリホサートは検出されなかった。興味深いことに、皮質のアミノメチルホスホン酸レベルには投与量の有意な主効果が認められ、50mg/kg群と500mg/kg群では遺伝子型に関係なく0mg/kg群より有意に高かった（F(2,26) = 20.81, p < 0.0001；図2H）。これらの結果を総合すると、グリホサート暴露の6ヵ月後、50 mg/kg群では脳重量が減少し、皮質のアミノメチルホスホン酸は50 mg/kg群と500 mg/kg群の両方で有意に上昇しており、永続的な影響が強調された。
3xTg-ADグリホサート曝露マウスは、アミロイド生成処理の増加、海馬（Hp）と大脳皮質（Ctx）におけるAβとプラークの可溶性・不溶性画分の増加を
示した。マウスは13.5ヵ月齢で安楽死させ、神経病理学的評価のために脳を採取した。グリホサートへの曝露がin vitroでアミロイドーシスを増加させるという以前の報告[6]を踏まえ、我々はまず、in vivoでのグリホサート曝露が、全長ヒトAPP（n = 4/群）およびAβペプチドを形成するために切断されるAPPのC99フラグメント（n = 6/群）のレベルを変化させるかどうかを調べた。非Tgマウスはヒト化Aβ病態を示さないため、これらの解析から除外した [42, 44]。Hp組織でもCtx組織でも、APPの定常レベルに有意な増加は見られなかった（図3A, B）。HpのC99については、有意な用量依存的効果（F(2,15) = 62.26, p < 0.0001；図3C）が認められ、3xTg-AD 50 mg/kg（p<0.0001）および500 mg/kg（p<0.001）マウスは0 mg/kgよりも高いレベルを示し、500 mg/kgは50 mg/kgマウスよりも高いレベルを示した（p = 0.0020）。次に、アミロイド生成経路に向かって膜貫通型APPを切断するイニシエーター酵素であるBACE-1（n = 6/群）のレベルを調べた[50]。その結果、3xTg-AD 50 mg/kg（p = 0.0347）および500 mg/kg（p = 0.0061）マウスでは、3xTg-AD 0 mg/kg群と比較して有意な増加が見られ（F(2, 15) = 6.438, p = 0.0096；図3D）、グリホサート暴露の回復期以降にアミロイド生成経路の酵素および切断産物が増加することが明らかになった。
図3
グリホサート暴露は、回復期間にもかかわらず、アミロイド前駆体タンパク質の切断産物を増加させることにより、Aβ40および42の可溶性および不溶性画分、ならびにAβ42プラーク負荷を増加させる。(A, B) 海馬（Hp）および大脳皮質（Ctx）組織における、全長APP（6e10）と負荷対照GAPDHの代表的ウェスタンブロットと定量。(C,D）グリホサート暴露は回復期間後にC99とBACE-1タンパク質レベルを増加させる。(E-H）HpとCtx組織におけるAβ40と42の可溶性画分と不溶性画分。(I, J) 3xTg-AD 500 mg/kgマウスのCtxにおけるAβ42プラーク負荷率、および3xTg-AD 50 mg/kgマウスのHpにおける平均粒子サイズの有意な増加を示す顕微鏡写真。(L, M) チオフラビンSの構造を示す顕微鏡写真と、グリホサート曝露3xTg-ADマウスにおける％粒子面積の増加傾向を示す定量結果（p = 0.0659）。略号 棒グラフは平均値±SEMである。箱ひげ図では、中央の線は中央値、限界値は25パーセンタイルと75パーセンタイル、ひげは分布の最小値と最大値を表す。*p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001
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AD発症に対するグリホサート曝露の影響を理解するために、3xTg-ADマウス（n = 5-7/群）の可溶性Aβ40画分と不溶性Aβ42画分をELISAで定量した。可溶性Aβ40画分については、3xTg-ADマウスのHpとCtxに投与量による有意差は認められなかった（図3E）。不溶性Aβ40画分については、3xTg-AD 500 mg/kgマウスのHpが3xTg-AD 0 mg/kgマウスよりも高い値（p = 0.0177）を示す有意な効果（F(2, 15) = 5.305, p = 0.0181；図3F）が認められたが、Ctxには有意な差は検出されなかった。次に、Aβ42の可溶性画分を調べたところ、Hpに有意な影響が認められ（F(2, 15) = 9.726, p = 0.0020；図3G）、500mg/kgの3xTg-ADマウスは、0mg/kg（p = 0.0107）および50mg/kg（p = 0.0028）群と比較して高いレベルを示した。可溶性Aβ42については、Ctxに差は認められなかった。不溶性Aβ42については、Hpに有意な用量依存効果が認められ（F(2,15) = 75.06, p < 0.0001；図3H）、3xTg-AD 500 mg/kgは3xTg-AD 50 mg/kgマウスよりも高いレベルを示し（p < 0.0001）、3xTg-AD 50 mg/kgは3xTg-AD 0 mg/kgマウスよりも高いレベルを示した（p = 0.0418）。同様に、Ctxにおける不溶性Aβ42の有意な用量依存性効果（F(2, 14) = 46.58, p < 0.0001）が認められ、3xTg-AD 500 mg/kgは3xTg-AD 50 mg/kgマウスよりも高いレベルを示し（p = 0.0137）、3xTg-AD 50 mg/kgは3xTg-AD 0 mg/kgマウスよりも高いレベルを示した（p < 0.0001）。Aβ42はAβ40よりも凝集しやすく、毒性が強いため [51] 、次にAβ42プラーク負荷量とプラーク（粒子）サイズを定量した（n = 5-6/群）。Aβ42プラーク負荷量の変化率については、Hpに差はみられなかったが、Ctxには投与量の有意な影響がみられ（F(2,14) = 4.675, p = 0.0279；図3I,J）、3xTg-AD 500mg/kgマウスは50mg/kgおよび0mg/kgマウスよりも高い負荷量を示した（p = 0.0440）。また、プラークの大きさ（F(2, 14) = 6.126, p = 0.0123；図3K）についてもHpに有意な効果が認められ、3xTg-AD 50mg/kg投与マウスは0mg/kgおよび500mg/kg投与マウスよりも大きなサイズのプラークを示した。粒子サイズのCtxには有意な効果はみられなかった。最後に、3xTg-ADマウス（n=5-6/群）の腹側Hpにおけるβシート確認凝集体の程度を確認するため、組織をチオフラビンSで染色した。その結果、0 mg/kg群と比較して、50 mg/kg群と500 mg/kg群のHpでは、粒子の面積％が増加傾向にあることがわかったX2(2) = 5.440, p = 0.0659（図3L, M）。これらの結果を総合すると、初期のグリホサート曝露はAPPプロセッシングを変化させ、ADで影響を受ける主要な領域におけるAβレベルを悪化させ、不溶性Aβ42画分、Aβ42プラーク負荷量およびプラークサイズにおいて、6ヵ月間の回復にもかかわらず、最も有意な差が認められた。
3xTg-ADグリホサート曝露マウスは、HpとCtxにおいて病理学的タウを有意に増加させた
次に、グリホサート曝露がタウの病態形成に及ぼす長期的影響を理解しようとした。そのために、3xTg-ADマウス（n = 6/群）において、Thr 181とSer 396でリン酸化されたタウ（pTau）の可溶性画分と不溶性画分をELISAで検出した。可溶性pTau Thr 181については、Hpに有意な効果が認められ（F(2, 15) = 25.54, p < 0.0001；図4A）、3xTg-AD 500 mg/kg（p<0.0001）と50 mg/kg（p<0.0001）の両マウスは、3xTg-AD 0 mg/kg群よりも高いレベルを示した。Ctxでは、有意な用量依存的効果（F(2, 15) = 926.80, p < 0.0001）が認められ、3xTg-AD 500 mg/kgは3xTg-AD 50 mg/kgマウスよりも高いレベルを示し（p < 0.0001）、3xTg-AD 50 mg/kgは3xTg-AD 0 mg/kgマウスよりも高いレベルを示した（p < 0.0001）。可溶性pTau Ser 396については、Hp（F(2, 15) = 28.12；図4B）とCtx（F(2, 15) = 79.37、p < 0.0001）に有意な用量依存的効果が認められた。0001）、3xTg-AD 500 mg/kgマウスは3xTg-AD 50 mg/kgマウスよりも高いレベルを示し（Hp p = 0.0046、Ctx p < 0.0001；図4B）、3xTg-AD 50 mg/kgマウスは3xTg-AD 0 mg/kgマウスよりも高いレベルを示した（Hp p = 0.0073、Ctx p < 0.0001）。不溶性pTau Thr 181については、Hp（F(2, 15) = 24.61, p < 0.0001；図4C）とCtx（F(2, 15) = 6.600, p = 0.0088）に有意な投与量の影響が認められた。0088）、3xTg-AD 50mg/kg群は0mg/kg群（p < 0.0001）および500mg/kg群（p = 0.0005）と比較してHpで高いレベルを示し、3xTg-AD 500mg/kg群は0mg/kg群（p = 0.0084）と比較してCtxで高いレベルを示した。不溶性pTau Ser 396については、Hpで有意な効果が認められ（F(2, 15) = 7.025, p = 0.0070；図4D）、3xTg-AD 500 mg/kgマウスは3xTg-AD 0 mg/kg群よりも高いレベルを示した（p = 0.0065）。Ctxでは、有意な効果（F(2, 15) = 26.26, p < 0.0001）が認められ、3xTg-AD 500mg/kgは3xTg-AD 50mg/kg群（p = 0.0010）および3xTg-AD 0mg/kg群（p < 0.0001）よりも高いレベルを示した。最後に、神経細胞内タウフィラメント[43]に関連するAT8（n = 6/グループ）に対して組織を染色したところ、3xTg-AD 50 mg/kgと500 mg/kgのHpのCA1で、0 mg/kgと比較して有意に高いAT8 +細胞が認められた（t(6) = 2.462, p = 0.049；図4E, F）。これらの結果は、グリホサート暴露がリン酸化過剰タウを増加させることを初めて証明したものである。これらのデータを総合すると、グリホサートへの早期曝露が3xTg-ADマウスのAD様神経病理を増加させることが証明された。
図4
グリホサート暴露後、回復期間を置くとリン酸化された病理学的タウが増加する。(A-D）海馬（Hp）と大脳皮質（Ctx）組織における、スレオニン（Thr）181とセリン（Ser）396でリン酸化されたタウの可溶性画分と不溶性画分。(E、F）AT8（Ser202/Thr205）＋細胞数は、3xTg-AD 50mg/kgおよび500mg/kgの海馬のCA1領域で有意に増加した。略号 DS＝背側小柱、DG＝歯状回、CA1＝cornus ammonis 1。棒グラフは平均値±SE。箱ひげ図では、中心線は中央値、限界値は25パーセンタイルと75パーセンタイル、ひげは分布の最小値と最大値を表す。棒グラフは平均値±SEM。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001
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3xTg-ADグリホサート曝露マウスは、血漿中のサイトカインおよびケモカイン濃度が有意に上昇している
。サイトカイン（炎症促進性および抗炎症性）およびケモカイン（細胞遊走を誘導するサイトカインファミリー内の分泌タンパク質）の上昇は、炎症を示す[52]。これまでの研究から、グリホサート暴露は、神経毒性、細胞死、ADのような疾患と関連しているTNF-αのような、循環血液、肝臓、脳内の炎症性サイトカインのレベルを増加させることが示されている [6, 53, 54]。初期のグリホサート暴露が長期にわたる末梢の炎症性変化をもたらすかどうかを決定するために、我々はマウス（n = 7-9 NonTg; n = 3-7/ 3xTg-AD）の末梢血漿の23プレックスのサイトカイン/ケモカインパネルを行った。NonTg血漿ではサイトカインとケモカインのレベルは検出されなかった。しかし、23のマーカーすべてについて有意な遺伝子型と投与量の相互作用がみられ、3xTg-AD投与マウスで有意な上昇がみられた（図5A）。図5Aは全23マーカーで有意な上昇を示し、6ヵ月間の回復にもかかわらず、グリホサート暴露は末梢の炎症分子を長期にわたって増加させ、3xTg-ADマウスにおける死亡率増加の一因となった可能性を示唆している。
Fig. 5
図5
グリホサート暴露とその後の回復期間により、3xTg-ADマウスの血漿中およびNonTgと3xTg-ADの両皮質組織中のサイトカインとケモカインレベルが上昇する。(A、B）3xTg-ADマウスの血漿中のサイトカインとケモカインの有意な増加（NonTgマウスでは検出値以下）、およびNonTgマウスと3xTg-ADマウスの皮質組織ホモジネート中のサイトカインとケモカインの有意な増加を示すヒートマップ。(C-I）有意な遺伝子型と投与量の相互作用をグラフ化し、2つの変数の違いを示した。棒グラフは平均値±SEM。*p＜0.05、***p＜0.01、***p＜0.001、***p＜0.0001
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グリホサートに曝露したNonTgマウスと3xTg-ADマウスは、Ctxにおけるサイトカインとケモカインレベルの上昇を示した
。 神経炎症は、神経変性疾患の発症に関与する重要な病態生理学的プロセスである[23, 24]。初期のグリホサート暴露が脳内に長期にわたる炎症性変化をもたらすかどうかを調べるため、マウスのサブグループ（n = 4/グループ）の皮質脳ホモジネートを用いて23-plexパネルを実施した。その結果、全23マーカーについて遺伝子型と投与量の有意な主効果が認められ、3xTg-ADはNonTgよりも高いレベルを示し、50mg/kgと500mg/kgは0mg/kg群よりも高いレベルを示した（図5B）。また、7つの炎症性サイトカインについて、投与量による有意な遺伝子型の相互作用が認められた。老化促進や神経変性の免疫マーカーであるEotaxin（C-C motif ligand 1, CCL1）[55]については、投与量による有意な遺伝子型の交互作用がみられ（F(2, 18) = 5.987, p = 0.0102；図5C）、NonTg 500 mg/kgマウスはNonTg 50 mg/kg（p=0.0017）および0 mg/kg（p<0.0001）マウスよりも高いレベルを示した。顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）は、神経保護作用を促進する成長因子であり、AD [56]では調節異常であるが、投与量による有意な遺伝子型の交互作用（F(2, 17) = 4.416, p = 0.0286；図5D）が認められ、NonTg 500 mg/kgマウスは、NonTg 50 mg/kgマウス（p = 0.0170）および0 mg/kgマウス（0.0012）よりも高いレベルを示した。マクロファージを活性化し、クラスII主要組織適合複合体（MHC）を誘導する炎症性サイトカインであり、脳内に存在するとBBBの破綻や神経変性と関連する[57, 58]インターフェロン-γ（IFN-γ）については、投与量による有意な遺伝子型の交互作用が認められた（F(2, 18) = 4.792, p = 0.0215；図5E）。ポストホック解析の結果、NonTgマウスでは有意な用量依存性が認められ、500 mg/kg群は50 mg/kg群より高値を示し（p < 0.0001）、50 mg/kg群は0 mg/kg群より高値を示した（p = 0.0455）。3xTg-ADマウスでは、0mg/kg群と比較して50mg/kg群で有意な上昇が認められた（p = 0.0087）。細胞増殖を促進し、アポトーシスを阻止する炎症性サイトカインであり、軽度認知障害（MCI）からADへの進行に関連するインターロイキン（IL）-9[59]については、投与量による有意な遺伝子型の交互作用が認められた（F(2, 18) = 4.872, p = 0.0204；図5F）。ポストホック解析の結果、NonTg 500 mg/kgは、NonTg 50 mg/kg群（p = 0.0049）および0 mg/kg群（p < 0.0001）のいずれよりも有意に高値を示した。ホメオスタシスを維持するために免疫反応を制限する抗炎症性サイトカインであり、AD [60, 61]で上昇するIL-10については、投与量による有意な遺伝子型の交互作用により（F(2,17) = 7.745, p = 0.0041；図5G）、NonTg 50 mg/kg群（p = 0.0003）およびNonTg 0 mg/kg群（p < 0.0001）と比較して、NonTg 500 mg/kg群で上昇することが明らかになった。3xTg-AD 50mg/kg投与マウスは、0mg/kg投与マウスと比較して有意な上昇を示した（p = 0.0441）。ケモカインであるケラチノサイト由来サイトカイン（KC）は、CXCL1としても知られ、炎症に反応して上昇するが、ADで観察される発症機序であるタウのリン酸化亢進を増加させることが示されている [62] 。我々は、有意な遺伝子型と投与量の交互作用（F(2, 17) = 6.723, p = 0.0071；図5H）を見いだし、NonTg 500 mg/kgは、NonTg 50 mg/kg（p=0.0001）および0 mg/kg（p<0.0001）群と比較して上昇を示した。3xTg-ADマウスでは、0mg/kg群と比較して50mg/kg群（p = 0.0182）および500mg/kg群（p = 0.0085）で有意な増加が認められた。最後に、CCL4としても知られ、神経血管内皮を破壊しAβを増加させることが示されているマクロファージ炎症性タンパク質（MIP）1-βのレベルを測定した［63, 64］。投与量による有意な遺伝子型の交互作用（F(2, 18) = 5.598, p = 0.0129；図5I）が認められ、NonTg 500mg/kg群は、NonTg 50mg/kg群（p = 0.0015）および0mg/kg群（p < 0.0001）よりも有意に高い値を示した。これらの結果を総合すると、6ヵ月間の回復後も、NonTgおよび3xTg-ADマウスの皮質組織では炎症性サイトカインおよびケモカインが上昇しており、AD病態の進行に寄与している可能性があることが明らかになった。
考察
本研究では、グリホサートとアミノメチルホスホン酸が6ヵ月間の回復期間後もマウスに残存するかどうか、また、この曝露／回復パラダイムが神経炎症とAD病態を変化させるかどうかを検討した。アミノメチルホスホン酸はグリホサートを投与したマウスの脳組織で検出可能であり、高投与動物ほど高い蓄積を示した。さらに、グリホサート投与マウスのHpおよびCtx脳組織において、Aβの可溶性および不溶性画分、Aβ42プラーク負荷量およびプラークサイズ、Thr181およびSer396におけるpTauの有意な増加が認められ、AD様タンパク質異常症の特徴が強調された。また、HpではAT8の上昇も観察され、グリホサート暴露によるタウの病態の増加が初めて示された。注目すべきは、3xTg-ADマウスの血漿中および3xTg-ADマウスとNonTgマウスの大脳皮質脳組織において、回復しているにもかかわらず、炎症性サイトカインとケモカインの上昇を認めたことである。長期化した炎症はAD病態の進行に影響を及ぼし、神経変性疾患を発症する可能性を高めることが示されていることから、この結果は重要である [52, 65,66,67] 。3xTg-ADグリホサート曝露マウスでは、Thigmotaxia（動物が壁の近くにいる時間が長くなる行動で、不安様行動[68]に分類される）が有意に上昇した。これらを総合すると、我々の結果は、グリホサート曝露マウスの末梢血と脳において、グリホサート曝露の数ヵ月後にアミノメチルホスホン酸の存在を伴うAD様病態の増加と炎症の上昇を初めて示したことになる（図6）。
Fig. 6
図6
グリホサート曝露後、有意な回復期間を経て、長期にわたる病理学的結果を引き起こす可能性があることを強調した主な知見のグラフによる要約
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グリホサートを投与されたマウスは、グリホサート曝露げっ歯類における過去の報告[18, 69, 70]と一致して、本研究の投与期間中および回復期間中に有意な体重減少を示さなかった。しかし、3xTg-ADマウスでは投与期間中および回復期間中に早死にする割合が高く、ADモデルにおける根本的な健康問題がグリホサート曝露によって悪化している可能性が示唆された。例えば、3xTg-ADマウスはNonTgマウスと比較して、グルコース代謝障害とインスリン抵抗性を示し[29]、また急性感染後の炎症反応に対する感受性が高い[71]。ここでは、グリホサート回復の数ヵ月後に3xTg-ADマウスでは末梢のサイトカインとケモカインレベルの上昇が見られたが、NonTgマウスでは見られなかった。末梢血や脳組織以外のグルコースレベルや臓器の病態を評価したわけではないが、3xTg-ADマウスで観察された末梢血サイトカインとケモカインレベルの上昇が、すでに存在する病気の悪化に寄与し、生存率の低下につながった可能性がある。ラットを用いた以前の研究では、グリホサート暴露がグルコースホメオスタシスとインスリンシグナル伝達を乱し、肝炎と肝障害を引き起こすことが示されている。さらに、ヒトにおける研究では、尿中のグリホサート濃度が高いほど、II型糖尿病、高血圧、心血管疾患、肥満と関連することが示されている [73] 。従って、グリホサートへの暴露がこのような代謝性疾患を増加させ、3xTg-ADマウスの早死にをもたらしたのではないかと推測したくなる。このような相互作用を解明するためには、今後の研究が必要である。
アミノメチルホスホン酸はグリホサートと同様の毒性を示し [74]、以前の研究では、ヒトで測定可能なアミノメチルホスホン酸は酸化的損傷と代謝の有害な結果と関連していることが確認されている [54, 75]。驚くべきことに、グリホサート投与数ヵ月後の3xTg-ADマウスとNonTgマウスの脳組織には、アミノメチルホスホン酸が存在していた。グリホサート暴露後、アミノメチルホスホン酸が皮質脳組織に入り込み、存在するようになったメカニズムはまだ不明である。最も有力な仮説は、グリホサート投与中に腸内細菌叢によってアミノメチルホスホン酸に代謝されたというものである。これは、げっ歯類やヒトの腸内細菌叢には、乳酸菌やバクテロイデスなどのシキメート経路を持つ微生物が含まれているという証拠によって裏付けられている。ヒトの腸内細菌叢に含まれる細菌の多くは、5-エノールピルビルシキメート3-リン酸合成酵素を持つため、グリホサートによる阻害に敏感である[21, 76]。その結果、アミノメチルホスホン酸はBBBを通過し、グリホサート暴露の数ヵ月後に大脳皮質組織で検出されるようになったと考えられる。このことは、in vitroモデルでアミノメチルホスホン酸がBBBを通過することを示した研究からも支持される[28]。さらに、3xTg-ADマウスはプラーク発症前から微小血管の変性がみられ、加齢とともに悪化する。特に、急性グリホサート中毒患者は血清s100βの上昇を示し [79]、これはBBB透過性の障害を示している [80]。さらに、神経や末梢の炎症の亢進や長期化は、BBBを弱める可能性がある [81, 82]。従って、炎症が亢進し、BBBの完全性が破壊されやすい人は、グリホサートが脳に浸潤する能力により、有害な影響を受けるリスクが高まる可能性がある。第二の可能性は、グリホサートがBBBを通過し、その後そこで代謝されたことである。しかし、我々の知る限り、脳がグリホサートを代謝できるという証拠はないので、この可能性は低いと思われる。
グリホサートとアミノメチルホスホン酸に関する研究のほとんどは、尿中暴露レベルと疾病転帰を関連付けている。最近の研究では、グリホサートとアミノメチルホスホン酸の組織における生物濃縮を調査したものはない。ほとんどの研究が、標準的な哺乳類の排泄経路を通じてほぼ完全にクリアランスされると仮定しているからである [83, 84]。我々の研究は、有意な回復期間後の組織、特にげっ歯類の脳におけるアミノメチルホスホン酸の蓄積を報告した最初のものである。この発見は、組織におけるアミノメチルホスホン酸のクリアランスを調査する必要性を強調し、その分子的相互作用と健康への長期的影響を明らかにするための追加研究の必要性を示唆している。特に植物では、蓄積されたアミノメチルホスホン酸が、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Al3+などの2価および3価の金属陽イオンをキレートして隔離することが示されている [85]。ヒトでは、重金属がADに至る病態生理学的過程に関与していると考えられており [86, 87]、アミノメチルホスホン酸が脳内の特定の重金属をキレートし、ADに関連した神経毒性を引き起こす可能性が示唆される。
我々は、3xTg-ADマウスとNonTgマウスの両方において、グリホサート暴露によって誘導された神経炎症を強調する様々なサイトカインとケモカインの長期にわたる上昇を見いだしたが、これはグリホサート暴露によってTNF-αが増加したことを示した既発表の研究結果とも一致する [6]。脳におけるいくつかの炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインの増加は、アミノメチルホスホン酸が暴露後数ヶ月の神経免疫機能の調節不全に関与している可能性を示唆しているが、そのような相互作用のメカニズムを明らかにするためには今後の研究が必要である。もう一つの可能性は、グリホサートへの暴露によって、サイトカインやケモカインの慢性的な放出が始まり、それが数ヵ月間続いている可能性である。炎症は身体の免疫反応に必要な部分であるが、神経炎症が長期化すると身体や脳に悪影響を及ぼす可能性がある（[88]に総説あり）。グリホサートは末梢の炎症を亢進させることが示されている。in vitroの研究では、T細胞がグリホサートとその代謝物に暴露されると、サイトカイン産生の増加 [89] と活性酸素種の増加 [90] に直接つながることが実証されている。さらにマウスでは、グリホサートの短期投与が末梢免疫の活性化と炎症を引き起こした。3xTg-ADマウスではすでに、感染に対する末梢の炎症反応が亢進しており、感染が末梢に及んだ場合でも神経炎症が亢進する [71]。グリホサートやアミノメチルホスホン酸が循環していないにもかかわらず、グリホサート投与が3xTg-ADマウスの末梢の炎症を亢進させたことを考えると、3xTg-ADマウスの末梢の炎症亢進が長期化したことを説明する3つの興味深い可能性が考えられる。第一に、我々は他の臓器におけるアミノメチルホスホン酸の蓄積を調べていない。肝臓と脂肪組織はグリホサート暴露により炎症性サイトカインの生成を増加させることが示されている [92]。従って、グリホサートまたはその代謝物が他の臓器に残存していた場合、3xTg-ADマウスにおいて慢性的な末梢性炎症を引き起こし続けている可能性がある。第二に、グリホサート暴露はin vitroの免疫細胞においてクロマチンリモデリング遺伝子の発現を変化させる可能性があり[93]、エピジェネティックなメカニズムを介して末梢の炎症を持続させた可能性がある。最後に、3xTg-AD株ではBBBが破壊されていることから、残存するアミノメチルホスホン酸から脳内で生成されたサイトカインが末梢循環に移行し、炎症シグナル伝達を悪化させた可能性がある。
ADマウスとNonTgマウスの両方の脳で見られた炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインの有意な上昇は、グリホサート暴露に関連した認知機能障害にさらに影響を及ぼす可能性がある。例えば、血漿中のEotaxinとMCP（単球走化性タンパク質）-1の増加は、高齢者やADのような神経変性疾患患者の記憶力の悪化と関連している [94]。我々は、グリホサート投与マウスの血漿と脳において、EotaxinとMCP-1の両方が有意に上昇していることを発見した。さらに、グリホサート投与マウスで有意に増加したサイトカインであるIFN-γは、ミクログリアにおいて神経毒性表現型を誘導する可能性がある。疾患状態では、これが神経炎症をさらに進行させ、酸化ストレス、そして最終的な細胞死をもたらす可能性がある [95, 96]。IFN-γ発現の増加はまた、成人の海馬の神経新生を障害し、その結果、学習と記憶に影響を及ぼす可能性がある [96]。免疫反応を中心に幅広い機能を持つサイトカインの一種である12種類のインターロイキン（IL）は、グリホサートを投与したすべてのマウスの皮質組織で有意に増加した： IL-1⍺、IL-1β、IL-2、-3、-4、-5、-6、-9、-10、-12(p40)、-12(p70)、-13、-17である。これら12種類のうち、IL-4、IL-10、IL-13は抗炎症性サイトカインであるが、先行研究ではIL-4とIL-10の上昇がAβプラーク負荷を増加させることが示されている [97, 98]。個々のサイトカインがADに及ぼす影響については、様々な結論がある。しかし、免疫応答は、親炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインの微妙なバランスで構成されており、ADでは最終的にそのバランスが崩れ、神経病理の進行に寄与するというのが一致した見解である [99, 100]。グリホサートへの曝露が、3xTg-ADマウスの脳と末梢における炎症性サイトカインとケモカインレベルの不均衡を促進することがわかったので、このことは、ADの危険因子としてのグリホサート曝露に深い意味を与えるかもしれない。
グリホサートへの曝露は、神経炎症の阻害を介してであれ、より直接的なメカニズムであれ、3xTg-ADマウスにおいてAβとタウの病理を増加させた。特に、アミロイド生成APPのプロセシングとタウのリン酸化亢進は、サイトカインレベルの上昇 [101,102,103] によって悪化するが、これはグリホサート投与マウスで観察され、BACE-1の上昇によってC末端断片C99のAPPプロセシングが亢進していることがわかった。我々のグループは以前、APP過剰発現マウスモデルの一次ニューロンをin vitroでグリホサートにさらすと、Aβ40と42のレベルが上昇することを示した[6]。さらに、APPスウェーデン変異を過剰発現させたN2a細胞を、IFN-γ＋TNF-⍺、IFN-γ＋IL-1βの組み合わせに暴露すると、BACE-1の発現とmRNAレベルが有意に増加することが示されている［104］。TNF-⍺、IFN-γ、IL-1βはすべて、グリホサート暴露マウスの血漿と皮質組織の両方で有意に上昇しており、これらの炎症性サイトカインの増加がBACE-1の発現に直接影響している可能性が示唆された。また、BACE-1遺伝子はそのプロモーター配列内にリンパカイン応答エレメントを含んでおり、リンパカインがBACE-1の転写を変化させる可能性がある。リンパカインにはIL-2、-3、-4、-5、-6というサイトカインが含まれ、グリホサート暴露マウスではこれらのサイトカインが増加していることから、BACE-1発現増加のメカニズムとして転写変化が示唆される。我々は、回復期に脳内に残ったアミノメチルホスホン酸の蓄積、あるいは曝露中に脳内に侵入した可能性のあるグリホサートがサイトカインレベルの上昇を招き、それがBACE-1の発現を増加させ、アミロイド形成プロセッシングを増加させ、最終的にアミロイドーシスを上昇させたと示唆している。感染による慢性炎症は、タウのリン酸化亢進に異常に寄与するキナーゼであるグリコーゲン合成酵素キナーゼ-3β活性（GSK-3β）を増加させることによって病的なタウを悪化させることが以前の研究で証明されていることから、神経炎症の亢進もタウ病態の亢進に寄与している可能性がある [105]。最後に、グリホサートとアミノメチルホスホン酸への暴露は、トランスクリプトームの変化 [6]、酸化的損傷 [54, 75]、DNA修復機構の破壊 [106] と関連している。DNA修復機構は、細胞の遺伝情報の完全性を守るために重要である。酸化的DNA損傷の修復障害は、ADの発症と進行に関係している [107, 108]。したがって、グリホサートへの早期曝露と脳内のアミノメチルホスホン酸の長期投与が、DNA損傷修復機構の調節障害を引き起こし、AD様病態を悪化させた可能性があると推測される。
我々は、グリホサート曝露3xTg-ADマウスは、3xTg-AD 0 mg/kg投与マウスと比較して、学習と記憶を評価するタスクにおいて同様の成績を示した。しかし、グリホサート曝露3xTg-ADマウスではThigmotaxiaの増加が観察された。3xTg-ADマウスは、NonTgマウスと比較してMWMで有意にThigmotaxiaの増加を示し[109, 110]、特に高齢の雌は、落ち着きのなさ、驚愕反応、凍りつき行動の増加によって示される高いレベルの恐怖と不安を示す[111]。亢進した不安表現型は、グリホサート暴露がげっ歯類の不安様行動を増加させるという報告と一致している [12, 36, 112]。ヒトでは、扁桃体の萎縮とAβの蓄積がADの初期に観察され [3, 113, 114]、患者はしばしば不安症状を経験する [114, 115]。3xTg-ADマウスでは、扁桃体に神経内Aβの蓄積が認められ [116] 、扁桃体依存性の情動反応や不安様行動の亢進と関連している [35, 111, 117]。さらに、扁桃体における神経炎症は不安様行動に寄与することが証明されており [118, 119]、今回の研究では、すでに不安になりやすい3xTg-ADグリホサート曝露マウスの扁桃体にも及んでおり、MWMにおけるThigmotaxiaの増加に寄与している可能性がある。最後に、Thigmotaxiaは、空間記憶障害のためにマウスが隠れたプラットフォームを見つけられない場合のテクニックとして使用できる[120]。この行動の違いが、グリホサートへの曝露と脳内に蓄積したアミノメチルホスホン酸によるものなのか、AD病態と神経炎症の亢進が扁桃体にまで及んでいるのか、あるいは3xTg-ADマウスではその両方が組み合わさっているのか、疑問が残るが、今後の研究で検討される予定である。
結論
結論として、グリホサート暴露は、3xTg-ADマウスでは早期死亡、AD様病態の促進、それに続く不安様行動、そしてNonTgマウスとADマウスの両方では、数ヵ月間の回復にもかかわらず神経炎症を引き起こした（図6）。グリホサートへの曝露がもたらす多因子的な影響は、グリホサートがいたるところで使用されていることを考えると、ますます懸念される。特に、NonTgマウスとADマウスの両方で神経炎症の亢進と関連していることを考えると、曝露からの回復後の脳でアミノメチルホスホン酸の蓄積を認めたことは、特に懸念すべきことである。グリホサートの使用量が増加の一途をたどる中、この除草剤とその代謝物がヒトの脳に及ぼす影響と、神経変性疾患の有病率増加に寄与する可能性を明らかにするため、さらなる研究が必要である。
データの利用
可能性 本研究の知見を裏付けるデータは、合理的な要求があれば、対応する著者によって利用可能となる。
データの利用可能性
本研究中に作成または分析されたデータセットはない。
略語
AD：
アルツハイマー病
US：
米国
Aβ：
アミロイドβ
NFT：
神経原線維性タウのもつれ
EPA：
Environmental Protection Agency（環境保護庁）
BBB：
血液脳関門
TNF-⍺：
Tumor necrosis factor-⍺
NonTg：
非トランスジェニック
NOAEL：
NOAEL
：観察可能な悪影響なし限界値
MWM：
モリス水迷路
EDTA：
エチレンジアミン四酢酸
MWCO：
分子量カットオフ
LC-MS/MS：
液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析
RSD：相対標準偏差 LOD：相対標準偏差
相対標準偏差
LOD：
定量下限値
LOQ：
定量下限値
ELISA：Enzyme-linked
immunosorbent assay
PBS：
リン酸緩衝生理食塩水
Hp：
海馬
Ctx：
皮質
FL-APP：
全長アミロイド前駆体タンパク質
GAPDH:
グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ
BACE-1:
βセクレターゼ1
C99:
アミロイド前駆体タンパク質のC末端99アミノ酸断片
Aβ40, Aβ42 ：
アミロイドβ、ペプチド長40と42
Thr 181：
スレオニン181
セリン396
セリン396
pTau：
リン酸化タウ
UHPLC:
超高圧液体クロマトグラフィー
LC-MRM:
多重反応モニタリング付き液体クロマトグラフィー
AT8:
セリン202とスレオニン205でリン酸化されたタウ
CA1:
Cornu ammonis 1
ANOVA:
分散分析
UPLC-MS:
超高性能液体クロマトグラフィー-質量分析
APP：
アミロイド前駆体タンパク質
G-CSF:
顆粒球コロニー刺激因子
IFN-γ：
インターフェロン-γ
MHC：
主要組織適合性複合体
IL：
インターロイキン
KC：
ケラチノサイト由来サイトカイン
MCI：
軽度認知障害
KC/CXCL1：
ケモカインリガンド1
MIP1-β：
マクロファージ炎症性タンパク質1-β
MCP-1:
Monocyte chemoattractant protein 1
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