マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）活性化、p53、およびオートファジー阻害は、SARS-CoV-2 スパイクタンパク質誘発神経毒性を特徴付ける（論文の翻訳）
Anthony M Kyriakopoulos 1、Greg Nigh 2、Peter A McCullough 3、Stephanie Seneff 4、✉
編集者：アレクサンダー・ムアセヴィッチ、ジョン・R・アドラー
PMCID：PMC9733976 PMID：36514706
【要旨】
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）スパイクタンパク質とプリオンは、共通の病原性経路を使用してニューロンの毒性を誘発します。感染性プリオンはp38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）経路を急速に活性化し、SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、toll-like 受容体シグナル伝達を介してp38 MAPKとc-Jun NH2末端キナーゼ（JNK）経路の両方を迅速に活性化し、同様の神経毒性の可能性を示し、プリオンおよびプリオン様疾患を引き起こします。このレビューでは、病気プロセスにおけるニューロンにおけるオートファジー阻害、分子模倣、細胞内p53レベルの上昇、および野生型p53誘発ホスファターゼ1（Wip1）および二重特異性ホスファターゼ（DUSP）発現の減少の役割を分析します。toll-like 受容体活性化を介してスパイクタンパク質によって誘導される経路は、PrPC（プリオンタンパク質の正常なアイソフォーム、PrP）のアップレギュレーションとβアミロイドの発現の両方を誘導する。βアミロイド代謝によるp53レベルのスパイクタンパク質依存性上昇により、PrPC発現の増加はPrPのミスフォールディングとオートファジー障害を引き起こし、プリオン疾患を引き起こす可能性がある。私たちは、スパイクタンパク質にさらされた患者の年齢と細胞オートファジー活動の状態に応じて、ニューロンにおけるp53の過剰持続活性が神経変性の触媒因子である可能性があると結論付けています。分子模倣による自己免疫反応も神経症状に寄与する可能性が高い。全体的な結果は、神経変性がスパイクタンパク質曝露の強度と期間、患者の高齢、細胞オートファジー活動、およびp53の活性化、機能、および調節に部分的に起因していることを示唆しています。最後に、神経学的に有害な影響は、曝露が自然感染によるものであれ、より実質的に繰り返されたmRNAワクチン接種によるものであれ、累積的にスパイクタンパク質に依存する可能性があります。
キーワード：自己免疫、covid-19、老化、老化、オートファジー、wip1、p53、プリオンおよびプリオン様疾患、mrnaワクチン、sars-cov-2スパイクタンパク質
【導入と背景】
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）に感染した患者のかなりの割合は、神経学的および認知障害を発症し、感染が治った後も長く続くこともあります。この状態は「long haul COVID病」または単に「long COVID」と呼ばれ、「PASC」（SARS-CoV-2感染の急性後遺症）としても知られています。国際的な研究では、SARS-CoV-2感染後の3,762人の持続的なロングCOVID症状を定量化しました。記憶と認知機能障害は、回答者の88%以上で経験しました。これらは最も持続的に観察された神経症状であり、すべての年齢層で等しく一般的でした。これらの障害は、被験者の仕事と日常生活活動を行う能力に重大な影響を与えた。中枢神経系と末梢神経系の損傷の両方が関与していた[1]。重症コロナウイルス病2019（COVID-19）で死亡した3人の患者の脳の死後研究では、インターロイキン-1β（IL-1β）とIL-6を含む炎症マーカーの過剰発現に関連する多数の活性化ミクログリアが示されました。著者らは、酸化ストレスが神経障害につながるグリアを介した神経炎症反応を誘発することを示唆した[2]。
これらの症状をスパイク糖タンパク質、特にS1サブユニットの神経毒性効果に起因するコンセンサスが高まっています[3]。IdreesとKumarが発表した論文は、SARS-CoV-2スパイクS1タンパク質の受容体結合ドメインがヘパリンとヘパリン結合タンパク質に結合することを示した。これらの著者は、S1タンパク質とこれらのタンパク質の安定した結合が脳タンパク質の凝集を開始し、神経変性を促進する可能性があると結論づけた[4]。スパイクタンパク質のアミロイド原性の可能性を評価する研究では、スパイクタンパク質がタンパク質をタンパク質分解した後、アミロイド様線維の出現を引き起こす可能性があることが確認されました。タンパク質分解後に出現した特定のセグメント、スパイク194-213（FKNIDGYFKI）は、理論的にも実験的にもアミロイド原性であることが示されました[5]。CastellettoとHamleyによる論文は、融合配列近くのSARS-CoV-2スパイクタンパク質の別の特定の配列、すなわち「RSAIEDLLFNKV」に焦点を当てました。これは、pHの変化に応じて通常のアルファヘリカル構造からベータシート構造に切り替えるために、分光分析を通じて実験的に実証されました。pH 4.4で顕著なベータシート型は、アミロイド原性であり、ヒドロゲル形成もサポートしていた[6]。クルーガーらの研究では、タンパク質分解に耐性のあるフィブリンアミロイドマイクロクロートがPASCに関連して血液中に蓄積し、スパイクタンパク質がアミロイド原性特性を持っていることも示唆しています[7]。
脳におけるS1の毒性効果の直接的な実験的証拠は、2022年に発表された韓国の研究者チームによって行われた研究から来ている[8]。実験では、S1サブユニットをマウスの背側海馬に直接導入し、その後、マウスが不安のような行動と認知障害に苦しんでいることが示されました。in vivoとin vitroの両方のさらなる実験では、その効果が中枢神経系（CNS）の特殊なタイプのマクロファージであるミクログリアによって媒介されることが分かった。曝露後にミクログリアが活性化され、興奮性サイトカイン、特にIL-1βが放出されました。IL-1βの発現は、曝露マウスの海馬で7倍以上アップレギュレートされた。形態学的には、被曝マウスのミクログリアは反応性ミクログリアの特徴を獲得した。
Farsalinosらは、スパイクタンパク質の毒性は、神経伝達物質であるアセチルコリンの作用を抑制する能力に部分的に起因している可能性があるという仮説を立てています。いくつかの既知の神経毒は、ニコチン性アセチルコリン受容体に結合し、その機能を阻害します。著者らは、これらの受容体に結合する既知の毒素と類似性を共有するスパイクタンパク質の特定の配列を特定しました。彼らは、ニコチンがこれらの受容体を刺激するので、治療的である可能性があるとさえ示唆しました[9]。
この記事では、スパイクタンパク質、特にS1に反応して神経損傷が発生する可能性のある生物学的経路を追跡しようとします。新興文献に基づいて、私たちは、toll-like 受容体4（TLR4）シグナル伝達が破壊的な反応プロセスの中心であると主張します。重要な仲介者はMAPKカスケードです。MAPKは4つの異なる経路で構成されています：a）細胞外シグナル調節キナーゼ1と2（ERK1/2）、b）ERK-big MAPキナーゼ1（BMK1）、c）c-Jun NH2-末端キナーゼ（JNK）またはストレス活性化プロテインキナーゼ（SAPK）、d）p38 MAPK。ERK経路は成長因子、ホルモン、および炎症誘発刺激によって刺激されるのに対し、JNKとp38 MAPKは炎症誘発刺激に加えて、細胞および環境ストレス信号によって活性化される[10-11]。スパイクタンパク質の神経毒性において主要な役割を果たすのは、後者の2つの経路であると主張する。
最近の神経毒性研究は、SARS-CoV-2 S1サブユニットがミクログリア細胞の神経炎症を誘発することを示している[12-13]。神経炎症反応は、主にパターン認識受容体TLR4を介して、p38 MAPKと活性化B細胞（NF-κB）活性化の核因子κ-軽鎖増強剤によって媒介されます。さらに、SARS-CoV-2 S1サブユニットは、TLR4受容体シグナル伝達を活性化することにより、マウスとヒトマクロファージで炎症誘発反応を誘発します。このシグナル伝達プロセスでは、JNKとp38の両方がリン酸化[14]によって活性化されます。感染性プリオンもp38 MAPK経路を活性化して神経毒性効果を誘発することに注意することが重要です[15]。スパイクタンパク質は、その神経毒性に寄与する可能性のあるプリオンのような特性を持っています。これらのトピックについては、後で詳しく説明します。
【レビュー】
【mRNAワクチンの特別な考慮事項】
現在市場に出回っているすべてのCOVIDワクチンは、スパイクタンパク質に対する抗体を産生するように免疫細胞を誘導する原理に基づいています。Sinovacのような一部のワクチンは、ウイルスの不活化バージョンに基づくより伝統的な戦略を使用していますが、米国で販売されている3つの主要なワクチンはすべて遺伝子治療に基づいています。スパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ワクチンを摂取する細胞でタンパク質にコピーされます。ジョンソン・エンド・ジョンソンのワクチン（およびヨーロッパで一般的に使用されているアストラゼネカのワクチン）は、DNA配列に挿入されたスパイクタンパク質のコードで増強された不活化アデノウイルスに基づいています。ウイルスが細胞に感染すると、独自のDNAをRNAに変換し、最終的にタンパク質に変換する標準的なツールを使用してスパイクタンパク質を生成します。
ModernaとPfizer/BioNTechによって販売されている米国で広く流通している2つのmRNAワクチンは、これまで市場に出回っているどの病気のワクチンにも使用されたことのない新しいアプローチを使用しています。これら2つのワクチンの背後にある技術は複雑で洗練されており、その多くは新しく、安全性の評価が不十分です[16]。ワクチンのmRNAは、ウイルスがスパイクタンパク質をコードするために使用するmRNA配列とは大きく異なります。重要な変更は、配列内のすべてのウリジンをメチルシュードウリジンに置き換えることでした[17]。これにより、mRNAは酵素分解に抵抗することができます。メチルシュードウリジン修飾は、翻訳開始の抑制を防ぐことによって、非修飾mRNAの10倍以上のタンパク質をサポートすることが示されています[18-19]。
修飾スパイクタンパク質mRNAは、コレステロールと他のリン脂質からなる高度に設計された脂質ナノ粒子にカプセル化されています。脂質ナノ粒子の他の成分には、ポリエチレングリコールと合成カチオン脂質が含まれ、リソソームから細胞質への脱出とタンパク質合成の開始を促進します。実際の配列自体も、ウイルスが各アミノ酸に使用したコドンよりも効率的に翻訳する冗長コドンに置き換えることを含む「コドン最適化」と呼ばれるプロセスを通じて変更されます。実際にペプチド配列を変えるコドン置換も導入され、隣接する2つのアミノ酸を二重プロリン配列に置き換え、アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）受容体に結合した後の膜進入を容易にするために再フォールディングステップを混乱させる。最後に、mRNA分子は、その両端に5'と3'の翻訳されていない領域（UTR）、長持ちするヒトmRNAから借用した配列を挿入し、分解に対する耐性をさらに促進するために長いポリAテイルを追加することによって「人間化」されます[16]。スパイクタンパク質は、多くの重要なヒトタンパク質と高分子類似性の領域を共有しており、特にワクチンが非常に強い免疫グロブリンG（IgG）抗体反応を誘発するため、分子模倣は自己免疫疾患につながる可能性があります[20]。このトピックについては、この記事の後半で説明します。
mRNAワクチンの開発者は、長期間にわたって持続するスパイクタンパク質の迅速な合成を保証することに非常に成功したようです。ほとんどのヒトmRNA分子は合成から数時間以内に排除されるのに対し、スパイクタンパク質mRNAはワクチン接種後2ヶ月に腕筋の排出リンパ節で発見され、この耐久性は、ロングCOVIDの症状プロファイルに似たワクチン接種後の症状と関連していました [21]。Fertigらは、ワクチン接種後少なくとも2週間はmRNAが循環していることを発見しました[22]。
すべてのSARS-CoV-2ワクチンは、有毒なスパイクタンパク質を体内に導入するため問題がありますが、mRNAワクチンは長期間にわたって大量のスパイクタンパク質を導入する可能性があるため、特に危険である可能性があります。
【CD16+単球、マイクロRNA、スパイクタンパク質持続性】
驚くべきことに、スパイクタンパク質は、SARS-CoV-2に感染してから15ヶ月後まで血液中を循環するヒトCD16+単球に持続することがわかっています[23]。スパイクの持続はロングCOVID症状と関連しており、持続的なスパイクの存在は長引く症状を説明することができると示唆されました。これらのPASC患者で断片化されたSARS-CoV-2 RNAのみが見つかったため、これは活発な感染を反映していませんでした。タンパク質やメッセンジャーRNA分子が生き残るには15ヶ月が長すぎるように見えるため、この発見は謎です。
この偉業は、スパイクタンパク質をコードするウイルスmRNAのDNAへの逆転写を含むプロセスによって達成される可能性があります[24]。SARS-CoV-2ワクチンのmRNAに関する最近のin vitro研究では、そのような能力がヒト細胞に存在することが示されています。これらの著者は、ヒトの肝癌細胞が、曝露から6時間以内にCOVIDワクチンのmRNAをDNAに変換できることを実証しました[25]。がん細胞は、mRNAをDNAに逆転写できるレトロトランスポゾンである、long interspersed nuclear elemant-1（LINE-1）を高レベルで発現することが知られています。LINE-1の発現は、p53変異を持つ腫瘍でより高い[26]。
さらに、驚くべきことに、腫瘍は、特に炎症状態下で、循環単球によって取りあげられる可能性のあるレトロエレメントを含む細胞外小胞を放出します[27]。これは、CD16+単球がmRNAを逆転写する能力を獲得できるメカニズムを示唆している。あるいは、腫瘍細胞はスパイクタンパク質をコードするmRNAを含むエクソソームを放出し、循環単球細胞によって直接取り込まれ、タンパク質に翻訳される可能性がある[28]。
さらに、CD16+単球自体は長命である可能性が高い。循環単球のCD16+サブセットは、「古典的な」CD16+単球と比較して、通常、toll-like 受容体（TLR）刺激に反応して、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）などの炎症性サイトカインの量を多く放出し、抗炎症性サイトカインIL-10の放出量は低レベルであるため、「炎症性」サブセットとして知られています。通常、それらは循環単球プールの10%-20%を占めますが、その数は炎症状態に関連して拡大します。
マイクロRNA（miRNA）は、遺伝子発現の転写後の調節に機能する短い一本鎖非コードRNA分子です。オートファジー調節の概念と病気との関連の中で、miRNAはオートファジーメカニズムをアップレギュレートおよび/またはダウンレギュレーションすることによって主役の役割を果たしている[29]。例えば、クローン病におけるc-Myc転写因子のレベルの増加など、自己免疫の病理学的ストレス条件下では、特にmiR-106BとmiR-93の発現の増加は、オートファゴソーム形成を減少させることによってオートファジーを阻害する[30]。
さらに、多くのmiRNAの発現の調節不全は、アルツハイマー病（AD）の場合のように神経変性疾患の病因に関与しています。疾患の病因に対するmiRNAの寄与は、オートファジーの差動変調によって達成される[31]。さらに、miR-101aの場合のように、特定のmiRNAのアップレギュレーションは、MAPK-1の発現を阻害することによってオートファジーの液胞形成を減少させる[32]。ERK経路を開始するには、MAPK-1の発現が必要です[10]。ERK活性の低下は、細胞のオートファジー能力の低下と関連しており、細胞の死または老化のいずれかをもたらす[33]。
この研究に関連して、特にmiR-146aは「老化」表現型のよく知られているマーカーです。このmiRNAの基底レベルは、古典的な単球よりもCD16+単球の方が有意に高い。老化は、不可逆的な増殖停止の長寿命状態です。老化した単球は長期間生き続け、炎症性サイトカインを継続的に放出する[34]。
スパイクタンパク質が長期間持続できるもう1つのメカニズムは、プロテアーゼ耐性型にミスフォールディングされることによるものです。スパイクタンパク質は糖タンパク質であり、ウイルスからの糖タンパク質はプロテオパシー種子の拡散を促進することが示されています。画期的な実験で、研究者は、スパイクタンパク質が細胞質プリオンとタウ凝集体を含むエクソソームの細胞間移動を促進し、プリオン様拡散を加速できることを明確に示しました。タウ凝集体を伝播させる細胞は、最初にスパイクタンパク質をコードするベクターでトランスフェクトされました。不滅化したヒト胚性腎細胞（HEK細胞）は、トランスフェクトされた細胞によって放出されるエクソソームの受け手として機能しました。トランスフェクトされたドナー細胞は、ACE2を過剰発現するレシピエントHEK細胞と共培養された。S1セグメントは、ソーストランスフェクトされた細胞の溶解物で同定され、これらの細胞によって分泌される細胞外小胞にも現れました。ソース細胞におけるスパイクタンパク質発現の存在は、誘導凝集体を持つレシピエント細胞の数の有意な増加をもたらした[35]。
ワクチン接種後のスパイクタンパク質産生の永続性を調査した研究では、2回目のワクチン接種後16日後に豊富なスパイクタンパク質が排出リンパ節の胚中心にまだ存在し、2回目のワクチン接種後60日後もスパイク抗原が依然として存在していた[36]。Bansalらによる2022年の研究では、スパイクタンパク質が最初のmRNAワクチン接種の14日後に循環エクソソームに現れ、スパイク含有エクソソームが4か月後も検出可能であることが示されました。彼らは、これらのエクソソームが抗体の誘導に不可欠な役割を果たしていると主張した[37]。
【TLR4受容体の活性化、CD16+単球、および脳の炎症】
SARS-CoV-2ウイルスがACE2受容体を介してヒト細胞に侵入することは十分に確立されていますが、重篤な病気に関連するサイトカインストームの原因となる可能性のある別の活性化経路があります。28人のCOVID-19患者（8人の重症患者対20人）を含む48人の被験者から抽出された末梢血単核細胞を含む遺伝子発現アッセイ研究では、重症症例はTLR4シグナル伝達の活性化と関連しており、細菌性敗血症に強く類似した反応が明らかになりました[38]。さらに、ヒトとマウスの両方のマクロファージに関するin vitro研究は、スパイクタンパク質のS1サブユニットのみがTLR4受容体を活性化し、NF-κBおよびJNK経路を介して強い炎症反応を誘発することを実証した[14]。スパイクタンパク質はTLR2を活性化することも示されている[39]。この受容体は、IL-6の誘導と特異的に関連している[40]。ケーススタディでは、mRNAワクチンの2回目の接種後に「原因不明」で死亡した4人の個人が参加しました。RNAシーケンシングにより、好中球脱顆粒とサイトカインストームに関与する遺伝子が対照群と比較して症例で急激にアップレギュレートされていることが明らかになり、ワクチンが過剰な炎症反応を誘発したことを示唆している[41]。別の実験では、SARS-CoV-2スパイクタンパク質のS1サブユニットが、TLR4の細胞外ロイシンが豊富な繰り返しドメインと特異的に相互作用してNF-κBを活性化することが示されました[42]。
TLR4は、細菌感染に対する感受性で知られるTLRファミリーの膜貫通メンバーです。それは主に骨髄系統の免疫細胞によって発現し、その活性化はNF-κB炎症シグナル応答を誘発し、感染に反応するために自然免疫系を活性化します。TLR4反応の最も有名な刺激剤は細菌性リポ多糖（LPS）です。スパイクタンパク質のS1セグメント、フリン切断部位のすぐ上に酸性の四アミノ酸配列（PRRA）があり、コロナウイルスの中で特有であり、非常に有毒なエンテロトキシンである黄色ブドウ膜エンテロトキシンB（SEB）にも見られます。SEBはTNF-αの強力な誘導体であり、CD16+単球のプールの拡張を誘導する。細胞へのSARS-CoV-2の侵入は、SEBに対するモノクローナル抗体によって抑制することができます[43-44]。スパイクによるTLRの活性化は、このユニークなシーケンスに部分的に依存する可能性があります。
CD16+細胞は、他の循環単球と比較して、より成熟した段階で知られています。それらは炎症組織に浸透し、TLR4シグナルカスケードを開始する主要な細胞タイプです[45]。
炎症がCNSの外で起こると、脳内で全身反応が起こり、それによってミクログリアが活性化され、TNF-αシグナル伝達がアップレギュレートされます。その後、循環単球は、脳単球化学誘引タンパク質（MCP）-1の発現強化を通じて脳に動員されます[46]。このようなメカニズムにより、CD16+単球がスパイクタンパク質を脳に送達し、神経損傷を引き起こし、ロングCOVIDに関連する認知障害を説明する可能性があります。
TLR4活性化（例えば、血管壁のCD16+細胞によって開始される）は、T細胞が組織に侵入するように誘導し、ケモカインCCL20の発現をアップレギュレートさせ、血管炎を引き起こす[47]。パーキンソン病の76歳の男性が、COVID-19（BNT162b2 mRNAワクチン）に対する3回目の予防接種の3週間後に死亡した事例[48]。脳の組織病理学的分析により、急性リンパ性血管炎と多巣壊死性脳炎が明らかになりました。免疫組織化学分析では、スパイクタンパク質は特定されましたが、脳と心臓の両方の炎症病巣におけるヌクレオカプシドタンパク質は同定されませんでした。患者は以前にCOVID-19と診断されたことがないので、ワクチンがこの状態を引き起こしたという強力な証拠があります。
【凝集性プリオンタンパク質：正常な機能と発現】
プリオン病の病理の中心は、主に神経細胞の表面に位置する正常なプリオンタンパク質（PrP）アイソフォーム、PrPCのコンフォメーション変化です。PrPCの三次構造のコンフォメーション変化は、タンパク質の感染性形態をもたらし、ミスフォールド・アイソフォームPrPSCとも呼ばれます（SCは「スクレイピー」の略で、羊に発生するプリオン病です）。これらのミスフォールドされたタンパク質は、長い原線維に凝集し、脳の正常な機能の調節を失調させ、スクレイピー、アルツハイマー病（AD）などのプリオン関連疾患を引き起こします[49]。非感染性形態のPrPCは、非病原性条件下で、多くの有益な細胞の役割を果たします。リンパ球の活性化、細胞分化、神経突起伸展、シナプス形成、細胞シグナル伝達と生存率、細胞接着プロセス、および細胞恒常性のための他の多くの重要な機能に関与しています[レビューについては、Castle and Gill（2017）[50]]を参照してください。
全体として、PrPCはストレス条件下で細胞保護を提供するストレス誘発性タンパク質であり、その正常レベルは低血糖、虚血、およびインスリンの存在下で増加します。PrPとADに関連したβ-アミロイド前駆体タンパク質（APP）の多くの有益な役割のいくつかを表1に示します。PrPCの発現は、ストレスを誘発する細胞状態によって上昇する多数の転写因子の影響を受けます。表1に示すように、小胞体ストレスもPrPC発現を誘導する[50]。プリオンタンパク質遺伝子（PRNP）は、ハウスキーピング遺伝子と見なすことができますが、選択的プロモーター因子Sp1とSp2を含む、プロモーター領域に転写因子の複数の結合部位があり、通常は腫瘍原性の可能性で知られています[51]。
表1。正常なPrPとAPPの生理機能の一部。
PrP、プリオンタンパク質; NMDAR, N-メチル-D-アスパラギン酸受容体; ER, 小胞体; APP, β-アミロイド前駆体タンパク質
活性化タンパク質-1（AP-1）とAP-2は、JunおよびFosファミリーのさまざまな二量体とともに、PRNP内のGCが豊富な推定結合およびプロモーター領域に対する高い親和性を持ついくつかの転写因子に含まれています。これらの転写因子による活性化は、脳で調節機能を果たす[64]。これらの転写因子は、JNK活性化とc-Junリン酸化、およびE4プロモーター結合タンパク質の結果として機能します。この結合タンパク質の発現は、ホスファターゼ経路の調節に関与する多くの追加の転写因子とともに、細胞内カルシウムレベル（Ca2+）に依存します[65-66]。
興味深いことに、PrPC発現のアンチセンスサイレンシングを誘導する実験では、結果は4E結合タンパク質-1（4EBP-1）のリン酸化であり、真核生物翻訳開始因子4E（eIF4E）の放出を引き起こし、キャップ依存性mRNA翻訳に進む分子イベントです。これは、神経膠腫細胞におけるオートファジー依存性細胞死を引き起こす[67-68]。
特に関連性のあることに、合成mRNAとeIF4Eのキャップの高い親和性を介してキャップ依存性翻訳を好むように細胞を誘導することは、レシピエント細胞を増殖傾向の増加に向け、発がん、免疫調節不全、および経年劣化を促進する細胞イベントの開始に向けることが示されています。遺伝子ワクチン接種に使用されるSARS-CoV-2 mRNAに現在常駐している合成mRNAキャップは、まさにmRNAのキャップ依存性翻訳を支持するキャップ組成です。さらに、合成mRNAとそのスパイクタンパク質産物の存在によってストレスを受けた細胞におけるキャップ依存性翻訳を駆動する少なくとも2つの追加の細胞因子があります。これらには、a）p38 MAPK経路とb）ラパマイシン（mToR）軸の機械的標的に対するp53阻害活性の不均衡[69]が含まれます。
要約すると、現在使用されているmRNAワクチンは、細胞をそのmRNAのキャップ依存性翻訳に駆り立てる状況の構成をもたらします。このプロセスは、細胞恒常性に対する多くの予想されるが、十分に特徴付けられていない有害な影響を持つプロセスです。
【プリオンタンパク質とオートファジー】
マクロオートファジーの障害または失敗は、プリオン病の主な原因としてますます認識されています[70-71]。オートファジーは、そうでなければニューロンに蓄積する凝集しやすいタンパク質を除去する能力を通じて、プリオン感染を制御することができます[72]。マクロオートファジーは、ミスフォールドされたプリオンタンパク質自体が分解される重要な経路であり、オートファジーを誘発する薬には抗プリオン効果があることが示されている[73]。オートファジー液胞は通常形成され、エンドリソソームと融合して最終的なクリアランスを得る[74]。オートファジー活性が増加すると、ニューロンはエクソソーム内でプリオンタンパク質を放出し、他のニューロンへの感染性の広がりを誘発する可能性が低くなります[73]。興味深いことに、プリオンタンパク質は複数のストレス条件下でアップレギュレートされ、それが果たす重要な役割は、ミスフォールドされたタンパク質や損傷したミトコンドリアを含む細胞破片の除去を促進するために、オートファゴソームとリソソームとの融合を促進することが提案されています。
研究所で使用されているマウスの株は、PRNPの遺伝子変異があり、その発現を無効にしています。これらのマウスは、プリオンタンパク質が存在しないため、プリオンタンパク質の機能に関する重要な知識を提供します。これらのマウスの主な特徴は、細胞質におけるオートファジー液胞が非常に早い段階で出現することです。液胞は生後3ヶ月で皮質ニューロンに現れ、6ヶ月までに海馬ニューロンにも出現した。対照マウスと比較して、海馬の液胞の数は加齢とともに加速的な速度で増加しました。これらの欠陥のあるマウスは、酸化ストレスに対してより敏感であり、発作、運動および認知障害、および海馬の長期増強障害のリスクが高かった[75]。これらのマウスは、プリオンタンパク質が細胞破片のオートファジークリアランスをサポートするという見解を強く支持します。
不思議なことに、オートファジー液胞の蓄積は、クロイツフェルトヤコブ病（CJD）を含む神経変性疾患の共通の特徴でもあります[71]。プリオンタンパク質が少なすぎることも多すぎることも、同様の疾患状態につながるという事実は、プリオン疾患が主に機能喪失の病理であると仮定すれば説明できます。ニューロンがミスフォールドされたタンパク質の負担を増やすストレス要因にさらされると、PrPをアップレギュレートして、リソソームシステムを介してこの破片の除去を支援します。しかし、種子のミスフォールドされたPrPScタンパク質、またはスパイクタンパク質などの外部から供給されたミスフォールドされたプリオン様タンパク質が、ストレス要因によって誘発される高濃度のPrPがあれば、種子が細胞質に存在するPrPのほとんどを動員し、最初に可溶性オリゴマーに変換し、最後に沈殿したフィブリルに変換する可能性があります。細胞内のPrPの量は高いが、そのほとんどはオリゴマーとフィブリルに縛られているため、破片を取り除くことができなくなり、オートファジー液胞の蓄積につながる。
【スパイクタンパク質、分子模倣、自己免疫疾患】
分子模倣が自己免疫疾患を誘発できることは、少なくとも20年前から知られていた[76]。SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質とさまざまな哺乳類プロテオームとの間のペプチド重複の分析により、分析された種のうち、ヒト、マウス、ラットのプロテオームのみが、ヘキサペプチドとヘプタペプチドレベルで有意な重複を持っていたことが明らかになりました。さらに、重複がほとんどない種（猫、犬、その他3匹の霊長類）は、SARS-CoV-2への曝露による症候性疾患の影響を受けませんでした。結論は、分子模倣が症候性疾患の主な原因である可能性があるというものでした[77]。
Nunez-Castillaらは、交差反応抗体による自己免疫は、血小板減少症、血小板活性化、calcium dysbiosis、心血管疾患など、COVID-19に関連するいくつかの症状を説明する可能性があると示唆しています。彼らは、交差反応の可能性の特に問題のある例として、スパイクタンパク質のTQLPPモチーフとELDKYモチーフを特定しました[20]。
VojdaniとKharrazianは、スパイクタンパク質が分子模倣を介して自己免疫疾患を引き起こす可能性を評価する実験を行いました。彼らは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する市販のマウスモノクローナル抗体を使用し、50種類のヒト組織抗原に結合する可能性を評価しました。トランスグルタミナーゼ、ミエリン塩基性タンパク質、ミトコンドリア、核抗原、α-ミオシン、甲状腺ペルオキシダーゼ、コラーゲン、クロージン5+6、S100B[78]など、自己免疫疾患に関連するいくつかのタンパク質が有意な交差反応性を有することが確認された[78]。
懸念されるのは、mRNA COVIDワクチンベースの免疫が、分泌された粘膜（IgM）抗体よりもIgG抗体に有利な不均衡な抗体反応を誘発することが実証されていることです。集団研究では、COVID-19 mRNAワクチンは、COVID-19回復期に生成されたレベルよりも、肺の粘膜抗体応答をかなり弱くしました[79]。ワクチンは粘膜の壁を越えて注射されるので、これは驚くべきことではありません。しかし、分泌されたIgMの欠如は、自己免疫疾患の進行を加速させることが示されている[80]。
スパイクタンパク質のセグメントと神経系の神経伝導の維持に関与するいくつかのタンパク質との間の線形配列の類似性は、mRNAワクチンに応答して神経疾患の可能性を示唆している[81]。特に、スパイクタンパク質が分子模倣に基づくメカニズムを通じてプリオン様疾患を引き起こす可能性がある。プリオンタンパク質は、小胞体（ER）ではあまり理解されていないが、重要な役割を担っており、その球状C末端ドメインはERへの取り込みに不可欠である[82]。驚くべきことに、球状ドメインに特異的な抗体は、減少速度が加速するだけで、クロイツフェルト・ヤコブ病に似た状態を誘発する[83]。このメカニズムは、抗体がERへの輸送を妨害し、プリオンタンパク質が細胞質から急速に除去され、上記のように機能喪失欠陥を誘発するという事実による可能性が高い[75]。
スパイクタンパク質の受容体結合ドメインにある3つの免疫優勢なB細胞エピトープの1つは、439から478までの配列にまたがる（[84]、図2を参照）。この配列の最後の5つのアミノ酸はYQAGSです。このサブシーケンスは、プリオンタンパク質の球状C末端ドメインの配列YQRGSと1つのアミノ酸のみが異なります。これは、mRNAワクチンに反応して生成されたIgG抗体がC末端ドメインに結合し、プリオンタンパク質がERに入るのを妨げ、細胞質からのクリアランスをもたらし、プリオン様疾患を誘発することを示唆しています。
興味深いことに、YQAGS配列に結合するSARS-CoV-2感染に反応して、回復期の患者によって中和抗体が生成されることが実験的に示されています。Wangらはこの特異的抗体を「XMA01」と呼び、オミクロンを含む複数の懸念される変異体に対するスパイクタンパク質のこの領域の安定性のために、モノクローナル抗体としての使用を促進した[85]。しかし、分子模倣により、これらのモノクローナル抗体による治療後、CJD様症候群のリスクがある可能性があります。
【PrPCとAPPとリン酸化経路とそれ以降の関係】
タンパク質凝集は、AD、パーキンソン病（PD）、ハンチントン病（HD）などの神経変性疾患でよく見られます。しかし、プリオンおよびプリオン様疾患のもう一つの共通の特徴は、疾患に関連するタンパク質の不適切なコンフォメーションアライメントです。プリオン病にはPrP、ADとHDにはそれぞれタウとβ-アミロイド、PDにはα-シヌクレイン。不適切なタンパク質コンフォメーションは、α-ヘリックスからβ-プリーツシートへの三次構造の変化であり、その後プロテアソーム分解経路に耐性のある凝集経路に有利に続く[49]。この点で、タンパク質のアミノ酸末端のわずかな変化でさえ、分解のためのN-デグロン認識シグナル伝達の変化を意味する[86]。
PrPCは極めて重要な細胞機能に関与しているが（表1）、PrPCからPrPSCへのコンフォメーション変換はプリオン病の進行の特徴であり、この変換の前提条件はPrPCの発現と存在である。内因性PrPCがない場合、プリオン病の発症に対する圧倒的な抵抗がある[87]。
一方では、通常のアイソフォームPrPC存在の役割は、例えばPrP mRNA発現の抑制が早期老化プロセスの発症につながる場合など、細胞を保護するようです[75]。一方、PrPCを発現しない組織はPrPSC毒性に耐性があります。凝集してフィブリルを形成するのは感染性PrPSCであり、これらのフィブリルのオリゴマーは感染性が高く、神経毒性があり、プリオンおよびプリオン様疾患の病因メカニズムを構成するのはリン酸化経路との関係である[15, 88-89]。さらに、タウタンパク質の分子内領域（タンデム繰り返し）は、野生型PrPのオクタペプチド繰り返しと強く相互作用し、PrPSCの変異型とより強く相互作用し、強く結合複合体を形成する[90]。これは、プリオン病とタウ関連神経変性を引き起こす共通の病原性メカニズムの文脈におけるPrPCとタウタンパク質の両方の潜在的な相互関与を強調しています。続くプリオン様伝播には、β-アミロイドタンパク質凝集も伴い、ADで遭遇するようにタウオパシーを誘発する[88-89, 91]。
重要なのは、先ほど説明した細胞経路によるPrPSC形成の加速は、タウタンパク質の生成と凝集を含むタウ関連病理の開始と進行を、肯定的なフィードバック方式で前進させることです。相互に関連する神経変性病因メカニズムの出来事が起こるのは、この文脈の中でです。さらに、リスクのあるヒト生物の神経組織へのミスフォールドされたPrPの進行と増殖は、神経病因疾患メカニズムの発症に先行し、PrPCの過剰発現がプリオンおよびプリオン様疾患の発症の主な要因であることを示唆している[88]。
【Wip1発現とp38 MAPK活性化の制御】
PrPSC感染性アイソフォームの形成は、p38 MAPK経路[15]を含む神経毒性イベントの分子カスケードを引き起こす。P38 MAPキナーゼは、ストレス信号、特にDNA損傷に反応し、成長停止、DNA修復、アポトーシスを誘発する核転写因子であるp53をリン酸化して活性化します[92-93]。オートファジー阻害は、アクティブな状態でp53の発現を維持し、アポトーシスへの経路を加速することができる[94]。野生型p53誘導ホスファターゼ1（Wip1）はセリン/スレオニンホスファターゼで、回復期にp38-p53シグナル伝達をダウンレギュレートすることにより、DNA損傷応答の解決に不可欠な役割を果たす[95]。Wip1は多くの腫瘍で過剰発現し[96-97]、筋萎縮性側索硬化症（ALS）などの神経変性疾患に関連してニューロンで低発現している[98]。
p38/MAPK応答を誘発するストレス因子は、p53の持続的なリン酸化をもたらし、細胞周期を停止するだけでなく、修復プロセスがあまりにも多くのDNA二本鎖断裂に圧倒されると、アポトーシスを誘発することもあります。いくつかの腫瘍抑制剤、特にp53を脱リン酸化することにより、Wip1はアポトーシスを抑制し、腫瘍形成、腫瘍の進行、浸潤、転移を促進する[96]。
腫瘍細胞は、突然変異率を加速するDNA損傷の存在下でも増殖にやや無謀であることが多いが、成熟したニューロンはストレス要因がなくても増殖しない細胞である。ニューロンではWip1のベースレベルが低いため、リン酸化状態が長期間維持されるため、p38/MAPKシグナル伝達後のアポトーシスに対してより脆弱です。
p53は神経細胞アポトーシスにおいて重要な役割を果たします。酸化ストレス、DNA損傷、代謝障害、カルシウム過負荷など、さまざまなストレス要因がニューロンのp53の合成を急速に増加させる可能性があります。[99]。p53のアップレギュレーションは、最終的に神経変性疾患の症状をもたらすニューロンのアポトーシスにつながり、p53を阻害する薬剤は神経変性疾患の効果的な治療法である可能性があります[99]。
Wip1の発現は、p38/MAPKの活性化から始まる複雑な規制プロセスによって制御されます。おそらく驚くべきことに、Wip1転写はリン酸化されたp53によってアップレギュレートされ、多くの腫瘍抑制遺伝子のアップレギュレーションと同時に、しかし、タンパク質への翻訳は遅れます。これは、miR-16もp53 [100]によって誘導され、このマイクロRNAは翻訳を抑制し、Wip1 RNAのクリアランスを促進するためです[97]。修復プロセスが進むにつれて、miR-16のレベルが低下し、Wip1は遅延期間の後にのみ機能し、その間にニューロンは損傷から回復するか、アポトーシスを受けます。ますます多くのニューロンが死ぬにつれて、認知障害と記憶障害の症状が現れ始めます[99]。
【リン酸化経路：Wip1の発現とp53の役割】
実験データは、p38 MAPK経路が感染性プリオンによる神経変性の発達の中心であることを強く示唆している。C Fang et al.、2018 [15]が実施した研究では、プリオンが神経シナプスに損傷を引き起こす細胞および分子メカニズムを区別する特定の神経培養システムを利用しました。著者らは、PrPSCによって引き起こされるシナプス毒性プロセスに関与しているキナーゼの異なる亜科のどれが関与しているかを判断するために、MAPKの3つの主要なファミリー、すなわちa）細胞外シグナル調節キナーゼ（ERKs）、b）ジュンアミノ末端キナーゼ（JNKs）、c）p38ストレス活性化プロテインキナーゼ（SAPKs）に対して特定の阻害剤を使用しました。著者らは、樹状突起スパイン毒性に関与する主なキナーゼは、p38 MAPKサブファミリー、特にp38αアイソフォームであると結論付けた。さらに、p38 MAPK阻害剤は、培養物に添加されてから24時間後、PrPSCによって引き起こされた最初のシナプス毒性効果を完全に逆転させることができました。さらに、著者らはまた、p38α MAPK（T180A/Y182F）、p38AFのヘテロ接合である海馬ニューロン細胞株を培養することによって、p38 MAPK活性化カスケードを抑制する遺伝的方法も使用しました。この優勢な負の変異細胞株は、p38α阻害剤の効果に匹敵する方法でPrPSCシナプス神経毒性から保護されました。関連する研究では、Thr180とTyr182の部位でのp38AFタンパク質の活性化部位の二重突然変異は、他のキナーゼによるp38分子のリン酸化を阻害します。また、この研究では、p38AF（+/-）対立遺伝子のヘテロ接合マウスは、a）p38関連シグナル伝達およびb）加齢細胞周期阻害剤の発現の著しい減少を示した[101]。
さらに、突然変異したp38AF動物は、他の臓器の中でも膵島の増殖と再生の増加を示した。全体として、この研究では、p38α AFの欠陥アイソフォームを発現するp38AF変異動物は、PrPSC（スパイン変性）によって引き起こされるシナプス毒性を緩和する耐性メカニズムを有し、それによって、樹状突起スパインの収縮につながる局所的なp38を介したシグナルカスケードのPrPSC活性化のメカニズムを迂回した[15,101]。重要なのは、p38AF、Wip1欠損マウスは細胞増殖能力の低下を示した。対照的に、Wip1の過剰発現を示した動物は、誘発された再生の細胞能力を保持していた。
p38AF変異動物の自然老化中に観察されたWip1不活性化は、p38 MAPK活性化の遺伝的に誘発された損失と並行して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質によるPrPSC伝播と非常に関連しています。以下で詳しく説明するように、スパイクタンパク質による神経毒性は、加齢に関連していると予測されることを示しています。p38AF変異動物で不活性化されたp38 MAPK経路は、Wip1活性に影響を与えなかった。したがって、これら2つの異なるが相互に関連するリン酸化経路は、老化のために同時に、しかし独立して不活性化されています[101]。
通常の状況下では、p38 MAPK経路は、骨髄分化一次応答（MyD88アダプタータンパク質）を介してTLR活性化の上流誘導によって活性化（リン酸化）され、TGFβ活性化キナーゼ1（TAK1）によって下流で活性化（リン酸化）され、自己リン酸化[34]によって活性化される[34]。さらに、MyD88誘導はTLR2とTLR4の両方の活性化（CD14受容体を介して）を含み、最終的な結果はNF-κB応答の促進である[102]。しかし、Il-1β、Il-6、TNF-αの炎症反応が提示されているのは、TLR4活性化とそれに続くリン酸化イベントのp38 MAPK経路のフォローアップを通じてです。SARS-CoV-2スパイクタンパク質によるIRAK4リン酸化の活性化は、TLR2とTLR4の両方の活性化によって誘発され、その後、ヒトマクロファージで同様のインターロイキンを介した炎症反応を引き起こすことが示されています[103]。さらに、NF-κBを生成するためのTLR2およびTLR4の活性化の同じパターンとインターロイキンを介した炎症反応は、負傷または損傷したミクログリアおよびアストロサイトでも発生しています[104]。
特に、TLR4受容体は、神経系の細胞におけるWip1ホスファターゼの上流調節因子として機能する[105-106]。アストロサイトでは、Wip1発現はNF-κB応答の活性化に応答して負のフィードバックループを提供します。簡単に言えば、TLR4活性化はLPS刺激一次アストロサイトにおけるWip1およびホスホ-NF-κB-p65発現の増加につながったが、Wip1の発現が不活性化されたときにp65の発現はさらに増加した[105]。ヒト単球におけるLPS誘発TLR4の活性化と同様に、SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、TLR4を活性化することによっても同等のインターロイキン（IL-1β）応答を誘発する[107]。スパイクタンパク質曝露後にTLR4を発現する分化した好中球細胞株で、IL-1βの同様の誘導が認められた。また、スパイクタンパク質は、特にTLR4発現により、さまざまなマウスマクロファージ細胞株でIL-1β応答を誘導することができました。
脳損傷の状態では、神経組織でのWip1の発現は、ミクログリアとマクロファージの蓄積を抑制することによって炎症を予防する[108]。マウスとヒトマクロファージでは、SARS-CoV-2スパイクタンパク質、特にトリマーのS1サブユニットは、特にTLR4活性化を介してNF-κBとc-Jun N-末端キナーゼ（JNK）経路を活性化する[14]。さらに、脳内の特殊なマクロファージタイプの細胞であるミクログリア細胞では、TLR4活性化による誘導スパイクタンパク質神経炎症には持続的なNF-κB活性化が含まれ、Wip1発現が弱いおよび/または遅延していることを示唆している[12]。JNKのROS依存性活性化により、p53はアポトーシスを強力に誘導し、これは腫瘍細胞の特徴であると考えられていますが、高リン酸化p53の文脈でニューロンがJNK活性化にさらされると心配になる可能性があります[109]。
したがって、Wip1発現のダウンレギュレーションは、好中球の移動を活性化し、感染時点での抗菌活性を高めることにより、敗血症からのより良い回復と正の相関関係がある[110]が、神経系におけるWip1発現の喪失は、制御されていない、p65依存性、NF-κBシグナル伝達の誘導による炎症の増加と密接に相関していると見なすことができる。その点で、p53活性の増加は、損傷したゲノムを持つ細胞の出現と持続を防ぐために、アポトーシスを促進する正常な機能と見なすことができます[111]。
【Wip1活動と発現の調節】
Wip1ホスファターゼは、DNA損傷修復プロセスを調節する重要なタンパク質です。DNA損傷修復後、細胞の恒常性メカニズムは、p53、p38 MAPK、運動失調症突然変異（ATM）、およびその他のストレス誘発タンパク質を脱リン酸化し不活性化することによって、細胞周期停止から細胞を解放するためにWip1活性を必要とします（Wip1標的のレビューについては、Jを参照してください。Lowe et al., 2013) [112].p53が細胞周期停止を誘発しなくなると、細胞は元の非リン酸化状態に戻ることができます。
PPM1D/Wip1遺伝子はもともとp53誘導遺伝子として発見されました。しかし、その後、その発現はp53以外の他の多くのストレス誘発転写因子にも依存していることがわかっています。主に、その生成物であるWip1は、ヒストン2HX-γ（H2AX-γ）およびp53調節（阻害剤）分子の脱リン酸化、したがって不活性化を含む多くのDNA修復因子の活性に負のフィードバックループを提供します[95、113]。
さらに、Wip1の過剰発現は、p65のセリン536のTNF-α誘導リン酸化を減少させ、p300との結合を減少させることによって、NF-κB応答を負に調節する。NF-κBの阻害とクロマチンリモデリングに対するWip1活性の影響は、p38 MAPK経路活性化とは無関係である[114]。特に、一次アストロサイトでNF-κB活性が阻害されると、Wip1発現が減少し、PPM1D遺伝子に対するNF-κBの正の調節を示し、さらに、Wip1とNF-κB阻害による神経炎症調節を示す[105]。
Wip1発現は好中球活性化中に減少し、その3'未翻訳領域を標的とするマイクロRNA-16発現の増加によって直接阻害され、転写後のWip1翻訳を調節します。最後に、TLR4配位子（リガンド）と炎症性サイトカインの活性化は、p38 MAPKとNF-κBによるマイクロRNA-16の活性化を介してWip1発現をダウンレギュレートします[97、115]。
【ヒトプリオンタンパク質とβ-アミロイド遺伝子の調節】
人間の20番染色体にあるPRNP遺伝子は、中枢神経系や他のいくつかの組織でPrPCをコードする[50]。これは高度に保存されたハウスキーピング遺伝子であり、プロモーターで機能する多くの転写因子の影響を受け、したがってその発現を調節します。他の多くの中で、活性化タンパク質1（AP-1）、SP1、SP2（転写因子のSP/KLFファミリーのメンバー）による転写活性化のための推定配列がPRNPプロモーターとして特定されています。
重要なのは、短いGCが豊富な領域がPRNP遺伝子プロモーターの上流にあることです。これらのGCが豊富な領域は、p53による好ましい結合の対象となるため、G-四重体（G4）構造を形成する可能性があるため、遺伝子疾患関連の発現を調節する可能性があります。G4sを形成するGC領域へのp53の結合は、疾患に関連する一連の細胞効果を開始することが示されている[116-117]。さらに、PRNPプロモーター領域はp53の結合配列と一致する配列を宿していることが示されています。p53は疑わしい配列に直接結合し、強力なPrPC転写活性化因子およびmRNA発現のエンハンサーとして機能します[118]。要約すると、p53はPrPCの発現を増加させる。
RNA翻訳調節は、PrPCから感染性PrPSCへの変換の重要な要因と考えられています。DNAを超えて、PrPCのメッセンジャーRNAには、G4結合リガンドの影響を受けやすいG4を形成する5つの自然に存在する連続した領域が含まれていることが示されています[119]。この点で、p53は、G4sの折り畳みを促進し、したがってその構造を安定させることができるRNAシャペロンと見なすことができます[120]。5'-未翻訳のmRNA領域のG4sは、複数の神経変性疾患に見られ、翻訳を阻害し、キャップに依存しない翻訳を開始することが示されている[121]。
ヒトのAPPをコードするアミロイド前駆体タンパク質（APP）遺伝子は、21番染色体にあります。プロモーター配列を見ると、PRNP遺伝子のようなハウスキーピング遺伝子として指定できます。APPは、他の多くの中で、AP-1やSp1などのPRNPといくつかの重要なプロモーターシーケンスを共有していますが、PRNPプロモーターのシーケンスとは異なります。これは、両方の遺伝子が共通の転写因子の活性によって部分的にトランスアクティブ化できることを示唆している[122]。
APP mRNAは、神経系での活発な発現に加えて、筋肉、免疫系、胸腺、膵臓、腎臓、肺などの多くの臓器を含むさまざまな組織で発現します。しかし、APPの異なる変種は、その発現において細胞型特異的である[123]。
APPの変異体には、APP様タンパク質-1（21番染色体に位置するAPPL1遺伝子）とAPPL2（染色体11に位置するAPPL2遺伝子）が含まれ、どちらも構造とトポロジーが類似した1型膜貫通タンパク質です。しかし、APP自体だけがAβ配列を含んでいます。Aβ（40-42アミノ酸）の線維型は、ADおよびダウン症候群に苦しむ患者の脳におけるプラークの主要な供給源であり、APPタンパク質分解のみに由来します。ヒトAPPの全長は、主にα、β、γ-セクレターゼを介してタンパク質分解を維持します。Aβの派生アミノ酸配列は、β-サイトAPP切断酵素1（BACE-1）またはβ-セクレターゼ切断から、APPsβおよびAPPのAPPCTFβ（βAPP）断片を生成する。その後、βAPP上のγ-セクレターゼの切断は、最終的にAβおよびAPP細胞内ドメイン（AIDC）断片を生成する（詳細は[124]を参照）。さらに、AIDCフラグメントはα-セクレターゼとそれに続くγ-セクレターゼ活性によっても生成されます。
γ-セクレターゼは、プレセニリン依存性γ-セクレターゼとも呼ばれ、プレセニリン（PS）の膜貫通タンパク質を触媒サブユニット（PS1またはPS2）に含む[125]。この点で、AIDCのγ-セクレターゼ/プレセニリン依存性生成は、p53の転写活性化因子として機能し、p53活性を増加させ、p53関連細胞死を引き起こすことが確立されています。さらに、転写因子Sp1の突然変異は、in vitroおよび家族性アルツハイマー病（FAD）に罹患した患者の脳内でのp53活性を増加させる[118]。Sp1の突然変異は、FADの原因となる要因と考えられています。
腫瘍抑制剤p53は、Fe65およびTip60補因子に結合したAIDCによるTP53遺伝子のγ-セクレターゼ/プレセニリン依存性転写活性化によって一旦生成され、PrPCのプロモーターに作用し、PrPC mRNAの発現を誘導します。p53、γ-セクレターゼ/プレセニリン依存性のPrPC発現のトランス活性化（転写促進）は、p53欠乏環境で消失する。したがって、最終的にPS（PS1またはPS2）は、AIDCを生成する能力を通じてPrPC発現に速度制限制御を発揮します。最後に、βAPPの過剰発現はPrPC発現を増加させるのに対し、βAPPの枯渇はin vitroおよびin vivo実験の両方でPrPC発現を低下させ、PrPC発現に対するBACE-1活性の制御の役割も示しています[117]。したがって、アミロイド生成物を生成するAPPの代謝は、PrPCの生成の増加も誘発します。
【神経変性に関連するオートファジーとプロテアソーム分解の微細なバランス】
神経変性疾患の共通の特徴は、タンパク質恒常性の深刻な障害です。オートファジー/リソソーム分解によるミスフォールドされたタンパク質のクリアランス障害は、細胞質内に蓄積する結果をもたらす[126]。
p53は、マクロオートファジー（以下、オートファジー）で多機能な役割を果たしています。これは、細胞が細胞の再生を抑制し、その成分を細胞内で消費/リサイクルして、飢餓中に恒常性と生存を維持する状態です。オートファジーとp53は相互機能相互作用を示します。p53はオートファジーのプロセスで負のフィードバックループ内で動作します。p53の活性が増加すると、オートファジーは細胞内で活性化されます。オートファジーの増加により、負のフィードバックはp53 [127]の活性を抑制します。オートファジー活性化中、バルボサらが詳細に説明しているように、細胞内成分はマクロオートファジー経路とミクロオートファジー経路の両方を介してさらに分解するためにリソソームに届けられます。[128]。
ミスフォールドされたタンパク質の分解は、ユビキチン-プロテアソームシステム（UPS）とマクロオートファジー（単に「オートファジー」とも呼ばれます）という2つの相互に関連する経路によって管理されます。ユビキチン結合タンパク質p62としても知られるセケストソーム-1は、両方の経路で重要な役割を果たします。 p62は、オートファジーのためにユビキチン化された貨物を捕獲し、提示します[129]。p62レベルの低下は、多くの神経変性疾患に関連しています[130]。p62プロモーターへの酸化的損傷は、p62プロモーターの活性を低下させ、p62の発現を低下させ、したがってオートファジーを損なう。そのプロモーターは、特に酸化的損傷の影響を受けやすいグアニンが特に豊富です[130]。プロテアソーム分解の阻害は、p53やβ-カテニンなどの基質のクリアリング障害をもたらし、細胞モデルにおけるそれらのレベルが2倍に増加する。これらの同じ上昇レベルは、オートファジーが阻害されていない場合でも、UPSがブロックされているときに到達します。
p53などの多くのUPS基質は毒性を媒介するため、オートファジーによるそのような調節タンパク質の除去障害は、プリオン病の場合のように、凝集しやすいタンパク質の細胞内増加のみによる多くの重篤な疾患状態の前提条件として認識されています[94]。さらに、オートファジーメカニズムの活性化は加齢とともに低下し、オートファジー阻害による神経変性疾患に対する感受性の追加パラメータを構成する[128]。
プリオン病の発生に関して、特定のin vitroおよびin vivoモデルは、p38 MAPKの遺伝子発現の減少がリソソーム分解によるBACE-1のクリアランスを促進することを示した。これにより、BACE-1の細胞内レベルと活性が低下し、最終的にはマウスの脳のAβレベルが低下し、オートファジーメカニズムの強化に関連しました。したがって、ニューロンにおけるp38 MAPKのノックダウンは、マクロオートファジーを促進することによってAβ生成を減少させ、Aβ負荷を減少させる。さらに、別の実験で、著者はヒト細胞をオートファジー阻害剤で治療し、BACE-1タンパク質レベルを増加させ、p38-MAPKノックダウンによるBACE-1タンパク質の減少さえも無効にしました。これらの知見は、p38 MAPKの活性化とオートファジー阻害がプリオン病の進行に不可欠であることを示している[131]。
SARS-CoV-2スパイクタンパク質がプリオン病の毒性因子であることに関して、感染性プリオンがp38 MAPKシグナル応答を活性化することが示されているため、これらの発見は非常に重要です。同様に、用量依存的に、スパイクタンパク質のS1サブユニットは、a）p38 MAPKタンパク質レベルを増加させる、b）リン酸化p38レベルを増加させる、c）とりわけ、炎症性サイトカインIL-6およびTNF-αを増加させる、d）TLR2/4タンパク質レベルを増加させ、したがってシグナル伝達、e）S1誘発BV2ミクログリアの確立された神経炎症に対する転写制御を提供するNF-κBタンパク質活性と結合を増加させることが示されている[12、15]。
【SARS-CoV-2スパイクタンパク質はDUSPを抑制し、神経変性をさらに誘導する】
Wip1に加えて、二重特異性ホスファターゼ[DUSP]は、多数のタンパク質のセリン、スレオニン、およびチロシン残基を脱リン酸することができるタンパク質ホスファターゼの大規模な異種グループです。脱リン酸化するタンパク質の多くはMAPKカスケードの一部であるため、MAPKの活性化をオフにして炎症反応を解決するのに効果的である[132]。
DUSP遺伝子、特にDUSP1タンパク質はp38 MAPKシグナル伝達の負の調節因子であるため、TLR4シグナル伝達下でのそれらの減少は、p38 MAPKとc-Jun NH2末端キナーゼ（JNK）経路の両方の活性化を維持する[106、133-134]。
見てきたように、いくつかの学際的な研究は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質[12-13、38-39、107]によるTLR2/4シグナル伝達の活性化の証拠を提供しています。特に神経細胞では、スパイクタンパク質のS1サブユニットは、TLR4パターン認識受容体の発現と活性化のアップレギュレーションを通じてp38 MAPKとNF-κBを活性化する[12]。さらに、ヒトマクロファージのスパイクタンパク質への曝露は、IRAK4とそれに続くp38 MAPKおよびJNK経路のリン酸化を活性化し、その結果、オートファジーの抑制をもたらす[103]。
特に、SARS-CoV-2感染とその後の膜貫通プロテアーゼ/セリンサブファミリー2（TMPRSS2）/p38 MAPK経路によるスパイクタンパク質の切断は、DUSP1とDUSP5の転写活性化を低下させることにより、MAPKリン酸化とNF-κBシグナル伝達を活性化します[135]。これは、他のすべてのコロナウイルスと比較して、SARS-CoV-2のユニークな特性です。さらに、p53はmiR-16 [100]の転写後成熟を促進することが示されており、私たちが見たように、miR-16はWip1の発現をダウンレギュレートすることが示されている[97]。
したがって、p53、p38 MAPK、およびATMに対するWip1およびDUSP阻害活性は、スパイクタンパク質の存在下でともに減衰します。その結果、炎症性サイトカインの持続的な産生があり、細胞老化とアポトーシスへの傾向が増加します[112]。β-アミロイド（Aβ）産生は、さまざまな細胞タイプと多くの臓器で発生します[124、136]。しかし、Aβ/AICD産生とPrPC発現を同時に調整する細胞、すなわちニューロンでは、スパイクタンパク質によるホスファターゼ経路の障害は有害な影響を及ぼし、細胞神経毒性に重大な影響を及ぼします[137-138]。
Wip1およびDUSP脱リン酸化活性の抑制による過剰なリン酸化p53は、プリオンタンパク質プロモーターの転写活性化剤として機能し、過剰なPrPCを生成し、プリオン病の発生のための環境を作り出します。プレセニリン依存性γ-セクレターゼは、AICDとAβの産生を通じてその発現を高めることによってp53と連携して働くため、このシステムにおけるスパイクタンパク質誘発神経毒性の前提条件を悪化させます。さらに、リン酸化されたc-Junによる転写因子AP-1の発現の増加は、さらなる転写活性化のためにAPPとPRNPのプロモーターを誘発する[118, 136]。
選択的プロモーター因子1（SP1）など、APPとPRNPの両方のプロモーターにある一般的な転写因子の活性化は、AD脳の炎症反応中に起こります。他の多くの重要な役割の中で、AP-1はBACE-1の転写を調節し、タウタンパク質はその後神経毒性の発生を促進する[139-141]。この状態は、「SARS-CoV-2スパイク糖タンパク質によって誘発されたプリオンおよびプリオン様疾患のWip1およびDUSP欠乏-p53媒介誘導」と説明でき、図1に示されています。
図1。SARS-CoV-2スパイクタンパク質によって誘発されるリン酸化経路は、プリオン病につながる。
スパイクタンパク質はTLR4シグナル伝達を活性化してp38 MAPKとNF-κBを誘導する。さらに、スパイクタンパク質はIRAK4シグナル伝達を刺激してp38 MAPK、NF-κB、サイトカインストームを誘発し、DUSPとWip1を阻害し、持続的なp53発現を引き起こします。JNK-microRNA-16活性化によって引き起こされるWip1欠乏症は、p53不活性化の減少につながり、したがって、ヒトPrPプロモーターの転写活性化につながります。これは、PrPCの蓄積の増加と、p38/CREBによるIL-6およびTNF-αサイトカインの誘導、およびp65/NF-κBの活性化につながります。PrPCの蓄積は、PrPSCのコンフォメーション変化の素因であり、したがってプリオンおよびプリオン様疾患の素因です。PrPSCが一度形成されると、p38 MAPKの活性化がさらに強化されます。適応：参照。[1, 12,15, 38, 103, 105-107, 115, 118, 133, 142]。
【SARS-CoV-2スパイクタンパク質誘発神経毒性と年齢とオートファジーの阻害との関係】
年齢とオートファジーの細胞能力の低下との関係は、オートファジー阻害中のp53の蓄積と相まって、図1に示すスパイクタンパク質誘発神経毒性の提案されたモデルを構成します。このモデルでは、病因は、a）オートファジー障害につながる老化、およびb）分解のためのUPSシステムの阻害によるp53蓄積によって増強される[127-128]。
オートファジー阻害とp38 MAPK活性化の下で、有害なカスケードの出来事が続いて起こります。Wip1の不活性化、したがって、BACE-1活性化と同時にp53脱リン酸化の阻害は、TP53遺伝子のAIDC陽性調節とPRNP遺伝子のp53依存転写活性化を促進します。これらのイベントは、プリオンタンパク質の凝集とそれに続く病理につながる細胞イベントのカスケードの段階を設定します。
DUSP1またはWip1による脱リン酸化によるp53の放出は、ニューロンをプリオンおよびタンパク質折り畳み疾患の発症に駆り立て、それによってSARS-CoV-2スパイクタンパク質が神経毒性を生み出し、曝露された個人を神経変性の素因となる上で中心的な役割を果たすことができる細胞状況を確立します。しかし、このプロセスは年齢に依存しており、オートファジーを誘発する細胞能力に関連しています。PrPCとPrPSCの形成の明確な関係はまだ確立されていませんが、感染性プリオンの生成はp38 MAPK経路の誘導と明らかに関連しており、これもいくつかの方法でJNKと組み合わせてスパイクタンパク質によって誘導されます。
図2は、自然感染またはSPをコードする合成mRNAから派生したSARS-CoV-2スパイクタンパク質の潜在的なメカニズムを示しており、プリオンおよびプリオン様疾患を誘発します。スパイクタンパク質誘発神経毒性メカニズムは、a）スパイクタンパク質レシピエントの年齢とb）マクロオートファジーによるプリオン病の抑制の障害に依存する[1、15、112、131、103]。
図2。SARS-CoV-2スパイクタンパク質の神経毒性は、年齢とオートファジーの阻害に依存しています。
オートファジーを誘導する能力は年齢に依存する。オートファジーは、酸化ストレスによって引き起こされるセキュストソームp62プロモーターへのDNA損傷によって部分的に阻害されます。神経細胞内のスパイクタンパク質によるp38 MAPKおよびJNK経路の活性化は、BACE-1活性化につながり、JNKを介したWip1不活性化により、活性化（リン酸化）p53を増加させます。APP代謝によるAIDCの放出は、TP53転写活性化をさらに高め、したがってp53発現を促進する。遊離P53は、ATMによってさらにリン酸化することができます（JNK依存性マイクロRNA-16 Wip1阻害によって活性化されます）。全体的なプロセスは、PrPCのレベルと発現の蓄積につながります。PrPCからPrPSCへのコンフォメーション変化は、p38 MAPKの活性化を誘発し、年齢依存性プロセス全体を構成します。適応：参照。[12、15、94、112、115、118、127-128、131、133、143]。
【結論】
この記事では、観察された毒性のメカニズムを報告するいくつかの最近の論文の文脈で、神経変性疾患の発症につながるスパイクタンパク質関連プロセスに関する研究文献をレビューしました。私たちは当初、COVID-19患者が認知障害を含む長期的な後遺症に苦しむことが多いという観察によって動機づけられました。いわゆるlong-haul COVID疾患です。また、long COVIDに強く似たワクチン接種後症候群もあります。
プリオンおよびプリオン様疾患の促進の中心は、APP配列のγ-セクレターゼ代謝の誘導であり、BACE-1を介して、TP53遺伝子の非常に強力な転写活性化因子であるAIDC配列を生成します。この病気にかかりやすい代謝状態は、ニューロンのp38 MAPK活性化によって誘発されます。したがって、SARS-CoV-2スパイクタンパク質は、p38 MAPKとJNKの両方の活性化を誘発し、その後活性化されたp53の余剰を提供するため、補強毒性因子になる可能性があります。p53の活性化は、JNK-p53誘発miR-16発現による同時Wip1不活性化によってさらに強制される可能性がある。p62プロモーターへの酸化的損傷によるUPSおよびオートファジーによるp53の分解の減少は、神経細胞アポトーシスの誘導のリスクをさらに高めます。分子模倣によるニューロンへの自己免疫攻撃は、おそらく寄与する役割を果たします。
私たちは、オートファジーにおける加齢に伴う障害は、スパイクタンパク質がプリオン様タンパク質として振る舞う能力に関連する認知問題のリスクの増加になり、PrPや他のアミロイド原性タンパク質のミスフォールディングを引き起こす可能性があると提案します。スパイクタンパク質は、酸化ストレスとDNA損傷につながる可能性のあるミクログリアの炎症反応を誘発することが示されています。TLR4受容体を介したMAPK活性化とJNK活性化により、スパイクタンパク質は、MAPKを介したp53活性化後に通常細胞恒常性を回復する重要なホスファターゼを抑制することが予想できます。ニューロンの持続的なp53リン酸化は、PrPCからPrPSCへの変換を誘導することができる。ミスフォールドされたPrPを原線維に沈殿させると、機能喪失の病理が引き起こされ、その後の壊滅的なオートファジー障害は、最終的にプログラムされた細胞死（アポトーシス）と結果として神経症状と老化の加速につながります。
COVID-19ワクチンの継続的な普及を考えると、私たちの仕事は公共政策に重要な意味を持っています。スパイクタンパク質が将来の神経変性疾患に寄与する可能性がある場合、大量無差別ワクチン接種のリスクベネフィット計算を再検討する必要があります。ここで提示された議論が真実であることが判明した場合、ワクチン接種を受けた人口はすでに多くの被害を受けています。
注：この記事の以前のバージョンは、2022年11月16日にAuthoreaプレプリントサーバーに投稿されました。