3つの年齢層における包括的な腸内細菌叢組成と微生物間相互作用
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研究論文
3つの年齢層における包括的な腸内細菌叢組成と微生物間相互作用
Jun Ma, Xiaohua Yang, Jianwu He
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研究論文
3つの年齢層における包括的な腸内細菌叢組成と微生物間相互作用
Jun Ma, Xiaohua Yang, Jianwu He
Abstract
交絡因子の影響を最小限に抑えつつ、複数の長寿研究を統合して加齢に関連する微生物叢を研究することへの関心が高まっている。ここでは、4つの異なる加齢研究のメタゲノムシーケンスデータを再処理し、バッチ効果を最小化するために潜在的な交絡因子を評価した。その後、3つの異なる年齢コホートにおける腸内細菌叢の多様性と存在量を検出した。1053種の細菌のうち、異なる年齢群間で実質的な減少を示したのは4種のみであった： Ligilactobacillus ruminis、Turicibacter sp. H121、Blautia massiliensis、Anaerostipes hadrusである。古細菌は、高齢者や百寿者に比べて若年者に多く蓄積していた。カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）は百寿者に多くみられたが、ナカセオマイセス・グラブラタス（Nakaseomyces glabratus）（別名カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata））は高齢者に多かった。シュイムウイルスIME207は、両対照群と比較して百寿者で有意な増加を示した。さらに、フィッシャーの正確検定を利用して、各年齢層の共起ネットワークにおいて、異なる豊富な微生物群の位相幾何学的特性を調査した。異なる年齢段階に特異的な微生物シグネチャーは、条件に基づいて同定された：差異のある存在量を示すリードは、他の年齢グループと比較して高かった。最後に、Y群にはMethanosarcina sp.Kolkseeを、E群にはPrevotella copriを、C群にはShuimuvirus IME207を、加齢に関連する特性の代表として選択し、加齢過程でこれらの相互作用がどのように変化するかを研究した。この結果は、加齢プロセスに関連した腸内細菌叢の生態学的ダイナミクスについて、重要な洞察を与えるものである。
引用 Ma J, Yang X, He J (2024) Comprehensive gut microbiota composition and microbial interactions among the three age groups. PLoS ONE 19(10): e0305583. doi:10.1371/journal.pone.0305583
Editor： Vinod Kumar Yata, Jawaharlal Nehru Technological University Hyderabad, INDIA
Received： 2024年3月20日受理： 受理：2024年3月20日; 受理：2024年6月2日; 掲載：2024年10月18日 Copyright: ©2024
Ma et al. 本論文は、クリエイティブ・コモンズ 表示ライセンスの条件の下で配布されるオープンアクセス論文であり、原著者および出典のクレジットを条件として、いかなる媒体においても無制限の使用、配布、複製を許可する。
データの利用可能性 我々はデータセットをFigshareにアップロードしており、DOIはhttps://doi.org/10.6084/m9.figshare.26039227.v1。メタゲノムシーケンスデータを処理し、図を生成するためのソースコードはhttps://github.com/mj200921059/longevity_microbes、自由に利用できる。
資金提供 陝西省自然科学基礎研究プログラム（2021JQ-543、2022JM-563）、陝西科学技術大学科学研究基金（2019BT-35）、中国博士研究基金（2020M673605XB）から資金援助を受けた。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と解析、発表の決定、原稿の作成には関与していない。
競合利益： 著者らは、競合する利益は存在しないと宣言している。
はじめに
百寿者は加齢に関連した病気や感染症のリスクが低い [1] 。長寿に関連する遺伝学的要因や環境的要因などの複合的な要因についてはよくわかっていない [2] 。腸内細菌叢は、病気と健康の関係において重要な役割を担っていることが明らかになっている。例えば、我々の以前の研究では、高齢者グループの腸内細菌叢において抗生物質耐性遺伝子が増加していることが示された[3]。近年、長寿微生物叢解析のためのメタゲノムデータは、少なくとも次の3つの側面に応用されている：細菌プロファイルと機能解析[4-6]、微生物叢全体と機能解析[2, 7-10]、分類学的王国グループでの組成と機能の比較[1, 11]。しかし、大半の研究は、ある特定の地理的地域における加齢過程における微生物領域内のつながりを調べることに主眼を置いている。
バッチ効果とは、技術的要因や交絡する生物学的変数によって生じるばらつきのリストであり、複数の大規模研究のメタゲノムデータセットを統合することで、偽陽性の知見をもたらし、包括的解析の真のシグナルを妨げる可能性がある。一方では、メタゲノム研究で使用されるサンプルあたりの配列深度などの手順は、依然として大きく異なっている[12]。大規模研究のライブラリーサイズの範囲は研究によって大きく異なることが多く、サンプル間で同じ微生物のリードの割り当てに影響を与える可能性がある。一方、細菌と真菌、古細菌、ウイルスなどの他の微生物叢からなる腸内細菌叢の組成は、食物、場所、健康、病気など多くの要因によって頻繁に変化する[13]。
腸内細菌叢コミュニティでは、通常、微生物同士が相互作用し、強く関連した生態系ネットワークを形成している [14] 。発生ネットワークは、微生物の相互作用の特徴を探るために、生態学的研究分野で広く利用されている[15, 16]。Jingらは、分子生態ネットワーク（MEN）が潜在的な微生物相互作用や環境ストレスの影響を探り、微生物群集構造の側面を説明するために利用できると指摘している[17]。しかし、いくつかの研究グループは、マイクロバイオーム間の相互作用を考慮することなく、加齢過程におけるマイクロバイオーム組成の変化を調査し、百寿者に関連する微生物シグネチャーを同定している[7, 8, 18]。本研究では、過去に発表された腸内メタゲノムを再解析し、3つの年齢層における微生物群集のすべての加齢関連メンバーとそれらの相互作用の移り変わりを調査した。
材料と方法
倫理承認と参加同意
これらのシーケンスデータセットは公開データベースからダウンロードした。データベースの対象者は倫理的承認を得ている。ユーザーは研究のために関連データを無料でダウンロードし、関連論文を発表することができる。本研究はオープンソースデータに基づいているため、倫理的問題やその他の利益相反はない。
バッチ効果除去
4つの研究のメタゲノムシークエンシングデータを統合するために、バッチ効果除去を行い、クラスカル・ワリス検定に基づいて研究間のα多様性に統計的な差異を誘発するサンプルを除外し、270人の百寿者（C群、女性228人、男性42人、90～109歳）、177人の高齢者（R群、女性91人、男性86人、62～89歳）、99人の若年成人（W群、女性43人、男性56人、21～62歳）を残した。公開コホートについては、sampleID、年齢、国、性別、run_ID、sequencing_platform、PMID、numbers_readsなどのメタデータテーブルを手作業で作成した。シーケンシングデータのダウンロード コホートに関する詳細は補足S1 Tableを参照。
Cutadapt、Trimmomatic、Komplexityによるアダプター、低品質、低複雑性配列の除去を含む。また、Sunbeamに実装されているbwaを用いて、ヒト-ホストアラインメントリードを除去した。初期品質管理後、残ったリードをkraken2 v2.1.2 (-minimum-hit-groups 3)とbracken v2.7を用いて分類した。各生物種のリード数は、サンプルあたりの割り当てリード総数に対するパーセンテージに正規化した。バッチ効果の除去は、最近開発されたRパッケージConQuR v2.0を用いて行った。ConQuR v2.0は、マイクロバイオーム関連解析のための実際の情報を保持しながら、複合ノンパラメトリックモデル補正によってバッチ効果を除去することができる[26]。PERMANOVA[20]R2を用いて、バッチおよび条件因子によって誘発されるマイクロバイオームデータの変動性を評価した。
統計解析
すべての統計解析はRソフトウェア（v 4.2.1）を用いて行った。グループ間の分類群のαおよびβ多様性分析は、Rパッケージvegan (v 2.6-4)を用いて計算し、ggplot2 (v 3.4.2)およびggpubr (v 0.6.0)を用いて可視化した。2群間のα多様性指標の差の評価には、ノンパラメトリックのKruskal-Wallis検定、次いで両側Wilcoxonの順位和検定を用い、P値＜0.05を有意差とみなして複数群の差を検討した。各マイクロバイオームカテゴリーの出力データは、さらに多変量統計フレームワークであるMaasLin2関数（線形モデルによる多変量関連）を用いて解析し、デフォルト設定（総和スケーリング、対数変換、LM）で微生物の存在量の有意差を同定した。P値は偽発見率（FDR）を用いて多重検定のために調整した。調整後のp値が0.25未満のグループ間の微生物は、加齢に関連したDAMとみなされた。微生物の共起ネットワークを、分類学的存在量に基づくピアソンの相関（PEA）を用いて構築した。ペアワイズPEAマトリックスは、RパッケージHmisc v 5.1-0のrcorr関数を用いて計算した。ネットワークの頑健性相関を確保するため、有意な相関（P < 0.05; |r| > 0.3）のみをネットワーク構築に保持した。ネットワークのトポロジー分析にはigraph v 1.4.3パッケージのcluster_walktrap関数を使用し、密接に関連するノードをグループ化することができる。クラスターのノードと加齢関連DAMの組み合わせを背景として、クラスターのノードにおける加齢関連DAMの過剰発現解析をRパッケージpiano v.1.12.0のrunGSAhyper関数で行った。加齢関連DAMが有意に濃縮されたクラスターは加齢関連クラスターとして同定され、igraphを用いて可視化された。
結果
コホートの概要
シークエンシング技術の発展により、数百から数千人を含む大規模で高解像度のヒトマイクロバイオームプロファイル研究が可能になった。我々は、サルデーニャ（イタリア）[8]、四川（中国）[10, 21]、日本[9]、エミリア・ロマーニャ地方（イタリア）[7]の成人参加者546人（年齢範囲：21～109歳）の合計140TBのfastqデータ（1サンプルあたり約1640万リード）を収集し、そのうち362人が女性であった（表1）。Wuらの研究では、イタリアのサルデーニャ島から19人の長寿者（99歳以上）、23人の高齢者（68～88歳）、17人の若者（21～33歳）を集め、メタゲノムシーケンスのデータはPRJEB25514からダウンロードできる。Zhangら. Zhangらの研究では、四川省（中国）に住む合計95人の中国人を対象とし、健康な長寿者28人（91～103歳）、不健康な長寿者9人（90～93歳）、高齢者31人（67～75歳）、若年者27人（24～48歳）の4群に分け、腸内細菌叢メタゲノムシーケンスをIllumina NovaSeq 6000プラットフォームとPE150を用いて実施した。日本人コホートは、長寿者176人（100歳以上）、高齢者110人（85～89歳）、若年者44人（21～55歳）の糞便サンプルで構成され、腸内メタゲノムシーケンスはPE150を搭載したIllumina NovaSeq 6000プラットフォームで実施された。Rampelliらの研究では、イタリアのエミリア・ロマーニャ地方に住む22～109歳、平均年齢85歳の被験者を対象とし、38人の長寿者（99歳以上）、13人の高齢者（65～75歳）、11人の若年者（22～48歳）に分け、腸内細菌叢メタゲノムシーケンスをIllumina NextSeq PE150プラットフォームで行い、シーケンスデータはPRJNA553191からダウンロードできる。
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表1. doi:10.1371/journal.pone.0305583.t001
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バッチ効果の除去
研究間のシーケンスデータは、ハンドリングや処理アプローチの違いによって頻繁に生成され、多くの研究内データには、時間や場所をまたいで収集され、異なるランで実行されたサンプルが含まれる。このようなバッチ効果は、メタアナリシスにとって重大な問題を引き起こし、誤解を招く結果につながる可能性がある。日本からの長寿者の具体的な年齢が不明であるため、合計546人を3群に分けた：W群（年齢＜62）、R群（62≦年齢＜89）、C群（年齢≧89）（図1A）。S1 Tableのメタデータによると、バッチ効果を減らすために、年齢群、性別、生カウントを交絡因子として選んだ。コホート内では、各サンプルに接続された分類学的リード数と生カウント数の分布にばらつきが見られたが（図1B）、各コホート、特に日本のコホートでは、分類学的リード数と生カウント数の関連はピアソン相関値に基づいて正の相関が見られた（S1図）。ConQuR処理を行った結果、バッチ間のデータのばらつきは、平均値（セントロイド）と分散値（楕円の大きさ）により大きく減少することが確認された（図1Cおよび1D）。具体的には、正規化されたタクサリードのスケール（Bray-Curtis非類似度による）では、4つのバッチの平均は同じ点を中心とし、バッチ間の分散も同様であった（図1Eおよび1F）。しかし、図1Gは、補正された分類群の読み取り値を正規化しても、バッチの影響がそれ以上小さくならないことを示している。興味深いことに、生のカウントを含む条件（性別、年齢グループ）、または含まない条件（性別、年齢グループ）では、バッチ効果を修正することはできません。生カウントを含む条件をマージした結果は、元の条件と同じです。バッチと年齢条件によって説明される分類群の多様性は、PERMANOVA R2を用いたConQuRによって測定された。表2が示すように、正規化された分類群データの補正は、バッチに関連する変動を大幅に減少させ、分類学的リードと比較して条件の特徴を保持した。
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図1. バッチ効果の除去。
左側が女性、右側が男性。B. 各データセットにおける、割り当てられたリードと配列決定されたリードの数の分布。C. D. EおよびF. 分類群リード、補正された分類群リード、正規化された分類群リード、正規化後の補正された分類群リードのBray-Curtis非類似度に従ってバッチIDごとにクラスタ化したPCoAプロット。G. タクサリードを補正した正規化データのBray-Curtis非類似度に基づいてバッチIDごとにクラスタ化したPCoAプロット。各点はサンプル、各楕円はバッチを表し、重心は平均を示す。楕円は各バッチの点の95%パーセンタイルを結ぶので、楕円の大きさは分散を示し、角度はバッチの高次の特徴を示す。doi:10.1371/journal.pone.0305583.g001
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表2. 各コホートの臨床的特徴。
doi:10.1371/journal.pone.0305583.t002
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ConQuRアプローチによる分類効果を調べるために、リードカウント調整前と調整後の3つの年齢グループ内で同定された微生物の数を比較した。バッチ効果除去後、年齢グループ間の微生物数は全体的に減少した（S2A Fig）。S2B, S2C図から、ConQuR法は各年齢群におけるバクテリア、真菌類古細菌、ウイルスの割合にほとんど影響を与えないことがわかる。これらの結果は、複数の研究グループから作成されたメタゲノムデータが、バッチ効果除去後のメタ解析に含めることができることを示している。
4つのバッチにおけるマイクロバイオームコミュニティのα・β多様性解析
腸内微生物コミュニティにおけるバッチ効果の除去をさらに確認するため、細菌、真核生物、古細菌、ウイルスのα・β多様性を場所ごとに比較した。サンプルの微生物組成のβ多様性は、バッチに応じて測定された。CLR変換したマイクロバイオーム種プロファイルのBray-Curtis距離の主座標分析をプロットし、種レベルでの微生物相組成プロファイルの関連性を可視化した（図2A）。細菌、真核生物、および古細菌の群集がかなり密に集まっているのに比べ、ウイルス群集のクラスタリングは緩やかであった。Adonis検定とbetadisper検定では、バッチIDに依存する種プロファイルの分散の影響が少ないことが示され、真菌とウイルスの群集でさえ、バッチ間で個々のサンプルによって有意にクラスタ化されていた（R2 = 1.22%, p < 0.01; betadisper p > 0.05とR2 = 5.39%, p < 0.01; betadisper p > 0.05）。さらに、各バッチの被験者が異なる腸内微生物群集を示すかどうかを調べるため、種の有無と均等性を考慮したシャノン多様性指数に基づいて、細菌、真核生物、古細菌、ウイルスのα多様性をコホート間で比較した（図2B）。腸内細菌のα多様性にはグループ間で有意な差は見られなかったが、細菌は真核生物、古細菌、ウイルスよりもα多様性が高く、真核生物、古細菌、ウイルスはコホート間で大きな差があった（Kruskal-Wallis検定、p < 0.05）。
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2. 4つの研究におけるマイクロバイオームコミュニティのαおよびβ多様性解析。
A. 細菌種、真核生物種、古細菌種、ウイルス種を用いたβ多様性の主座標分析（PCoA）（CLR変換したBray-Curtis距離）。B.シャノン多様性指数密度分析。
doi:10.1371/journal.pone.0305583.g002
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3つの年齢群におけるマイクロバイオームコミュニティα多様性分析
研究のメタゲノムシークエンシングを統合するために、まずKruskal-Wallis検定を用いて、研究間でα多様性に統計的に有意な差があるサンプルをフィルターにかけた（図3A）。残りの被験者を年齢によって3つのグループに分類した：長寿グループC（年齢＞95歳、n＝48）、高齢グループE（66＜年齢＜90歳、n＝64、中央値：85歳）、若年グループY（年齢＜55歳、n＝41、中央値：27歳）（図3B）。百寿者の女性は、先行する長寿研究[1, 7, 22]で広く報告されている集団が中心である。年齢が微生物群集にどのような影響を与えるかをより深く理解するために、3つの異なる年齢グループのアルファ多様性とリッチネスを分析した。3つの年齢群の細菌群集間で、シャノン指数値に有意差は見られなかった（図3C）。しかし、Cao1指数は、C群とE群、Y群とE群の間で、統計的に区別できなかった。古細菌群集については、3つの年齢群におけるアルファ多様性とリッチネスの統計的差異が示された。その結果、百寿者の菌類群集のシャノン指数は、高齢者群と統計的に分離しており、C群は他の年齢群に比べてリッチネス指数が低いことがわかった。ウイルスのシャノン指数分布は、百寿者群に比べ若年群で有意に低かった。しかし、リッチネス分析では、若いグループと百寿者グループに有意な差は見られなかった。興味深いことに、Chao1のリッチネスには、Eグループと他のグループとの間で顕著な差が見られた。これらの結果は、アルファ多様性とリッチネス分析を通して観察されたように、若年者や高齢者と比較して、百寿者には有意な違いがあることを示している。
拡大図
3. α多様性とリッチネス分析における3つの年齢グループ間の有意差。
A. Kruskal-Wallis検定に基づき、各微生物群集において有意なα多様性を示さなかったサンプル数を示す。B. 残りの被験者を年齢によって3つのグループに分けた。色の付いていないボックスプロットはα多様性解析（C）、色の付いた鎖で塗りつぶされたボックスプロットは豊富性解析（D）を意味する。
doi:10.1371/journal.pone.0305583.g003
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3つの年齢グループにおけるマイクロバイオームコミュニティのβ多様性解析
個々のサンプルのβ多様性を測定し、年齢カテゴリーによってグループに分けた。Bray-Curtis距離の主座標分析をプロットし、微生物叢組成プロファイルの関連性を種レベルで可視化した（図4A）。微生物群集のクラスタリングは比較的緩やかに集まっていた。アドニス検定は、すべての微生物群集が年齢群間で統計的に異なることを示し、各タイプの微生物叢プロファイルが年齢群間でより高い差異を持つことを示した。さらに、個々のサンプル間の細菌、真菌、古細菌、ウイルス群集の構造的差異を評価し、年齢区分の影響を評価した（図4B）。Kruskal-Wallis検定（P < 0.001）に基づくと、距離の分布は、年齢カテゴリーによって微生物群集の構造が異なることを示した。4つの群集の距離の最も高い点はE群であり、Y群とC群のそれと比較した。
図4
. 異なる年齢群における細菌、真核生物、古細菌、ウイルス群集のベータ多様性。
A. 各サンプルの微生物相のBray-Curtis距離のPCoA（種レベル）。B.各年齢群におけるコミュニティの類似性分析における微生物叢プロファイルの密度プロット。
doi:10.1371/journal.pone.0305583.g004
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微生物叢コミュニティの分類学的組成
細菌分類群の中では、3つの年齢群において、Bacillota門、Bacteroidota門、Actinomycetota門が支配的な微生物叢であることが観察され、これは過去の百寿者研究[9]と一致している。子嚢菌門と担子菌門が、3つの年齢群における腸内微生物叢の主要な真菌門であった。古細菌はEuryarchaeotaとCandidatus Thermoplasmatotaが優勢で、3つのグループにおける主なウイルスはUroviricotaとPhixviricotaであった（図5A）。次に、種レベルでの微生物相の相対的存在量に注目した。最も豊富な細菌はFaecalibacterium prausnitziiとPhocaeicola vulgatusで、相対存在量はそれぞれ11.8%と5.19%であった。主な真核生物種はNakaseomyces glabratus、Saccharomyces cerevisiae、Candida albicansで、それぞれ25.8％、20％、12.7％を占めた。3つの年齢群で5％以上を占めた古細菌の目には、Methanobrevibacter smithii、Methanocorpusculum labreanum、Methanosarcina barkeri、Methanosarcina sp. Kolksee、Candidatus Methanomassiliicoccus intestinalisが含まれ、優勢なウイルスはCrAss-like virus sp.と未培養のcrAssphageで、腸内ウイルス全体の42％以上を占めた（図5B）。
拡大図
5. 3つの年齢群における微生物群集の分類学的組成。
A プロットは、各年齢群のサンプル間の異なる優勢な細菌、真核生物、古細菌およびウイルス門の平均相対存在量を示す。B 3つの年齢群における主要な腸内細菌種の相対存在量。C 若年者、若年高齢者、百寿者の各グループ間で異なる存在量の微生物叢の数。D 3つの比較群に存在する5つの異なる細菌種を示すベン図。E サンプル間で選択された微生物叢のlog2(reads+1)を示すヒートマップと、各比較群における対応する微生物叢のlog2(Fold change)値を示す棒グラフ。
doi:10.1371/journal.pone.0305583.g005
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異なる豊富な微生物叢を得るために、3つの年齢群間で種レベルの相対存在量比較が行われた。その結果、1053種の細菌、4種の真核生物、2種の古細菌、14種のウイルスが、3つの年齢群で存在量に差があることが示された。高齢者年齢群に存在する多数の微生物は、若年者と百寿者の間で同定されたものと比較して、存在量に実質的な差異を示した（図5C）。若年者対高齢者、若年者対百寿者、高齢者対百寿者を含む3つの比較群によって同定された差異のある豊富な細菌群の大部分は群特異的であり、そのうちの5つの生物（Ligilactobacillus ruminis、Turicibacter sp. H121、Blautia massiliensis、Streptomyces coelicolor、Anaerostipes hadrus）のみが共通して存在していた（図5D）。さらに、5つの一般的な細菌と、差分的に存在するすべての真核生物、古細菌、ウイルスの存在量をヒートマップで示した。図5Eの棒グラフは、高齢者および百寿者と比較した若年グループ、および百寿者と比較した高齢者グループにおける、それぞれの微生物の濃縮度と減少度を示している。百寿者で濃縮されたStreptomyces coelicolorを除き、5つの一般的な差次的多量菌種は、若年者から百寿者へと徐々に減少した。古細菌は、高齢者や百寿者に比べて若年層で蓄積を示した。例えば、Methanosarcina sp.Kolkseeは若年者に濃縮された。カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）は百寿者に濃厚であったのに対し、ナカセオマイセス・グラブラツス（Nakaseomyces glabratus）は高齢者により多く蓄積していた。ウイルスについては、対照群と比較して、百寿者では、Shuimuvirus IME207の大きな濃縮、Cedarrivervirus Sf11の中程度の濃縮、Streptococcus phage YMC-2011の枯渇が観察された。これらの結果は、腸内細菌叢の組成の変化が、驚異的な長寿者における老化プロセスに一部関係していることを示している。
マイクロバイオームの相互作用シフトを探索するためのネットワーク解析
次に、加齢過程における存在量の異なる微生物の相互作用の可能性を探索するために、マイクロバイオームの存在量差分解析を追加で行い、種レベルでの生態ネットワークを作成した。共起ネットワークは、分類学的組成データに基づいて微生物群集のサンプル間の関連を推測するために、微生物生態学で用いられる著名な手法である。若年の共起ネットワークは、6986個のノード間で合計787543個のエッジを獲得し、26個の大きな微生物群（メンバーシップ＞10）に分割された。高齢者ネットワークには7550ノード、2212233エッジがあり、24の大規模微生物群集が生成された。一方、百寿者ネットワークでは、7135ノード、2087937エッジを含む27の大規模微生物クラスターを同定した。
各共起ネットワークにおける存在量差のある微生物群のトポロジー的特性を調べるため、存在量差のある微生物群が主要な微生物クラスターに有意に濃縮されているかどうかを、フィッシャーの正確検定を用いて独立に評価した。その結果、若年者と百寿者の比較および若年者と高齢者の比較で生じた存在量の差のある生物種は、若年者ネットワークの5つの共通クラスターで別々に濃縮されたのに対し、高齢者と比較した若年者の残りの存在量の差のある生物種は13のクラスターで濃縮されたことが観察された（図6A）。また、高齢者と百寿者のネットワークでは、高齢者と百寿者のグループに関連した比較（E vs. Y、E vs. CとC vs. Y、C vs. E）によって生じた存在量の差のある生物種によって濃縮されたクラスターが大部分であった（S3およびS4図）。各共通クラスターのノードは青で示した。これらの知見は、異なる比較群の存在量差のある種が、腸内微生物群集内で密接な生態学的関連を持っている可能性を示している。
拡大図
6. 加齢に関連した微生物バイオマーカーの相互作用シフト。
A Y対E、およびY対Cの有意に濃縮されたクラスターの存在量差のある微生物群。共通の濃縮クラスターは青色で、緑色はY対Eに特異的な存在量の差のある微生物相を示す。C 年齢に関連した微生物バイオマーカーを含むクラスターを黄色で示す。D、E、Fはそれぞれ、Y、E、CのネットワークのクラスターにおけるMethanosarcina sp.Kolkseeの相互作用を示す。
doi:10.1371/journal.pone.0305583.g006
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いくつかの生物種が比較群で存在量に差を示し、それを条件に基づいて年齢段階に関連するシグネチャーに分類した。最終的に、11のYシグネチャー、83のEシグネチャー、13のCシグネチャーが得られた（図6B、S5、S6図）。前述したように、シグネチャーの濃縮分析を用いて、関連するネットワークの生態学的クラスターも検出し、これらのノードを黄色でマークした（図6C、S7、S8図）。さらに、各年齢グループから3つのシグネチャーを選択し、YグループのMethanosarcina sp.Kolksee、EグループのPrevotella copri、CグループのShuimuvirus IME207を例として、加齢過程におけるライフステージシグネチャーの相互作用シフトを調査した。エネルギー生産者[23]であるMethanosarcina sp.Kolkseeは、E群およびC群に比べY群で存在量が多かったが、Y群ではE群およびC群に比べそれぞれ微生物との相互作用が少なかった（図6D-6F）。Eクラスターでは83の微生物が、Yクラスターでは124の微生物が、Cクラスターでは14の微生物がPrevotella copriと相互作用していることが観察された（S9-S11図）。肺炎Klebsiellaやサルモネラ菌を溶菌するバクテリオファージShuimuvirus IME207[24]は、C群クラスターで26個のウイルス、2個の古細菌、8個の細菌と相互作用し、Eネットワークでは1個の古細菌、18個の細菌、2個の真核生物、20個のウイルスを含むより多様な微生物相と結合していた（S12およびS13図）。しかし、IME107はYネットワークには存在しなかった。これらの結果は、加齢に伴う微生物マーカーの変化の相互作用は、それらの存在量とは無関係であることを示している。
考察
ヒト腸内細菌叢は、高齢成人の健康状態を決定する極めて重要な役割を果たすと長い間信じられてきた。本研究では、異なる場所にまたがる4つのメタゲノムデータセットを収集し、バッチ効果除去後にこれらのデータセットを3つの年齢群に再割り当てした。その結果、高齢者グループのマイクロバイオーム・プロファイルは、若年グループや長寿グループに比べて複雑であり、同定された腸内マイクロバイオーム数のかなりの割合を細菌が占め、古細菌、ウイルス、真核生物がそれに続いていた。さらに、各分類群の優占種は、通常3つの年齢群間で広く分布していた。両比較年齢群内での存在量の差のある微生物群の重複は少ないが、これらの存在量の差のある微生物群は、年齢群ネットワークの共通クラスターにおいて独立して濃縮されている。最後に、各年齢群のマイクロバイオームシグネチャーの相互作用は、加齢過程における生態系クラスターによって劇的に変化することが観察された。複数のソースからのデータを統合する場合、よりロバストなバッチ効果補正法が必要である。トランスクリプトームデータとは異なり、マイクロバイオームデータの基本的な特性は、極めてゼロインフレであり、過分散であり、複雑な分布で多様であることが多い。Limma、DESeq2、ComBatなど多くのバッチ効果補正アルゴリズムは、もともとRNA-seqデータセット用に開発されたものであり、メタゲノムデータ解析には全く適していない可能性がある[25]。第二に、地理、性別、BMI、年齢、ストレス、遺伝的、人口統計学的、臨床的、食事などの交絡生物学的変数も、微生物叢組成分析にバッチ効果をもたらす。バッチ効果を補正するためのバッチ変数の詳細な評価が重要である。しかし、ComBat、パーセンタイル正規化、多変量RUVIII、および関連する方法は、バッチ効果と関心のある交絡因子との間の相互作用を考慮することなく、補正されたデータを生成するために生データからバッチ効果を除去しようとするものである。このような問題に対処するため、メタゲノムデータを対象とした様々なアプローチが開発されている： PLSDA-batch、BDMMA、NetMoss、ConQuRはそれぞれ、偏最小二乗判別分析、ディリクレ多項回帰モデルを利用し、ベイズフレームワーク、微生物ネットワークモジュール、2分割分位点回帰モデルを用いたノンパラメトリックモデリングを採用している[25-28]。しかし、今後、メタゲノム解析の下流工程に先立ち、バッチ効果補正解析の有力な手法を決定する必要がある。
バッチ効果補正前の生カウントの正規化に加えて、バッチ効果を除去する前にライブラリサイズの違いを除去することも、バッチ効果を低減するために不可欠なステップとして提案された。それぞれのfastqファイルをfastqcソフトウェアで確認したところ、4つのコホートにおけるサンプルあたりのリード深さの中央値はPRJEB25514： 18M、PRJNA624763：38M、PRJNA675598：0.7M、PRJNA553191：19Mであった。以前の研究[26]と一致し、ConQuRと相対存在量に変換された分類群の生カウントを組み合わせることで、これら2つの方法のうちの1つで生成された結果と比較して、バッチ効果を劇的に減らすことができます。しかし、ConQuR-libsize関数を用いた代替法では、バッチ除去の際に補因子としてライブラリのサイズを別途考慮するため、本研究ではバッチ効果が除去されず、ConQuRの論文の記述と一致しませんでした。これは、ライブラリサイズのばらつきがバッチ間の実質的な差ではないことが原因かもしれない。
一貫性のない結果をよりよく理解するためには、マイクロバイオームデータ解析の結果を先行研究と比較する前に、さらに影響を及ぼす要因を取り除く必要がある。高齢者の細菌群集、真核生物群集、古細菌群集は、若年者や百寿者よりもα多様性とβ多様性が高いことがわかったが、これは過去の論文[4, 11]と一致する一方で、Wangらの報告[6]とは対照的であった。また、百寿者のウイルス群集は、若年者や高齢者よりも高いシャノン指数を示したが、これは過去の文献 [1]とは対照的であった。加齢に関連するマイクロバイオーム群集の多様性については、先行研究間の一致が真実であるかどうかは、ほとんど判断できない。このような一貫性のない結果は、メタゲノム配列解析のためのソフトウェアやデータベースの選択、あるいはサンプルを3つの年齢グループ（若年者、高齢者、百寿者）に割り当てる際の年齢閾値など、その他の要因によって引き起こされた可能性がある。例えば、Xuらは94歳から105歳までを百寿者として選び、50歳から59歳までを高齢者の閾値として選んだ[4]。Liらは、100歳から106歳までを百寿者として選び、66歳から92歳までを高齢者とした[2]。Luは、99歳から107歳、68歳から88歳、21歳から33歳を百寿者、高齢者、若年者のグループに分けた[8]。
3つの年齢グループ間での分類学的存在量のシフト傾向は、年齢に依存したマイクロバイオーム同定の十分な証拠とはならない。支配的な種の存在量は、年齢グループ間で実質的な差が少ないかもしれない。例えば、Faecalibacterium prausnitzii、Nakaseomyces glabratus、Methanobrevibacter smithii、CrAss-like virus sp.は、3つの年齢群間で主要な細菌、真菌、古細菌、ウイルスであった。主要な酪酸産生菌であるFaeacalibacterium prausnitziiは加齢とともに減少することが観察され、これはBiagiらの報告[7, 9, 22]と一致するが、若年グループと高齢グループとの間に有意差は認められなかった。カンジダ・グラブラータとして知られるN. glabratus [29]という病原体は、百寿者と高齢者群に濃縮されていたが、高齢者群と若年者群、百寿者群と高齢者群に有意差はなかった。さらに、以前の論文では、M. smithiiの相対量が長寿者で増加していることが述べられていた[9]。しかし、我々は、百寿者だけでなく高齢者グループでもM. smithiiが濃縮されていることを観察し、このメタン生成菌の濃縮が老化プロセスの早い段階から始まっている可能性を示した。ヒトの消化には、加水分解、発酵、メタン生成の3つの段階がある。メタン生成は、ギ酸および水素を消費することにより、ATPおよび短鎖脂肪酸の生成を促進するために重要な役割を果たし、宿主のエネルギー収穫に役立つ [30]。アセトゲンと比較して、H2利用能が非常に低いM. smithiiは、より効率的に腸内環境からH2を枯渇させることができる[31]。CrAss様ファージ[32]は、3つの年齢群間で非常に豊富であり、どの年齢群間の差も少ない。
共起ネットワークアルゴリズムの大半は、実際の生息環境におけるペア種の相互作用をすべて反映しているとは言い難い。ネットワーク構築アプローチは通常、種の相互作用を解釈する間の生態学的関連を推論する。微生物生態ネットワークを構築するために、複数のアルゴリズムが開発されている。古典的な方法はピアソンの相関係数とスピアマンの相関係数である[33]。Sparse Correlations for Compositional dataは、微生物群の対数比変換存在量間の相関を計算するために、反復近似戦略を利用している[34]。SParse InversE Covariance Estimation for Ecological ASsociation Inference (SPIEC-EASI)は、種の相互作用ネットワークを推測するために使用されるもう一つの方法である[35]。Hiranoらは、現実的なシミュレーションを用いて組成データアプローチを評価し、SPIEC-EASIとSparCCは従来の手法よりも微生物の生態系ネットワークを推論することが困難であると指摘した[36]。誤った相互作用を除外するために、ネットワーク内の種の相互作用によって決定される種の程度に主に焦点を当てた先行研究とは異なり、我々は特定のクラスター内の年齢に関連するバイオマーカー間のリンクを選択した。しかしながら、本研究には注意を要するいくつかの限界がある。第一に、本研究は、より信頼性の高い結論を導き出すために、より多くの参加者と、より良い年齢分類に関する今後の分析が必要である。第二に、加齢に関連した微生物叢変動の潜在的なメカニズムをよりよく理解し、偽陽性の微生物を回避し、ペア種の生態学的相互作用をより正確に検出するためには[37]、MetaPhlAn [38]、CLARK [39]などの代替メタゲノム解析ソフトウェアのプリフォームを比較する必要がある。第三に、パラメトリック統計モデルに基づいて相互作用を推論するネットワーク構築手法を考えると、代替手法も必要である。
まとめると、我々は3つの年齢群にまたがるすべてのマイクロバイオーム組成プロファイルの包括的な分析を提示し、分類学的存在量の差に基づいて年齢に関連するマイクロバイオームを同定し、加齢に伴う微生物関連のシフトを解釈した。
参考情報
S1表。doi:10.1371/journal.pone.0305583.s001
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S1図. ロケーションサンプル間の生カウントと割り当てられたリードの関連性。
各データセットのピアソン相関係数（PCC）、PCCJapan = 0.96, PCCItaly_1 = 0.69, PCCItaly_2 = 0.77, PCCCChina = 0.34.
バッチ効果除去後、年齢群間の微生物総数は減少した。B 補正前の各年齢群における細菌、真核生物、古細菌、ウイルスの割合。C 補正後の各年齢群における細菌、真核生物、古細菌、ウイルスの割合。
doi:10.1371/journal.pone.0305583.s003
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S3 図. E群対Y群、E群対C群の比較で生じた存在量の差のある種が濃縮されたクラスター。.s004
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S4 図. C 対 Y、C 対 E のグループ比較で生じた存在量の差によって濃縮されたクラスター。.s005
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S5 図. 高齢者グループに関連する微生物バイオマーカー
doi:10.1371/journal.pone.0305583.s006
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S6 図. 百寿者グループに関連する微生物バイオマーカー
doi:10.1371/journal.pone.0305583 図
10.1371/journal.pone.0305583.
s008
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図8 シグネチャー濃縮分析を用いた百寿者ネットワークの生態クラスターと黄色で示したノード。.s009
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S9 図. EクラスターでPrevotella copriと相互作用した83の微生物
doi:10.1371/journal.pone.0305583.s010
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S10 図. YクラスターでPrevotella copriと相互作用した124の微生物
doi:10.1371/journal.pone.0305583 図
10.1371/journal.pone.0305583.s012
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図12 バクテリオファージShuimuvirus IME207は、C群クラスターで26のウイルス、2つの古細菌、8つの細菌と相互作用した。.s013
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S13図 バクテリオファージShuimuvirus IME207は、Eネットワークにおいて、古細菌1個、細菌18個、真核生物2個、ウイルス20個を含む、より多様な微生物相と相互作用した。.s014
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謝辞
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腸内細菌叢における加齢に伴う抗生物質耐性遺伝子の累積的影響を明らかにした。Nat Aging. このような背景のもと
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