イリノテカン-腸内細菌叢の相互作用とイリノテカン関連毒性を緩和するプロバイオティクスの機能性

オープンアクセス
発行：2023年3月2日
イリノテカン-腸内細菌叢の相互作用とイリノテカン関連毒性を緩和するプロバイオティクスの機能性

https://bmcmicrobiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12866-023-02791-3

マルワ・S・マーディ
アーメッド・F・アズミィ
...
アーメッド・O・エル・ゲンディ
著者を表示する
BMC Microbiology 23巻、記事番号：53（2023） この記事を引用する
1220 アクセス数
1件の引用
9 Altmetric
指標詳細
概要
背景
イリノテカンは、大腸がん（CRC）を含む様々な腫瘍の治療に使用される化学療法剤である。腸内では腸内細菌酵素によりSN-38に変換され、排泄時の毒性に関与している。
目的
本研究では、イリノテカンが腸内細菌組成に与える影響と、イリノテカン関連下痢の抑制と腸内細菌β-グルクロニダーゼ酵素の抑制におけるプロバイオティクスの役割に注目するものである。
材料および方法
イリノテカンの腸内細菌叢組成への影響を調べるため、健常者、大腸がん、イリノテカン治療患者の3グループの便サンプル（n = 5/グループ）において16S rRNA遺伝子シーケンスを適用しました。さらに、Lactiplantibacillus plantarum (L. plantarum), Lactobacillus acidophilus (L. acidophilus), Lacticaseibacillus rhamnosus (L. rhamnosus) という3種類の乳酸菌を単一および混合で用い、大腸菌由来のβ-グルクロニダーゼ遺伝子発現に対するプロバイオティクスの効果をin vitroで探索しました。また、イリノテカン投与前のマウス群にプロバイオティクスを単一および混合形態で導入し、活性酸化種（ROS）のレベルを評価するとともに、付随する腸内炎症およびアポトーシスを調査することにより、その保護効果を探索した。
結果
大腸がん患者およびイリノテカン治療後の腸内細菌叢は乱れていた。健常者群では、BacteriodetesよりもFirmicutesが多く、大腸がんやイリノテカン投与群ではその逆であった。健常者群では、ActinobacteriaとVerrucomicrobiaが顕著に存在し、大腸癌とイリノテカン投与群ではCyanobacteriaが認められた。腸内細菌科とDialister属は、大腸がんグループで他のグループより多く見られた。Veillonella、Clostridium、Butryicicoccus、Prevotellaは、Irinotecan投与群で他の群に比べ存在量が増加した。マウスモデルで乳酸菌混合液を使用すると、β-グルクロニダーゼの発現と活性酸素の両方を減少させ、さらに腸上皮を微生物の異常繁殖と増殖性クリプト損傷から保護することにより、イリノテカン誘発下痢を著しく緩和した。
結論
イリノテカンベースの化学療法は、腸内細菌叢を変化させた。腸内細菌叢は化学療法の有効性と毒性の決定に大きく関与しており、その中でもイリノテカンの毒性は細菌のβ-グルクロニダーゼ酵素によって引き起こされている。腸内細菌叢は、化学療法薬の有効性を促進し、毒性を減少させるために、目的に応じて調節することができるようになりました。本研究で使用したプロバイオティクスレジメンは、イリノテカンの粘膜炎、酸化ストレス、細胞炎症、アポトーシスカスケード誘導を低下させました。
ピアレビュー報告
論文紹介
ファーマコバイオミクスは、医薬品とヒト腸内細菌叢との相互作用を研究している。薬剤のバイオアベイラビリティ、臨床効果、および毒性はすべて、直接的および間接的なメカニズムを通じて、腸内微生物およびその酵素産物によって影響を受ける可能性があります[1]。
イリノテカン（CPT-11）は、カンプトテシンアルカロイドに由来し、大腸がん、膵臓がん、肺がんなど様々な腫瘍に細胞毒性を発揮します。イリノテカンは、DNAの複製に含まれるトポイソメラーゼ-Iという酵素を阻害する活性体SN-38のプロドラッグである。イリノテカンのより強力な代謝物であるSN-38は、加水分解後に肝細胞のCES1およびCES2カルボキシルエステラーゼから放出されます。SN-38は、肝細胞内でウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ（UGT）の作用により不活性なSN-38グルクロニド（SN-38G）に酵素的に変換され、グルタル酸と結合して胆汁とともに腸内に排泄されるまではイリノテカンの数百倍から千倍の細胞毒性を持っています［2］。
β-D-グルクロニダーゼ（GUSs）は腸内細菌酵素の一種で、腸管内腔でSN-38Gを脱共役化し、下痢の主な原因である毒性体SN-38を放出するため、イリノテカン系化学療法中の罹患率と死亡率が高くなる可能性があります。これらの毒性作用は、腸内細菌GUSの選択的阻害剤によって減少することが実証されています[3, 4]。イリノテカンのその他の有害作用には、白血球減少や粘膜炎があります。化学療法による粘膜炎（粘膜バリアーの損傷）は、吐き気、嘔吐、下痢、体重減少など多くの臨床症状で現れる深刻な腫瘍学的問題である。さらに、CPT-11を投与した患者の腸から、Enterococcus属、Streptococcus属、Staphylococcus属、Enterobacteriaceaeなどの通性嫌気性菌や日和見微生物が転移して敗血症を引き起こす可能性があります[5, 6]。イリノテカンによる粘膜炎は、活性酸素種（ROS）を放出する炎症経路の活性化によって引き起こされ、タンパク質損傷、DNA変異、膜リン脂質の酸化、低密度リポタンパク質の変質を引き起こす [7]．
腸内細菌の変化は、がんの進化に大きく関与していることが示唆されています [8,9,10,11,12]。細菌は、さまざまなメカニズムを通じて、がんの始まりと進行を助けることができます。腸内細菌の変化は、日和見病原微生物を増強し、粘膜透過性の増加の結果である慢性炎症を引き起こし、細菌とその産物が体内に入り、自然免疫反応と獲得免疫反応の両方を活性化させます [13,14,15] 。転移してきた細菌の毒素や代謝物は、DNAの安定性、細胞周期、細胞増殖、さらには腫瘍の発生や発達に影響を与える可能性があります [3, 16]。
プロバイオティクスは、腸内細菌叢の改変による影響を緩和することができます。プロバイオティクスは、医薬品や食品サプリメントとして使用される細菌で、ヒトやその他の動物の腸管内の健全な微生物学的平衡を維持する役割を担っています。また、プロバイオティクスは腸内のβ-D-グルクロニダーゼ機能を抑制することができ[17]、イリノテカン投与中のがん患者における抗がん剤による下痢を回避するために利用できる可能性が示唆されている。
プロバイオティクスがβ-D-グルクロニダーゼの潜在的な阻害剤として機能するかもしれないという仮説は、イリノテカン毒性に対抗するための支持的プロバイオティクスレジメンを提案するために、本研究の焦点となりました。また、本研究の目的は、イリノテカンが腸内細菌群集に与える影響に光を当て、潜在的なディスバイオシスを特定し、大腸上皮のバリア保全と炎症への影響を評価することであった。さらに、イリノテカンによる下痢を克服するために、プロバイオティクスが酸化ストレスを抑制し、あるいは天然の抗酸化防御を増強する効果をin-vivoで調査しました。
材料と方法
細菌株と増殖条件
健康なボランティアの便サンプルから回収した3つの臨床用大腸菌分離株は、ベニスエフ大学薬学部微生物学・免疫学教室から好意的に提供された。本研究で使用したプロバイオティクスLactobacillus属菌と菌の培養条件を（表1）に示す。各菌は25%グリセロールで維持し、-20℃で保存した。
表1 本研究で使用した細菌株、その増殖培地、増殖条件
原寸大の表
大腸菌のβ-グルクロニダーゼの表現型スクリーニング
β-グルクロニダーゼの検出は、発色酵素基質としてp-nitrophenyl-p-D-glucopyranosiduronic acid（PNPG）存在下で実施した。PNPGディスクは，100 mMリン酸緩衝液（pH8）中の1%PNPG溶液50 µlをディスクに含浸させることで調製した[18]．調製したディスクは、36℃で一晩乾燥させた後、デシケーターが存在する4℃のバイアル内で冷却維持した。
大腸菌懸濁液（4マクファーランド標準）を一晩のBHI寒天プレートから滅菌蒸留水で調製し，無色基質（PNPG）で飽和したディスクの存在下で37℃，24時間培養した。試験は2、6、24時間モニターし、PNPG基質の加水分解により、p-ニトロフェノールの黄色が陽性反応を示すことを確認しました。また、上澄みが無色のままであるネガティブコントロールも採用した。
異なる濃度のイリノテカン存在下での大腸菌の増殖速度について
イリノテカン（Sigma Aldrich chemical company, St.Louis, Mo, USA）を2倍濃縮BHIブロスで最終濃度10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.312 mg/mlに調整し、96ウェルのマイクロタイタープレートに各ウェルあたり100μLとして展開した。大腸菌3株の標準化接種液は、0.9%NaCl溶液で一晩培養した各株を希釈し、0.5McFarland標準の濁り懸濁液を得、マイクロタイタープレートのウェルに接種するために調製した[19]。イリノテカンを含まない細菌を有する陽性増殖対照ウェルおよび細菌を含まないBHIブロスを有する陰性対照ウェルが含まれる。データ処理前に、プレートを37℃で18時間、120rpmで連続的に振とうした。マイクロタイタープレートリーダー（Tecan Sunrise、オーストリア）を使用して、各ウェルの光学密度（OD）を620nmで測定し、測定は30分間隔ごとに行った［20］。各処理は3連で行った。
得られたデータに基づいて、特定の時点における成長曲線および最大成長速度（μmax）を、正の成長対照と比較して評価した。正規化は、バックグラウンドのネガティブコントロールからすべての実験結果を差し引くことで行った。ここで、Xtは特定の時点における成長吸光度、X0は初期成長吸光度、tはμmaxが得られる時間であり、μmaxを求めるために以下の式が用いられた。
{X}}{t} = {mathrm{X}}{0}mathrm{ exp }left({upmu }_{mathrm{max}} .\mathrm{ t}}right)
イリノテカン治療に対する腸内細菌叢のメタゲノム解析
倫理的配慮
ベニスエフ大学医学部研究倫理委員会（FM-BSU REC）より倫理的承認を得た（承認番号；FMBSUREC/05072020/Mahdy）。
ヘルシンキ宣言、国際整合性会議ICH、米国連邦規則のガイドラインを遵守し、被験者保護のための連邦広域保証（FWA）の下で登録されました。本研究に参加するすべての患者からインフォームドコンセントを得た。データは機密扱いとし、匿名とした。社会統計学的な質問は、身元を特定するためではなく、特徴を特定するためのものであった。参加者自身が参加する義務を負うことはない。
デザイン、サンプル収集、DNA抽出
本研究で分析した便サンプルの提供者は15名のボランティアであり、そのメタデータは報告されている（表2）。サンプルは、健常者5名、大腸がん患者5名、イリノテカン服用中の大腸がん患者5名から、イリノテカンの最終投与から1週間以内に採取されました。すべての患者および健常者は、年齢19歳から41歳の成人男性および女性で、サンプル採取前に少なくとも3ヶ月間、抗生物質を投与されていなかった。健常者は、慢性疾患や感染症はなく、胃腸疾患の既往歴もなかった。便サンプルは滅菌された容器に採取され、DNA抽出のために直ちに-20℃に保存された。
表2 検便を採取したグループの違い
原寸大の表
Igenomic stool DNA Extraction mini kit (iNtRON Biotechnology, Korea)を用いて、便サンプルからDNAを抽出した。製造者の説明書に正確に従った。DNAは、最初にNanoDrop 2000 UV-Vis spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)で品質と量を検査した。
V3-V4 領域の 16S rRNA 増幅とイルミナシーケンス
DNAサンプルは、ダルハウジー大学（カナダ、ハリファックス）のIntegrated Microbiome Resource（IMR）で16S rRNA遺伝子シーケンスのために提出された。細菌16S rRNA遺伝子の可変領域V3-V4は、プライマー341F：5'- CCTACGGNGGCWGCAG -3'と805R：5'- GACTACHVGGTATCTAATCC -3' [21] のセットを使用してすべての精製DNAサンプルから増幅し、ペアエンド300 bpシーケンス [22, 23] を使用してイルミナ MiSeqで配列決定しました。
16S融合プライマーは、多重化されたサンプルに等量添加された。イルミナNexteraアダプターおよびバーコードは、アンプリコンの両端で二重標識するために融合プライマーに含まれていた。25 µLの反応混合物には、5 µLの5×HFバッファ、0.5 µLのdNTPs（40 mM）、5 µLのフォワードプライマーと5 µLのリバースプライマー（1 µM）、 0.25 µL Phusion polymerase（2 U/µL; Thermo Scientific）、2 µLのテンプレートおよび7.25 µLの水が含まれていました。反応条件は、98 ℃での変性（30秒）から始まり、98 ℃（10秒）、55 ℃（30秒）、72 ℃（30秒）のサイクルを30回繰り返した。最終伸長は72 °Cで4.5分間行った。サンプルとネガティブコントロールを組み合わせて1つのライブラリーを形成し、製造元のプロトコールに従って2 × 300 bp Pair-End v3ケミストリーを使用してIllumina MiSeqプラットフォームに適用しました。
バイオインフォマティクス解析
配列解析および一次統計のためにQIIME2 Core（2019.10）を実装した（Bolyen et al.、2019）。QIIME 2 demuxプラグインを使用して、固有のバーコードに基づいて生のFASTQファイルをデマルチプレックスした[24]。キメラ配列は、QIIME 2 deblurプラグインを使用して品質フィルタリング、トリミング、およびデノイズした後、各デマルチプレックス配列から識別および削除して、特徴テーブルを獲得した［25］。QIIME 2のfeature-classifierプラグインを使用して、特徴的な配列をGREENGENES 13_8 99%データベースにアライメントし、分類学的割り当てと解析のための分類表を作成した[26]。データは、4400リードの深さを使用して、アルファおよびベータ多様性解析の前に希釈されました。QIIME2内のα群有意性コアメトリクスプラグイン（Chao1およびShannon）およびβ多様性序列化皇帝プラグイン（Bray Curtis Index）を用いて多様性メトリクスを計算しプロットした[27]。患者、治療者、健常者の間の分類群の相対存在量の違いは、線形判別分析効果量（LEfSe）[28]、カウントデータの差分分析のためのDESeq2[29]、ANCOMによる差分存在量分析[30]によって検出された。PICRUSt2は、微生物の代謝経路を予測し、潜在的な機能的意味を評価するために適用されました[31]。MicrobiomeAnalystウェブベースツールは、マイクロバイオームデータの包括的な統計、視覚、およびメタ解析のために使用されました[32]。
異なるプロバイオティクス処理に反応したβ-グルクロニダーゼの発現
L. plantarum、L. acidophilus、L. rhamnosus、またはそれらの混合物のβ-グルクロニダーゼの発現を変化させるin vitro能力を研究した。各Lactobacillus属を30mLのMRS broth（Himedia社製）でサブカルチャーし、30℃で一晩インキュベートした。生育したばかりの培養液を10mLの3つの部分に分けた。各パートは10,000 gで5分間遠心分離し、1パートの細菌ペレットを10 mLの生理食塩水で2回洗浄し、再遠心分離してペレットを回収した。第2部の無細胞上清（CFS）を0.22 umフィルターでろ過滅菌し，そのpHを記録した。第3部のCFSをフィルター滅菌し，0.1M NaOHでpH7に調整した。
大腸菌AF02を、1％の乳酸菌ペレット、粗製CFS、またはL.アシドフィルス、L.プランタルム、L.ラムノサスもしくはそれらの混合物のpH7に調整したCFSと別々に、または共培養生息地内で、30℃で18時間増殖させた[33]。一般に，CFS は最終容量 20 mL の 2 倍力 BHI（共培養培地）に対して 50％の割合（v/v）で添加した．試験した3つのLactobacillus属の代謝物の混合物を調製するために、各菌のCFSを等量の二倍力BHIと等しく混合して最終容量20 mLとした。
RNA抽出およびβ-グルクロニダーゼの発現
大腸菌を未処理または乳酸菌とその代謝物で処理したものから、Fast Q RNA抽出キット（iNtRoN、韓国）を用いて、製造者の説明書に従ってゲノムRNAを抽出した。リアルタイムRT-PCR解析は、DTliteリアルタイムPCR装置（DNA-Technology、ロシア）を用いて実施した。β-グルクロニダーゼをコードする遺伝子は、プライマーuidAF（5′-CAACGAACTGAACTGCAGA-3′）およびuidAR（5′-CATTACGCTGCGATGAT3′）（Macrogen、韓国南部）およびuidAP-FAM（5′-CCCGCCGGAATGGTGATTAC3′）を用いて増幅した。各反応混合物の最終容量は10μLであり、5μLのTOPrea{mathrm{l}}^{mathrm{TM}}を含んだ。One-step RT qPCR kit (TaqMan Probe) (Enzynomics, Korea)、各プライマー1μL、ゲノムRNA (100 ng/μL) 2.5 μL、プローブ 0.25 μL、およびヌクレースフリー水 0.25 μL。増幅には、50℃で30分間の逆転写ステップ、95℃で10分間の初期変性、95℃で5秒間の変性、60℃で30秒間のアニーリング/伸長のサイクルを30回繰り返した。また、プライマーcysGF（5′-TTGTCGGCGGTGTGATGT-3′）およびcysGR（5′ATGCGGTGAACTGGAATAAA-3′）（Macrogen, Southern Korea）を用いて大腸菌参照遺伝子を増幅した。
各遺伝子の発現量は、示唆されたように分析した[34]。各遺伝子の発現の変化は、発現の倍数変化（Fc）として記録された。結果は、対照試料に対する対数倍の増加を反映する。フォールドチェンジを得るために、以下の式を使用した：
{Fold change }= 2}^{-ΔDelta
Ct；サンプルのサイクル閾値（Ct）、記号△はデルタを意味する。
\Ct }= ㊟左（㊟処理済み試料｝右）-㊟右（㊟処理なし試料｝右）。
本質的に、⊿⊿Ctは処理/実験サンプルと未処理/対照サンプルの⊿⊿Ct値の差である：
\δCtは、処理・実験試料と未処理・対照試料のδCt値の差である：δCt=Ctleft(Ⓐmathrm {gene of Interest}right) - Ctleft(Ⓐmathrm {housekeeping gene }} Right)
プロバイオティクスを用いたマウスモデルによるイリノテカン誘発毒性への対策
対象動物
体重30±2gの雄性スイスマウスをNAHDA University, Beni-Suef, Egyptの動物舎から入手した。実験に先立ち、マウスは動物舎で7日間馴化させた。室温26±2℃、12/12時間の明暗サイクル、餌と水への自由なアクセスという標準的な飼育条件下で維持された。動物の取り扱いおよびすべての実験手順は、動物実験倫理委員会（Institutional Animal Care and Use Committee, Beni-Suef University）の承認番号：021-200、および実験動物の飼育と使用のためのガイド（NIH publication No.85-23） のガイドラインにより承認されている。
実験デザイン
合計60匹のスイスマウスを以下のように10群（n = 6）に分けた：
グループI：通常のコントロールグループは、22日間、1日1回ビヒクルを受け取った。
グループII：L. acidophilusコントロールグループは、L. acidophilus（200μl、p.o）を22日間、1日1回受けた。
グループIII：L. plantarumコントロールグループには、L. plantarum（200μl、p.o.）を22日間、1日1回投与した。
IV群：L. rhamnosus対照群には、L. rhamnosus（200μl、p.o.）を22日間、1日1回投与した。
グループV：混合物対照群には、3つのLactobacillus属の混合物（200μl、p.o.）を1日1回、22日間投与した。
グループVI：イリノテカン対照群は、ビヒクルを1日1回22日間投与＋イリノテカン（270mg/kg、i.p）を21日目に1回投与。
グループVII：イリノテカン＋L.アシドフィルス群は、L.アシドフィルス（200μl、p.o）を22日間1日1回投与＋イリノテカンを21日目に1回投与。
VIII群：イリノテカン＋L.プランタラム群に（200μl p.o.）を1日1回22日間投与＋イリノテカンを21日目に1回投与。
IX群：イリノテカン＋L. rhamnosus群にL. rhamnosus（200μl）を1日1回22日間投与＋イリノテカンを21日目に1回投与。
グループX：イリノテカン＋混合物グループには、3種の乳酸菌の混合物（200μl p.o.）を1日1回、22日間投与し、21日目にイリノテカンを1回投与しました。
イリノテカン投与48時間後、マウスを犠牲にした後、大腸を解剖し、糞便を取り除くために通常の生理食塩水を用いて穏やかに洗浄した。大腸の一部分を10%リン酸緩衝ホルマリン溶液に浸し、病理組織学的検査とカスパーゼ-3の免疫組織化学的分析を行った。もう一方の結腸は、0.1Mリン酸緩衝食塩水でホモジナイズし、4℃で10分間遠心分離した（1000×g）。上清を捨て、大腸のマロンジアルデヒド（MDA）、還元型グルタチオン（GSH）、スーパーオキシドディスムターゼ（SOD）活性などの酸化ストレスバイオマーカー、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン6（IL-6）発現などの炎症性バイオマーカーの推定に使用しました。
生化学的解析
酸化ストレスバイオマーカーの評価
Biodiagnostic社（エジプト、カイロ）から購入したキットを用いて、MDA、還元型GSH、およびSODの活性をカロリメトリーで測定した。MDAはnmol/g組織、還元型GSHはmmol/g組織、SOD活性はU/g組織で表された。
炎症性バイオマーカーの評価
IL-6およびTNF-αの組織発現レベルは、R and D systems（米国）およびCUSABIO Biotech Co, Wuhan（中国）からそれぞれ購入したELISAキットを用いて、製造者の指示に従い測定した。
病理組織学的解析
マウスの大腸から標本を採取し、中性緩衝ホルマリン10%で保存し、パラフィン包埋法で処理した。厚さ4〜5μmの横断切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン（H＆E）［35］で染色し、病理学者が光学顕微鏡（BX43、オリンパス）で盲検的に検査した。大腸病変の定量的な病理組織学的評価を行い、動物（n＝6）ごとにランダムにチェックした5つの顕微鏡視野において、以下のように（0〜3）の点数をつけた： (0）は変化なし、（1）、（2）、（3）はそれぞれ軽度、中度、重度の変化を示した。簡単に言うと、割り当てられた病変は、粘膜壊死、粘膜炎症細胞浸潤、粘膜下浮腫、粘膜下炎症細胞浸潤、および粘膜と腺上皮のアポトーシスであった［36］。
免疫組織化学的解析
切断型カスパーゼ-3発現量
大腸組織におけるCleaved Caspase-3の発現量を[37]に従って検討した。切片をカスパーゼ-3に対する一次抗体（猫番号 sc-7148; ポリクローナルウサギ切断カスパーゼ3抗体; 1:100; Santa Cruz Biotechnology, Inc.）と4˚Cで一晩置 いた。対応する二次抗体とインキュベートした後、ヤギ抗ウサギIgG-FITC（cat. no. sc-2012; 1:100; Santa Cruz Biotechnology, Inc.）を使用した。免疫反応を可視化するために、四塩化ジアミノベンジジン（DAB、Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO、USA）を使用した。免疫反応陽性細胞は、茶色に染色された細胞質を示した。染色強度とその分布は、陰性（染色なし）、弱、中、強に分類された。切断されたカスパーゼ3の量は、画像解析ソフトウェア（Image J, version 1.46a, NIH, Bethesda, MD, USA）を用いて、各セグメントでランダムに選んだ5箇所の面積発現パーセントを平均化することで求めた。
統計解析
本研究のデータは、平均値±SEMとして記録される。比較は、一元配置分散分析に続いてTukey-Kramerポストホック多重比較テストを用いて行った。ノンパラメトリックデータは、Kruskal Wallisテストに続いてDunnテストを用いて分析し、中央値および四分位範囲として表現した。データ解析には、Graph Pad Prism Program, v.5.を導入した。P < 0.05は統計的に有意であるとみなされる。
結果
大腸菌のβ-グルクロニダーゼ活性のスクリーニングと、異なる濃度のイリノテカンに対する増殖動態
本研究では、健康なボランティアの便から回収した3つの臨床大腸菌を対象に、イリノテカンの代謝変換と毒性に関与するβ-グルクロニダーゼ酵素を産生する能力を表現型的に検討した。試験した3つの大腸菌は、発色酵素基質であるp-ニトロフェニル-p-D-グルコピラノシデュロン酸（PNPG）を加水分解することができ、6時間後にカナリアイエローを呈し、β-グルクロニダーゼ酵素活性を示すことが確認された。
大腸菌の増殖速度に対するイリノテカンの阻害効果を推定するため、イリノテカンを異なる濃度で投与したところ、陽性増殖対照群と比較して、試験した最高濃度の10 mg/mLを除いて大腸菌の増殖速度に影響を及ぼさないことが示された。イリノテカン（10 mg/mL）は、（図1）に見られるように、完全な増殖阻害を引き起こすことなく、大腸菌の増殖速度を著しく遅延させた。
図1
大腸菌AF01、大腸菌AF02、大腸菌AF03の成長速度に対するイリノテカン濃度の影響。* p < 0.05 ** p < 0.01
フルサイズ画像
大腸がんおよびイリノテカン治療患者における腸内細菌叢の変化（健常者グループと比較して
健常者、大腸がん、イリノテカン治療患者の3群における腸内細菌叢組成を、16S rRNAメタゲノミクスシーケンスアプローチにより解析しました。大腸がんおよびイリノテカン治療では、健常者グループと比較して明らかな微生物叢の摂動が見られた（図2a）および（図S1）。健常者群では、BacteriodetesよりもFirmicutesが多く、大腸がんやイリノテカン投与群ではその逆であった。また、健常者群では Actinobacteria と Verrucomicrobia が顕著に存在し、大腸がん群または Irinotecan 処理群では Cyanobacteria が認められた。
図2
16S rRNAメタゲノミクスシーケンスで評価した、健常群、大腸がん群、イリノテカン群の腸内細菌叢実存量。イリノテカンは微生物叢実存量を低下させた（a）。健常者、大腸がん、イリノテカン治療群におけるα多様性の推定（b）Shao indexはp値0.019025 [ANOVA] F値5.8035で有意な多様性を示し、（c）Shannon indexはp値 0.027945 [ANOVA] F値 5.0403 で有意な多様性を示しています。Bray Curtis Indexに基づく3群間のβ多様性、[PERMANOVA] F値 1.6378; R二乗 0.22945; p値 0.032 (d)
フルサイズ画像
いくつかのα多様性指標（例えば、ChaoやShannon）を用いて、イリノテカン投与群の腸内細菌叢の豊かさと多様性が健常群および大腸がん群と比較して減少していることを示した（図2b、c）。各群のコア細菌分類群は、異なる分類学的レベルで同定された（図S2）。
OTUの相対的な存在量に基づき、全グループの腸内細菌叢の構造の違いを明らかにするために、Bray Curtis Indexに基づくβ多様性と主座標分析（PCoA）を実施した。その結果、健常者グループと他グループのコミュニティとの間に有意な非類似性が見られた（p < 0.05）。しかし、大腸がんグループとイリノテカングループはいずれも多かれ少なかれ類似していた（図2d）。
存在量の差の検定では、統計的な検定を用いて、特定の微生物の相対的な存在量が研究グループ間で有意に異なるかどうかを判断します。ANCOMは、各分類群の存在量と残りのすべての分類群の存在量の対数比を1つずつ比較することで、サンプルグループ間で存在量の異なる分類群を特定することができました。ANCOM解析の結果、Bacteroidalesは他のグループよりも健康なグループのバイオマーカーとなりうることが示された（図3a）。さらに、DESeq2を用いた存在量の差分解析を行ったところ、Verrucomicrobia門が他のグループよりも健常者グループにおいて有意であることが示されました（図3b）。健常群、大腸がん群、イリノテカン群における微生物相の上位特徴の相関ネットワークとパターンサーチプロットをそれぞれ（図S3、S4）に表す。さらに、健常者、大腸がん、イリノテカン群における微生物群の系統図と存在量に基づくデンドログラムを（図S5）に示す。
図3.
(a)ANCOM解析プロットを用いた存在量の差は、健常者グループにおけるBacteroidalesの存在量を示し、(b)DESeq2解析では、健常者グループにおいてVerrucomicrobia門が最も有意なマーカーとして示される。
フルサイズ画像
線形判別分析（LDA）効果量（LEfSe）分析では、クラスカル・ワリス検定、ウィルコクソン・ランク・サム検定、線形判別分析を使って、グループのバイオマーカーを見つけます。この解析では、グループを区別する細かい分類群のいくつかを選び出すことができました（図4a）。実際、大腸がんグループとイリノテカングループでは、アクチノバクテリア門、Verrucomicrobia、Bifidobacterium属、Gimmiger、Phascolarctobacterium、Bacteroidales S24-7 と Desulfovibronales科の存在量が健康グループと比較して減少していた（図4b）。特にVerrucomicrobiaは健常者に比べ、大腸がん群、イリノテカン群ともに存在しなかった。一方、Lactobacillus属、Veillonella属、Clostridium属、Butryicicoccus属、Prevotella属の存在量は、イリノテカン投与群では健康群および大腸がん群に比べ増加した（図4c）。また、腸内細菌科とDialister属は、健常者とイリノテカン投与群に比べ、大腸がん群で存在量が増加した（図4d）。
図4
a)クラドグラムで示された腸内細菌叢の線形判別分析（LDA）効果量（LEfSe）；分類学的レベルはリングで表現されている。健常群、大腸がん群、イリノテカン群はそれぞれ緑、赤、青で着色されている。b) 健常群における有意に注目された腸内細菌群の相対存在量のヒストグラム（A、B、C、D、E、Fはそれぞれ Actinobacteria、Bifidobacterium、Bacteroidales S24-7, Gemmiger, Phascolarctobacterium, Desulfovibronales）； c)イリノテカン投与群と健常者投与群および大腸がん投与群との腸内細菌量の比較（A、B、C、D、EはそれぞれLactobacillus, Veillonella, Clostridium, Butryicicoccus, Prevotella）を示したヒストグラム； d)健康群およびイリノテカン群と比較した大腸がん群の腸内細菌叢の相対存在量のヒストグラム(AおよびBはそれぞれDialisterおよびEnterobacteriaceae); e) KEGG pathway hierarchy level 2 [38] によるイリノテカン、健康、大腸がん群における腸内細菌叢の予測される機能. 縦列はグループを表し、横列は代謝経路を表す。f) KEGGパスウェイ階層レベル3によるイリノテカン群、健常者群、結腸がん群の腸内細菌群の予測機能[38]。縦列はグループを表し、横列は代謝経路を表す。色分けは、行のzスコアに基づいています。
フルサイズ画像
さらに、マイクロバイオーム構造とマイクロバイオーム機能を考慮するため、PICRUStを用いて16S rRNA遺伝子配列データからメタゲノムプロファイルを予測した。その結果、KEGGパスウェイ階層レベル2によると、イリノテカン治療患者ではすべてのパスウェイの発現が低下していることが示された（図4e）[38]。KEGGパスウェイ階層レベル3（図4f）[38]に従って選択したマイクロバイオーム機能を深く調査したところ、大腸がん群では、重金属症、病原性大腸菌感染、膀胱がん、前立腺がん、上皮細胞への細菌侵入、細菌毒素、アポトーシスに関連する特定のパスウェイが過剰発現することが判明しました。また、黄色ブドウ球菌感染症に関連するパスウェイがイリノテカン投与群で過剰発現していた。
大腸がん患者に多い腸内細菌科の大腸菌由来のβ-グルクロニダーゼの発現とプロバイオティクス治療に対する発現の変化
大腸菌由来のΒ-グルクロニダーゼは、イリノテカンの下痢性毒性の発現に重要な役割を果たす。そこで、β-グルクロニダーゼの発現量（uidP遺伝子をcysG参照遺伝子で正規化）を低下させるための様々なプロバイオティクスまたはその組み合わせの効果を検討した。L.plantarum、L.acidophilus、L.rhamnosusを混合して大腸菌を培養した場合、それらのいずれかを単独で使用するよりもuidP遺伝子の発現量を最も顕著に低下させた（Fig. 5）。
図5
大腸菌に、a) L. acidophilus、b) L. plantarum、c) L. rhamnosus、d) Lactobucillus属3種の混合菌を添加したときのuidA遺伝子（β-グルクロニダーゼをコード）の発現をcysG参照遺伝子の発現で正規化。各実験は、プロバイオティクス細胞ペレット、またはpH5またはpH7に調整した無細胞上清中のプロバイオティクス生代謝物を用いて行った。 p > 0.05, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 でNs（非有意）。
フルサイズ画像
プロバイオティクスの生体内投与によるイリノテカン誘発酸化ストレスの制限
イリノテカン誘発毒性に対抗するプロバイオティクスの能力を調べるために、in vivoマウスモデルが使用されました。基本的に、イリノテカンの投与は、コントロールグループと比較して、大腸のMDA量を有意に増加させ、GSH量とSOD活性を低下させました。L.アシドフィルス、L.プランタラム、L.ラムノサスおよびそれらの混合物をイリノテカンと一緒に投与すると、大腸のMDA含有量が著しく低下し、GSH含有量とSOD活性が著しく上昇した（図6A、B、C）。プロバイオティクス混合物は、L. rhamnosusと比較してMDAを有意に減少させ、L. rhamnosusとL. acidophilusと比較してSODに有意な効果を示しました。これらの結果は、プロバイオティクス混合物の顕著な効果を示唆しており、どれかを単独で使用するよりも優れた抗酸化作用が得られることを示しています。
図6
プロバイオティクスはイリノテカン誘発の酸化ストレスを抑制した。大腸MDA（A）、減少したGSH（B）、およびSOD（C）。各バーは、6匹のマウスの平均±SEMを表す。統計は、一元配置分散分析（ANOVA）およびTukeyの多重比較検定により実施した。*a イリノテカン群との有意差 p < 0.05 b イリノテカン＋L. アシドフィルス群との有意差 p < 0.05 c イリノテカン＋L. ラムノサス群との有意差 p < 0.05
フルサイズ画像
プロバイオティクスはイリノテカン誘発の炎症事象に対抗した
イリノテカン投与により、大腸のTNF-αおよびIL-6のタンパク質発現量が対照群に比べ有意に増加した。L.アシドフィルス、L.プランタラム、L.ラムノサス、およびそれらの混合物をイリノテカンと共に投与すると、イリノテカン群と比較して、結腸のTNF-αおよびIL-6タンパク質発現レベルの有意な低下が引き起こされた（図7AおよびB）。プロバイオティクス混合物は、L. rhamnosusおよびL. acidophilusと比較して、大腸のTNF-αおよびIL-6タンパク質の発現レベルを有意に低下させた。これらの結果は、プロバイオティクス混合物を単独で使用するよりも、プロバイオティクス混合物の顕著な抗炎症効果を示唆している。
図7
プロバイオティクスは、イリノテカンによって誘発された炎症イベントを抑制した。TNF-α（A）およびIL-6（B）。各バーは、6匹のマウスの平均±SEMを表す。統計は、一元配置分散分析（ANOVA）およびTukeyの多重比較検定により実施した。*a イリノテカン群との有意差 p < 0.05. b イリノテカン＋L. アシドフィルス群との有意差 p < 0.05. c イリノテカン＋L. ラムノサス群との有意差 p < 0.05. 図8】H＆E染色した結腸切片を示す代表的な顕微鏡写真（スケールバー、50μm）；（A）対照、正常な組織学的構造を示す。(B、C、DおよびE）L. acidophilus、L. plantarum、L. rhamnosusおよびプロバイオティクス混合物をそれぞれ処理し、組織病理学的変化を示さないことがわかる。(F, G & H) イリノテカン処理により、粘膜および粘膜下層に大量の炎症細胞浸潤（if）、粘膜下層の浮腫（ed）および局所的な粘膜壊死（nc）を示した。(I) イリノテカン＋L. acidophilus処理により、粘膜および腺上皮のアポトーシス（ap）および粘膜下層の浮腫（ed）を示す。(J）イリノテカン＋L. plantarum処理では、わずかな粘膜下浮腫（ed）および少数の炎症細胞浸潤（if）を示した。(K）イリノテカン＋L. rhamnosus、粘膜に炎症細胞浸潤（if）、粘膜下層に浮腫（ed）が見られる。(L）イリノテカン＋プロバイオティクス混合液、病理組織学的変化は見られない。
フルサイズ画像
病理組織学的特徴
顕微鏡で見ると、コントロールマウスの大腸は、正常な組織構造（粘膜、リーベルキューンの陰窩、粘膜下層、筋層）を示した（図8A）。さらに、L. acidophilus、L. plantarum、L. rhamnosus、およびプロバイオティクス混合物で処理したマウスの大腸は、組織学的変化を示さなかった（図8B、C、D、E）。一方、イリノテカンを投与したマウスの結腸は、粘膜および粘膜下層における大量の炎症細胞の浸潤、ならびに粘膜下層の浮腫（図8FおよびG）および炎症細胞の浸潤に続く局所的な粘膜壊死（図8H）として記述される重度の病理組織学的病変を呈した。一方、イリノテカン＋アシドフィルス菌投与マウスの大腸切片では、粘膜分泌細胞の過形成、粘膜および腺上皮のアポトーシス、粘膜下層の浮腫が認められた（図8I）。一方、イリノテカン＋L. plantarumを投与したマウスの大腸では、粘膜下層の浮腫と炎症細胞の浸潤がわずかに認められただけで、改善した画像が観察された（図8J）。また、イリノテカン＋L. rhamnosus投与マウスの大腸組織では、粘膜分泌腺の過形成、粘膜の炎症細胞浸潤、粘膜下層の浮腫など、中程度の改善が認められた（図8K）。さらに、大腸の病理組織学的変化は認められなかったが、大腸の組織構造の顕著な回復が、大腸を投与したマウスの切片で見られた（図8L）。大腸炎モデルにおける病理組織学的病変のスコアは、対照群および治療群と比較して、有意に増加した。さらに、最も顕著な改善は、（表3）に示されるように、イリノテカン＋プロバイオティクス混合物処理群で記録された。
図8
図8：H＆E染色した結腸切片の代表的な顕微鏡写真（スケールバー、50μm）；（A）コントロール、正常な組織学的構造を示す。(B、C、DおよびE）L. acidophilus、L. plantarum、L. rhamnosusおよびプロバイオティクス混合物をそれぞれ処理し、組織病理学的変化を示さないことを示す。(F, G, H) イリノテカン処理により、粘膜および粘膜下層に大量の炎症細胞浸潤（if）、粘膜下層の浮腫（ed）および局所的な粘膜壊死（nc）を示した。(I) イリノテカン＋L. acidophilus処理により、粘膜および腺上皮のアポトーシス（ap）および粘膜下層の浮腫（ed）が認められた。(J）イリノテカン＋L. plantarum処理では、わずかな粘膜下浮腫（ed）および少数の炎症細胞浸潤（if）を示した。(K）イリノテカン＋L. rhamnosus、粘膜に炎症細胞浸潤（if）、粘膜下層に浮腫（ed）が見られる。(L）イリノテカン＋プロバイオティクス混合液、病理組織学的変化は見られない。
フルサイズ画像
表3 病理組織学的病変のスコア
フルサイズ表
免疫組織化学
切断型カスパーゼ3発現
カスパーゼ-3の免疫組織化学的染色では、コントロールの正常マウス、およびL. acidophilus、L. plantarum、L. rhamnosus、およびプロバイオティクス混合物で処理したマウスの結腸組織では、それぞれ発現が見られなかった（図9A、B、C、DおよびE）。逆に、イリノテカン投与マウスの結腸切片では、カスパーゼ-3の強い陽性発現が記録された（図9F）。一方、イリノテカン＋アシドフィルス投与群の切片では、カスパーゼ3の陽性発現の減少が観察された（図9G）。一方、イリノテカン＋L. plantarum投与群のマウスの大腸では、カスパーゼ3の弱い発現が認められた（Fig. 9H）。その他、イリノテカン＋L. rhamnosusを投与したマウスの大腸では、中程度の免疫発現が認められた（図9I）。逆に、イリノテカン＋プロバイオティクス混合物を投与したマウスの大腸では、カスパーゼ3の免疫発現が調査されなかった（図9J）。切断カスパーゼ-3タンパク質発現レベルの免疫組織化学的調査の画像解析結果は、（図10）に示されている。
図9
カスパーゼ3免疫染色結腸切片の代表的な顕微鏡写真（スケールバー、50μm）；A コントロール、免疫発現がない正常な状態を示す。B, C, D, E L. acidophilus, L. plantarum, L. rhamnosusおよびプロバイオティクス混合物をそれぞれ処理した場合、カスパーゼ-3の発現がないことを示す。F イリノテカン、強い陽性のカスパーゼ-3免疫発現を示す（矢印）。G イリノテカン＋L. アシドフィルス、茶色染色陽性細胞の数が減少していることを示す。H イリノテカン＋L. plantarum、カスパーゼ3の弱い発現を示す（矢印）。I イリノテカン＋L. rhamnosus、中程度の免疫発現を示す（矢印） (J) イリノテカン＋プロバイオティクス混合物、カスパーゼ3免疫発現を示さない。
フルサイズ画像
図10
免疫組織化学的手法による切断型カスパーゼ3タンパク質の発現レベルの画像解析結果。各バーは、平均値±SEMを表す（n = 5）。統計は、一元配置分散分析（ANOVA）およびTukeyの多重比較検定により実施した。*a イリノテカン群との有意差 p < 0.05 b イリノテカン＋L. アシドフィルス群との有意差 p < 0.05 c イリノテカン＋L. ラムノサス群との有意差 p < 0.05 d イリノテカン＋L. プランタルム群との有意差p < 0.05
フルサイズ画像
考察
イリノテカン（CPT-11）は、様々な固形がんに対して抗がん作用を有しています。しかし、重度の下痢はイリノテカンを用いた化学療法中の罹患率の最も高い原因の一つである。細菌性β-グルクロニダーゼは腸内細菌の酵素で、腸管内腔でSN-38Gを脱共役化し、毒性体SN-38を放出し、イリノテカンによる下痢の主原因となる。したがって、細菌のβ-グルクロニダーゼを抑制することは、イリノテカンによる下痢に対する予防的アプローチと考えられている。
本研究では、L. plantarum、L. acidophilus、L. rhamnosusについて、大腸菌由来のβ-グルクロニダーゼ発現量（uidP）を減少させる能力を単一および混合形態で検討しました。大腸菌の培養液に3種のLactobacillus属の混合菌を添加した場合、単独で添加した場合よりもuidPの減少が最も顕著であった。L. rhamnosusはuidP遺伝子の発現を減少させたが、統計的に有意ではなかった。L.acidophilusとL.plantarumは統計的に有意な遺伝子発現の減少を示したが、そのレベルは3つの乳酸菌の混合物によって誘導されたものよりも低い。 したがって、混合物はβ-グルクロニダーゼ活性を低減するための最良の選択肢であることが示された。
同様に、L. plantarum CFR 2194をFOSを炭素源とする基本培地で大腸菌と共培養すると、β-グルクロニダーゼをより顕著に阻害し、濾液中の有機酸、特にn-酪酸の生産がβ-グルクロニダーゼ生産の検出低下に関連していることが示唆されました［39］。
これまで、ペニシリンやストレプトマイシン[40]、ネオマイシン[41]、コレスチラミンとレボフロキサシンの併用[42]などの抗生物質を用いて、微生物叢を除去して細菌のβ-グルクロニダーゼ発現量を減少させることが行われていた。それでも、抗生物質は、他の正常な有益な腸内細菌に有害な影響を及ぼす。ガイドラインによると、遅延性下痢は、食生活の改善や、ソマトスタチンアナログのオクトレオチド、ロペラミド、脱臭アヘンチンキなどの特定のメカニズムに基づく従来の止瀉薬の使用によりコントロールできるかもしれない。しかし、これらの薬は、既存の胃腸の問題を悪化させ、不整脈、呼吸不全、神経障害、けいれんなどの深刻な影響を誘発することがあります[43]。したがって、遅延性下痢に対するより多くの実際の治療法を見つけることが必要であり、ハーブエキス、植物化学物質、プロバイオティクスを含む新しい新興の方法を調査する必要がある[43、44]。
in vitro研究で得られた結果をさらに裏付けるために、マウスモデルを用いたin vivo研究を計画し、プロバイオティクスがイリノテカン誘発の下痢に対抗し、その毒性を低下させる能力を調査しました。本研究で使用したモデルは、がん患者における粘膜炎を模倣したものであることが以前に報告されています。イリノテカンの投与は、対照群と比較して、大腸のMDA量を有意に増加させ、GSH量とSOD活性を減少させた。L. acidophilus、L. plantarum、L. rhamnosus、およびそれらの混合物をイリノテカンと一緒に投与すると、大腸のMDA量が有意に減少し、GSH量とSOD活性が大幅に上昇しました。プロバイオティクス混合物は、L. rhamnosusと比較してMDAを有意に減少させ、L. rhamnosusおよびL. acidophilusと比較してSODに有意な効果を示しました。これらの結果は、単一処理よりも優れた効果をもたらすプロバイオティクス混合物の顕著な抗酸化作用を示唆しています。L. acidophilus、L. plantarum、L. rhamnosusおよびそれらの混合物の投与は、コントロールマウスと比較して、大腸の酸化ストレスおよび抗酸化状態を有意に変化させなかった。マロンジアルデヒド（MDA）は、酸化ストレスの予測可能なマーカーである。イリノテカンの腹腔内注射は、チオール基、抗酸化タンパク質レベル、およびSODを含む抗酸化酵素の活性の激しい減少とともに、腸のMDA含量を増加させると報告された[45]。今回の結果と同様に、プロバイオティクスは、糖尿病性腎症において、血清GSHおよびMDAレベルの有意な低下を通じて、強力な抗酸化作用を発揮することが判明しました[46]。
同様に、プレバイオティクス、プロバイオティクス、シンバイオティクスの補給が、慢性腎臓病患者の心代謝および酸化ストレスにおいて、GSHレベルを有意に増加させ、MDAレベルをかなり減少させることが報告されました[47]。MDAの減少は、プロバイオティクスやシンバイオティクスの補給による脂質プロファイルの改善に起因している可能性があります[48]。さらに、プロバイオティクスやシンバイオティクスは、グルタミン酸システインリガーゼ（GCL）の活性を高めることにより、GSHレベルを高める可能性があります[49]。また、インビボでの調査により、大腸環境におけるさまざまなプロバイオティクスがSOD産生の増強を引き起こすことが明らかになった[50]。
イリノテカン投与マウスの結腸切片の病理組織学的検査では、粘膜および粘膜下層における大量の炎症性細胞の浸潤、粘膜下層の浮腫、局所的な粘膜壊死といった重度の病理組織学的病変を認めた。これらの結果は、これまでに発表された研究[51,52,53,54]によっても確認されました。3種の乳酸菌の経口投与は、スケジュール特異的な方法でイリノテカン誘発下痢を軽減する潜在的効果を明らかにした。イリノテカン＋L. acidophilusを投与したマウスの結腸切片の病理組織学的検査では、結腸像がわずかに改善した。一方、イリノテカン＋L. plantarumを投与したマウスの結腸切片を調べたところ、顕著な改善が見られた。また、イリノテカン＋L. rhamnosusを投与したマウスの結腸組織では、中程度の改善が認められました。Lactobacillus属の混合物の経口投与は、結腸組織の正常な病理組織学的構造の回復を示しました。
同様に、VSL#3などのプロバイオティクス製剤は、上皮の増殖を増加させ、イリノテカン治療後の粘膜層の硬化に含まれることが以前に報告されています。また、VSL#3はイリノテカン治療後の腸管アポトーシスを抑制し、粘膜崩壊や陰窩の傷害を回避するのに役立つとされています。さらに、VSL#3は、イリノテカン治療後の杯細胞数の増加やムチン分泌の増加を抑制した。このような効果は、腸内の水分や電解質のバランスを維持し、下痢を予防する。プロバイオティクスの保護効果は、化学療法使用前に特定のレジメンで投与された場合にのみ最大になると考えられている[51]。
イリノテカンの毒性における炎症の役割と、プロバイオティクスの保護効果のメカニズムとして提案されている抗炎症作用の可能性をさらに探るため、TNF-α、およびIL-6のタンパク質発現レベルを測定した。イリノテカン投与は、コントロール群に比べ、大腸のTNF-α、IL-6タンパク質発現量を有意に増加させました。L. acidophilus、L. plantarum、L. rhamnosus、およびそれらの混合物をイリノテカンと共に投与すると、イリノテカン群と比較して、大腸のTNF-αおよびIL-6タンパク質の発現レベルが有意に減少した。プロバイオティクス混合物は、L. rhamnosusおよびL. acidophilusと比較して、大腸のTNF-αおよびIL-6タンパク質の発現レベルを有意に減少させた。これらの結果は、プロバイオティクス混合物が単一菌株よりも顕著な抗炎症活性を持つことを示唆している。また、L. acidophilus、L. plantarum、L. rhamnosusおよびそれらの混合株の経口投与は、対照群と比較して、大腸の炎症状態を有意に変化させることはなかった。プロバイオティクスが保護効果を発揮する可能性の高いメカニズムを調べるため、切断型カスパーゼ3の免疫組織化学的標識が行われた。大腸切片では、L. acidophilus、L. plantarum、L. rhamnosusおよびそれらの混合物を投与したマウスと同様に、コントロールマウスの大腸組織で切断型カスパーゼ-3の陰性発現が認められた。
逆に、イリノテカン投与マウスの結腸切片では、切断型カスパーゼ3の強い陽性発現が記録された。イリノテカン投与マウスにラクトバチルス属の菌株を単独または組み合わせて投与すると、カスパーゼ3陽性発現が有意に減少し、カスパーゼ3発現レベルがほぼ正常化したことから、プロバイオティクス混合物でより良い効果が示されました。プロバイオティクス処理は、TNF-α、インターロイキン-1α（IL-1α）およびインターフェロン-γ（IFN-γ）による腸の上皮細胞のアポトーシスを防止した［55］。これらの炎症性物質は、化学療法による粘膜炎の予後に関与していた[56,57,58]。
今回の検討では、大腸菌3株の増殖速度に対するイリノテカンの抗菌効果をin vitroで、腸内細菌叢全体に対する効果をin vivoで検討し、イリノテカンの腸内細菌叢への作用を解析しました。イリノテカンの抗菌効果については、他の試験では検討されていない。イリノテカンは大腸菌の増殖を抑制しなかったが、10mg/mlの高濃度でのみ大腸菌の増殖に有意な遅延を引き起こした。このことは、腸内大腸菌は高濃度のイリノテカンでも増殖し、イリノテカンの毒性に寄与するβ-グルクロニダーゼを産生できるはずであることを示しています。
また、健常者、大腸がん患者、イリノテカン治療患者の便を採取し、メタゲノム法によりイリノテカンが腸内細菌叢に及ぼす影響について検討しました。3つのグループの腸内細菌群集は、16S rRNAシーケンシングアプローチによって分析されました。一般に、腸内細菌叢には、投与方法、食事、医薬品、プロバイオティクス、プレバイオティクス、糞便移植、年齢、性別、民族性などの人口統計学的要因など、多くの要因が影響しうる[59、60]。よく知られている腸内細菌叢の構成は、一般に、微生物群集全体の90％以上を占める4つの支配的な門（Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria、Proteobacteria）に依存する。さらに、VerrucomicrobiaやFusobacteriaのような他のマイナーなフィラも含まれている[61]。
本研究では、ActinobacteriaとVerrucomicrobia、Bifidobacterium、Gimmiger、Phascolarctobacteriumの属、Bacteroidales S24-7とDesulfovibronalesの科が、大腸癌とイリノテカン投与群よりも健常群で非常に豊富であることが示された。このような腸内細菌叢の存在量の低下は、炎症の増加や様々な腸疾患の原因となる可能性がある[62, 63]。
アクチノバクテリア（例えば、ビフィドバクテリウム）、は、健康な人の総腸内細菌の優勢なフィラの一つであることがよく知られている[64]。さらに、Akkermansia属を含むVerrucomicrobia phylaは、炎症や腸のバリア機能を回復させるエンドカンナビノイドの腸内レベルを増加させることが報告された[65]。さらに、ゲンミガーとファスコラクトバクテリウムは、大腸細胞に総エネルギー需要の約70％を供給するギ酸、酪酸、酢酸、プロピオン酸、またはその他の短鎖脂肪酸（SCFA）を合成し、宿主の代謝状態と気分を高めることに結び付けられる可能性があります[66]。
Bacteroidales S24-7は、Bacteroidales目の未培養のファミリーで、腸の機能と健康に影響を与える宿主と微生物の相互作用に関与していることが示された[67, 68]。Desulfovibrionalesは、タウリンなどの基質をH2Sに還元する大きな役割を担っており、7α-dehydroxylating beneficial bacteriaにとって必要な増殖因子であることが報告されました[69]。
今回の研究では、大腸がん群では、健康群およびイリノテカン投与群に比べ、Enterobacteriaceae科、Dialister属の存在量が多く、LactobacillusおよびBifidobacteriumの存在量は少なかった。腸内細菌科細菌は、腸上皮層のβ酸化能力を低下させる日和見病原体とみなされることが多いことは、特筆に値する。したがって、酸素は腸内に分散し、通性嫌気性腸内細菌のコロニー形成を促進することが予想される[70]。さらに、大腸癌（CRC）の初期段階では、抗炎症性のSCFAを生成することが認められているLactobacillus、Clostridium、Bifidobacteriumなどの微生物叢が減少し、ジアミン酸化物（DAO）、D-乳酸、LPSなどの腸上皮層を傷つけるマーカーの上昇と負の関係にあることが特徴であった。常在菌による日和見感染症の排除は、大腸がんを含む消化器疾患に対する自然な防御策となりうる。プロバイオティクス細菌（ラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属）は、微生物酵素の不活性化を介して抗発がん特性を有する [71] 。
微生物叢のディスバイオシスとともに、病原性細菌もCRCのようないくつかの疾患において重要である。本研究では、健常者群に比べ、大腸がん群でプレボテラが増加した。Bacteroides-Prevotellaグループに属する細菌が、健常対照者と比較してCRC患者の便検体でより高いレベルにあることが以前に指摘されている[72]。
イリノテカン投与は、健常者群および大腸がん群と比較して、明らかにいくつかの微生物相の乱れを引き起こし、Lactobacillus属、Veillonella、Clostridium、Butryicicoccus、さらにはPrevotellaの存在量の増加が示された。ラクトバチルス属は健常者群でより多く存在することが予測されるが、イリノテカン投与後にラクトバチルス属が増加することが観察された。これは、イリノテカンの下痢毒性に対抗するためにこのような有益な微生物を増殖させようとする宿主の自己防衛機構と、これらの細菌の抗発がん特性によるものと考えられる。
Veillonella属は、ピルビン酸や乳酸を利用し、酢酸やプロピオン酸、H2、Co2などを生成することが知られています。イリノテカン処理後のこれらの増加は、Lactobacillus属などの乳酸産生菌が増加するためであり、これらの数の増加は、乳酸産生菌の増殖に直ちに付随または相関している[73]。
KEGGパスウェイ階層レベル3に従って選択されたマイクロバイオーム機能を深く調査したところ、大腸がんグループでは、赤痢、病原性大腸菌感染、膀胱がん、前立腺がん、上皮細胞への細菌侵入、細菌毒素、アポトーシスに関する特定のパスウェイが過剰発現することが判明しました。
一部の細菌の毒素や代謝物が、DNAの安定性、細胞周期、細胞増殖、さらには腫瘍の発生や発達に影響を与えることは言及に値する [3, 16] 。一部の細菌は、ライバルを排除しマイクロバイオームで繁栄し続けるために、DNAを破壊する方法を進化させました。このような細菌の防御因子は、不幸にも発がんに関与する変異を引き起こす可能性があります[3]。
いくつかのプロテオバクテリアは、細胞拡張毒素（CDT）とコリバクチン（pks遺伝子座によってコードされ、大腸菌 [74] と他の腸内細菌科 [75] によって発現）を生成します。Bacteroides fragilis toxin (Bft)は、腸内毒素原性B. fragilisによって生産される [3, 76, 77]。コリバクチンは、ヒト大腸腫瘍におけるpks + 大腸菌の同定や、コリバクチン発現大腸菌がマウスにおける腸管腫瘍形成を悪化させる可能性があることから、大腸発がんにおける注目分子として浮上している [78, 79]。哺乳類細胞は、コリバクチンやCDTによる二本鎖DNA損傷を受けやすい[80]。Bftは活性酸素種（ROS）の上昇を引き起こすため、宿主のDNAは間接的に損傷を受ける[81]。大量の活性酸素種（ROS）は、体内の自然な修復能力を圧倒することにより、DNA損傷や突然変異を引き起こす可能性があります[3]。
結論
腸内細菌叢は、大腸がん、およびイリノテカンベースの化学療法によって変化した。腸内細菌叢は化学療法の有効性と毒性の決定に大きく関与しており、その中でも細菌のβ-グルクロニダーゼ酵素はイリノテカンの毒性を引き起こす。現在では、化学療法薬の有効性を促進し、毒性を減少させるために、腸内細菌叢を目的とし、調節することができる。プロバイオティクスは、化学療法使用中の粘膜の完全性を維持し、イリノテカン化学療法薬の毒性を軽減または減少させることができます。細菌の変質による大腸粘膜の軽度の炎症を防ぐためにプロバイオティクスを使用することは、将来的に最も有望な治療法であると考えられる。ラクトバチルス属混合物の経口投与により、大腸組織の正常な病理組織学的構造の回復が見られた。プロバイオティクスの保護効果は、特定のレジメン、すなわち化学療法投与の前後に投与された場合にのみ最大となる。プロバイオティクスは、炎症と酸化的危害の抑制を通じて、イリノテカン誘発の腸管粘膜炎を減少させる。この研究では、プロバイオティクスを使用して大腸菌のβ-グルコルニダーゼ発現を低下させ、下痢を抑えることで、イリノテカン毒性に対抗する方法を強調しました。最後に、本研究では、特定のプロバイオティクスレジメンを用いて、粘膜炎と異常組織構造の低下、イリノテカンの酸化ストレスの低下、イリノテカンの細胞炎症の低下、イリノテカンのアポトーシスカスケード誘導の低下が報告されました。
この研究の限界は、被験者数の少なさ、いくつかの変数に対する考慮不足、研究に登録する被験者の多様性であった。環境および文化（したがって食物）の違いは考慮されていない。さらに、本研究では、希少な地域住民の潜在的な役割や、細菌、ウイルス、真菌の間の複雑な相互作用については触れていない。
データおよび資料の利用可能性
16S配列データはNCBIのSequence Read Archive（SRA）に提出され、アクセッション番号（SRR19141967～SRR19141981）、（Bioproject：PRJNA836383）、（Biosample：SAMN28159325～SAMN28159339）が付与されています。
本論文の結論を裏付けるデータセットは、figshareリポジトリ（https://figshare.com/articles/dataset/Sequences_rar/20056499）で公開されています。
参考文献
Scher JU, Nayak RR, Ubeda C, Turnbaugh PJ, Abramson SB. 炎症性関節炎におけるファーマコバイオミクス：治療反応の調節因子としての腸内細菌叢。Nat Rev Rheumatol. 2020;16:282-92.
記事 PubMed Google Scholar
Palmirotta R, Carella C, Silvestris E, Cives M, Stucci SL, Tucci M, Lovero D, Silvestris F. SNPs in predicting clinical efficacy and toxicity of chemotherapy: walking through the quicksand. Oncotarget. 2018;9:25355-82.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
ギャレットWS. がんと微生物叢(microbiota)。Science. 2015;348:80-6.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar（パブメドセントラルグーグルスカラー
Pellock SJ, Creekmore BC, Walton WG, Mehta N, Biernat KA, Cesmat AP, Ariyarathna Y, Dunn ZD, Li B, Jin J, et al. Gut Microbial β-Glucuronidase Inhibition via Catalytic Cycle Interception. ACS Cent Sci. 2018;4:868-79.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
イリノテカンはラットにおいてタイトジャンクションを傷害し、細菌のトランスロケーションを引き起こす。J Surg Res. 2012;173:341-7.
論文 CAS PubMed Google Scholar
大腸癌における細菌転座は臨床的に重要な現象ではない．World J Surg. 2005;29:198-202.
記事 PubMed Google Scholar
Arifa RDN, Paula TP, Madeira MFM, Lima RL, Garcia ZM, Ÿvila TV, Pinho V, Barcelos LS, Pinheiro MVB, Ladeira LO, et al. The reduction of oxidative stress by nanocomposite Fullerol decreases mucositis severity and reverts leukopenia induced by Irinotecan. Pharmacol Res. 2016;107:102-10.
記事CAS PubMed Google Scholar
Gao R, Gao Z, Huang L, Qin H. Gut microbiota and colorectal cancer. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2017;36:757-69.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
ゴパラクリシュナンV、ヘルミンクBA、スペンサーCN、ルーベンA、ウォーゴJA. 腸内細菌叢ががん、免疫、がん免疫療法に及ぼす影響．Cancer Cell. 2018;33:570-80.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Meng C, Bai C, Brown TD, Hood LE, Tian Q. Human Gut Microbiota and Gastrointestinal Cancer. ゲノミクス・プロテオミクス・バイオインフォーム. 2018;16:33-49.
記事 Google Scholar
Wong SH, Yu J. Gut microbiota in colorectal cancer: mechanisms of action and clinical applications. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2019;16:690-704.
記事CAS PubMed Google Scholar
Vivarelli S, Salemi R, Candido S, Falzone L, Santagati M, Stefani S, Torino F, Banna GL, Tonini G, Libra M. Gut microbiota and cancer: From pathogenesis to therapy. Cancers. 2019;11:38.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Di Domenico M, Ballini A, Boccellino M, Scacco S, Lovero R, Charitos IA, Santacroce L. The Intestinal Microbiota May Be a Potential Theranostic Tool for Personalized Medicine. J Personal Med. 2022;12:523.
論文 Google Scholar
Polimeno L, Barone M, Mosca A, Viggiani MT, Di Leo A, Debellis L, Troisi M, Daniele A, Santacroce L. Gut microbiota imbalance is related to sporadic colorectal neoplasms. パイロットスタディ。アプライド・サイエンス. 2019;9:5491.
記事CAS Googleスカラー
Santacroce L, Man A, Charitos IA, Haxhirexha K, Topi S. Current knowledge about the connection between health status and gut microbiota from birth to elderly A narrative review. Front Biosci Landmark. 2021;26:135-48.
記事CAS Googleスカラー
Roy S, Trinchieri G. Microbiota: a key orchestrator of cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2017;17:271-85.
記事CAS PubMed Google Scholar
Arthur JC, Jobin C. The struggle within: Microbial influences on colorectal cancer. Inflamm Bowel Dis. 2011;17:396-409.
論文 PubMed Google Scholar
腸内細菌科の乳糖発酵菌におけるβ-グルクロニダーゼの検出と尿培養細菌におけるその存在。J Clin Microbiol. 1984;20:1177-9.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Teh CH, Nazni WA, Nurulhusna AH, Norazah A, Lee HL. ハエ幼虫抽出物の抗菌活性と最小発育阻止濃度の測定（レサズリンベース濁度測定法）。BMC Microbiol. 2017;17:36.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
ルーレンソ FR. Pinto TdJA: Kinetic-reading microplate systemを用いた抗生物質微生物アッセイ。Braz J Pharm Sci. 2011;47:573-84.
論文 Google Scholar
Klindworth A, Pruesse E, Schweer T, Peplies J, Quast C, Horn M, Glöckner FO. 古典的および次世代シーケンサーに基づく多様性研究のための一般的な16SリボソームRNA遺伝子PCRプライマーの評価。Nucleic Acids Res. 2013;41:e1.
論文CAS PubMed Google Scholar
Comeau AM, Douglas GM, Langille MG. Microbiome helper: a custom and streamlined workflow for microbiome research. mSystems. 2017;2:e00127-16.
Finlayson-Trick ECL, Getz LJ, Slaine PD, Thornbury M, Lamoureux E, Cook J, Langille MGI, Murray LE, McCormick C, Rohde JR, Cheng Z. Taxonomic differences of gut microbiomes drive cellulolytic enzymatic potential within hind-gut fermenting mammals. PLoS ONE. 2017;12:e0189404.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, Bittinger K, Bushman FD, Costello EK, Fierer N, Peña AG, Goodrich JK, Gordon JI, et al. QIIMEでハイスループットなコミュニティシーケンスデータの解析が可能になった。Nat Methods. 2010;7:335-6.
論文CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Amir A, McDonald D, Navas-Molina JA, Kopylova E, Morton JT, Zech Xu Z, et al. Deblurは1塩基コミュニティ配列パターンを迅速に解決する. mSystems. 2017;2:e00191-16.
Bokulich NA, Kaehler BD, Rideout JR, Dillon M, Bolyen E, Knight R, Huttley GA, Gregory Caporaso J. Optimizing taxonomic classification of marker-gene amplicon sequences with QIIME 2' q2-feature-classifier plugin. Microbiome. 2018;6:90.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Vázquez-Baeza Y, Pirrung M, Gonzalez A, Knight R. EMPeror: a tool for visualizing high-throughput microbial community data. Gigascience. 2013;2:16.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
メタゲノミックバイオマーカーの発見と説明。ゲノム生物学2011;12:R60.
論文 PubMed PubMed Central Google Scholar
Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014;15:550.
論文 PubMed PubMed Central Google Scholar
Mandal S, Van Treuren W, White RA, Eggesbø M, Knight R, Peddada SD. マイクロバイオームの組成の分析：微生物の組成を研究するための新しい方法。Microb Ecol Health Dis. 2015;26:27663.
PubMed Google Scholar
Douglas GM, Maffei VJ, Zaneveld JR, Yurgel SN, Brown JR, Taylor CM, Huttenhower C, Langille MGI. メタゲノム機能予測のためのPICRUSt2。Nat Biotechnol. 2020;38:685-8.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Dhariwal A, Chong J, Habib S, King IL, Agellon LB, Xia J. MicrobiomeAnalyst: a web-based tool for comprehensive statistical, visual and meta-analysis of microbiome data. Nucleic Acids Res. 2017;45:W180-w188.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Mariam SH, Zegeye N, Tariku T, Andargie E, Endalafer N, Aseffa A. Potential of cell-free supernatants from cultures of selected lactic acid bacteria and yeast obtained from local fermented foods as inhibitors of Listeria monocytogenes, Salmonella spp.and Staphylococcus aureus. BMC Res Notes. 2014;7:606.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Tournayre J, Reichstadt M, Parry L, Fafournoux P, Jousse C. "Do my qPCR calculation", a web tool. バイオインフォメーション. 2019;15:369-72.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Suvarna KS, Layton C, Bancroft JD. Bancroft's theory and practice of histological techniques E-Book. London： Elsevier Health Sciences; 2018. p. 654.
ボーイングT、ゴイスMB、デソウザP、ソメンシLB、サンタアナDMG、ダシルバLM. イリノテカンによるマウスの腸管粘膜炎：病理組織学的研究(Irinotecan-induced intestinal mucositis in mice: a histopathological study). Cancer Chemother Pharmacol. 2021;87:327-36.
論文CAS PubMed Google Scholar
Yuan DD, Chi XJ, Jin Y, Li X, Ge M, Gao WL, Guan JQ, Zhang AL, Hei ZQ. 肝移植後の腸管傷害は、TLR4/NF-κB活性化誘導細胞アポトーシスが介在した。Mol Med Rep. 2016;13:1525-32.
記事CAS PubMed Google Scholar
KEGGによるパスウェイとゲノムの分類学に基づく解析. Nucleic Acids Res. 2023;51(D1):D587-92.
Lactobacillus plantarum CFR 2194によるプレバイオティクスのin vitro発酵：選択性、生存率およびβ-グルクロニダーゼ活性に対する代謝産物の影響. World J Microbiol Biotechnol. 2012;28:901-8.
記事 PubMed Google Scholar
ラットにおける抗悪性腫瘍剤カンプトテシン誘導体塩酸イリノテカン（CPT-11）の腸管毒性における腸内細菌叢のβ-グルクロニダーゼの関与.高砂和彦、萩原俊彦、広橋正明、加藤真、野村真、永井英樹、横井利彦、鎌滝敏夫 Cancer Res. 1996;56:3752-7.
CAS PubMed Google Scholar
腸内細菌叢β-グルクロニダーゼの阻害は抗癌剤塩酸イリノテカン（CPT-11）のラットにおける活性代謝物の分布を変化させる。Cancer Chemother Pharmacol. 1998;42:280-6.
記事CAS PubMed Google Scholar
転移性大腸癌患者におけるイリノテカン隔週投与2次治療におけるコレスチラミン／レボフロキサシンによる遅延性下痢予防に関する第II相臨床試験。Oncology. 2007;72:10-6.
論文CAS PubMed Google Scholar
イリノテカンによる下痢に対する漢方薬。Front Pharmacol. 2019;10:182.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
コーセルケE、クラフトS. 化学療法誘発性下痢：治療と予防のための選択肢。J Hematol Oncol Pharm. 2012;2(4):143-51.
Google Scholar
Rtibi K, Selmi S, Grami D, Sebai H, Amri M, Marzouki L. Irinotecan化学療法による腸の酸化的ストレス： 粘膜の水および電解質輸送を阻害する根本的な原因。Pathophysiology. 2017;24:275-9.
記事CAS PubMed Google Scholar
Bohlouli J, Namjoo I, Borzoo-Isfahani M, Hojjati Kermani MA, Balouch Zehi Z, Moravejolahkami AR. 糖尿病性腎症における酸化ストレスと炎症状態に対するプロバイオティクスの効果： 臨床試験のシステマティックレビューとメタアナリシス(A systematic review and meta-analysis of clinical trials)。Heliyon. 2021;7:e05925.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Bakhtiary M, Morvaridzadeh M, Agah S, Rahimlou M, Christopher E, Zadro JR, Heshmati J. Effect of Probiotic, Prebiotic, and Synbiotic Supplementation on Cardiometabolic and Oxidative Stress Parameters in Patients With Chronic Kidney Disease： A Systematic Review and Meta-analysis. Clin Ther. 2021;43:e71-96.
記事CAS PubMed Google Scholar
Shakeri H, Hadaegh H, Abedi F, Tajabadi-Ebrahimi M, Mazroii N, Ghandi Y, Asemi Z. シンバイオティックパンの摂取は、2型糖尿病患者の血清中のトリアシルグリセロールとVLDLレベルを低下させ、HDLレベルを上昇させる。Lipids. 2014;49:695-701.
記事CAS PubMed Google Scholar
Samah S, Ramasamy K, Lim SM, Neoh CF. 2型糖尿病管理のためのプロバイオティクス： A systematic review and meta-analysis. Diabetes Res Clin Pract. 2016;118:172-82.
記事CAS PubMed Google Scholar
アマレッティA、ディ・ヌンツィオM、ポンペイA、ライモンディS、ロッシM、ボルドーニA. 潜在的プロバイオティック細菌の抗酸化特性：in vitroおよびin vivoの活動。Appl Microbiol Biotechnol. 2013;97:809-17.
記事CAS PubMed Google Scholar
Bowen JM, Stringer AM, Gibson RJ, Yeoh AS, Hannam S, Keefe DM. VSL#3プロバイオティクスは、化学療法による下痢と体重減少を軽減する。Cancer Biol Ther. 2007;6:1449-54.
記事 PubMed Google Scholar
Gibson RJ, Bowen JM, Inglis MR, Cummins AG, Keefe DM. イリノテカンは、乳癌移植ラットにおいて、大腸障害と同様に重度の小腸障害を引き起こす。J Gastroenterol Hepatol. 2003;18:1095-100.
記事CAS PubMed Google Scholar
Gibson RJ, Bowen JM, Keefe DM. Paliferminは、腫瘍を有するDAラットにおけるイリノテカン治療後の下痢を軽減し、生存率を向上させた。Int J Cancer. 2005;116:464-70.
論文CAS PubMed Google Scholar
Gibson RJ, Bowen JM, Alvarez E, Finnie J, Keefe DM. 胃腸粘膜炎の単回投与イリノテカンモデルの確立。Chemotherapy. 2007;53:360-9.
論文CAS PubMed Google Scholar
Yan F, Polk DB. プロバイオティクス細菌は、腸上皮細胞におけるサイトカイン誘発アポトーシスを防止する。J Biol Chem. 2002;277:50959-65.
論文CAS PubMed Google Scholar
Logan RM, Gibson RJ, Sonis ST, Keefe DM. がん化学療法後の口腔粘膜におけるNuclear factor-κB（NF-κB）およびcyclooxygenase-2（COX-2）の発現。Oral Oncol. 2007;43:395-401.
論文CAS PubMed Google Scholar
Sonis ST. 粘膜炎に対する生物学的アプローチ。Jサポートオンコル。2004;2:21-32 (discussion 35-26).
PubMed Google Scholar
Sonis ST, Elting LS, Keefe D, Peterson DE, Schubert M, Hauer-Jensen M, Bekele BN, Raber-Durlacher J, Donnelly JP, Rubenstein EB. がん治療による粘膜傷害の展望：病因、測定、疫学、および患者への影響。Cancer. 2004;100:1995-2025.
記事 PubMed Google Scholar
バルデスAM、ウォルターJ、セガールE、スペクターTD. 栄養と健康における腸内細菌叢の役割。BMJ. 2018;361:k2179.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Marino MM, Nastri BM, D'Agostino M, Risolo R, De Angelis A, Settembre G, Rienzo M, D'Esposito V, Abbondanza C, Formisano P: Does Gut-breast Microbiota Axis Orchestrates Cancer Progression? Endocrine, Metabolic & Immune Disorders-Drug Targets (Formerly Current Drug Targets-Immune, Endocrine & Metabolic Disorders) 2022, 22:1111-1122.
Principi N, Esposito S. Gut microbiota and central nervous system development. J Infect. 2016;73:536-46.
記事 PubMed Google Scholar
Wegierska AE, Charitos IA, Topi S, Potenza MA, Montagnani M, Santacroce L. The connection between physical exercise and gut microbiota: implications for competitive sports athletes. Sports Med. 2022;52(10):2355-69.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Cataldi S, Poli L, Şahin FN, Patti A, Santacroce L, Bianco A, Greco G, Ghinassi B, Di Baldassarre A, Fischetti F. 前臨床およびヒトモデルにおける腸内細菌叢と腸脳軸に対する身体活動の影響： A Narrative Review. Nutrients. 2022;14:3293.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
ブル＝ラーセンS、モハジェリMH。ADHDの発症と進行に対する細菌マイクロバイオームの潜在的影響。Nutrients. 2019;11(11):2805.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Leung C, Rivera L, Furness JB, Angus PW. NAFLDにおける腸内細菌叢の役割。Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2016;13:412-25.
記事CAS PubMed Google Scholar
Wu F, Guo X, Zhang J, Zhang M, Ou Z, Peng Y. Phascolarctobacterium faeciumのヒト胃腸管における豊富なコロニー形成。Exp Ther Med. 2017;14:3122-6.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Bunker JJ, Flynn TM, Koval JC, Shaw DG, Meisel M, McDonald BD, Ishizuka IE, Dent AL, Wilson PC, Jabri B, et al. Innate and Adaptive Humoral Responses Coat Distinct Commensal Bacteria with Immunoglobulin A. Immunity. 2015;43:541-53.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Palm NW, de Zoete MR, Cullen TW, Barry NA, Stefanowski J, Hao L, Degnan PH, Hu J, Peter I, Zhang W, et al. Immunoglobulin A coating identifies colitogenic bacteria in inflammatory bowel disease. Cell. 2014;158:1000-10.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
VAN ELDER J, CELIS P, De Pauw G, Lesaffre E, Eyssen H. Tauroconjugation of cholic acid stimulates 7 alpha-dehydroxylation by fecal bacteria. Appl Environ Microbiol. 1996;62:656-61.
記事 PubMed PubMed Central Google Scholar
Hughes ER, Winter MG, Duerkop BA, Spiga L, Furtado de Carvalho T, Zhu W, Gillis CC, Büttner L, Smoot MP, Behrendt CL, et al. Microbial Respiration and Formate Oxidation as Metabolic Signatures of Inflammation-Associated Dysbiosis. Cell Host Microbe. 2017;21:208-19.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Jia W, Rajani C, Xu H, Zheng X. Gut microbiota alterations are distinct for primary colorectal cancer and hepatocellular carcinoma. Protein Cell. 2021;12:374-93.
記事 PubMed Google Scholar
Sobhani I, Tap J, Roudot-Thoraval F, Roperch JP, Letulle S, Langella P, Corthier G. Tran Van Nhieu J, Furet JP: Microbial dysbiosis in colorectal cancer (CRC) patients. PLoS ONE. 2011;6:e16393.
論文CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Kolenbrander P. Veillonella属。Prokaryotes. 2006;4:1022-40.
記事 Google Scholar
真核細胞において大腸菌はDNAの二本鎖切断を誘導する。Science. 2006;313:848-51.
記事 PubMed Google Scholar
腸内細菌科のコリバクチンゲノムアイランドの遺伝的構造とその分布。Infect Immun. 2009;77:4696-703.
論文CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Boleij A, Hechenbleikner EM, Goodwin AC, Badani R, Stein EM, Lazarev MG, Ellis B, Carroll KC, Albesiano E, Wick EC. Bacteroides fragilis毒素遺伝子は、大腸がん患者の結腸粘膜に多く存在する。Clin Infect Dis. 2015;60:208-15.
記事CAS PubMed Google Scholar
Dejea CM, Wick EC, Hechenbleikner EM, White JR, Mark Welch JL, Rossetti BJ, Peterson SN, Snesrud EC, Borisy GG, Lazarev M. Microbiota organization is a distinct feature of proximal colorectal cancers. Proc Natl Acad Sci. 2014;111:18321-6.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
Arthur JC, Gharaibeh RZ, Mühlbauer M, Perez-Chanona E, Uronis JM, McCafferty J, Fodor AA, Jobin C. Microbial genomic analysis reveals the essential role of inflammation in bacteria-induced colorectal cancer. Nat Commun. 2014;5:1-11.
記事 Google Scholar
Arthur JC, Perez-Chanona E, Mühlbauer M, Tomkovich S, Uronis JM, Fan T-J, Campbell BJ, Abujamel T, Dogan B, Rogers AB. 腸の炎症は微生物叢のがん誘導活性を標的とする。Science. 2012;338:120-3.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
細菌性ジェノトキシンは慢性炎症、ゲノム不安定性、腫瘍の進行に寄与しているか？FEBS J. 2011;278:4577-88.
論文CAS PubMed Google Scholar
Goodwin AC、Shields CED、Wu S、Huso DL、Wu X、Murray-Stewart TR、Hacker-Prietz A、Rabizadeh S、Woster PM、Sears CL. ポリアミン異化作用は、腸内毒素原性Bacteroides fragilisが誘発する結腸腫瘍の発生に寄与する。Proc Natl Acad Sci. 2011;108:15354-9.
記事CAS PubMed PubMed Central Google Scholar
参考文献のダウンロード
謝辞
ベニスエフ大学薬学部微生物学・免疫学教室のご協力に感謝いたします。
資金提供
The Egyptian Knowledge Bank (EKB)の協力のもと、The Science, Technology & Innovation Funding Authority (STDF)よりオープンアクセス資金を提供されました。本研究は、公的機関や民間機関からの資金提供は受けていない。
著者情報
著者および所属
ベニスエフ大学薬学部微生物学・免疫学教室（Salah Salem Street, Beni-Suef, 62511, Egypt
マルワ・S・マーディ、アーメッド・F・アズミー、タレック・ディシシャ、アーメッド・O・エルジェンディ
ベニスエフ大学薬学部薬理学・毒物学教室、ベニスエフ、エジプト
ワファー・R・モハメド
カイロ大学獣医学部病理学教室、ギザ、12211、エジプト
カワカブ・A・アーメッド
ベニスエフ大学医学部臨床腫瘍学教室、エジプト、ベニスエフ
アーメッド・ハッサン
フローニンゲン大学フローニンゲン生体分子科学・バイオテクノロジー研究所（GBB） 宿主-微生物相互作用、オランダ、フローニンゲン
サハール・エル・アイディ
貢献度
AOE、TD、AFA、SEAは、本研究の構想・設計を行った。MS、WRM、KAA、AHおよびAOEは実験を行った。MS、AOE、WRMがデータを解析した。AOEとWRMは、図とイラストを作成した。MS、TD、AFA、AOE、WRM、KAA、AH、SEAは原稿を作成した。MS、AOE、WRMは最終的に論文を執筆した。著者全員が最終原稿を読み、承認した。
対応する著者
Ahmed O. El-Gendyに対応する。
倫理的宣言
倫理的承認と参加への同意
ヒトの研究： すべての実験と方法は、関連するガイドラインと規則に従って行われた。倫理的承認は、ベニスエフ大学医学部研究倫理委員会（FM-BSU REC）より、承認番号; FMBSUREC/05072020/Mahdy で得た。ヘルシンキ宣言、国際整合性会議ICH、米国連邦規則のガイドラインを遵守し、被験者保護のための連邦広域保証（FWA）の下で登録されました。研究に参加するすべての患者からインフォームドコンセントを得た。データは機密扱いとし、匿名とした。社会統計学的な質問は、身元を明らかにするためではなく、特徴を明らかにするためのものである。
動物実験： すべての実験と方法は、関連するガイドラインと規則に従って行われた。エジプト、ベニスエフ大学理学部の動物倫理委員会は、この実験で動物に行われるすべての手順を認証し、この研究を承認した（承認番号：BSU/FS/2019/8）。学部動物倫理委員会 動物実験は、ARRIVEガイドライン（https://arriveguidelines.org）に従って管理されました。
論文発表の同意
該当なし。
競合する利益
著者は競合する利益を宣言していない。
追加情報
発行者のコメント
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権主張および所属機関に関して、中立を保っています。
補足情報
追加ファイル1：表S1.
便サンプルを採取したボランティアグループの人口統計学的データ。図S1. 健常者群、大腸がん群、イリノテカン群の16S rRNAメタゲノミクスシーケンスで評価された要約OTUの存在量プロファイルを、異なる分類レベル（(a) class、(b) order、 (c) family、 (d) genus、 (e) speciesレベル）でスタックバープロットを使用して示した。図S2. コアマイクロバイオームとは、健常者、大腸がん患者、イリノテカン患者において、高い割合で検出される分類群のことで、（a）門、（b）類、（c）目、（d）科、（e）属、（f）種のレベルごとに分類した。図S3. 健常者、大腸がん、イリノテカン群における微生物相のクラスタリングとSparCC相関ネットワーク。各ノードは、（a）1つの菌の目、（b）1つの菌の家族、（c）1つの菌の属、（d）1つの菌種を示す。ノードの大きさは、微生物相の対数変換相対存在量に対応する。図S4. SparCCに基づくパターン検索プロットは、（a）門レベル、（b）クラスレベル、（c）オーダーレベル、（d）ファミリーレベル、（e）属レベル、（f）種レベルで相関するトップフィーチャーを示す。特徴量は相関関係でランク付けされ、青い棒は負の相関、赤い棒は正の相関を表す。色が濃い（青や赤が濃い）ほど、相関が強い。右側は、各グループでその特徴の存在量が多い（赤）か少ない（青）かを示すミニヒートマップである。図S5. 健常者、大腸がん、イリノテカンの各グループにおける、異なる分類レベルの集団の系統図と存在量に基づくデンドログラム；（a）門、（b）類、（c）目、（d）科、（e）属レベル。
権利と許可
この記事は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされており、原著者と出典への適切なクレジット表示、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクの提供、および変更を加えた場合の表示を行う限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製を許可します。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する使用が法的規制によって許可されていない場合、または許可された使用を超える場合、あなたは著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの献呈放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）は、データへのクレジット表記がない限り、この記事で利用可能になったデータにも適用されます。
転載と許可
この記事について
この記事を引用する
Mahdy, M.S., Azmy, A.F., Dishisha, T. et al. Irinotecan-gut microbiota interactions and the capability of probiotics to mitigate Irinotecan-associated toxicity. BMC Microbiol 23, 53 (2023). https://doi.org/10.1186/s12866-023-02791-3
引用文献をダウンロードする
2022年6月28日受領
2023年2月10日受理
2023年3月02日発行
DOIhttps://doi.org/10.1186/s12866-023-02791-3
この記事を共有する
以下のリンクを共有した人は、このコンテンツを読むことができます：
共有可能なリンクを取得する
コンテンツ共有イニシアティブ「Springer Nature SharedIt」による提供です。
キーワード
イリノテカン
抗がん剤
β-グルクロニダーゼ
プロバイオティクス
大腸
炎症
BMCマイクロバイオロジー
ISSN: 1471-2180
お問い合わせ先
投稿に関するお問い合わせ: bmcmicrobiology@biomedcentral.com
一般的なお問い合わせ ORSupport@springernature.com
ブログで詳しく見る
BMCニュースレターを受け取る
記事アラートの管理
著者のための言語校正
著者のための科学編集
ポリシー
アクセシビリティ
プレスセンター
サポートと連絡先
ご意見・ご感想をお寄せください
採用情報
BMCをフォローする
BMC Twitterページ
BMC Facebookページ
BMC Weiboページ
このウェブサイトを使用することにより、お客様は当社の利用規約、お客様の米国州のプライバシー権、プライバシーステートメントおよびCookieポリシーに同意したものとみなされます。あなたのプライバシーの選択/プリファレンスセンターで私たちが使用するクッキーを管理します。
© 2023 BioMed Central Ltd 特に断りのない限り、BioMed Central Ltd。シュプリンガー・ネイチャーの一部です。