シングルセルラマン分光法による尿路感染症生菌の無培養定量化
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ORIGINAL RESEARCHの記事
Front. Microbiol.、2023年3月23日
抗菌薬・耐性・化学療法の項
第14巻～2023年｜https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1144607
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抗菌薬耐性に対抗するシングルセルツール
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シングルセルラマン分光法による尿路感染症生菌の無培養定量化
Jingkai Wang1、Kang Kong1,2、Chen Guo1,3、Guangyao Yin1、Siyu Meng1、Lu Lan4、Liqiang Luo2、Yizhi Song1,3,5* 。
1中国科学院蘇州生体工学技術研究所（中国蘇州市
2上海大学理学部化学科（中国・上海市
中国科学技術大学蘇州校生体医工学部生命科学・医学部門（中国・蘇州市
4中国・蘇州のVibroniX, Inc.
5重慶国科医療技術開発有限公司、中国・重慶市
尿路感染症（UTI）は、外来患者の中で最も多い感染症です。サンプル中の生きた病原体の濃度を得ることは、治療にとって極めて重要です。しかし、その濃度は尿培養とプレートカウントに依存し、何日もかかるため、TAT（Turn-around Time）が必要です。重水素同位体探査と組み合わせた単一細胞ラマンスペクトル（Raman-DIP）は、代謝活性の高い細菌を高い精度で特定できることが証明されていますが、Raman-DIPプロセス中の細菌の複製により、生きた病原体の数を明らかにすることができません。本研究では、酢酸ナトリウムを用いて病原体の複製を抑制し、Raman-DIPを適用して活性な単細胞を同定するという新しいアプローチを確立しました。顕微鏡画像のスティッチングと認識を組み合わせることで、新手法の効率をさらに向上させることができました。9つの人工尿サンプルを用いた新手法の検証では、Raman-DIPで得られた生きた病原体の正確な数はプレートカウントと一致し、TATは18時間から3時間以内に短縮され、臨床での病原体定量にRaman-DIPを適用できる可能性があることが示された。
はじめに
尿路感染症（UTI）は、世界で最も一般的な臨床感染症の1つです。統計によると、女性成人の約半数が生涯に少なくとも1回のUTIに悩まされ（Alós, 2005; Bono et al., 2022）、高齢者のUTIの全発生率は高い（Ruben et al., 1995; Jackson et al., 2004）。世界の疾患データに関する以前の研究によると、2019年、UTIは4億461万件の症例と23万6790人の死亡を引き起こしています（Yang et al., 2022）。したがって、UTIは公衆衛生に大きな脅威をもたらすだけでなく、病院や地域社会にも大きな負担をもたらしました。
長い間、尿培養は臨床現場におけるUTI診断の金字塔とみなされており、これには細菌の同定と列挙が含まれます（Schmiemann et al.、2010）。菌数測定は、単位尿サンプル中の生きた細菌の実際の濃度を示すもので、UTIの病理診断のための主要かつ直接的な指標となる。通常、1mlあたり105コロニー形成単位（CFU）以上の尿中病原体である細菌尿は、UTIと確定されます（Schmiemann et al., 2010; Rowe and Juthani-Mehta, 2014）。しかし、現在のゴールドスタンダードである細菌列挙は、一般的に18時間以上かかるオーバーナイト培養が必要なため時間がかかり、このようなターンアラウンドタイム（TAT）はタイムリーなUTI診断を遅らせ、経験的な薬剤投与を引き起こす。
比較的信頼性の高い定量的な推定を得るために、微生物検出に適用可能なイメージングや分子生物学的な手法が登場しています。近年、顕微鏡による直接観察が臨床的なUTI診断において実現可能であることが報告されている（平岡ら、1993；Beyerら、2019）。しかし、この方法の特異度や感度は、顕微鏡検査における労働者の専門知識によって異なります。さらに、直接観察は細菌の生存率を反映することに限界があり、それゆえ、列挙結果には感染症とは無関係な病原体の数が含まれることがある。実験室では、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）による生細胞の染色や生死染色と顕微鏡による集計を組み合わせることで、集計に大きな可能性を示してきました（Garcia-Armisen and Servais, 2004; Kumar et al, 2011; Perdana et al, 2012）。それらの細胞計数法は、蛍光活性化細胞選別（FACS）などの細胞選別技術によってさらに発展した（Friedrich and Lenke, 2006; Doherty et al., 2010; Chen et al., 2012）。複雑な手順に加え、自己消光、プローブのハイブリダイゼーション効率、試薬の毒性は、高頻度の偽陰性計数結果につながる可能性があり（Cui et al., 2012; Maslov et al., 2018）、臨床UTI診断から阻害されるようにする。そのほか、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）などの核酸増幅技術は、試料から抽出された核酸を定量するために頻繁に使用され、環境診断やヘルスケアで広く使用されている（Maurin, 2012; Bouchez et al., 2016）。しかし、RT-qPCRによる検出は、通常、生細胞ではなく完全に溶解した細胞を用いて行われるため、RT-qPCRから得られる量には代謝不活性な細胞が含まれることがあり、偽陽性の結果がもたらされることがある。したがって、迅速、簡便、信頼性が高く、代謝を感知する技術は、ゴールドスタンダードな臨床尿路結石診断を改善するための思慮深い解決策となるであろう。
シングルセルラマン分光法は、ラベルフリー、非侵襲的、分子特異的な技術であり、微生物の同定などの病原性微生物研究に光を当ててきた（Huら、2022年；Wangら、2023年）。代替の表現型-代謝特性評価技術として、重水素同位体プロービングと組み合わせた単一細胞ラマン分光法（Raman-DIP）も、従来の抗菌薬感受性試験を改善する上で大きな可能性を示した（Song et al., 2017; Yi et al., 2021）。このような技術は、大まかな細胞の列挙と細胞の代謝状態を同時に得ることができ、臨床的なUTI診断の理想的な解決策となり得るでしょう。しかし、現在の方法における重水素標識は、最低2時間の培養が必要であり（Yi et al., 2021）、これは細菌が必然的に繁殖することを示し、初期細菌濃度の決定に影響を与える。
重水素標識による初期菌濃度への影響を回避し、迅速・簡便・確実なRaman-DIP法による尿路結石診断法を確立するために、我々はここに、単細胞の細菌代謝を確保し、一方で細菌の分裂・増殖を抑制するという要件を満たす酢酸ナトリウム（SA）含有培養液を新規開発しました。また、このSA含有培地が、異なる成長段階における細菌の増殖と代謝に及ぼす影響についても検討した。9つの人工尿サンプルを用いて、列挙法を確立し、テストした。また、SA培地と組み合わせたラマン分光法が尿路結石症の診断に有効であることを、ゴールドスタンダードとの比較で検証した。
材料と方法
菌株と試薬
グラム陽性2株（Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212）およびグラム陰性2株（Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853）を含むUTI病原菌の一般的な4種（Flores-Mireles et al., 2015）を用いて、細菌の増殖に対するSAの影響について解析しました。また、UTI病原体の最も一般的なグラム陽性種およびグラム陰性種として（Flores-Mireles et al., 2015）、大腸菌と黄色ブドウ球菌もSAの単細胞代謝への影響を判定する際に使用した。そして、臨床的なUTIの65%を占めることから、人工尿サンプルを調製するために大腸菌を採取しました。菌はLuria-Bertani（LB）ブロスを用い、ロータリーインキュベーターで200rpm、37℃で一晩、菌濃度が109CFU/mlになるまで培養した。
今回開発した培養液は、2×LBブロス50％、99.9％ろ過した重水素水40％、無水SA、二重蒸留水からなるものであった。重水素標識の前に、リン酸二水素ナトリウムで培地のpHを7.2に調整した。特に指定がない限り、本調査で使用したすべての試薬は、Sigma Aldrich, Shanghai, Chinaから購入した。
一晩プレート培養による阻害試験
各SA濃度について、それぞれ0、1、2、4、8時間に単板-連続希釈スポッティングを実施した。各SA濃度について、5つの生物学的複製と連続希釈（0倍、10倍、100倍）を使用した。希釈した検体10マイクロリットルを各サンプルスポットにピペッティングした。スポット後、直ちにプレートを37℃のインキュベーターに移し、一晩培養した。その後、各プレート上のコロニー数を手動で列挙してまとめ、異なるSA濃度の阻害効果を決定した。また、エクスポネンシャル期（ラグ期から3時間後）に得られた大腸菌についても同様の手順を繰り返し、異なる代謝条件下での菌の阻害効果を調べた。
重水素標識とラマンフィンガープリントの取得
一晩培養後、大腸菌と黄色ブドウ球菌を128、256、512mMのSAを含む10ml培養液に播種し（1：1000）、ロータリーシェーカーで4時間培養した。各SA濃度について少なくとも30の単細胞ラマン分光（SCRS）を0、1、2、4時間にそれぞれ収集した。各SCRSの取得前に、試料を7,000rpmで3分間の遠心分離で2回洗浄し、二重脱イオン水で再懸濁した。その後、再懸濁した検体2μlをアルミコートしたスライドにピペッティングし、スライドを風乾した後、SCRS採取の準備をした。自作ラマン分光器の市販モデル（R300 Confocal Raman microscope, Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology, China）を用いて、積分時間3秒、表面レーザー出力7mW、連続波レーザー532nmの条件でSCRS収集を実施しました。
列挙法の確立
大腸菌と黄色ブドウ球菌の単細胞代謝指数は、そのSCRSから得た。代謝指数は、C-Dバンド（2,000-2,300cm-1）の積分スペクトル強度が、C-DバンドとC-Hバンド（2,800-3,100cm-1）の合計と比較して何パーセントであるかというものです。ここでは、サンプルとネガティブコントロールの代謝指数の差が、ネガティブコントロールの標準偏差の3倍以上である細菌を代謝活性・生菌と定義しています。
初期菌濃度を復元するために、アルミスライド上のサンプリング領域に対して、ラマン顕微鏡を用いた画像スティッチングと認識を行いました。自社開発の画像処理ソフトで、画像のつなぎ合わせと認識が完了した。画像処理ソフトウェアから与えられた全菌の空間座標により、共焦点ラマン顕微鏡は全菌からSCRSを自動的に収集することができた。そして、C-Dラマンバンド（2,170cm-1付近）を持つすべての細菌の数を求め、これがサンプリングエリア内の生菌数と等しくなる。最終的に、C-Dバンドを持つ細菌の数に希釈倍数をかけることで、サンプル中の初期細菌濃度を得ることができました。
人工尿サンプルによる検証
尿路不快感や半年以内の抗生物質服用歴などの危険因子を除外した後、当研究所のボランティア3名から健康な尿サンプルを3群提供いただき、0.2μmのフィルター膜でろ過してから使用しました。そして、遠心分離した一晩培養した大腸菌を3つの尿検体で元の濃度になるように再懸濁した。各グループについて、再懸濁された検体は、それぞれ最終的な菌濃度が104、105、106となるように3つの人工グループに分けられた。
Raman-DIPベースの細胞計数法の一貫性を検証するため、すべての人工試料を、従来のゴールドスタンダード法とRaman-DIPアプローチの2通りの方法で処理して比較しました。簡単に説明すると、ゴールドスタンダード法（手動による計数）では、遠心洗浄、検体再懸濁、連続希釈スポット（0.2μl/サンプリングスポット）、細胞培養、手動計数を行い、ラマンDIP法では、遠心洗浄、検体再懸濁、SAとD2Oによる培養、サンプリング、顕微鏡画像ステッチング、C-Dラマン信号による計数を行っている。細胞計数の難しさを簡略化するため、両方のアプローチですべての検体について一連の希釈レベル（10倍、100倍、1,000倍）を使用しました。そして、次の細胞数測定に最適な希釈レベルを選択した。最後に、この2つの方法から得られた結果をまとめ、分析した。
データ処理と解析
本研究では、特に断りのない限り、データ解析はR（Version 4.2.2, R Core Team, 2022）を用いて実施した。代謝指標は、reshape2（Version 1.4.4, Wickham, 2011）およびpylr（Version 1.8.8, Wickham, 2007）パッケージを使用して計算した。図は、Origin 9ソフトウェア（OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA）を使って作成されました。すべてのSCRSは450-3,200cm-1に減算され、Labspec6 (Horiba JY, Tokyo, Japan)で10度の線形ベースラインフィッティングアルゴリズムでベースライン補正された。その後、スペクトル範囲内のすべてのピークの下の総面積を用いてスペクトルを正規化した。
結果
コロニー再生におけるSAの抑制
他の研究によると、SAは低分子量の有機酸であり、細菌によって排泄される可能性があり、抗菌および抗酸化用途で一般的に使用されている（Sallam, 2007; Pinhal et al., 2019）。成長阻害のための適切なSA濃度を決定するために、4つの細菌株を一連のSA濃度でインキュベートした。一晩のプレート培養から得られた手動による列挙結果を、5つの時点（0、1、2、4、および8時間）で記録した。図1は、手動による菌数測定の結果から得られた成長曲線を示しています。SA濃度が128mMより低い培地では、培養時間が長くなるにつれて菌濃度が上昇し、SA濃度の上昇に伴って増殖速度が低下するものの、最終的にはほぼ同じ濃度（約108.75～9.5CFU/ml）まで増殖する傾向にあります。一方、512mMのSAを含む培地では、増殖曲線のすべてのポイントが同じオーダー内にあるため、細菌の増殖は停滞または減少傾向を示している（青色領域）。図1A-Dの左上に示した4つの図は、0時間から2時間まで細菌の増殖が緩やかであることを示している。つまり、上記の結果は、128〜512mMのSAを含む培地が、特に0〜2時間、細菌の成長および増殖を効果的に抑制することができることを示している。
図1
図1. 7種類の酢酸ナトリウム（SA）濃度の加圧下におけるEscherichia coli（A）、Staphylococcus aureus（B）、Pseudomonas aeruginosa（C）、Enterococcus faecalis（D）の増殖曲線である。パネル(A-D)の左上にずらした4つの詳細図は、4種の0-2時間の成長曲線である。青色領域は、細菌濃度の初期レベルを表す。エラーバーとエラーリボンは、5つの生物学的複製の標準偏差を表す。0-mM SAはネガティブコントロールとして機能する。
上記の結果は、一晩培養後のLBブロス中に一般的に存在する定常期の細菌から得られたものです。しかし、UTIの臨床サンプルには、他の成長段階にある細菌も含まれています。本研究では、異なる成長段階から得られた細菌に対するSAの阻害効果を調べるために、指数相の大腸菌の成長も測定した。図2Aには、指数期大腸菌の0-8時間および0-2時間の成長曲線が示されている。0-2時間の間、菌数は同じコロニー形成単位（CFU）レベルに維持された。8時間の培養後、16、32、64mMのSA下での細菌の最終濃度は同じポイントに来た（約109.25CFU/ml）。しかし、128、256、512mMのSA濃度では、他の濃度よりも低い数値となった。SAの圧力下での増殖の違いを可視化するために、定常大腸菌と指数大腸菌の菌数測定結果を図2Bで比較しました。比較のために、抗菌特性が比較的穏やかで、より優れた増殖抑制効果を持つSA濃度256mMを選択した（図1A）。図1A、2Bから予測されるように、両成長段階の大腸菌の濃度は、SAの阻害による差は見られなかった。一方、4時間培養後の指数関数大腸菌の濃度は、定常大腸菌のそれよりも著しく高かった。したがって、同じSA圧下でも指数期菌の方が成長・増殖が活発であった。
図2
図2. 7種類のSA濃度の圧力下における指数関数的大腸菌の成長曲線（A）および256-mM SA下における定常大腸菌と指数関数的大腸菌の成長比較（B）。0-mMのSAはネガティブコントロールとして機能する。エラーバーとエラーリボンは、5生物学的複製の標準偏差を表す。統計的有意性を計算し（t-test）、それに応じて印をつけた。***p ≤ 0.001; **p > 0.05、有意差なし（ns）。
細菌の単細胞代謝に対するSAの阻害作用
SA含有培地で培養した細菌の単細胞代謝活性を特徴付けるために、Raman-DIP法（Berry et al.、2015）を使用しました。我々の以前の研究（Yi et al., 2021）によると、代謝活性を持つバクテリアは、NADPH再生を介して重水素を細胞内バイオマスに取り込むことができ、C-HバンドはC-Dバンドにシフトします。したがって、細菌の代謝活性は、C-DバンドとC-Hバンドの合計と比較したC-Dバンドの強度に比例し、これを代謝指数と定義した。代謝指標である単細胞代謝指標に対するSAの阻害作用を調べるため、大腸菌と黄色ブドウ球菌を40%D2Oで2時間培養した。以上の結果から、細菌の増殖阻害濃度範囲は128-512mMであることがわかった。そこで、3つの濃度（128、256、512mM）のSAが単細胞代謝に及ぼす阻害効果を検討した。重水素標識の2時間後、0-、128-、256-mMのSAで培養した細菌は、2170cm-1のC-Dラマンバンドに顕著なシグナルを示した（図3A、C）。しかし、512mMのSAの圧力下で増殖した細菌は、2時間と4時間後に低いC-D強度を呈した。ネガティブコントロール（0 mM SA）と比較して、128 mM以上のSA濃度で培養した場合、細胞内の重水素取り込み量は時間とともに増加するものの、単細胞代謝は阻害された。一方、同じ時点で、対応するSA濃度が高くなるにつれて、代謝指標は徐々に低下した。
図3
図3. 大腸菌（A,B）および黄色ブドウ球菌（C,D）の128-, 256-, 512-mM SA下での単細胞ラマンスペクトル（SCRS）および代謝指標（異なる重水素標識時間後）。(A,C) 線は、少なくとも30回の反復の平均強度を表す。0-mM SA の SCRS はネガティブコントロールとして機能する。スペクトルはベースライン補正され、スペクトル範囲内のすべてのピークの下の総面積を使用して正規化された。(B,D) 代謝活性のある細菌は、青い矢印で示した。エラーバーは、少なくとも30反復の標準偏差を表す。0時間時点の代謝指数は、ネガティブコントロールとして機能する。
本研究では、サンプルとネガティブコントロールの代謝指数の差が、ネガティブコントロールの標準偏差の3倍以上である細菌を生菌としています。それに基づいて、生菌を青い矢印で注釈した（図3B、D）。したがって、細菌の重水素標識と活性検出には、2時間のインキュベーション時間と128または256mMのSAで十分である。
生きているバクテリアの列挙
臨床尿路結石症診断の核となるのは、生菌の計数である。Raman-DIP法による菌数測定は、C-Dシグナルがしっかり出ている単細胞の細菌を同定することに依存する。重水素標識法では、細菌の増殖が菌数測定結果に影響を及ぼすのを避けるため、256-mM SAを含む培地を使用し、細胞増殖を抑制し、細胞代謝を維持し、細菌濃度を初期検体と同じレベルに維持した。256-mMのSAを選択した理由は、この濃度下で細菌の代謝活性に影響を与えず、細菌の増殖が最も抑制されるためである。
Raman-DIPを用いた菌数測定法では、まず顕微鏡画像のスティッチングにより、サンプルスポット内のすべての菌を特定する（補足図1）。そして、同定されたすべての細菌の代謝指標を分析することで、その数が生菌数の合計に等しいことを確認し、列挙の結果を得ることができます。Raman-DIPによる列挙法の整合性を検証するため、比較のために従来のプレートカウント法も実施した（図4）。詳細な列挙結果は、補足表1に示すとおりである。さらに、2つの方法による列挙結果が同じオーダー内にある場合（図5の青色領域）、一貫性があるとみなされます。したがって、一貫した列挙を行ったサンプルは、青い領域に位置することになる。図5から、細菌細胞数は従来法のCFU数の4.07倍と均等に少ないが、2つの方法で得られた9つの結果は、正の直線相関と100％の一貫性（細菌濃度が同じオーダー内にあること）を示しています。
図4
図4. 尿路結石診断のためのパイプラインとRaman-DIP法と従来のゴールドスタンダード法との比較。パイプラインA：従来のゴールドスタンダードによる手作業での列挙。パイプラインB：SA含有培地とRaman-DIPによる代謝指標測定に基づく判定。
図5
図5. Raman-DIP法および従来のプレートカウント法による列挙結果。一貫した列挙が可能なサンプルは、青い領域に位置する。
考察
尿路結石症の診断には、検体の初期細菌濃度を正確かつ迅速に特定することが必要である。尿培養に基づく現在のゴールドスタンダードは、迅速な尿路結石症診断を満足させることができず、結果として公衆衛生に隠れた危険性をもたらす。そこで、尿路結石診断の補助として正確な菌数測定を実現するために、本研究では、菌の濃度を維持するために培養液を使用した修正Raman-DIPアプローチを開発しました。本研究は、Raman-DIP法の改良であり、生細胞計数のための手法に追加するものである。
抗菌メカニズムは曖昧であるが（Pinhal et al., 2019）、これまでの研究でSAが細菌の増殖を抑制することが健全に証明されている（Warnecke and Gill, 2005; De Mey et al., 2007; Carpenter and Broadbent, 2009）。Raman-DIPを行う際に、細胞代謝を維持したまま細胞増殖を抑制するために、SA濃度を変えた場合の細胞増殖と単細胞代謝を、それぞれプレートカウントと代謝指標の評価によって調べました。SA濃度の上昇に伴い、細菌の増殖と代謝の抑制も強まりました。UTIサンプルにはあらゆる成長段階の細菌が存在する可能性があるため、指数関数的な細胞成長に対するSAの影響をさらに調べ、定常細胞成長による結果と比較しました。同じSA濃度では、培養4時間後に指数関数期の細菌の増殖速度が定常期の細菌よりも高く、特に512 mMのSA下で培養した指数関数菌の代謝活性が高いことに起因しています（Stadie et al.、2013）。
UTI診断におけるRaman-DIPアプリケーションを成功させるためには、重水素標識後の細菌の代謝活性を保証するために、特定のSA濃度を決定する必要があります。ここでは、サンプルと陰性コントロールの代謝指数の差が、陰性コントロールの標準偏差の3倍以上である細菌を生菌と定義します。以上の根拠で生菌を特定することができ、Raman-DIPによる列挙法が確立された（図4のパイプラインB）。図1、図3の結果とゴールドスタンダード（図5）との比較の結果、256mM SA含有培地とRaman-DIPの組み合わせにより、2時間以内に生菌の濃度を正確に算出することができると考えています。
一晩の培養に依存しない場合を除き、迅速な計数技術は、臨床尿路結石のTATを短縮するもう一つの方法である。1つの検体に対して、Raman-DIPによる菌数測定は、画像ステッチングと1つ1つの代謝指標測定に基づいています。サンプルの希釈（0倍、10倍、100倍）を行い、サンプリングエリア内の細菌の総数を減らしてからラマンスペクトルを取得しますが、それでも列挙には1時間程度かかります。そこで、重水素同位体探査と組み合わせた刺激ラマン散乱（SRS）イメージング（SRS-DIP）が試用されました。弱い自然ラマン散乱に対するSRSの増幅により、バクテリアの弱いC-Dシグナルは数桁増強される（Zhang et al.、2020）。したがって、SRSはミリ秒以内にラマン画像を撮影することができ、列挙のための時間を大幅に短縮することができる。補足図2は、10ミリ秒以内に得られたサンプリングスポットの一部における生菌の分布を示している。画像の明るい画素は、細胞内のC-D結合の散乱によって生成されたもので、大腸菌の位置を表している。しかし、SRS画像スティッチングによる細菌の列挙は、狭い撮像視野とサンプルのノンストップ浮遊のために困難であった。そこで、試料中の細菌のブラウン運動を緩和し、高出力レーザーによる細胞損傷を避けるため、レーザー出力を下げ、試料を風乾した後にSRS画像取得を行うことを試みました。しかし、乾燥した試料から低いレーザー出力でC-D信号を収集することは困難であることが判明した。表1では、考えられる細胞計数ソリューションの長所と短所をまとめている。ラマン顕微鏡を用いた細胞数測定は、ゴールドスタンダードに比べ、1回の測定で高いコストがかかるが、小型で特殊なラマン分光器の開発、バッチサンプルの測定により、コストを下げることができる可能性がある。結論として、SAを含む培地を用いた我々のRaman-DIPは、生細胞の同定において明らかな優位性を提供するものである。
表1
表1. 現在の細胞計数法の比較。
結論
尿路感染症は外来患者の中で最も多い感染症であり、急性尿路感染症は腎盂腎炎や膀胱炎などの重篤な症状を引き起こすことがある。尿路感染症の臨床診断では、プレートカウント法のTATが長いため、抗生物質投与前の除菌結果が遅れるという重大な課題に直面している。本研究では、Raman-DIPと酢酸ナトリウムによる増殖抑制を併用することで、尿サンプル中の生菌を同定し、3時間以内に正確な細胞数を算出することに成功しました。この研究は、迅速な抗菌薬感受性試験以外の感染症診断におけるRaman-DIPの新しい能力を実証しています。本実証実験が確立されれば、臨床医の正しい処方、病院や患者の負担軽減、生細胞計数の新たなアイデアにつながります。
データ提供に関する声明
本論文の結論を裏付ける生データは、著者らが過度の遠慮をすることなく提供する。
著者の貢献
JW: 概念化、方法論、調査、形式的分析、および執筆-原案。KK：方法論、調査、データキュレーション、可視化、執筆-レビューと編集。CG：データキュレーション、検証、ライティング-レビューとエディティング。GY：調査・執筆-レビュー・編集。SM：ソフトウェアとライティング-レビューと編集。LLan：リソースとライティング-レビューと編集。LLuo：方法論と執筆-レビューと編集。YS：構想、監督、資金獲得、および執筆-レビューと編集。すべての著者が最終版の原稿を承認した。
資金提供
本研究は、中国国家重点研究開発計画（MOST、2022YFC2403300）、中国国家自然科学基金（32170173）、蘇州市崛起創新主導人材（ZXL2021422）、吉林省一次研究開発計画（グラント20210204117YY）、SIBET Funding（重慶）（グラントナンバー：E1050Q80）からの助成を受けている。
謝辞
SRS画像取得に貢献したVibroniX, Inc.のShoupu Yi氏（中国・蘇州）に感謝します。
利益相反について
LLanは、中国蘇州のVibroniX, Inc.に勤務していました。YSは、重慶国科医療技術開発有限公司の生体診断部部長として勤務していた。
残りの著者は、潜在的な利益相反と解釈され得る商業的または金銭的関係がない状態で研究が行われたことを宣言する。
出版社からのコメント
本記事で表明されたすべての主張は、あくまでも著者のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。
補足資料
本論文の補足資料は、オンラインにてご覧いただけます：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2023.1144607/full#supplementary-material。
参考文献
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キーワード：シングルセル、ラマン分光法、尿路感染症、酢酸ナトリウム、ライブセル・エニュメレーション
引用元 Wang J, Kong K, Guo C, Yin G, Meng S, Lan L, Luo L and Song Y (2023) Cultureless enumeration of live bacteria in urinary tract infection by single-cell Raman spectroscopy. Front. Microbiol. 14:1144607. doi: 10.3389/fmicb.2023.1144607.
受理された： 2023年1月14日、受理された： 2023 年 3 月 06 日；
発行：2023年3月23日
編集者
セブカン・アイドゥン（イスタンブール大学、チュルキイ語
レビューした人
Asghar Ali, Jamia Hamdard University, インド
ラフィグ・グルバノフ、ビレシク・シェイ・エデバリ大学、テュルキエ
アバント・イゼト・ベイサル大学 オズレム・アテス・ドゥル（チュルキエ
Copyright © 2023 Wang, Kong, Guo, Yin, Meng, Lan, Luo and Song. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを記載し、本誌の原著を引用することを条件に、一般的な学術慣行に従って、他のフォーラムでの使用、配布、複製が許可されます。本規約を遵守しない使用、配布、複製は許可されません。
*Correspondence： Yizhi Song、songyz@sibet.ac.cn
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