ダークチョコレートの摂取はエリートサッカー選手の腸管透過性をポジティブに調節する： ランダム化比較試験
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ジャーナル Nutrients 15巻 19号 10.3390/nu15194203
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オープンアクセス論文
ダークチョコレートの摂取はエリートサッカー選手の腸管透過性をポジティブに調節する： ランダム化比較試験
https://www.mdpi.com/2072-6643/15/19/4203
by Cristina Nocella 1,*,†,Elena Cavarretta 2,3,†ORCID,Chiara Fossati 4ORCID,Fabio Pigozzi 4,5ORCID,Federico Quaranta 4,Mariangela Peruzzi 1,3,Fabrizio De Grandis 5,Vincenzo Costa 6,Carwyn Sharp 6,Massimo Manara 6、 Antonia Nigro 5,Vittoria Cammisotto 1ORCID,Valentina Castellani 7,Vittorio Picchio 2ORCID,Sebastiano Sciarretta 2,8,Giacomo Frati 2,8,Simona Bartimoccia 1,Alessandra D'Amico 2,‡ORCID andRoberto Carnevale 2,8,‡ORCID
1
ローマ・サピエンツァ大学臨床・内科・麻酔・心臓血管科学科、00161ローマ、イタリア
2
ローマ・サピエンツァ大学医療外科・バイオテクノロジー学部、40100 Latina、イタリア
3
メディテラネア・カルディオチェントロ、80122 ナポリ、イタリア
4
ローマ大学運動・人間・健康科学部、00135ローマ、イタリア
5
ヴィラ・スチュアート・スポーツ・クリニック、FIFAメディカル・センター・オブ・エクセレンス、Via Trionfale 5952, 00136 Rome, Italy
6
Associazione Sportiva (A.S.) Roma Football Club, Piazzale Dino Viola 1, 00128 Rome, Italy
7
ローマ・サピエンツァ大学一般外科・外科専門学科、00161ローマ、イタリア
8
IRCCS Neuromed, 86077 ポッツィッリ, イタリア
*
Author who correspondence should be addressed.
†
これらの著者は本研究に等しく貢献した。
‡
これらの著者は等しく本研究に貢献した。
Nutrients 2023, 15(19), 4203; https://doi.org/10.3390/nu15194203
受理された： 受理：2023年8月26日／改訂：2023年9月20日／受理：2023年9月27日／発行：2023年9月28日
(この論文は、特集「アスリートのためのスポーツ栄養学」に属しています。）
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要旨
腸管バリアの破綻は腸管透過性の亢進につながり、内毒素、病原体、その他の炎症性物質が腸管バリアを通って循環系に移行することを可能にする。長期間にわたる激しい運動は腸管透過性を亢進させ、活性酸素種（ROS）や炎症性サイトカインの産生増加によってさらに悪化する可能性がある。本研究の目的は、エリートサッカー選手の腸管透過性の程度を評価し、激しい運動によって誘発される腸管透過性に対するココアポリフェノールの効果を明らかにすることである。24人のエリートサッカー選手と23人のアマチュアアスリートにおいて、タイトジャンクションの調節因子であるゾヌリン、タイトジャンクションタンパク質であるオクルディン、LPSトランスロケーションの循環レベルなどの腸管透過性のバイオマーカーを評価した。さらに、エリートサッカー選手24人を無作為化比較試験において、ダークチョコレート（カカオ85％以上）摂取群（n＝12）と対照群（n＝12）に無作為に割り付け、30日間摂取させた。ベースライン時と30日間のチョコレート摂取後に生化学的分析を行った。アマチュアアスリートと比較して、エリートサッカー選手は、ゾヌリン、オクルディン、LPSの高レベルによって示されるように、腸管透過性の増加を示した。ダークチョコレートを30日間摂取した結果、ダークチョコレートを摂取したエリートアスリートでは腸管透過性の低下が認められた。対照群では変化は認められなかった。In vitroでは、ポリフェノール抽出物はヒト腸粘膜細胞株Caco-2における腸管障害を有意に改善した。これらの結果は、ポリフェノールを豊富に含むダークチョコレートの慢性的な補給が、エリートサッカーアスリートの運動誘発性腸管障害をポジティブに調節することを示している。
キーワード：腸透過性、運動、ポリフェノール
要旨
はじめに
腸管バリアは、必須栄養素の吸収を可能にし、免疫感知に機能し、毒素、食物抗原、細菌から保護する半透性の構造である。実際、腸関門は制限的かつ選択的な物理的バリアであり、リポ多糖（LPS）などの細菌成分が前膜に移行し、全身循環に移行するのを防いでいる [1] 。正常な状態では、腸管バリアは構造的に、腸管内腔から内側と外側の粘液層からなるムチン層、そして上皮細胞間の結合を強固に保つタイトジャンクションやアドヘレンスジャンクションに至るまで、複数の層から構成されており、LPSの移行を防いでいる [2]。しかし、腸疾患、栄養因子、酸化ストレス、機械的損傷、抗生物質、外部刺激など、いくつかの病態生理学的ストレス因子は、腸透過性を誘発する腸バリアを破壊する可能性がある [1]。したがって、健康な腸は、微生物が豊富で、腸の機能が適切に保たれていることが特徴であり、健康と免疫力を維持するために不可欠である。
身体運動は腸内環境と微生物叢の調節因子として作用し、その全体的な構造と機能性に影響を及ぼす。しかし、あらゆる種類の運動が腸内細菌叢に悪影響を及ぼすわけではない。実際、低～中強度の運動は、粘膜の保護、微生物叢の多様性の増加、酪酸産生菌の増加や酪酸濃度の上昇など、消化管にプラスの影響を及ぼすという説得力のある証拠がある [3] 。逆に、1992年には早くも、マラソン後に腸管透過性が急性的に増加することを示した最初のデータが発表されている [4]。さらに、他の著者は、有酸素運動が腸管透過性を誘発することを報告しており、その腸管透過性は運動強度や運動時間の違いによって影響を受ける。実際、最大作業能力の70％以上の負荷で60分以上の激しい持久的トレーニングを行うと、腸管透過性が亢進し、胃の運動性の低下、上皮傷害、粘膜の完全性の障害、栄養吸収障害、局所的・全身的な低悪性度炎症を伴う内毒素血症と関連する [5]。
胃腸障害を経験したアスリートは、健康状態に全体的な影響を及ぼし、パフォーマンスの低下を示した。最近、レジスタンストレーニングを行った男性において、腸管細胞傷害の指標であるラクチュロース・ラムノース（L/R）比と腸管脂肪酸結合蛋白（I-FABP）レベル [6,7] が、運動後の男性で運動していない対照群よりも高いことが証明された [8] 。Ribeiroらは、文献レビューの中で、水泳やランニングを含む数種類の運動による腸管透過性の分子的・生理学的変化を報告している。これらの研究は、持久的運動が腸管透過性の亢進につながること、透過性亢進の決定因子はトレーニングの強度と量であることを示した［5］。
このような証拠があるにもかかわらず、腸管透過性における運動の役割を明らかにし、この現象に影響を及ぼす可能性のある他の変数を特定するためには、さらなる研究が必要である。
運動が腸管透過性に及ぼす影響を緩和しうるいくつかの戦略のうち、栄養および栄養補助食品は、運動に伴う細胞損傷および腸管透過性を予防する役割を果たす可能性がある [9] 。
牛コロストラム、グルタミン、プロバイオティクス、補助炭水化物、抗酸化物質など、さまざまなサプリメントの急性または慢性的な影響が、さまざまな持久的運動プロトコルで試験された [10] 。運動によって誘発される腸透過性を緩和しうる適切な栄養戦略があるにもかかわらず、抗酸化剤などの他のサプリメントでは不明確な結果が示されており [11,12]、アスリートの栄養計画にサプリメントを追加する場合には、より詳細な調査が必要である。
食餌性ポリフェノールは、強力な抗酸化作用と幅広い薬理学的特性を発揮する、天然に存在する最大の植物化学物質群である [13,14] 。ポリフェノールは腸内細菌叢とも相互作用する。代謝障害の様々なマウスモデルにおいて、ポリフェノールやポリフェノールを豊富に含む抽出物は、腸の酸化ストレスを緩和し、炎症状態と腸のバリア機能を改善した [15]。さらに、ポリフェノールは、短鎖脂肪酸産生菌の存在量を増加させ [15]、あるいは循環リポ多糖（LPS）レベルを低下させることによって腸内細菌叢を調節し、炎症状態を改善し、酸化的不均衡を緩和した [15]。最後に、ポリフェノールは、直接的・共同的な作用や、潜在的な病原種に対する抑制作用を通じて、有益な腸内細菌を促進する可能性がある [9]。具体的には、アスリートにおいて、チョークベリー（アロニア）[16]、クルクミン[17]、または果実由来ポリフェノール[18]などの食事性ポリフェノールの補給は、酸化還元バランスと運動パフォーマンスの向上、またはDOMSと筋機能障害の減衰を含む有益な効果を発揮した[16,17,18]。運動によって誘発される腸機能障害におけるポリフェノールサプリメントの効果を報告した研究はほとんどなく [19,20]、ポリフェノールを豊富に含む食品のサプリメントがアスリートの腸管透過性に及ぼす効果に関するデータは得られていない。
したがって、本研究の目的は、エリートサッカー（サッカー）選手の腸管バリア透過性のレベルを検証し、運動前にダークチョコレートの形でポリフェノールを補給することが、腸管透過性を低下させるのに有効かどうかを検証することである。材料と方法
2.1. 研究参加者
本研究は、24名の若いエリート男子サッカー選手（17.2±0.7歳）と、23名の性別をマッチさせたアマチュア選手（30.2±4.6歳）を対象として行われた。簡単に言えば、本研究では、(1)イタリア1部リーグのA.S.ローマのユースチーム（Primavera）の全メンバーであるエリートアスリート（少なくとも14時間/週のトレーニングを行い、6.0METsを超え、少なくとも8年の競技経験がある）と、(2)身体活動的な男性被験者（3.0～6.0METsおよび/または6.0METsを超える中等度から強度の身体活動を3日/週-1日行った）を比較した。
エリートアスリートの登録、トレーニングスケジュール、および除外基準は、以前に記載されている[21]。すべてのアマチュアアスリートは、サッカーを除く「混合スポーツ」を実践しており、すでに説明されているように [22] 、Dal Monte-Lubichスポーツ分類 [23] およびオリンピックスポーツ種目の心血管分類 [24] に従っている。
本研究は、施設内審査委員会（C.E. 4662）の承認を得ており、ランダム化比較試験はClinicalTrials.govに登録された（Identifier: NCT03288623）。
2.2. 試験デザイン
第1段階は、よく訓練された24人の若い男子エリートサッカーアスリートと、対照として23人の性別をマッチさせたアマチュアアスリートにおいて、腸管透過性を比較するために行われた横断研究であり、LPS、ゾヌリン、オクルディンのレベルを測定することによって、腸管バリア完全性の変化を正確に検出することができる3つのバイオマーカーを測定した[25]。第2段階では、エリートサッカーアスリートがランダム化比較試験に参加し、30日間毎日、通常の食事と市販のダークチョコレート40g（12時間ごとに20g）を補給した場合と通常の食事を補給した場合を比較し、ダークチョコレートの形態のポリフェノールが腸管透過性マーカーに及ぼす影響を調べた。
LPS、ゾヌリン、オクルディンの血中濃度は、ベースライン時（T0）とチョコレートを最後に摂取してから30日後（T30d）に評価された。研究期間中、参加者は、体格や臨床的特徴、チョコレート摂取によるカロリー数に応じて調整された食事に従うとともに、ポリフェノール含量の高い食品やチョコレートの追加摂取を避けた。
2.3. 試験製品
第2段階では、ダークチョコレート（カカオ固形分85%以上、カカオマス、脂肪低減カカオ、カカオバター、砂糖、バニラ）の錠剤を投与した。総ポリフェノール含有量は799μg GAE/mLで、エピカテキンは0.65mg/g、カテキンは0.26mg/gであった。
2.4. 採血と準備
すべての血液サンプルは、朝（午前8～9時）、絶食状態のアスリートの座位で前下窩静脈から採取された。選手には、血液検査前24時間は激しい運動を避けるよう指示した。抗凝固剤無添加またはクエン酸三ナトリウム（3.8％、1/10（v/v））含有の試験管（BD Vacutainer、Franklin Lakes、NJ、USA）に採血し、それぞれ血清と血漿を得た。血液を300×g、室温（RT）で10分間遠心分離した後、上清をアリコートに分け、さらに分析するまで-80℃で保存した。
2.5. 腸管透過性バイオマーカーの評価
腸管透過性のマーカーとして、ゾヌリン、LPS、オクルジンのレベルを測定した。
血清サンプルおよび細胞培養液中のゾヌリンレベル、血清LPSレベル、血漿オクルディンレベルは、市販のELISAキット（Elabscience, Houston, TX, USA、Cusabio, Houston, TX, USA、Novus Biologicals Centennial, CO, USA）を用いて測定した。値はゾヌリンについてはng/mL、LPSについてはpg/mL、オクルディンについてはng/mLで表した。
アッセイはすべて製造者の説明書に従って行い、アッセイ内およびアッセイ間の変動係数は、各アッセイとも10％以内であった。
2.6. 細胞培養
腸のin vitroモデルとしてよく知られているCaco-2細胞株は、Sigma Aldrich（米国ミズーリ州セントルイス）から入手した。細胞をT75組織培養フラスコで解凍し、1％L-グルタミンとピルビン酸ナトリウム、10％ウシ胎児血清、1％L-アラニル-L-グルタミン、1％非必須アミノ酸を添加した高グルコースDMEMからなるCaco-2/TC-7 Expansion Medium（試薬はすべてSigma Aldrich, St.
培養が80％コンフルエントに達した時、細胞を5mLのアキュターゼで剥離し、新鮮なCaco-2/TC-7 Expansion Mediumに再懸濁し、450k細胞/cm2の密度で60mmプレートに再播種した。実験に使用した細胞の継代数は2から6の間であった。培地は48時間ごとに交換した。
その後、細胞をビヒクル（リン酸緩衝生理食塩水、PBS）またはカカオ由来ポリフェノール（25～50μg/mL）で1時間前処理した後、PBS中30～120pg/mLの濃度範囲で大腸菌0111:B4（Sigma Aldrich、タンパク質混入率1％未満）のリポ多糖で48時間刺激した。
このメカニズムを検証するため、大腸菌0111:B4のリポ多糖で刺激する前に、TLR4シグナル伝達の特異的阻害剤であるTAK-242（PBS中1μM；InvivoGen社、トゥールーズ、フランス）[26]でも細胞を処理した。
可溶性ゾヌリンを定量化するためにコンディショ ニングメディウムを回収し、オクルディン発現によるバリア損 傷を確認するためにペレットをウェスタンブロットで分析した。実験は3つの異なるバッチのCaco-2で行った。
2.7. チョコレートからのフェノール画分の抽出
脱脂チョコレート1gから、80% (v/v) アセトン/水を用いて、80℃で3mL (1 × 3 mL)のポリフェノールを抽出した。ポリフェノールの大部分はこのアセトン水溶液に含まれており、in vitro試験に使用した。
2.8. Caco-2細胞の生存率
Caco-2細胞の生存率は、比色MTSアッセイを用いて測定した。Caco-2細胞を96ウェルマイクロタイタープレートに8000個/ウェルの密度で3連で播種した。1％L-グルタミンとピルビン酸ナトリウム、10％ウシ胎児血清、1％L-アラニル-L-グルタミン、1％非必須アミノ酸を添加した高グルコースDMEM存在下で72時間培養した後、細胞をLPS（0、30、60、120 pg/mL）またはポリフェノール抽出物（0、25、50、100 µg/mL）で処理した。
培養終了後、CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assayキット（Promega, Madison, WI, USA）を用いて、製造元の指示に従って細胞生存率を測定した。
処理48時間後、調整培地を除去し、20μLのMTS（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H tetrazolium）を100μLの新鮮な培養液に加え、各ウェルに添加し、加湿、5％CO2雰囲気下、37℃で3時間インキュベートした。分光光度計（Varioskan LUX multimode microplate reader, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA）を用いて、波長490 nmの吸光度を検出した。各試験は3連で行った。
2.9. 酸化ストレスバイオマーカーの評価
H2O2は、製造元の説明書（Abcam, Cambridge, UK）に従って比色測定法で測定した。NOX2活性の指標であるsNox2-dpは、既報のELISA法で評価した[27]。値は、H2O2についてはμM、sNOX2dpについてはpg/mLで表した。アッセイ内およびアッセイ間の変動係数は、各アッセイとも10%未満であった。
2.10. タンパク質の検出、電気泳動、ウェスタンブロット分析
プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（10μg/mL; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）存在下、氷冷したRIPAバッファーで細胞をこすり、超音波処理を3回行った。氷上で30分間インキュベートした後、サンプルを10,000×gで20分間遠心し、上清を回収して2×Laemmliサンプルバッファーと2-メルカプトエタノール（20%）と混合した。
Bradford比色アッセイでタンパク質濃度を測定し、等量の細胞タンパク質（30μg/レーン）をSDS-PAGE（10-12%ポリアクリルアミドゲル）で分離した後、Trans-Blot Turbo（Mini Nitrocellulose, Bio-Rad, Hercules, CA, USA）でニトロセルロース膜に電解転写した。一次抗体：ウサギポリクローナル抗オクルディン（Sigma Aldrich）およびマウスモノクローナル抗アクチン（Santa-Cruz Biotechnologies, Dallas, TX, USA）を用いて4℃で一晩インキュベートした。HRP標識二次抗体（1:3000; Bio-Rad、CA、USA）をメンブレンと1時間インキュベートした後、強化化学発光基質（ECL Substrates, Bio-Rad、CA、USA）を用いてブロットを検出した。デンシトメトリー分析は、Image Labソフトウェア6.1.0を用いて行った。結果は任意単位（A.U.）で表し、3回の独立した実験の平均として表した。
2.11. 統計分析
すべての連続変数はShapiro-Wilk検定で正規性を検定した。正規分布のある連続変数は平均値±標準偏差（SD）として、ノンパラメトリック変数は中央値および四分位範囲（IQR）として報告した。群間比較は、正規分布の変数については対応のないT検定を用い、正規分布でない変数については適切なノンパラメトリック検定（Mann-Whitney U検定）を用いて行った。相関はスピアマンの順位相関係数を用いて計算し、Rsとして記述した。すべての解析はPrism GraphPad version 9を用いて行った。結果
3.1. 観察研究
エリートサッカー選手とアマチュアアスリートの臨床的特徴は、以前に報告されており [21,22]、表1に報告されている。
表1. アマチュアアスリートとエリートサッカー選手のベースライン特性。
腸管透過性のすべてのマーカーは、アマチュア選手と比較してエリート選手で有意に高かった（図1A-C）。
栄養素 15 04203 g001図1. アマチュアおよびエリートサッカー選手における腸管透過性。アマチュア（n=23）とエリートサッカー選手（n=24）における（A）LPS、（B）ゾヌリン、（C）オクルディンの血清レベル。データは散布図とヒストグラムで、パネル(A)では平均値±SD、パネル(B,C)では中央値[四分位範囲]で報告されている。*** p 値＜0.001はt検定、p＜0.001はノンパラメトリック検定（Mann-Whitney U検定）を用いて算出した。
相関分析によると、LPSはゾヌリン（r = 0.773、p < 0.001）およびオクルディン（r = 0.752、p < 0.0001）と関連していた（図2A,B）。興味深いことに、絶対強度の基準閾値であるタスクの代謝等価値（METs）は、LPS（r = 0.603、p < 0.0001）、ゾヌリン（r = 0.501、p < 0.001）、オクルディン（r = 0.500、p < 0.001）と正の相関があることがわかった（図2C-E）。
栄養素 15 04203 g002図2. アマチュアサッカー選手23名とエリートサッカー選手24名における、LPS濃度の垂直方向対水平方向のゾヌリン（A）とオクルディン（B）、およびMETsの垂直方向対水平方向のLPS（C）、ゾヌリン（D）、オクルディン（E）の有意な（両側）スピアマン正相関を示す散布図。各ドットは個々の値を表す。
3.2. 介入試験
30日間のトレーニング後、対照群ではベースラインと比較してLPSレベルの上昇が見られた（31.5±4.8pg/mLから46.5±5.15pg/mLへ、*** p < 0.001）（図3A）。さらに、ベースラインと比較して、ゾヌリンとオクルジンのレベルも上昇した（2.63±0.49ng/mLから4.65±0.97ng/mLへ、*** p < 0.001、0.96±1.88ng/mLから1.42±0.37ng/mLへ、** p = 0.003）（図3B,C）。LPS、ゾヌリン、オクルディンのレベルは、エリートサッカー選手では、ベースラインと比較してダークチョコレート摂取30日後に変化しなかった（29.2±7.75pg/mLから31.7±8.37pg/mLへ、p = 0. 561、3.06±1.40ng/mLから3.50±1.25ng/mLへ、p＝0.150、および0.88±0.32ng/mLから0.86±0.37ng/mLへ、p＝0.99であった）。
栄養素 15 04203 g003図3. エリートサッカー選手における1日40gのダークチョコレート（緑丸、連続線）またはダークチョコレートなし（青四角、点線）の摂取前および摂取30日後のLPS（A）、ゾヌリン（B）、オクルディン（C）レベル。データは平均値±標準偏差で示した。(*** p < 0.001; ** p < 0.01; * p < 0.05)。
LPS（46.5±5.15pg/mL対31.7±8.37pg/mL、*** p < 0.001）（図3A）、ゾヌリン（4. 65±0.97ng/mL対3.50±1.25ng/mL、* p < 0.05）（図3B）、試験終了時のオクルディン（1.42±0.37ng/mL対0.86±0.37ng/mL、*** p < 0.001）（図3C）であった。
3.3. In Vitro試験
腸透過性に対するココア由来ポリフェノールの臨床効果を立証するために、ダークチョコレートから抽出したフェノール画分を用いたin vitro試験を行った。
まず、異なる濃度のLPS（0～120 pg/mL）が上皮細胞の生存率に及ぼす影響を調べ、無毒性の濃度を選択した。生理的に適切な濃度のLPSが腸管上皮細胞に及ぼす影響を検証するため、エリートアスリートの血清から検出された濃度のLPSを試験することにした。0-120 pg/mL LPSと48時間インキュベートしたCaco-2細胞では、LPSの用量にかかわらず、細胞生存率に統計的な差は見られなかったことから、0-120 pg/mL LPSにはCaco-2細胞に対する細胞毒性作用がないことが示された（図4A）。
栄養素 15 04203 g004図4. LPS誘発腸管上皮バリア障害および酸化ストレスに対するPPの保護効果。細胞生存率に対する(A) LPS (0-120 pg/mL) および(B) PPs (0-100 μg/mL)の影響。Caco-2細胞の生存率は、各化合物とともに48時間培養した後の培養液中の細胞の490 nmにおける光学密度（O.D.）として表した。LPS（30-120pg/mL）または60pg/mLのLPSとカカオ由来ポリフェノール（PP、25および50μg/mL）またはTAK-242（1μM）の併用で刺激したCaco-2細胞のオクルジン発現（C）、ゾヌリンレベル（D）、H2O2産生（E）、sNOX2dp放出（F）。ノンパラメトリック検定による# p < 0.05および# # p < 0.01。
さらに、ポリフェノール抽出物（PP）に毒性作用があるかどうかを調べるため、Caco-2細胞を、ダークチョコレート摂取後のエリートサッカー選手の血清中に見られる濃度と比較的近い濃度のPP（0、25、50、100μg/mL）と48時間インキュベートした[21]。細胞生存率は、試験した用量のPPの存在下で変化せず、Caco-2細胞に対する細胞毒性作用がないことを示した（図4B）。
3.3.1. PPはLPS誘発の腸管上皮バリア障害を回復させる
上皮バリア機能障害に対するLPSの影響を確認するため、(1)タイトジャンクション構造と透過性に重要な役割を持ち[28]、破壊されるとバリアから放出され血液中で検出可能になる膜一体型タイトジャンクションタンパク質であるオクルジンの発現量[29]、および(2)腸管透過性の重要な調節因子であるゾヌリンレベル[30]を評価した。そこで、Caco-2細胞をPP（25および50μg/mL）で1時間前処理した後、LPS刺激を行った。その結果、LPSは60pg/mLと120pg/mLの濃度で、刺激していない細胞に比べてオクルディンのタンパク質レベルを有意に低下させた（図4B）。タイトジャンクションの発現障害と一致して、LPS処理細胞では未処理細胞に比べてゾヌリンのレベルが上昇していた（図4C）。ポリフェノール抽出物（25-50μg/mL）で処理すると、オクルディン発現が有意に改善され（図4B）、細胞培地中のゾヌリンレベルが減少した（図4C）。
最後に、TLR4阻害剤（TAK-242）で細胞を前処理すると、LPSが介在する細胞障害が有意に減少し（図4C,D）、このプロセスにおけるLPSの役割が確認された。
3.3.2. PPはLPS誘発酸化ストレスを軽減する
腸管障害に対するPPの有益な効果の基礎となるメカニズムを調べるため、処理した細胞の上清を、(1)NOX2活性化の指標である可溶性NOX2由来ペプチド（sNOX2-dp）濃度、(2)H2O2産生について評価することにより、酸化ストレスを測定した。LPS（60および120 pg/mL）は酸化ストレスの有意な増加を惹起したが、PP（25および50 μg/mL）による前処理はsNOX2-dpおよびH2O2レベルを減少させた（図4E,F）。TLR4の特異的阻害剤の添加は、LPS誘発酸化ストレスを鈍化させた（図4E,F）。
4. 考察
ここでは、(1)腸管透過性のマーカーは、中等度の運動と比較して、激しい運動中に有意に増加すること、および(2)ダークチョコレートの慢性的な摂取は、エリートサッカー選手のトレーニングセッション中の激しい運動によって誘発される腸管透過性の障害を打ち消すことができるという証拠を提供する。In vitroでは、ダークチョコレートのポリフェノールが、腸管バリアの完全性に害を与えるLPSによって誘導される酸化ストレスと上皮透過性を緩和できることを実証した。
集中的な運動が腸の健康と完全性に影響を与えることは、いくつかのエビデンスで報告されている。しかし、腸粘膜に悪影響を及ぼさない適切な運動量-反応閾値に関する詳細な情報はない。急性または長時間の運動によって腸管透過性が誘導される程度は、運動時間と強度、およびセッション間の回復に直接関係することが知られている [31] 。
最近のメタアナリシス [32] では、急性運動が腸管透過性マーカーと腸管細胞損傷に及ぼす影響が検討されており、健康な参加者では、1回の運動で腸管損傷と透過性が著しく増加するという現在の仮説が支持されている。さらに、実験モデルでは、急性運動後数時間は腸管バリアの破壊が続く可能性が示唆されている [33] 。さらに、激しい運動を持続的に行っているアスリートは、腸内細菌叢の組成が低グレードの炎症プロセスと関連していることを報告している [34]。炎症性細菌が多いため、腸管透過性パラメータも増加した。
我々の研究では、非常に激しいプロのトレーニングプログラムに参加するエリートアスリートは、中程度から激しい運動に従事するアマチュアアスリートと比較して、腸の機能低下の2つのバイオマーカーであるゾヌリンとオクルジンの循環レベルの増加を示した。さらに、腸管透過性の亢進と一致する血清LPSレベルの上昇も認められた。この関連は、LPS、ゾヌリン、オクルディン間の正の相関によっても確認された。
腸管バリアはヒトの健康にとって重要な機能を持ち、腸疾患や全身疾患の発症に関与している。腸内細菌異常症によって誘導される腸管接着タンパク質のダウンレギュレーションにより、LPSは活性酸素種（ROS）産生の増加 [35] を引き起こし、全身循環に移行して炎症反応を誘発し、動脈硬化性障害 [36]、凝固活性化、血栓形成 [37,38] の一因となる可能性がある。
アスリートのトレーニングや競技のスケジュールが増えるにつれて、腸管透過性を調節できる効果的な非侵襲的戦略を特定することが重要である。一般に、天然物由来のポリフェノールを食事から補給することで、抗酸化作用や血管作用に関連する可能性が高いメカニズムで、身体能力を向上させることができるという証拠が増えつつある。我々は以前、ポリフェノールを豊富に含む食品の補給が、高強度トレーニングのエリートアスリートの抗酸化状態にプラスの効果をもたらすことを実証した [21] 。腸内微生物生態系の調節におけるポリフェノールの効果については、いくつかの研究で報告されている [39]。ポリフェノールが豊富な食品がヒトの腸管透過性に及ぼす潜在的な有益効果について検討した研究はわずかであるようであり [30]、アスリートにおけるポリフェノール補給に関する不明確な知見については、さらなる研究が必要である。
本研究では、ポリフェノールを多く含むダークチョコレートを慢性的に補給すると、補給していないアスリートと比較して、激しい運動によって誘発される腸透過性のバイオマーカーが減少することを実証した。
ダークチョコレート由来のポリフェノールによる有益な効果は、試験管内のCaco-2細胞を用いて、タイトジャンクション構造の完全性を確保するのに重要なタンパク質システムを分析することによっても確認された。タイトジャンクションは、クローディン、オクルディン、細胞内足場のゾヌラ・オクルディンタンパク質（ZO-1、ZO-2、ZO-3）など、いくつかの主要な種類のタンパク質からなる複数のタンパク質複合体からなる複合分子構造を持っている。タイトジャンクションは、様々な活性酸素、特にH2O2 [38]を含むいくつかの因子によって制御される可能性があり、酸化ストレスを発生させる。我々のデータは、in vitroでLPSが酸化ストレスを増加させ、その結果腸細胞の完全性を破壊することを確認した。酸化ストレスと腸細胞傷害の両方は、ポリフェノール処理によって回復した。
我々の研究には限界と含意がある。ポリフェノール補給が、集中的な運動中のエリートアスリートの腸透過性を調節するという事実は、腸傷害に対抗し、腸由来のLPSによって誘発される心血管系リスクを軽減する可能性のある、栄養に関連した戦略に関する新たな洞察を提供するものである［38］。
我々は、腸管透過性の直接的な評価を行っていないことを認めなければならない。したがって、観察された間接的なバイオマーカーの増加は腸管障害を示しているに過ぎず、LPSの増加がこのような状況において腸管障害を誘発する可能性があると推測しているに過ぎない。第二に、ポリフェノールが腸の機能を回復させるメカニズムを部分的に評価した。これまでの研究から、ポリフェノールは腸内でいくつかのレベルで生物学的活性を発揮することが示されている。ポリフェノールは、その代謝産物を通して腸内微生物の生態系を調節することができ、この機能は、エリートアスリートにおいてサプリメント摂取後に観察されたLPSの減少を説明することができる。さらに、ポリフェノールは、NF-κBなどの炎症遺伝子やサイトカイン産生をダウンレギュレートし、抗酸化遺伝子をアップレギュレートすることができる[40]。しかし、腸内細菌叢と透過性調節が関与するメカニズムは依然として不明であり、さらなるメカニズム研究が必要である。我々は、グループ間の比較可能性を高めるために、男性および混合スポーツのアスリートのみを対象としたため、我々の結果は、技能、持久力、およびパワーのアスリートのように、すべてのアスリートに適用することはできないが、女性アスリートと同様に、これらの集団においても具体的な研究を実施すべきである。最後に、アマチュアアスリートとエリートサッカー選手の平均年齢には大きな差があることを認めなければならない。しかし、これまでのデータでは、年齢を重ねても腸管バリアの機能的能力は維持されることが示されている[41,42]。
5. 結論
この結果から、激しい運動は腸管透過性を低下させ、ダークチョコレート由来のポリフェノールは優れた抗酸化作用と抗炎症作用を持つ活性天然物であり、LPS誘発傷害から腸管細胞を効果的に保護することが明らかになった。これらの結果は、ダークチョコレートのようなポリフェノールが豊富な食品が、サッカー選手のLPS関連腸管障害を予防するための有効なアジュバントとなる可能性を示唆している。
著者貢献
C.N.、E.C.、A.D.、R.C.、執筆-原案作成、方法論、調査；M.P.、V.C.（Vittoria Cammisotto）、V.C.（Valentina Castellani）、V.P.、S.B.、方法論、調査、データキュレーション；E.C、 F.D.G., V.C. (Vincenzo Costa), C.S., M.M. and A.N., resources; C.F., F.P., F.Q., G.F. and S.S. writing-review and editing; C.N. and R.C., conceptization, writing-original draft preparation, and supervision. すべての著者が本原稿を読み、同意した。
資金提供
本研究は外部資金援助を受けていない。
施設審査委員会声明
本研究はヘルシンキ宣言に従い実施され、ローマ・サピエンツァ大学ポリクリニコ・ウンベルト1世の施設審査委員会（C.E. 4662）の承認を得た。
インフォームド・コンセント
本研究に参加したすべての被験者からインフォームド・コンセントを得た。
データの利用可能性に関する声明
本研究で発表されたデータは、対応する著者からの要請により入手可能である。
利益相反
著者らは利益相反がないことを宣言する。
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