呼気揮発性メタボロームから食物繊維が腸内細菌叢に与える影響を明らかにする。健康なボランティアにおける概念実証

2022年11月28日 09:31

論文|第80巻 104051号 2022年06月01日発行
呼気揮発性メタボロームから食物繊維が腸内細菌叢に与える影響を明らかにする。健康なボランティアにおける概念実証
オードリー・M・ネイリンク 1
ジュリー・ロドリゲス 1
Zhengxiao Zhang
Julie-Anne Nazare
Laure B. Bindels
パトリス・D・カニ
他
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脚注を表示するオープンアクセス公開日:2022年5月10日DOI:https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2022.104051
PlumX メトリクス

概要
背景
食物繊維（DF）は、腸内細菌叢との相互作用により、その生理学的効果に大きく寄与していることが、現在のデータから示唆されている。食物繊維の細菌発酵は代謝産物の産生につながり、その多くは揮発性である。本研究では、健康な人（n=15）を対象に、不溶性の発酵性食物繊維であるキチン-グルカン（CG、4.5 g/日）に3週間介入する前と後の呼気揮発性代謝物（BVM）プロファイルを分析した。
研究方法
本調査は、副次的結果、特にBVMの分析に関連するオリジナルデータを提示するものである。BVMは、試験期間中（空腹時および標準化された食事後）、選択イオンフロー管質量分析法（SIFT-MS）を用いて分析された。BVM産生は、介入前後に分析された腸内細菌叢組成（イルミナシーケンス、主要アウトカム）と相関していた。
得られた知見
データは、食後の状態と空腹時の状態がBVMフィンガープリントの重要な決定要因であることを明らかにした。糞便微生物相との相関分析により、酪酸産生菌、特にFaecalibacteriumが酪酸およびその他のBVMの排出に関与する主要な細菌としてスポットライトを浴びた。CGの介入は、空腹時BVMの個人間変動を促進し、ほとんどの呼気BVMの呼気を減少または遅延させ、H2呼気を好むが、胃腸の耐性には影響を及ぼさないことがわかった。
解釈
BVMの評価は、腸内細菌叢に対するDF介入の影響を分析するための非侵襲的な方法論である。
資金調達
FiberTAGプロジェクトは、欧州共同プログラミングイニシアチブ「A Healthy Diet for a Healthy Life」（JPI HDHL）の一環として開始され、Service Public de Wallonie (SPW-EER, convention 1610365, Belgium) の支援を受けています。
キーワード
腸内細菌叢
食物繊維
短鎖脂肪酸
キチン-グルカン
発酵
呼気中揮発性メタボローム

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はじめに
腸内細菌叢の組成は個人間で大きく異なることがあり、食生活によってヒトの微生物構造のばらつきの約20%が説明される。食事とマイクロバイオームがヒト血清メタボロームの最も強力な決定要因であることを考えると4、食品成分とマイクロバイオームの相互作用から生じる生物活性代謝物の同定は、栄養戦略に基づく健康増進のバイオマーカーの提案に役立つ可能性があります。実際、腸内細菌はメタン、H2、短鎖脂肪酸（SCFA）、アルカンなどの揮発性代謝産物の主要な供給源となっています。このような代謝産物は、呼気中に一部排出される。このことは、BVM分析が、代謝異常、特定の食習慣、またはその両方の指標となり得ることを示唆しています。私たちは以前、健康なボランティアにおいて、朝にDF（キチンブルカン）を1回摂取すると、1日を通して特定のBVMプロファイルが形成されることを明らかにしました9。
DFの栄養学的な興味は、広範な文献に基づく健康への恩恵が認識されていることに起因している。動物およびヒトにおける研究に基づいて、DFはSCFA産生に関連するメカニズムを通じて満腹感を高め、代謝障害を改善し、腸管関連免疫を調節し、それによって内分泌および代謝機能、腸管上皮の完全性に影響を与える可能性があることが提案されています10、11、12、13、14 ほとんどのDFは完全に、またはある程度、異なる動態で発酵可能です15。
FiberTAGプロジェクト（Joint Programming Initiative "A Healthy Diet for a Healthy Life" 2017-2020 https://www.fibertag.eu/）の文脈で、非侵襲的かつ革新的な方法（したがって血液サンプリングを除く）により、DF摂取と腸内細菌関連健康効果を結びつける一連の生物活性細菌代謝物の確立を目指しています。 16 健康なボランティアを対象に、欧州食品安全機関17で安全な食品成分として認められている新規の不溶性DFであるキチン-グルカン（CG）4,5 gを3週間毎日投与する単方向介入研究を実施した。我々は、このようなCGの補給が3週間後に腸内細菌叢の組成に特異的な変化をもたらし、主にEubacterium、Dorea、Roseburia属を促進し、糞便中の酪酸、イソ吉草酸、カプロン酸レベルが増加することを示した18。これらのデータから、3週間CG介入後のBVM測定がDF摂取と腸内細菌叢の相互作用を反映していると推測された。本論文では、選択イオンフロー管質量分析計（SIFT-MS）を用いて、空腹時および食後のBVMを測定し、そのデータを糞便マイクロバイオームシークエンスと関連付けたデータを紹介する。
研究方法
参加者と研究デザイン
FiberTAG研究は、呼気中に放出される揮発性代謝物および便サンプルの腸内細菌叢を分析することにより、3週間にわたり毎日4.5gのキチン-グルカン（KitoZyme, BelgiumのKiotransine®）を補給した後の腸内細菌叢組成および活性を特徴付けることを目的とした2日間のテスト日を含む介入単中心研究である。これは縦断的なプロトコルで、同じボランティアにおいて、投与21日後と0時間後のデータを比較したものである。健康的なライフスタイルの中でCGを補給することの妥当性を調査するために、健康な若い被験者が選ばれた。サンプルサイズは、主要アウトカムに基づき、ソフトウェアPASS 14.0.7と対の平均出力分析テストを用いて見積もられた。15人の被験者は、特定の腸内細菌レベル（主要アウトカム）における平均差2％、推定差の標準偏差2％（両側）を94％の検出力で検出するのに十分である。この数は、呼気代謝物分析に焦点を当てた他の研究と一致していることに注目したい19, 20, 21。
健康な被験者は、臨床栄養学研究センター（CICN-UCLouvain）が大学敷地内にポスターを掲示し、郵便、ソーシャルネットワーク、地元新聞、近隣都市の店舗や医院で配布されるチラシで募集しました。健康な男女34名を募集し、スクリーニングテストを実施した。そのうち16名が事前に設定された参加基準および除外基準に基づいて研究に参加し、割り付けられた介入を受けた。15名が研究を完了した。
被験者は、事前に電話または郵便で質問票によるスクリーニングを受け、参加基準（男性または女性、18～40歳、ボディマス指数（BMI）18～25kg/m2、白人、非喫煙者、病歴および身体検査からわかる良好な一般健康状態、女性には有効な避妊法の使用、H2プロデューサーの必要）を満たしているかどうかを検査された。除外基準は以下の通り。胃腸障害、慢性腸疾患（潰瘍、憩室炎、炎症性腸疾患など）、喫煙、試験開始前4週間以内に抗生物質、プロ／プレバイオティクス（栄養補助食品）、腸管通過に影響を与える製品（下剤など）を現在または最近使用した場合。腸内細菌叢の組成を変化させる薬剤（抗糖尿病薬、コレステロール低下薬、プロトンポンプ阻害薬）の使用、妊娠中または授乳中の女性（および効果の高い避妊をしていない女性）、精神疾患（および/または抗精神病薬の使用）、薬剤の慢性摂取、特定の食事療法（例. g., ベジタリアン、高繊維食、高タンパク食）、アレルギーまたは食物不耐性（例：乳糖またはグルテン）、試験製品の1成分に対するアレルギーまたは不耐性の存在、過度のアルコール摂取（3単位/日以上）、スクリーニング訪問の1ヶ月前に別の臨床試験に参加していることなどが挙げられます。募集は、2018年2月から3月にかけて実施しました。本試験は、2018 年 4 月から 5 月にかけて実施された。
健康な男女34名を募集し、以前に説明したようにH2産生者を選別し、小腸菌過繁殖（SIBO）の被験者を除外するために、ラクチュロースを用いたスクリーニング検査を行い、便を採取した9。H2産生者であるかどうかを評価するため、介入の少なくとも4週間前にスクリーニング用ラクツローステストを実施した。ラクチュロース10gを空腹時（10時間以上）に経口投与し、4時間の間、30分ごとに呼気中H2を測定した（Lactotest 202, Medical Electronic Construction, MEC使用）。H2産生者を選択するためには、3回の測定でH2が10ppm以上増加することが必要である。SIBOの被験者を避けるため、最初の30分間はH2の増加は観察されない。参加者は、インフォームドコンセントと、すべての研究手順を遵守する意思、および研究期間中に参加可能であることを表明した。
スクリーニング検査後、被験者は治験責任医師による健康診断を受け、健康であることが確認された。この健康診断の後、被験者は少なくとも介入の2週間前から、栄養士からDFを多く含む食事を避けるようにアドバイスを受けた。食物繊維を多く含む食品（全粒粉、アーティチョーク、エルサレムアーティチョーク、サルサ、ネギ、タマネギなど）の摂取は週に1回に制限された。
食物繊維を多く含む試験食摂取後のBVM産生動態を評価するために、CGによる栄養介入の前（0日目）と後（21日目）の2回の試験日を設けた。被験者は、2回の試験訪問の1週間前に3日間の食事日記（平日2日、週末1日）を記入し、その日に摂取したすべての食品と飲料を報告しなければならなかった。Nubel ProプログラムとNubel 2010の成分表を使用して、大栄養素と食物繊維の摂取量を評価した。0日目および21日目の前4日間に、すべての被験者に新鮮な便サンプルの提供を依頼した。介入期間中、被験者に郵便または電話で頻繁に連絡し、被験者が依然として参加/除外基準を満たしていること、食事のアドバイスに従っていること、便の採取を確認した。さらに、被験者は介入期間中毎日、電子アンケート（REDCap（Research Electronic Data Capture）と呼ばれるソフトウェアを使用）に回答するよう求められ、これにより被験者の副作用とコンプライアンスを監視することができた。また、被験者の副作用や服薬状況を把握するため、空箱や未使用の箱は返却された。
倫理性
本研究は、地元の倫理委員会（Comité d'Ethique Hospitalo-Facultaire UCLouvain/Cliniques Universitaires Saint-Luc; reference 2017/11SEP/437）の承認を受け、研究への参加前にすべての被験者から書面によるインフォームドコンセントを得ている。本試験は、人体実験に関する2004年5月7日のベルギー法および臨床試験に関するEU指令2001/20/ECで要求されているGCP（Good Clinical Practice）に従って実施された。本試験は、ClinicalTrials.govに識別番号NCT03505177で登録された（登録日：2018年4月23日）。
試験のアウトカム
本試験の主要アウトカムは、3週間のCG補給による腸内細菌叢組成の評価であり、結果は我々のチームによって既に発表された18。本探索的研究では、副次アウトカムに関連するオリジナルデータ、特に高度に制御した食事摂取による試験日のBVMの分析が提示されている。これらのデータは、主要アウトカムの研究で検討され、以前に発表されたのと同じ被験者から得られたものである18。
試験日
試験日（0 日目および 21 日目）はいずれも同じ方法で構成された。試験デザインの概要を図 1 に示す。
図1
図1試験日の研究デザインの概要
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介入日2日前の晩、被験者は野菜をとらずに米と肉を食べ、アルコールは控えるように指示された。前日の午後9時から絶食した被験者は、午前7時に調査センター（CICN）に到着した。治験コーディネーターは、被験者の参加基準および除外基準を確認し、指示が適切に行われているかを確認した。口腔洗浄（ペリオエイドインテンシブケア）後、ベースライン時のBVMを分析するために呼気サンプルを採取した。その後，ライ麦パン2枚にカロブスプレッド25gを塗った繊維質の多い標準的な朝食（合計15g）とオレンジジュース200mlを摂取した．朝食は参加者全員が15分以内に食べた。朝食摂取後10時間ごとに呼気サンプルを採取し，BVMを測定した．一方、食物繊維摂取後に通常見られる8つの胃腸症状（痙攣、膨満感、腹鳴、不快感、鼓腸、げっぷ、胃腸の逆流、吐き気）を調べるため、ベースライン時と朝食摂取後10時間毎に被験者に100mmVASアンケートを依頼した。尺度は、0からの距離（mm）を定規で測定することでスコア化された。スコアはベースラインからの変化としてcm単位で表した。なお、朝食摂取の2時間後、被験者は自由に水を飲むことができた。開始5時間後、被験者は白パン、ハム、チーズからなる標準化された昼食を摂取した。この昼食は15分以内に全員が食べている。午後4時（開始8時間後）、被験者はコラショ（甘いワッフル）を受け取った。試験日は午後6時に終了した。
呼気中揮発性代謝産物（BVM）分析
専用のサンプリングバッグ（MEC R&D SPRL, Belgium製 FMONP.SBAG1.01）を用いて、呼気サンプル（200 mL）を採取した。被験者は、通常の呼吸の後、サンプラーから深くゆっくりと息を吹き込むように訓練された。バッグはInterscience社（ベルギー、Louvain-La-Neuve）に直接運ばれ、まずBVM測定のためにSIFT-MS（Voice 200ultra, Syft Technologies, New Zealand）に、次にH2分析のためにTCD検出器（Trace 1310 GC, Thermo Scientific, USA）に接続されました。さらに、エネルギー代謝を研究し、DFの腸関連代謝効果を研究するために、特に腸内発酵を反映することが知られている揮発性代謝物（細菌代謝に由来）をターゲットとした8,21。実際、確率的商標準化（PQN）を含むいくつかの標準化アプローチは、人工的な差異、特に偽陽性のバイオマーカー同定を引き起こす傾向があり、SIFT-MS技術によるバイオマーカー同定には推奨されないことが示されています22,23。しかし、バッグには相互変動があることが知られていますが、環境や大気条件（温度など）に起因して現れる可能性のあるバックグラウンドバイアスを取り除くために、試験の各時点、すなわち両試験日の0h-30分-2h-4h-5h-6h-8h-10hで不活性ガスで満たされたバッグで測定したBVM濃度を検討しました。そこで、呼気サンプル中の同定されたBVM（H2を含む）を、まず、ヘリウムを充填したバッグから各時点で得られた値で補正した（バックグラウンド除去）。その後、データを絶対値（ppm）またはベースラインからの変化量（ppm）として表現した。
データ統合と統計解析
本研究では、プロトコルごとの解析が完了した。データは中央値±四分位範囲で表した。しかし、中央値は、考慮される時間が何であれ、胃腸症状のほとんどについて0であるので、データは、表S3および図S5について平均値±SDとしても表される。曲線の下の正味面積（AUC）は、毎時間記録された各症状と、10時間の間に記録された各識別されたBVMについて計算された。さらに、時間経過に伴う進化BVMを比較するために、混合モデルとSidak post-testを実施した（図S2）。PCAモデル（図S1および補足ビデオに記載）は、R（v3.5.1、パッケージ「ade4」）を使用して、正規化ステップなしで生データに構築された。相関分析は、Rの "corrplot "パッケージを用いたスピアマンの相関検定により、0日目または21日目の相対存在度の平均が1％以上のBVMと属の間で行われた。
資金提供者の役割
資金提供者は、研究デザイン、データ収集、データ解析、データ解釈、報告書の執筆、および論文を出版するための投稿の決定において、いかなる役割も担っていない。責任著者は、本試験の全データにアクセスし、論文投稿の決定について最終的な責任を有していたことを確認する。
研究成果
対象者
男性7名、女性8名がラクツロース試験によりH2産生者と判定され（データは示さず）、試験参加資格および除外基準を遵守して試験を完了した。参加者のコンプライアンスは96.5％であった。参加者のベースライン特性は表S1に示す通りである。炭水化物、脂質、タンパク質、繊維およびアルコールの摂取量に有意な影響はなかったが、エネルギー摂取量は3週間のCG補給で約15％減少した18。
CG投与後、DFを多く含む朝食の摂取に反応して、より高いH2が排出された
図2は、0時間後、5時間後、10時間後にGC-TCDで測定された呼気中のH2を示しています。H2は200ppmより高濃度で呼気された。空腹時（0時間）の基礎濃度は、両試験日間で有意な差があった（p = 0.0186）。興味深いことに、呼気中のH2は、0日目の朝食摂取後5時間および10時間では減少（-20ppm）したが、CG介入後には増加（+20ppm）した（p = 0.0001）。
図2
図2健康な被験者（n=15）の呼気中の水素は、キチン-グルカン摂取前（0日目）と摂取後（21日目）の標準的な朝食摂取に反応して排出された。データは絶対値（a）およびベースラインからの変化（b）。データは中央値±四分位範囲（*p < 0.05; Matched-pairs Wilcoxon signed-rank test）である。
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CG処理後のDFを多く含む朝食の摂取に反応して、呼気中のBVMプロファイルが変化していた
SIFT-MSを用いた非標的解析により、試験日中の異なる時間における呼気のフィンガープリントを記録した。3つの前駆イオン（H3O+、NO+、O2+）でイオン化して得られたMSフラグメントの動的な進化を、主成分分析（PCA）解析によって示した（図S1および補足ビデオ）。その結果、両試験日の15人の被験者について、測定時間によって別々のクラスタが形成されていることが確認された。最も判別性が高かったのは、一晩絶食した状態（時刻0h）と絶食状態（時刻30分以降）、食前状態（昼食前、時刻4hと5h）、食後吸収状態（時刻6h以降）であった。さらに、一晩絶食した状態で個人差が大きくなることが観察され、これは3週間のCG投与で促進される効果であることがわかった。
図3および図3は、時刻0hに得られたベースライン値で補正したppmでの濃度を示しているのに対し、図S2には、CG摂取前および3週間後の呼気中に吐き出されたすべてのBVMの時間変化を絶対値 (ppm) で示している。呼吸で吐き出されるBVMによって、0.001〜100ppmの範囲で濃度の大きなばらつきがあることが確認された（図S3）。その結果、1ppm以上の濃度で検出されたBVMはメタンとアセトンの2種類のみであり、いずれもCG摂取の影響を受けていないことがわかった。呼気中に検出された低濃度（0.01〜1ppm）のBVMのうち、空腹時（時間0h）のアセトアルデヒドとフェノールは0日目に対して21日目に有意に高値を示したが、空腹時の呼気中のペンタン、酪酸および3-ヒドロキシブタノンは介入後に低値を示した（混合モデル、p＜0.0001、処理別）。0.01ppm以下の呼気中H2S、トリエチルアミン、カプロン酸も両試験日の0時間後の値で差が見られた。
図3
図3キチングルカン摂取前（0日目）と摂取後（21日目）の標準的な朝食摂取に対する健常者（n=15）の呼気中のBVM濃度（ベースラインからの変化）（3週間のキチングルカン摂取により有意に影響される）。データは中央値±四分位範囲（*p < 0.05; Matched-pairs Wilcoxon signed-rank test on net area under the curve)である。
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DFを多く含む朝食摂取後の呼気BVMの変化（空腹時のベースライン値に対する変化として表現）に注目した（図3およびS3）。混合モデルにより、すべての対象BVMについて、時間の有意な影響が明らかになった（p < 0.05）。酪酸、カプロン酸、エタノール、フェノール、メタン、ペンタン、トリエチルアミン、2,3-ブタンジオン、アセトアルデヒドについてCG処理の有意な効果が得られた（すべてのBVM進化について実施した混合モデル：p＜0.05）。同定された6種類のSCFAのうち、DFリッチ朝食後の酪酸およびカプロン酸濃度の推移の正味AUCは、CG処理により有意に減少した（それぞれp = 0.0353 and p = 0.0004）（図3）。呼気中に排出されるSCFAの変化の他に、図3は、CGによる栄養介入後に純AUCが有意に低下した8つのBVM、すなわち、ブタノール（p = 0. 0084）、エタノール（p = 0.0034）、フェノール（p < 0.0001）、メタン（p = 0.0151）、ペンタン（p = 0.0001）、トリエチルアミン（p = 0.0215）、2，3-ブタンジオン（p < 0.0001）およびアセトアルデヒド（p = 0.0003）でした。これらの副次的結果に対する検出力の計算と効果の大きさは表S2に示した。その結果、6つの項目で検出力と効果の大きさが優れていることがわかった（それぞれ80％以上、0.8以上）。プロピオン酸とアセトアルデヒドは、朝食に反応して減少した唯一のBVMであり、それ以外の日中の変動は観察されなかった。アセトアルデヒドの減少はCG処理後により顕著であったが、呼気中プロピオン酸のレベルはCG摂取後終日高く維持された。
全体として、いくつかのBVMについては、そのレベルが、食後または吸収後の状態で、後で実行されたすべての測定よりも空腹時に高かったことに注意することが重要である。プロピオン酸、プロパノール、ベンゼンは、朝食後に急激に（プロピオン酸で40倍以上、プロパノールで10倍程度）低下した（Figure 3, S3）。酢酸とアセトアルデヒドも、摂食によってそれほど大きくは減少しなかった（2倍程度）。他のすべてのBVMは、試験期間中の異なる時点において、安定または増加した。
呼気中SCFAについては、酪酸、カプロン酸および（iso）吉草酸がCG介入前の朝食直後（主に2時間目）に増加し、（iso）吉草酸のみが基礎値に戻ったが、酪酸とカプロン酸は増加し続けた（図3、図S3）。さらに、呼気中に排出されるSCFA（減少した酢酸とプロピオン酸を除く）の最高レベルは、CGを3週間摂取した場合、標準朝食のかなり後、すなわち少なくとも8時間後に得られた。
酪酸、カプロン酸、ブタノール、エタノール、フェノール、メタン、ペンタン、トリエチルアミン、ペンタン、2,3-ブタンジオンで観察されたように、CG介入前の0日目に食物繊維の多い朝食に反応して増加し、最高レベルは主に朝食摂取後8時間後に得られた（図3）。驚くべきことに、3週間のCG摂取により、時間8hにおけるこれらの微生物代謝物のDF強化朝食に対する反応の大きさが減少した（*p < 0.05; 時間8hで行ったマッチドペアのWilcoxon signed-rank検定）。他の標的BVM（例えば、ヒドロキシブタノンは酪酸と同じ傾向を示した）についても同様の進化が観察されたが、全ネットAUCについて実施したマッチドペアのウィルコクソン符号順位検定では、CG介入の有意な効果は明らかにならなかった（図S3）。
重要なことは、BVMは食後の朝食または昼食後の状態を考慮すると、異なる影響を受けるということである（図S4）。両日とも空腹時に対して昼食後に増加したBVMのうち、2-メチル酪酸、イソ吉草酸、アセトンの呼気中濃度が高く、一方、トリエチルアミン、カプロン酸、酪酸、ブタノール、エタノール、フェノール、ペンタンおよびメタンの濃度はCG処理後に低くなった（図S4b）。
DFを多く含む朝食摂取後の胃腸耐性は、CG処理後も変化しなかった
摂食後の水素生成量はCG処理後に高くなり、このDFは大部分が発酵していることを知り、胃腸症状に対するCG処理の潜在的影響の問題を評価することが必要であることが分かった。我々は、CG処理前後の胃腸パラメータのベースライン・スコアに有意な差がないことを示した（p>0.05）（表S3）。食物繊維を多く含む標準的な朝食を摂取した後、胃腸の耐性を調査した。一日を通しての各スコアの推移は、CG摂取による有意な影響を受けなかった（ネットAUCに関するマッチドペアのWilcoxon符号順位検定：p>0.05）（図S5）。
呼気BVMと腸内細菌叢組成の相関分析
図4aは、DF介入前のベースラインにおける属レベルの相対存在量を示している。図4aは、DF介入前のベースラインにおける腸内細菌叢の属レベルの相対量を示している。健常者の糞便細菌の50％は9属で占められており、そのほとんどが酪酸産生菌（Faecalibacterium、Ruminococcus、Eubacterium、未分類のLachnospiraceae、Coprococcus）であることが確認された。CG介入前（0日目）の腸内細菌叢組成とBVMの相関分析は、BVMが最も高くなる時間（朝食後8時間）を考慮して実施された。興味深いことに、最も豊富なFaecalibacterium（相対量で7％）は、朝食摂取の8時間後に呼気酪酸と相関があった（p＝0.0498）（図4b）。さらに、この属は他のBVMとも正の相関があり、そのほとんどが細菌代謝物9であった：ブタノール（p = 0.0351）、アセトアルデヒド（p = 0.0260）、エタノール（p = 0.0351）、イソプレン（p = 0.0019）、プロピオン酸（0.0189）、カプロン酸（0.0498）と3 - ヒドロキシブタノン（p = 0.0498）であった。このとき、他の呼気中細菌代謝物（プロピオン酸、2,3ブタンジオン、フェノール、ペンタン、メタン）は、主にPrevotella属やRuminococcaceae属、Lachnospiraceae属の豊富な属（>1%）と正の相関があった（p < 0.05）。
図4
図4キチン-グルカン介入前（0日目）の健常者15名（n=15）の呼気揮発性代謝物（ppm、8時間後に呼気）と腸内細菌叢組成との相関解析。各被験者の1%以上を占める属レベルの相対的存在量の棒グラフ(a)。各被験者の1％以上の属とBVM（時間8時間、単位：ppm、空腹時のベースライン値で補正）の相関のヒートマップ（b）。丸印は相関が有意であることを示す（p<0.05）（スピアマンの相関検定）。
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3週間の介入後のCG摂取が腸内細菌の変化に及ぼす影響については、以前に説明した18。我々は、3週間のCG補給が腸内細菌叢全体の組成に大きな変化を誘発しない（α-多様性およびβ-多様性指数に変化なし）と結論づけた。我々は以前、3週間のCG摂取により細菌の属および種に特異的な変化が生じることを示した18。実際、3週間のCG摂取によりLachnospiraceae UCG-004、Roseburia、Eubacterium、Ruminococcaceae UCG-003 および UCG-005が著しく増加し、一方、Subdoligranulum、 Bergeyella、 BlautiaおよびDoreaが減少することが分かった。しかし、3 週間にわたる CG の介入により増加した細菌（各被験者の 1%以上）のうち、細菌代謝産物の有効期限と正の相関を示したものはなかった（補足データの時間 8h における BVM と D21 における属の相関分析参照）。
考察
一般に、生体液中の代謝物は、ヒトの臨床状態および栄養状態の興味深いバイオマーカーと考えられており、したがって、代謝性疾患のモニタリングのための有用な診断補助として提案することができる。8 例えば、BVM分析は、過敏性腸症候群および炎症性腸疾患の診断およびモニタリングのための魅力的な非侵襲的バイオマーカーとして役立つ可能性がある24 しかし、ボラタイル代謝物の起源についてはまだ十分に理解されていない。しかし、揮発性代謝物の起源はまだ十分に解明されていません。揮発性代謝物の検出と定量を可能にする分析法は絶えず開発されており、病態生理や栄養状態に関する幅広いバイオマーカーの検出を可能にしています。SIFT-MSのようなダイレクトMS技術は、選択性、スピード、感度（体積比で10億分の1の低レベル）が期待できるため、ますます関心を集めており、SIFT-MSは特に呼気分析の目的に適している。26,27 BVMのプロファイルにおける栄養の貢献度は、まだ十分に評価されていない。
いくつかの研究では、食習慣の変化（高脂肪乳飲料と低脂肪乳飲料、高繊維食と低繊維食、グルテンフリーダイエット）に伴う呼気のモニタリングが行われています20、21、28、29、30 最近、我々は、不溶性食物繊維（4.5 g CG）の単回摂取が健康被験者の呼気の揮発性代謝物に与える影響について分析しました。SIFT-MS分析および腸内細菌叢組成との相関分析で得られたターゲットアプローチにより、呼気中の酪酸、トリエチルアミン、ペンタン、3-ヒドロキシブタノンおよび2,3-ブタンジオンが、摂取の6時間後に最高レベルが観測されたCG摂取の微生物シグネチャーとして識別されることが示唆された9。最近の研究では、高齢者と若年成人にプレバイオティクス食物繊維（ガラクトオリゴ糖、15g/日）を一晩絶食で4週間補給しても、揮発性化合物プロファイル（熱脱着ガスクロマトグラフと飛行時間型質量分析装置を併用）に大きな変化がないことが示されており、呼気プロファイルに比較的小さな違いがあることを示している。これは微生物相組成と糞便代謝物データと一致している19。今回の探索的研究の目的は、同じ教育レベルの健康な若い男女混合ボランティアの代表的な均質集団において、3週間のCG消費前後のBVMを評価することにより、DFと腸内細菌叢の間の複雑な相互作用を調査することであった。大学の敷地内で行われた被験者の募集により、病歴および身体検査から明らかなように、平均年齢21歳の全身状態が良好な男性7名および女性8名が研究に参加したため、この目的を達成することができた。我々は、CGの慢性的な摂取（21日間、1日4.5g）の前と後に、食物繊維を豊富に含む標準化された朝食に対する呼気BVMを追跡するために、SIFT-MS手法を適用しました。参加者のコンプライアンスは96.5%と良好であった。従って、このパラメータは研究の推論に影響を与えない。ライ麦パンとキャロブスプレッドは、DFを豊富に含み、発酵能力も実証されているため、試験食として選択した。ライ麦パンは全DFの11％を占め、主にフルクタンと水抽出可能なアラビノキシランを含んでいることから、試験管内大腸モデルにおいて高い発酵率と発酵能力を持つことがわかった32。この標準化された朝食に含まれるDFの割合が高い（15g）ため、胃腸の症状に関連する可能性がある18,33。しかし、この朝食は、8つの胃腸症状の分析に関して十分に耐えられるようであり、我々は、CGの3週間の摂取が、健常者の繊維を多く含む朝食に対する胃腸耐性に影響を与えないことを観察した。
対象外の分析では、呼気揮発性メタボロームが被験者の栄養状態に大きく影響されることが明らかになった。最も重要な被験者間の変動は、一晩絶食した後に測定を行った場合（時間0hとそれ以外の時間）に観察された。BVMは摂食後に明らかに変化し、栄養状態が呼気分析の解釈において重要であることが示唆された。3週間にわたるCGの食事摂取は、栄養状態にかかわらず、すなわち時間帯や食事摂取とは無関係に、個人間のばらつきを強調することが強調された。呼気成分に対する絶食・喫食状態の影響は複雑であることがすでに観察されている8。本研究では、酢酸、プロピオン酸、アセトアルデヒド、プロパノール、ベンゼンが朝の絶食状態で最も高くなることが確認された。その中で、呼気中プロピオン酸とアセトアルデヒドのみ、慢性的なDF補給の影響を受けた。食後のCG摂取により、呼気中プロピオン酸は増加し、アセトアルデヒドは減少した。相関分析の結果、呼気中プロピオン酸は主に0日目のFaecalibacteriumの存在と21日目のRuminococcaceaeの存在に関連していることが明らかになった。しかし、呼気中プロピオン酸およびアセトアルデヒドは、DF を多く含む食事に反応して増加しないため（空腹時）、これら 2 つの BVM を DF 摂取の主要なバイオマーカーとして提案することはできない。
試験日の最初の4時間では、わずかなBVMが有意な影響を受けた。CG介入前、朝食摂取後の呼気中では、炭素数4のSCFAが急速に増加した。時刻0の呼気サンプリング前に消毒液で口腔内を洗浄したにもかかわらず、他の研究者がすでに仮定しているように、口腔内または喉で起こる細菌発酵が呼気BVMの初期増加（時刻30分）に関与する可能性を排除できない21, 35。重要なことは、時刻4時間から呼気中のレベルが増加した唯一のSCFAが酪酸とカプロン酸であったことである。これらは、朝食中に高濃度で存在するDFの腸内発酵に関連している可能性がある。酪酸は、バクテリアによって酪酸キナーゼまたはブチリルCoA：酢酸CoA転移酵素を介して生産されるが、カプロン酸は乳酸酸化から生産されることが最近明らかになった36,37。バクテリアでは、乳酸酸化によってアセチルCoAが供給され、伸長プロセスに入ってブチリルコアとヘキサノイルコア（またカプロイルコアともいう）を形成する。
SCFA 以外にも、ブタノール、エタノール、フェノール、メタン、ペンタン、トリエチルアミン、2,3-ブタンジオン、アセトン、アセトニトリル、ベンズアルデヒド、3-ヒドロキシブタノン、H2S、メタノールなどが CG介入前の昼食後（0日目）にも上昇し、8時間後にピークとなる場合が多い。そこで、呼気中BVMが最も多く存在する時間、すなわち朝食摂取後8時間におけるBVM（ppm、空腹時の基準値で補正）と属（相対存在量1％以上）の相関解析を行った。酪酸とカプロン酸は、ベースライン時に健常者から最も多く検出されたFaecalibacterium属と正の相関があった。この属は、ブタノール、エタノール、3-ヒドロキシブタノンなど、細菌の代謝物として認識されている他の呼気中BVMの高レベル（時間8hで得られる）とも相関していた。38,39 さらに、2,3ブタンジオン、フェノール、ペンタン、メタンは呼気で排出される他の細菌代謝物であり、主にRuminococcaceaeおよびLachnospiraceaeファミリーの他の興味深い乳酸生成細菌と正の相関を持っていた。3-ヒドロキシブタノンと2,3-ブタンジオンの細菌による生産は、ピルビン酸を前駆体とするクエン酸-オキサロ酢酸-ピルビン酸-酢酸-アセトイン/ジアセチル経路によるクエン酸代謝と関連している39 。呼気メタンの起源が腸内発酵と関連していることは間違いないが、内因性膜脂質過酸化の寄与に対して、腸内細菌も呼気ペンタンの主要な供給源と考えられている8、41、42 ペンタンなどの代謝物の生産における細菌と宿主代謝の相対的寄与を裏付けるデータがあれば興味深いはずである。実際、呼気中のペンタンは食事からのリノール酸摂取量に依存し、抗生物質処理によって鈍化することがすでに示されている8,41。これらの結果から、呼気中に排出される酪酸やカプロン酸などのSCFAやエタノール、ブタノール、フェノール、3-ヒドロキシブタノン、2,3ブタンジオン、ペンタン、メタンなどの代謝物は、腸の下部の細菌代謝から発生し、主に酪酸生産菌として知られている細菌に依存していることが示唆された。同定された細菌の代謝経路が、このような代謝物を生成することができるかどうかを知ることは、興味深いことである。BVMの代謝産物の起源とその動態を研究するためには、さらなる研究が必要であることは間違いない。
我々は、3週間のCG介入により発生した腸内細菌叢組成の変化（主にRoseburia属とEubacterium属の増加）は、マイクロバイオームの個人内変動によるものではなく、明らかにCG処理に起因しており、これらの細菌はCG摂取の特権的ターゲットとなることを証明した18。実際、Roseburiaは、食事由来の多糖類を利用し、酪酸を生産する重要な能力を持つことが知られている36。一貫して、我々はCG補給後に糞便中の酪酸濃度が高いことを明らかにした18。しかしこの効果は、DFを多く含む食事に反応して呼気でこのSCFAを多く排出することは伴わなかった。C5およびC6 SCFAも食事介入の影響を受けたが、その程度ははるかに小さかった（delta < 0.01ppm）。呼気中に排出されるSCFA以外に、大腸の細菌代謝を反映する7つのBVMがCGによる栄養介入によって有意に影響を受けた。実際、ブタノール、エタノール、フェノール、メタン、ペンタン、トリエチルアミン、2,3-ブタンジオンは、DF強化朝食の少なくとも6時間後に最高レベルで排出されたが、反応の振幅はCG補給後にかなり小さくなっていた。特に、昼食後の状態に注目した解析では、呼気中の酪酸、カプロン酸、ブタノール、エタノール、フェノール、トリエチルアミン、ペンタン、メタンがCG投与後に減少することが明らかにされた。一方、呼気H2は、DF強化朝食に反応して、CG介入後に増加した。我々は、治療後の空腹状態でのH2放出の基礎レベルが、両試験日で有意に異なることを観察した。夜の食事（およびDFの含有量）が翌朝のH2生成に影響を与える可能性があることを知り43、我々はDFの摂取を最小限に抑えるために夜の食事（野菜を含まない肉と米の食事）を標準化した。したがって、0日目と21日目の空腹時のレベルが異なるのは、慢性的なCG摂取と夜間の大腸での栄養素の発酵の可能性に関連した腸内細菌叢の組成（および機能）の変更に起因している可能性がある。実際、微生物のH2循環は、ヒトの消化管における代謝の恒常性と微生物組成の中心的な役割を担っています。分子状H2は炭水化物発酵の最終生成物として生成され、その後、交差摂食する微生物によって成長やより大きな分子の生産に利用される可能性がある（H2は主に硫酸還元、酢酸生成、メタン生成によって再酸化される）42,44 Wolf et al.は、消化管内の70％の微生物がH2生成に関与していることを明らかにした。は、消化管内微生物の70％がH2を代謝する遺伝的能力をコード化しており、他の細菌産物と比較した相対的な割合は、環境条件（例えば、pH）に依存することを実証している44。また、大腸菌の90％以上がEubacterium/Roseburia spp.に代表される酪酸産生菌であることも考慮しなければならない。クラスタXIVaの酪酸菌では、基質代謝とH2ガス生成の間に定量的な関連性または化学量論的にバランスのとれた経路がすでに提案されている45,46。CGの慢性的な摂取により、2つの重要な酪酸産生菌（EubacteriumおよびRoseburia）の割合が高くなったことを考慮すると、これらのリンクが呼気H2の高い生成を説明するメカニズムに関与していると思われる。
本研究にはいくつかの限界がある。第一に、この研究は縦断的なプロトコルであり、同じ被験者について、治療21日後と0時間後のデータを比較したものである。この種の戦略は、プレバイオティクスDFの微生物の特徴を明らかにするために既に使用されている47。我々は、BVMにおけるいくつかの変化が、治療とは無関係に時間とともに生じた可能性を排除することはできない。第二に、本研究は単一施設で調査された小規模なコホートに焦点を当てたものである。第三に、食物日誌の自己報告によるバイアスが含まれている可能性がある。最後に、水素発生源のみ（SIBOの被験者は除く）が検討された。
結論として、本研究は、DFを多く含む食事に反応して、いくつかの細菌代謝産物が呼気中に排出される可能性があることを示した。代謝恒常性の変化および/または腸内細菌叢の変化の存在を厳密に除外することはできないが、病歴、薬歴、対象者および除外基準、ならびにベースラインで得られたいくつかの臨床パラメータにより、肥満、糖尿病、高血圧など腸内細菌の異常との関連が知られている代謝性疾患を除外し、この若い集団を「健康」と見なすことができることに注目することが重要である。この探索的研究では、DFを多く含む朝食後の腸内細菌代謝のバイオマーカーとして、呼気中の酪酸、カプロン酸、ブタノール、エタノール、フェノール、メタン、ペンタン、トリエチルアミン、3-ヒドロキシブタノン、2，3ブタンジオンが同定された。ただし、10個のBVMのうち4個については、検出力が80％未満であった。我々のデータは、不溶性食物繊維であるCGの慢性的な摂取は、不快な胃腸症状を引き起こすことなく、食物繊維を多く含む食事に反応して、ほとんどの呼気BVMの呼気を減少または遅延させて、H2呼気を促進することを示唆した。トリエチルアミン、アセトアルデヒド、ペンタンなどのBVMの呼気の低下は、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）または非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の患者の呼気でそれらのレベルが著しく上昇していることから、興味深い調査対象となり得る48,49。CGを1回摂取した後の呼気の揮発性メタボロームの研究に専念した我々の以前の研究9と合わせると、呼気中のBVMの分析は、DFと腸内細菌叢との複雑な相互作用を非侵襲的に評価する動的アプローチとして使用できることが確認された。本研究は、栄養素-腸内細菌叢-宿主の相互作用を解明するための呼気揮発性メタボロームアプローチの妥当性を支持するものであった。DFの選択的発酵の概念は、主にin vitroで研究されているが、in vivoでの評価は不十分であることから、異なる種類のDFを用いたさらなる実験により、DFと腸内細菌叢との相互作用のメタボロームサインを明らかにすることができるだろう。また、この種の分析に必要な非侵襲的なサンプリングも、我々のデータの好ましい成果であると思われる。
貢献者
コンセプト立案。A.M.N.、N.M.D.、データキュレーション。A.M.N.、J.R.、形式的な分析。A.M.N.、J.R.、Z.Z.；資金獲得。N.M.D., V.M., M.L., S.C.B., J.W.、調査。A.M.N.、J.R.、方法論。方法論：A.N.M., J.R., Z.Z., L.B.B.; プロジェクト管理。N.M.D.、A.N.M.、リソース P.D.C.、N.M.D.、V.M.、ソフトウェア。ソフトウェア：J.R.、監修：N.M.D.、V.M: N.M.D.、基礎データの検証を伴う妥当性確認。N.M.D.、A.M.N.、J.R.、可視化。A.N.M.、J.R.、Writing-original draft: 執筆-原案：A.N.M.；執筆-校閲-編集：J.R., Z.Z.．J.R., Z.Z., J-A.N., P.D.C., L.B.B., N.M.D. 全著者が最終版の原稿を読み、承認した。
利害関係者の宣言
P.D.C. は A-Mansia Biotech SA の共同設立者であり、Akkermansia muciniphila、腸内細菌および代謝性疾患に関する特許の所有者である。他の著者は、利益相反のないことを宣言している。
データ共有に関する声明
本研究のプロトコルと、本研究中に生成および/または解析されたデータセット（非識別化された参加者データを含む）は、妥当な要求があれば対応する著者から入手可能である。
謝辞
本研究の準備およびボランティアとの調査において、UCLouvain platform CICN (Center of Investigation in Clinical Nutrition) のBarbara Pachikianの有益な支援と批判に非常に感謝している。また，Remi SelleslaghとVéronique Allaeysの優れた技術的支援に感謝する．また、UCLouvainのデータ解析コンサルティングサービス（platform "Support en méthodologie et calcul statistique"）、特にCéline Bugliの助言と統計解析の妥当性に感謝する。引用されたすべての人は、書面による同意を得た。また、本研究に参加されたボランティアの方々にも感謝します。NMDは、科学研究費補助金（FRS-FNRS）［PINT-MULTI R.8013.19（NEURON-ERANET, call 2019）およびPDR T.0068.19］、およびFédération Wallonie-Bruxelles (Action de Recherche Concertée ARC18- 23/092) から助成金を受給している。PDCはFRS-FNRSの研究ディレクターであり、科学研究費補助金（FRFS-WELBIO: WELBIO-CR-2022 A-02, and EOS program no.40007505）の支援を受けています。
付録補足資料
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記事情報
出版年譜
掲載されました。2022年5月10日
受理されました。2022年4月24日
改訂版受理 2022年4月22日
受理：2022年4月22日 2021年9月24日
身分証明書
DOI: https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2022.104051

著作権について
© 2022 The Author(s). 発行：Elsevier B.V.
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図
図1
図1試験日中の研究デザインの概要。
図2
図2健康な被験者（n=15）のキチン-グルカン摂取前（0日目）と摂取後（21日目）の標準的な朝食摂取に対する呼気中の水素の排出量。データは絶対値（a）およびベースラインからの変化（b）。データは中央値±四分位範囲（*p < 0.05; Matched-Pairs Wilcoxon signed-rank test）である。
図3
図3キチングルカン摂取前（0日目）と摂取後（21日目）の標準的な朝食摂取に対する健常者（n=15）の呼気中のBVM濃度（ベースラインからの変化）（および3週間のキチングルカン摂取により有意な影響を受けた）。データは中央値±四分位範囲（*p < 0.05; 曲線下の正味面積に関するマッチドペア・ウィルコクソン符号順位検定）である。
図4
図4キチン-グルカン介入前（0日目）の健常者15名（n=15）の呼気揮発性代謝物（ppm、8時間後に呼気）と腸内細菌叢組成との相関解析。各被験者の1%以上を占める属レベルの相対的存在量の棒グラフ(a)。各被験者の1％以上の属とBVM（時間8時間、単位：ppm、空腹時のベースライン値で補正）の相関のヒートマップ（b）。丸印は、p<0.05の有意な相関を示す（スピアマンの相関検定）。
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