人工甘味料が多剤耐性菌の増殖を抑制し、抗生物質活性を増強すること

記事2022年11月22日
人工甘味料が多剤耐性菌の増殖を抑制し、抗生物質活性を増強すること
ルベン・デ・ディオス
[...]
ローナンRマッカーシー
著者情報
EMBO Mol Med (2022)e16397
https://doi.org/10.15252/emmm.202216397
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図と情報
概要
抗菌剤耐性は、現代の最も差し迫った問題の1つである。ヒトの食事には、腸内細菌群集や病原性に関連した行動を変化させる化合物が豊富に含まれており、食品添加物が新規抗ウイルス性化合物の発見のためのニッチとなる可能性が示唆される。我々は、サッカリン、シクラメート、アセスルファム-K（ace-K）という3つの人工甘味料が、優先的な病原体に対して大きな増殖抑制効果を持つことを明らかにした。さらに、多剤耐性菌Acinetobacter baumanniiに対するace-Kの影響を調べ、バイオフィルム形成、運動性、外来抗生物質耐性遺伝子獲得能力などの病原性行動を阻害することができることを実証した。さらに、バルジを介した細胞溶解が増殖抑制のメカニズムであること、カチオンを補充することで細胞が救済されることを解析で明らかにした。抗生物質感受性試験により、ace-Kは亜致死濃度において、カルバペネム系抗生物質を含む最終手段の抗生物質に対してA. baumanniiを再感受性化できることが示された。新しいex vivoブタ皮膚創傷モデルを用いて、ace-Kの抗菌活性が創傷微小環境下で維持されることを示した。本研究は、人工甘味料が病原体の挙動に及ぼす影響を明らかにし、その治療の可能性を示すものである。

あらすじ
画像
人工甘味料は、多剤耐性菌の増殖を抑制し、病原性に関連する行動を阻害し、抗生物質活性を増強することができる。創傷モデルにおいて、甘味料であるアセスルファムKは局所創傷治療薬としての可能性を示している。

人工甘味料は、細菌性病原体の増殖に大きな影響を与える可能性があります。
Ace-Kは、バイオフィルム形成、運動性、自然形質転換など、さまざまな病原性形質を阻害することができる。
また、細菌の細胞膜を弱め、形態の喪失やバルジを介した細胞溶解を引き起こします。
また、カルバペネム系抗生物質を含む抗生物質の活性を増強することができる。
Ace-Kは局所的な創傷治療薬として臨床的な可能性を持っている。
はじめに
ペニシリンの発見は、新しいクラスの抗生物質が日常的に発見されるようになり、抗生物質発見の黄金時代の幕開けとなった。しかし、1990年代に入ってから、抗生物質の発見速度はほぼ停止状態にまで鈍化している（Hutchings et al, 2019）。この発見の欠如は、第一選択の抗生物質治療に対して耐性を示す細菌性病原体の急速な出現と拡散と相まって、世界中で抗生物質耐性の危機を招いている（Lewis, 2020）。抗菌薬耐性（AMR）に起因する死亡は2019年に495万人に達し（Murray et al, 2022）、2050年までに世界の累積コストが100兆ドルに達すると予測されています（HM Goverment, 2019）。世界保健機関（WHO）の2018年の報告書では、Acinetobacter baumanniiとPseudomonas aeruginosaが、新規治療介入を緊急に必要としている細菌のグローバル優先リストの最上位に位置づけられています。これらの生物は、一般的に使用される多くの抗生物質に対して耐性であることが多く、コリスチン、カルバペネム、チゲサイクリンなどのいくつかの最終ラインの抗生物質に対してさえ耐性を獲得しています（Cai et al, 2017; Andrade et al, 2020; Hua et al, 2021）。抗生物質耐性が上昇し続け、多剤耐性（MDR）、広範囲薬剤耐性、汎耐性病原体の出現により、抗生物質特性を持つ新しい化合物を特定する必要性がこれまで以上に急がれています。このため、科学者たちは潜在的な治療薬を特定するための新しい環境とアプローチを模索しています。しかし、新薬開発には多大な資金と時間がかかり、平均的な新薬の上市には最大で20年、13億3000万ドルが必要とされています（Wouters et al, 2020; Brown et al, 2022）。高いコストと長い時間、そして開発パイプラインにおける新規原薬の高い失敗率から、代替手段が必要であることは明らかである。近年、最も人気のあるアプローチのひとつが、研究が進んでいないニッチにおける新規化学物質の採掘である。多くの研究が、新しい抗菌化合物を同定するために、海洋植物や陸上植物などの天然のリザーバーを調査している。クマリン、シンナムアルデヒド、バイカリンなどのいくつかの植物化学物質は、潜在的な抗菌または抗ウイルス療法として同定されています（Gutiérrez-Barranquero et al, 2015; Slachmuylders et al, 2018; Ahmed et al, 2019）。興味深いことに、これらのような植物化学物質が食事中に存在する場合、腸内の細菌のシグナル伝達やコミュニケーションなどのプロセスに影響を与える可能性が指摘されています。さらに、これらの化合物は、病原性生物の治療および制御に使用される可能性があることが示唆されている（McCarthy & O'Gara, 2015; Proctor et al, 2020）。抗菌および抗ウイルス活性を示すこのような広範囲の食事性植物化学物質があるため、潜在的な治療薬としての非食物性化合物の評価は、明白な次のステップである。研究対象となる食品添加物やその他の化合物には多くの種類があるが、人工甘味料は最も一般的なものの1つである。

人工甘味料（AS）は、非栄養性甘味料またはノンカロリー甘味料としても知られ、ショ糖と比較して著しく高い甘味力を示す化合物である。そのカロリー寄与は無視できるかゼロであり、それらは甘味機能のみのために最も一般的に使用されている（Carocho et al, 2017）。最も人気のある集中甘味料には、アスパルテーム、サッカリン、スクラロース、アセスルファム-K（ace-K）などがある。ASは19世紀にサッカリンの合成で初めて発見されましたが（Tandel, 2011）、依然として論争の的となっています。今日、ASは同時に、これまでの食品産業における最も重要な成果の一つとされ、人間の健康への影響が不明な理解不十分な物質として提示されている（Carocho et al, 2017）。にもかかわらず、世界的な肥満の憂慮すべき増加により、ASが人間の健康や環境に与える影響に関する研究が活発化しています。いくつかの研究は、ASが環境における新たな汚染源であることを指摘している（Scheurer et al, 2009; Naik et al, 2021）。なぜなら、ASのかなりの割合が、変化しないかわずかに分解されるだけで消化管（GI）を通過し（Roberts et al, 2000）、したがって排水に排出されることが示されているからである。最近の研究では、廃水中に存在するASのレベルが環境細菌の挙動に影響を与え、横方向の遺伝子転移（すなわち、抱合および自然形質転換）を促進し、関連する抗生物質耐性遺伝子の交換を促進する可能性があることが示されている（Yu et al, 2021, 2022）。この発見は、いくつかのASが細菌に対する生物学的活性を有することを明確に示している。このため、研究者たちは、腸内細菌叢のような体内の細菌群に対するASの影響を調査するようになった。

興味深いことに、ASが腸内細菌集団に与える影響については、さまざまな証拠が存在する。Markusらによる最近の研究（2021年）では、スクラロースがグラム陰性菌のクォーラムセンシングを著しく阻害し、その結果、GI微生物群集のバランスを乱すことが示唆されています。同様に、別の研究では、スクラロースを含むASの摂取が、マウスのマイクロバイオームの機能的および組成的変化を誘発し、グルコース不耐性をもたらすことが実証されている（Suez et al, 2014）。Suezら（2022）は、異なるASが便および口腔内マイクロバイオームを変化させることを報告した。著者らはまた、これらのASによるマイクロバイオームの変化が、個人の血糖反応に影響を与えるという証拠を提示している。これらの研究は、ASがマイクロバイオームとさらに下流に及ぼす重大な影響を示しているが、他の研究では、ASが個々の細菌種に及ぼす、より基本的であるが同様に重要な影響も示している。Ace-Kは、多くの研究において、大腸菌などの生物の成長を促進することが示されている（Mahmud et al, 2019; Shahriar et al, 2020）。逆に、実験用大腸菌の増殖に負の影響を及ぼすことも報告されている（Wang et al, 2018）。これらの矛盾する知見にもかかわらず、研究の大部分は、ASがマイクロバイオームの組成及び／又は機能を変化させる可能性があることに同意している。

ASの活性に関する証拠の欠如、および病原性生物に対するこれらの化合物の影響を調査する研究の比較的な欠如は、我々の調査を促した。我々は、最も一般的なMDR細菌病原体（Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, A. baumannii, P. aeruginosa and Enterobacter cloacae）に対して強固な抗菌活性を示すASを同定した。これらの病原体は院内感染の主な原因であり、抗菌剤で治療した後でも持続することがあります（Mulani et al, 2019）。MDR A. baumannii株AB5075をモデルとして、成長を阻害するだけでなく、特にace-Kが、バイオフィルム形成（持続感染に関連）、運動性（宿主内での細菌の拡散に関連）、自然形質転換（AMR遺伝子の拡散に関連）などのさまざまな病原性行動を阻害できることを実証しています。我々は、dRNA-seqを用いて、ace-Kの作用機序を明らかにし、バルジを介した細胞溶解を引き起こすことを示し、この機序が種を超えて保存されていることを確認した。また、驚くべきことに、ace-Kがカルバペネム系抗生物質を含む臨床的に関連するさまざまな抗生物質の活性を増強することも明らかにした。最後に、ex vivo裂傷および熱傷モデルを用いて、ace-Kが局所用抗菌薬として再利用できる可能性を示す。

研究成果
人工甘味料はMDR病原体の増殖に悪影響を与える可能性がある
異なるASがMDR病原体の増殖に影響を与えるかどうかを調べるため、臨床分離株A. baumannii AB5075および実験株P. aeruginosa PA14を、最も広く用いられているAS（キシリトール、ソルビトール、スクラロース、D-マンニトール、エリスリトール、サイクラム酸ナトリウム、マルチトール、ラクチット、サッカリンナトリウム、アスパルテーム、ce-K）を添加したLBブロスで培養した。各甘味料は2.66%の濃度で使用した。これは、すべての甘味料が溶解できる共通の最大濃度を表し、各ASの効果を直接比較できることを保証するためである。アスパルテームは他の甘味料に比べて溶解度が著しく低いため、1％の濃度で使用した。これらの甘味料の大半は、A. baumanniiの増殖にわずかながら有意な悪影響を及ぼした（図1）。例外もいくつかあり、ソルビトールはAB5075の増殖に全く影響を与えず、アスパルテームは著しく増殖を増加させた。P. aeruginosa PA14の増殖は、キシリトール、ソルビトール、スクラロース、シクラミン酸ナトリウム、マルチトール、サッカリンナトリウムおよびace-K（濃度2.66%）に有意な影響を受けた。マンニトール、ラクチトール、アスパルテームの暴露では、成長への有意な影響は見られなかった（Fig.2）。AB5075およびPA14に対する各甘味料の成長阻害の度合いのエンドポイント解析（19時間後）をそれぞれAppendix Figs S1およびS2に報告する。

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図1. Acinetobacter baumanniiの増殖速度に対する各種ASの影響

キシリトール、スクラロース、D-マンニトール、エリスリトール、シクラミン酸ナトリウム、マルチトール、ラクチトール、サッカリンナトリウム、2.66%濃度のace-KはいずれもMDR A. baumannii AB5075の増殖を19時間かけて程度の差こそあれ、有意に抑制した。サッカリンナトリウム、ace-K、シクラミン酸ナトリウムは最も強い負の効果を示したが、1%のアスパルテームは増殖を促進した。ソルビトールは、AB5075の成長を有意に抑制または促進しなかった。データは3生物学的反復の平均値±標準偏差（S.D）である。統計解析は二元配置反復測定ANOVAによって行った（***P ≤ 0.0001）。
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図2. Pseudomonas aeruginosa PA14の増殖速度に対する各種ASの影響

キシリトール、ソルビトール、スクラロース、エリスリトール、シクラミン酸ナトリウム、マルチトール、サッカリンナトリウム、2.66%濃度のエースKはいずれも19時間の増殖で程度の差こそあれP. aeruginosa PA14の増殖を有意に阻害した。マンニトール、ラクチトール、アスパルテームは増殖に影響を与えなかった。データは3生物学的複製の平均値±S.D.である。統計解析は二元配置反復測定ANOVAによって行った(***P ≤ 0.001, ****P ≤ 0.0001).
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成長に悪影響を及ぼすASのうち、最も強い影響が見られたのは、シクラミン酸ナトリウム、サッカリンナトリウムおよびace-Kであった。しかし、シクラミン酸ナトリウムとサッカリンナトリウムでは、阻害効果の強さが病原菌によって異なるのに対し、ace-Kでは両病原体間で効果が一貫していたため、この甘味料に着目してさらに特徴を調べた。

エース-Kは用量依存的に増殖を抑制し、炭素源としては使用できない
我々は引き続きace-Kに注目し、細菌の増殖に与える影響が用量依存的であるかどうかを調査した。最小発育阻止濃度（MIC）測定は、ace-K濃度が0.09%から7.08%の範囲で、両方の病原体に対して行われた。A. baumanniiでは0.89%のace-Kで顕著な増殖抑制が認められ、その効果は4.43%以上でプラトーとなった(Fig 3A)。液体培養でのAB5075に対するace-kの半値最大阻害濃度（IC50）は2.20%と算出された。緑膿菌の増殖は0.44%で影響を受け、5.31%以上で最大阻害に達した(Fig. 3B)。PA14に対するace-kのIC50は、2.85%と算出された。我々はまた、これらの病原菌のいずれかがace-Kを炭素源として利用することができるかどうかを探った。しかし、両菌株をM9最小培地で2.66%のace-K存在下で培養したところ、24時間後に増殖せず、炭素源として利用できないことがわかった（Appendix Fig S3）。これらの結果を総合すると、ace-KはA. baumannii AB5075とP. aeruginosa PA14に対して大きな抗菌効果を持ち、これらの菌が増殖を促進するためには利用できないことが示された。

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図3. AB5075（A、C）およびPA14（B、D）に対するace-Kの最小発育阻止濃度（A、B）および最小バイオフィルム発育阻止濃度（C、D）。

A-D.
AB5075は0.89%のace-Kで、PA14は0.44%のace-K以上で浮遊菌の成長を有意に阻害した。成長阻害は、両生物に対して5.31%の濃度まで用量依存的であることが示され、それ以上では濃度の増加とともにそれ以上の阻害は起こらなくなった。AB5075に対しては2.66%、PA14に対しては1.77%の濃度で、バイオフィルム形成のほぼ完全な阻害が達成された。サンプルは生物学的三重奏で、技術的四重奏でテストされた。データは、3つの生物学的複製の平均値±S.D.を表す。統計分析は、二元配置反復測定ANOVAによって行った（*P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001, ****P ≤ 0.0001）.
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Ace-KはA. baumanniiとP. aeruginosaのバイオフィルム形成を阻害する。
バイオフィルム形成は、病院関連感染の最大80%に関連しており、抗生物質治療の日常的な失敗の主要因である（Jamal et al, 2018）。エース-Kは、宿主にバイオフィルムを形成する能力で悪名高い病原体に対して有意な阻害効果を示したため（Mulcahy et al, 2013; Harding et al, 2018; Maslova et al, 2021）、この不治の行動を阻害するエース-Kの能力を評価した。ace-KがA. baumannii AB5075およびP. aeruginosa PA14のバイオフィルム形成を変化させるかどうかを決定するために、最小バイオフィルム阻害濃度（MBIC）アッセイを実施した（図3CおよびD）。この実験により、A. baumannii AB5075では、0.44%の生育亜抑制濃度であっても、ace-Kがバイオフィルム形成に大きな悪影響を与えることが明らかになった。さらに、A. baumanniiでは2.66%（図3C）、緑膿菌では1.77%（図3D）以上の濃度で、バイオフィルム形成が完全に阻害される結果となった。これらの結果は、ace-Kが抗ウイルス作用を持つことを示す証拠である。確立したバイオフィルムは臨床的に重要な課題であるため、AB5075とPA14の両方で確立したバイオフィルムを根絶するためのace-Kの能力を評価した。8.85%のace-Kで処理すると、AB5075とPA14のバイオフィルム総量がそれぞれ48.8%と69.7%減少した（Appendix Fig S4）。

Ace-KはA. baumanniiのグローバルな遺伝子発現を変化させる
A. baumanniiで観察された増殖およびバイオフィルム形成に対するace-Kの影響を考慮し、ace-K曝露がグローバルな遺伝子発現パターンに及ぼす影響を明らかにするために、dRNA-seq解析を行った。研究の条件として、増殖速度の低下や多面的効果によるグローバル転写への追加的影響を最小限に抑えるため、模擬処理と比較して増殖に中程度の効果を示すace-K濃度（1.33%）を選択した。処理した培養物とコントロールの培養物を指数関数的な中盤まで成長させ、それらのトータルRNAを抽出し、cDNAを合成し、配列決定し、比較した。その結果、464個の遺伝子の発現がace-Kの存在下で有意に変化した（212個の遺伝子は2倍以上発現が増加し、252個の遺伝子は減少した；Fig 4A; Dataset EV1）。有意に制御された遺伝子の機能的関連性を評価するために、現在のAB5075-UWアノテーション（Gallagher et al, 2015）とFUNAGE-Pro（de Jong et al, 2022）で行った遺伝子セット濃縮分析（GSEA）に基づいて分析を行った。

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図4. 遺伝子発現と行動に対するace-Kの影響

A.
ace-K存在下でのグローバル転写をモック処理と比較して得られたdRNA-seq結果を表すボルケーノプロット。dRNA-seqの結果によると、1.33% ace-K存在下では、水コントロールと比較して212の遺伝子が2倍以上アップレギュレート（赤）、252がダウンレギュレート（青）された。代表的な遺伝子にはラベルを付け、痙攣運動と自然形質転換に関連するpilとcom遺伝子には緑色の陰を付けた（転写に有意な変化がない遺伝子は黒で表現）。
B.
PpilA::gfpmut3転写融合物からの正規化蛍光は、pilA (ABUW_0304)のace-K媒介ダウンレギュレーションを示す。データは、2つの技術的複製を含む3つの生物学的複製の平均値±S.D.を表す。解析は独立t検定による（*P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01）。
C, D.
痙攣運動性（C）および自然形質転換（D）アッセイは、ace-Kによるpil遺伝子のダウンレギュレーションによる表現型効果を示す。0.33、0.66、1.33%の異なるace-K濃度がモック処理と比較された。サンプルは生物学的五重奏で痙攣運動性と自然形質転換について試験した。データは5つの生物学的複製の平均値±S.D.を表す。解析は処理サンプルと対応する水コントロールの間の独立t検定により行った（**P ≤ 0.01, ****P ≤ 0.0001）.
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機能的GSEAクラスタリングによると、dRNA-seqデータは、A. baumanniiの生理学において特定の機能を有する様々な遺伝子群を強調した。その中には、ace-Kの存在下で制御不能となるように見える、膜関連タンパク質をコードする遺伝子のかなりの割合が含まれていた（データセットEV3）。他の機能グループの中では、pfeAシデロフォア受容体コーディング遺伝子（ABUW_2916）、feoA鉄輸送体（ABUW_3633）、fecIR鉄獲得σ-抗σシステム（ABUW_2986-2987）などの鉄摂取に関する遺伝子が全般的に誘導されていることが確認された。また、バウマンフェリン生合成経路をコードするbfn遺伝子群（ABUW_2178-2189）、アシネトバクチン生合成経路に属するbauFとbasE（それぞれABUW_1168とABUW_1180）といったシデロフォア生合成関連遺伝子も有意に発現が増加した（ABUW_1168-1188）。このことは、ace-Kの存在下で転写調節因子の発現が上昇したことと一致する。このことから、ace-Kが細胞に鉄欠乏を引き起こしている可能性が考えられたため、外部から鉄を添加してace-K効果を緩和することを試みた。しかし、Fe2+は細胞を救済せず、Fe3+はごくわずかな回復をもたらすだけで、鉄濃度を上げても改善しなかった（Appendix Fig S5）。このことから、鉄はace-Kの抗菌機構に関連した役割を担っていないことが示唆された。

Csu piliをコードする遺伝子（ABUW_1487-1492）とBap（biofilm-associated protein）をコードする遺伝子（ABUW_0916）は、ace-K存在下でダウンレギュレーションされていた。Csu piliは、A. buamanniiのバイオフィルム形成に不可欠な役割を果たすことがよく知られている（Moon et al, 2017; Pakharukova et al, 2018; Romero et al, 2022）。このcsu遺伝子のダウンレギュレーションがバイオフィルム表現型の低下の原因であることを検証するために、Manoil A. baumanniiトランスポゾン変異体ライブラリー（Gallagher et al, 2015）から得られたダウンレギュレーションcsu遺伝子の多くの変異体のバイオフィルム形成能力を試験した。これらの変異体は、野生型AB5075に関してバイオフィルム形成の欠陥を示し（Appendix Fig S6）、したがって、それらのダウンレギュレーションは、ace-K存在下でのバイオフィルム形成の減少に関連するものであった。さらに、このダウンレギュレーションは、paaフェニル酢酸分解経路全体のアップレギュレーションと同時に起こっている（ABUW_2525-2536）。最近の報告では、抗生物質処理によってpaaとcsuの発現量が負の相関を示すことから、フェニル酢酸量とバイオフィルム形成が関連することが示されている（Moon et al, 2017; Hooppaw et al, 2022）。この結果は、A. baumanniiのMBICデータ（図2C）と共に、ace-K存在下でのバイオフィルム阻害が、フェニル酢酸シグナル依存的にcsu遺伝子をダウンレギュレートすることによって引き起こされることを示唆する。

ace-K存在下での最も顕著な観察は、タイプ4ピリ（T4P）の生合成、機構および制御をコードするほとんどの遺伝子のダウンレギュレーションである。これらの細菌付属物は、A. baumanniiの痙攣運動のための重要な構造である（Harding et al, 2013; Chlebek et al, 2019; Ellison et al, 2021）。さらに、DNAの取り込み、一本鎖DNAの結合、および組換えに関与する遺伝子とともに、T4Pは自然の力量および形質転換において重要な役割を果たす（Vesel & Blokesch, 2021）。この一般的なダウンレギュレーションにはpilA, fimT, pilVWXY, pilGHIJL, pilZ, pilTU, pilBCD, pilRが含まれる（それぞれABUW_0304, ABUW_0313-0317, ABUW_0678-0682, ABUW_2255, ABUW_3031-3032, ABUW_3549-3551 とABUW_3641）．また、comと注釈された多くの遺伝子（comMNOLQとcomEF、それぞれABUW_0290-0294とABUW_0318-0319のlocusタグを持つ）がダウンレギュレートされているようである。しかし、現在のAB5075アノテーション（AB5075-UW, Gallagher et al, 2015）で提供される遺伝子説明によれば、それらはpilクラスターの一部として分類されるべきで、これはVesel & Blokesch（2021）が提示したT4Pゲノム比較によってさらに支持されている。DNAの取り込みと安定化に直接関与する遺伝子に関しては、dprA（ABUW_3723）のみがダウンレギュレートされているようである。

Ace-KはA. baumanniiのtwitching運動性と自然形質転換を消失させる。
運動性、特にA. baumanniiの痙攣は、病原性の中心的な側面であり、感染宿主内の血流または他のニッチへの細菌の拡散を促進する（Guoqi et al, 2018; Maslova et al, 2021）。上述のように、我々のdRNA-seqデータによると、T4Pの組み立てと突出/後退ダイナミクスの制御に関与するほぼすべての遺伝子が、ace-Kの存在下で著しくダウンレギュレートされた。この制御を検証するために、ace-K存在下で最大のダウンレギュレーションを示す主要ピリンpilA（Ronish et al, 2019）をコードする遺伝子ABUW_0304を選択し、そのプロモーターに転写型gfp融合を構築しました。このPpilA::gfpmut3融合体が発する蛍光をpil調節の読み出しとして、AB5075を異なるace-K濃度で2時間処理するアッセイを設定した。 このアッセイで用いたace-K濃度は0.33%から我々のdRNA-seq実験に用いたもの（1.33%）までの範囲で、モック処理と比較された。その結果、PpilA::gfpmut3融合体を持つAB5075は、ace-K濃度の増加とともに蛍光レベルが減少し、dRNA-seqの結果を検証することができた（図4B）。このことを表現型レベルでさらに検証するため、PpilA::gfpmut3転写融合物で測定したのと同じ範囲のace-K濃度を用いて、痙攣アッセイを行った（図4C）。dRNA-seqおよび蛍光測定の結果と一致するように、AB5075の痙攣運動はace-Kの濃度を上げるにつれて用量依存的に減少することが観察された。さらに、この効果は株特異的ではなく、一般的に使用されている他のA. baumannii株（AB0057およびBAA 747）も同じ範囲のace-K濃度で用量依存的な痙攣運動の減少を示した（Appendix Fig S7A and B）。

排水中のace-Kが環境細菌に及ぼす影響を調べたYuらによる2つの最近の研究から得られた重要な知見は、それらのace-K濃度（3×10-7から0.03％の範囲）が、抱合および自然形質転換頻度を高めることによって横方向の遺伝子移動を促進し得ることだった（Yuら、2021，2022年）。したがって、ace-Kは抗生物質耐性遺伝子の獲得を刺激する可能性がある(Yu et al, 2022)。しかし、より高いace-K濃度で処理した後に行った我々のトランスクリプトームデータでは、前述のpil遺伝子など自然形質転換に関連する遺伝子がダウンレギュレートされていることが分かった。転写に対するこの影響が表現型に反映され得るかどうかに対処するため、A. baumannii AB5075において、先に述べた範囲のace-K濃度が自然形質転換に与える影響を検証した。驚くべきことに、トランスクリプトームデータ、蛍光測定、およびピリを介した運動性の結果と同様に、形質転換頻度はace-Kの影響を受け、0.66%以上では形質転換が完全に消失した（図4D）。さらに、A. baumanniiの自然形質転換頻度を高めることが証明されている二価の陽イオン（2mM CaCl2および1mM MgSO4）存在下でも形質転換頻度の低下が起こった（Traglia et al, 2016; Appendix Fig S7C）。この条件では、コントロールと比較して0.33%で有意な形質転換能の低下が認められ、0.66% ace-K以上で形質転換消失に至った。また、ace-Kを補充した場合、陽イオン存在下で細胞生存率に影響がなかったことから（Appendix Fig S7D）、この効果が増殖阻害によるものである可能性は捨象された。

これらの知見は、ace-Kの抗ウイルス性のレパートリーを増やし、ある濃度以上では、病原性細菌の抗菌剤耐性要素の獲得を実際に制限する可能性を示している。

Ace-Kは幅広い抗菌活性を持つ
ace-KがP. aeruginosa PA14およびA. baumannii AB5075の増殖に顕著な影響を与えたことから、他の臨床関連病原体に対しても同様の効果があるのではないかと仮定した。この仮説を検証するために、さまざまな種に属する臨床分離株を用いて、2.66%存在下での増殖アッセイを実施した。その結果、ace-Kは緑膿菌、大腸菌、Stenotrophomonas maltophilia、K. pneumoniae、E. faecalis、E. cloacaeなど多くの臨床分離株の増殖を、種によって異なる程度に著しく阻害したが（図5）、Staphylococcus aureusは阻害しないことが明らかとなった。グラム陰性菌とグラム陽性菌の両方に影響を与えることができるという発見は、ace-Kの活性の強さを浮き彫りにするものである。

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図5. 2.66% ace-Kの異なる臨床関連細菌に対する増殖抑制活性

A. baumannii AB5075、P. aeruginosa G4R7、E. coli NCTC 13476、S. maltophilia CCUG 63145、K. pneumoniae ST234、 E. faecalis CCUG 19916T および E. cloacae DUBに対して有意な阻害活性を示し、カチオンを添加すると、異なる程度まで補完された（2 mM CaCl2と1 mM MgSO4） 。S. aureus CCUG 62707のみ、ace-Kの存在下で培養した場合、増殖に大きな影響を示さなかった。棒グラフは24時間後のOD600を表し、3つの生物学的複製の平均値±S.D.を表す。解析は独立したt-検定により行った（*P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001, ****P ≤ 0.0001）.
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トランスクリプトームデータによると、細胞膜内に局在するタンパク質や膜関連プロセスに関与するタンパク質をコードする複数の遺伝子の発現が、ace-Kの存在下で影響を受けていることがわかった。これは、排水濃度のace-Kが環境バクテリアの膜透過性を変化させることを示した先行研究（Yu et al, 2021, 2022）と一致する。膜ストレス下では、細胞は膜の修復と毒性のバランスを取ろうとするため、細菌は増殖速度に影響を与えることが知られている（Mitchell & Silhavy, 2019）。さらに、二価陽イオンは膜安定性の維持に役立つことが知られています（Clifton et al, 2015）。膜の安定性がace-Kの毒性に関与している可能性を探るため、2.66%ace-K存在下でのAB5075の成長を、モック処理と二価の陽イオンを添加した同じ培地と比較して測定しました。A. baumannii AB5075に陽イオンを添加すると、ace-K存在下での増殖が有意に増加した（図5）。さらに、陽イオンの補充は、ace-K存在下での緑膿菌、大腸菌、S. maltophilia、K. pneumoniae、E. cloacaeの成長を救助することができた（Fig.5）。このことは、ace-Kを介した膜の安定性への影響が、異なる病原体種の間で広く見られることを示唆している。このことは、膜の破壊が、少なくとも部分的には細菌の増殖に対するace-K効果に関与しているという仮説を支持するものである。

Ace-Kは細菌の膜安定性に影響を与え、透過性の増加、総形的な形態の歪み、膜の膨張をもたらす
上述のように、我々のトランスクリプトームデータは、膜のホメオスタシスの崩壊を示唆した。これは、膜関連コーディング遺伝子44個と36個のアップレギュレーションとダウンレギュレーションに反映されている（同族遺伝子オントロジー用語に基づくこれらの遺伝子のリストは、データセットEV3に記載されている）。膜プロテオームにおけるこれらの再配置は、細胞がこのASで処理されたとき、膜のホメオスタシスの崩壊があることを示唆している。ace-Kの細菌細胞膜への影響をさらに調べるために、まず、膜特異的染料ナイルレッドとDNA染色剤DAPIを用いて、膜透過性への影響を評価した（Banerjee et al, 2021）。このアッセイでは、ace-Kのsub-MICの存在下で培養すると、A. baumannii AB5075は未処理の対照と比較してDNA色素の取り込みが著しく増加し（Appendix Fig S8）、膜透過性がより高くなることが確認された。また、このアッセイでは、ace-Kに暴露された細胞は、細胞の形態が変化しているように見えることが指摘された。この観察から、ライブセルイメージングを用いて、ace-Kが細胞形態に与える影響についてさらなる調査が行われた。細胞の挙動を経時的に観察したところ、A. baumannii細胞はace-Kに暴露されると分裂を停止し、構造的完全性を失って急速に膨張することが確認された。また、細菌細胞内に膨らみが形成されることも観察された。カルジオリピン（CL）特異的蛍光色素10-N-nonyl-acridine orange（NAO）を用いてCL分布を可視化すると（Mileykovskaya & Dowhan, 2000）、細胞膜のリン脂質組成に明らかな構造変化が見られ、細胞から膨らみが出ていることも確認できた（図6A；動画EV1およびEV2）。次に、このような細胞形態への重大な影響が他の種でも維持されているかどうかを調べようとした。そこで、カルバペネム耐性大腸菌NCTC 13476を用いて、ライブセルイメージングを繰り返した。興味深いことに、A. baumanniiとは異なるが保存された形態の喪失が観察された。細胞が膨張する代わりに、大腸菌の細胞は糸状化し、元のサイズの何倍にも伸びて、最終的に特徴的な膜の膨らみを形成し、最終的に溶解した（図6B）。これらの表現型は、実験室の大腸菌MG1655株でも保存されていた（図6C; 動画EV3-EV5）。これらの膜バルジの局在をより理解し、バルジの中身を知るために、mCherry-FisとCFP-FtsZを標識した大腸菌MG1655株のライブイメージング顕微鏡撮影を行った。Fisは小さなDNA結合タンパク質で、染色体の多くの領域に結合し（Cho et al, 2008）、生きた細胞でヌクレオソームを可視化することができる。FtsZはZリングの構成要素であり（Bi & Lutkenhaus, 1991）、将来の細胞分裂部位を示している。このタイムラプス実験により、膜の膨らみは、隔壁が形成される部位か、すでに侵入が起こっている部位のどちらかに大きく局在していることが明らかになった。また、mCherry-Fisは、これらの膨らみが核物質を含んでいることを示した（図6D）。このことから、ace-Kが細胞死に至るメカニズムは、バルジを介した細胞溶解であることが示唆された。

詳細は画像に続くキャプションに記載
図6. Ace-Kが細胞形態に与える影響

ace-Kで処理したA. baumannii細胞の位相差画像と蛍光画像。細胞はLBブロスで指数増殖期初期まで増殖させた。2.66% ace-Kを培養に添加し、表示された時間にサンプルを取り出した。膜は、NAOで5分間染色した後に可視化した。膜の膨らみの明確な例は、白い矢印で強調されている。60分後の図では、2つの灰色の矢印で強調されているように、溶解して「ゴースト」だけを残していることがわかる。
カルバペネム耐性大腸菌NCTC 13476の位相差画像と蛍光画像。細胞は上記のように処理され、可視化された。白い矢印は、膜の膨らみを強調するために使用されている。
ace-Kを含む培地上で増殖した大腸菌MG1655細胞のタイムラプスの位相差画像。環境チャンバを使用して37℃の一定温度を維持し、細胞を120分間撮像した（動画EV3およびEV4参照）。この画像は、ace-Kの存在下で細胞が増殖する際に起こる広範囲な膨らみを強調している。
Fisタンパク質がmCherryで、FtsZタンパク質がCFPで標識された大腸菌MG1655細胞の位相差画像および蛍光画像である。細胞は(A)に記載したように処理され、可視化された。この画像は、ace-Kで60分処理すると膜の膨らみがはっきりと見え（白矢印）、Zリングが位置する部位（青矢印）または浸潤が既に起こっている部位（灰色矢印）のいずれかに発生することを示している。CFPとRFPチャネルの位相差画像とオーバーレイを示す（詳細は材料と方法を参照）。
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Ace-Kは異なる抗生物質に対してMDR A. baumanniiを感作する。
A. baumanniiは、治療が困難な病原体として知られており、ほぼすべての利用可能な抗生物質に対する耐性を進化させる顕著な能力で認識されている（Harding et al, 2018; Tacconelli et al, 2018）。これは、バリアとして機能するその細胞エンベロープと、染色体およびその付属ゲノム（すなわちプラスミドおよび移動性遺伝要素；McCarthy et al, 2021）にコードされる解毒酵素および流出ポンプのかなりのレパートリーの共同貢献によるものである。抗生物質耐性における細胞外膜の役割、そしてace-Kは膜の変化を生じさせ、その安定性に影響を与えることから、我々は、ace-Kが細菌を抗生物質処理に対してより感受性にするのではないかという仮説を検討した。この仮説を検証するため、A. baumannii AB5075の様々な抗生物質に対する感受性を、成長を完全に阻害せずに影響を与えるace-K濃度（2.2%と2.4%）の存在下でテストした。その結果（Fig. 7A）、ace-KはポリミキシンB、ゲンタマイシン、カルバペネム系のドリペネム、イミペネム、メロペネムの活性を増強することが判明した。この株はカルバペネム系抗生物質に対して高い耐性を持つことが知られている。このカルバペネム系抗生物質耐性に対する顕著な効果を考慮し、ace-K存在下でのこれらの抗生物質のMIC変化を定量化した（図7B；表EV1）。エースK非存在下では、カルバペネム系抗生物質のMICは試験の検出限界（32 mg/l）以上であったが、エースKを2.4%添加すると、ドリペネム、イミペネム、メロペネムのMICはそれぞれ 1.9, 4.5, 1.8 mg/lに低下する。さらに，この感作性を他のβ-ラクタム系抗菌薬に外挿し，ディスク拡散アッセイを試みた。しかし，カルバペネム系薬と比較して40〜100倍高濃度のディスクを用いた場合，同様の感受性の変化が観察された（Appendix Fig S9）。ace-Kの多剤耐性菌に対する抑制効果、抗悪性腫瘍効果、抗生物質増強効果を考慮すると、感染症治療のための併用療法において有望な候補となる可能性がある。

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図7. Ace-KはAcinetobacter baumannii AB5075の異なる抗生物質に対する感度を増加させる。

A, B.
エースKの濃度とAB5075のポリミキシンB、ゲンタマイシン、カルバペネム系のドリペネム、イミペネム、メロペネムに対する感度を相関させた用量依存的な効果が観察された(A)。カルバペネム系抗生物質に対する特異的な効果に関する傾向を考慮して、Etest MICアッセイを実施し（B）、ace-Kの存在下で感度が向上することがさらに示された。解析は独立したt-検定により行った（*P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ****P ≤ 0.0001）。
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Ace-Kを添加した創傷洗浄剤およびドレッシングはin vitroでコロニーバイオフィルムの細菌生存率を低下させる
細菌性病原体は、感染した創傷にバイオフィルムを形成することがある。これらのバイオフィルムは治療に対して非常に抵抗性が高く、創傷を持続的な炎症状態に固定し、慢性創傷の発生につながる（Maslova et al, 2021）。特に、ASは一般的に規制当局から安全であるとみなされているため（WHO Food Additives Series 28）、ace-Kの抗菌活性は臨床的に大きな可能性を秘めています。その抗ウイルス性を考慮し、我々はace-Kを確立されたバイオフィルムに直接適用し、破壊することができると仮定した。これを評価するために、A. baumannii AB5075コロニーバイオフィルムを培養し、その後、慢性感染創傷の洗浄/灌漑を模した8.85% ace-K溶液による洗浄に曝した（Giri et al, 2020; Lewis & Pay, 2022）。この処理は、未処理のバイオフィルムおよび水洗浄対照と比較すると、AB5075バイオフィルム内の生存細胞数の3.5 log減少につながった（図8A）。創傷被覆材にace-Kを塗布した場合、慢性創傷のコロニー形成に同様の影響を与えるかどうかを知るために、同様のコロニーバイオフィルムアッセイを行ったが、8.85%のace-K溶液に浸した外科用ガーゼでバイオフィルムを被覆した。1時間の処理後、AB5075バイオフィルムは、水に浸したガーゼの対照と比較して、生存細胞の1.98 logの減少を示した（図8B）。さらに、ace-K浸漬ガーゼで処理した後、スライドグラス上で成長した18時間経過したAB5075バイオフィルムは、総蛍光強度の減少によって示されるように、全体のバイオマスが著しく減少していることが示された（Fig. 8C-F）。これらの結果は、創傷治療におけるace-Kの可能性を明確に示している。

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図8. Ace-Kとコロニーバイオフィルム

A-F.
A）洗浄液および（B）浸したガーゼとして適用した場合のA. baumannii AB5075コロニーバイオフィルムに対する8.85% ace-Kの抗菌活性、（C、E）ace-Kガーゼ処理バイオフィルムの蛍光画像および（D、F）蛍光強度マッピング。ace-K溶液でコロニーバイオフィルムを洗浄した場合（A）、バイオフィルムに結合している生細胞の数が3.47 log減少することが確認された。飽和ガーゼとして塗布した場合（B）、ace-K処理により、水コントロールと比較して生存細胞数が2-log減少した。3つの生物学的複製の平均値±S.D.を表す（***P ≤ 0.001）。解析は独立したt-検定による。スライドグラス上で増殖したA. baumanniiバイオフィルム（C、D）は、ace-Kガーゼ（E、F）で1時間処理すると、バイオフィルムに結合した生細胞が大幅に減少することが示された。画像の蛍光強度をマッピングすると、蛍光の大幅な減少が見られ、SYTO9染色細胞の減少を示唆した。蛍光強度マップの3次元視覚化をAppendix Fig S10に示す。
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Ace-kを添加した創傷被覆材は、ex vivoブタ皮膚モデルにおける熱傷および急性裂傷の細菌生存率を低下させる。
抗生物質耐性菌の抗菌治療に対する反応は、生物の微小環境と栄養の利用可能性に大きく影響される（Maslova et al, 2021; Van den Bossche et al, 2021）。創傷感染環境内におけるA. baumanniiに対するace-Kの有効性を評価するために、我々はex vivoブタ創傷感染モデルを使用しました（Alves et al, 2018）。ブタ皮膚摘出物の熱傷または皮膚裂傷のいずれかにバイオフィルムを増殖させ、ace-Kを浸したガーゼドレッシングで処理した。現在使用されている治療法に対してace-Kを評価するために、有効成分としてクロルヘキシジンを含むSterets Uniseptを使用しました。これは、臨床医が、有効性が不明であり、正確な投与量を得ることが困難であることから、局所用抗菌剤の使用を避けているため、比較対象治療として選択された（Lipsky & Hoey, 2009）。ace-K単独で1時間処理した後、火傷モデルで増殖したAB5075バイオフィルムは、水を含んだガーゼの対照処理と比較して、生存細胞の1.86 log減少を示した（図9A）一方、ステリセプトで処理したバイオフィルムは1.27 log減少にとどまった。

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図9. ex vivo モデルにおける治療可能性

A-C.
ex vivoブタ皮膚モデルを用いた、現行の創傷消毒剤と比較したace-Kの個別治療としての評価、ポリミキシンとのアジュバント治療としての評価、感染した裂傷の治療としての評価。8.85% ace-K溶液に浸したガーゼを単独で感染火傷の治療として評価したところ（A）、一般的に使用されている創傷消毒剤ステリセップでは1.27 logの減少にとどまったのに対し、ビークルコントロールに比べてバイオフィルム結合生菌が1.86 log減少していることが示された。ポリミキシン（B）と併用した場合、ace-Kは単独で使用した場合の2.11 log減少から3.13 log減少へと抗生物質の効果を増大させた。感染した裂傷の治療に使用した場合（C）、0.5 logの減少が達成された。データは、3つの生物学的複製の平均値±S.D.を示す。解析は独立したt検定による。
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併用療法としてのace-kの可能性を評価するために、0.59 mg/mlのポリミキシンB（一般に使用されているポリミキシン含有外用クリーム「ネオスポリン」と同等の用量）1.5 mlを含ませたガーゼで火傷創のバイオフィルムを処理しました。ポリミキシンBで処理した火傷創のバイオフィルムは、生存細胞の2.11 log減少を示したが、ポリミキシンBとace-Kの組み合わせで処理すると、3.13 log減少という改善が見られた（図9B）。最後に、感染した裂傷の治療法として、ace-Kを染み込ませたガーゼを評価した。感染した裂創を8.85%のace-Kで処理したところ、生存細胞の0.5 log減少を達成した（Fig. 9C）。これらの結果は、臨床シナリオに近いモデルにおいて、感染した傷の治療法としてace-Kの可能性を補強するものである。

考察
西洋の食事には、細菌の挙動を変化させる化合物がたくさん含まれている。これらの化合物の多くは、クオラムセンシングなどの細菌のコミュニケーションシステムを破壊し、腸および口腔マイクロバイオームの構成を著しく変化させることが示されている（McCarthy & O'Gara, 2015）。このような発見により、これらの化合物が感染症の進行に影響を与える能力を探る研究がさらに進んでいます。例えば、ガーリックオイルは、緑膿菌のクオラムセンシングを阻害することができる様々な化合物を含むことが知られており、慢性緑膿菌肺感染症の嚢胞性線維症患者に投与した場合、臨床試験で有望な結果を示しています（Smyth et al, 2010）。シナモンに含まれるシンナムアルデヒドも、この病原体のクォーラムセンシングを阻害することが示されています（Ahmed et al, 2019）。しかし、食事に含まれる化合物の範囲は、天然由来のものにとどまりません。食品業界に導入されて以来、ASは主に人間の健康への影響に関して、科学界の注目を集めてきました。最近では、ASがマイクロバイオームにどのような影響を与えるかに焦点が当てられています。この現象に焦点を当てた様々な研究は、ASが腸内の微生物群集の挙動を変化させ、これらの化合物が実際に生物学的活性を示すことを示すことで合意している。

この研究では、初めて、2つの関連する病原性細菌に対するASの効果に取り組んだ。A. baumannii AB5075とP. aeruginosa PA14である。これらの細菌の増殖に対するASの影響を評価したところ（図1および2、付録図S1～S3）、病原体によって増殖促進から異なる程度の増殖抑制まで、さまざまな結果が得られた。しかし、ace-KはA. baumanniiとP. aeruginosaの両方に対して強い効果を示した。そこで、我々はこのASに着目し、さらなる実験的開発を行った。我々は、ace-Kが阻害濃度以下で強力な抗バイオフィルム活性を有し、確立されたバイオフィルムを破壊する能力を有することを実証した。この抗バイオフィルム効果は、paaフェニル酢酸分解経路（ABUW_2525-2536）全体のアップレギュレーションによって媒介されているようである。この経路は、最近、csuオペロンの発現、したがってバイオフィルムレベルに大きく影響することが示されている（Moon et al, 2017; Hooppaw et al, 2022）。後の実験では、ace-Kが、S. maltophiliaの完全な増殖阻害からS. aureusの影響なしまで、幅広い抗菌活性を有することが確認された（図5）。S. aureusの増殖に影響がないことは、この細菌がace-K曝露による毒性効果を克服する手段を持っていることを示唆しており、さらなる調査が必要であることは確かである。

我々は、A. baumannii AB5075のace-Kによる転写変化を明らかにするために、dRNA-seq実験を行った。これまでのグローバルな転写試験で、ace-Kが廃水中に存在する濃度（我々の作業濃度の約107倍）で、大腸菌とA. baylyiのトランスクリプトームに変化を引き起こすことが示されている（Yu et al, 2021, 2022）。しかし、それらの効果は生物種によって異なっていた。例えば、大腸菌ではace-Kが活性酸素種（ROS）産生を誘発したが、A. baylyiでは同じ範囲の濃度でROSが増加しなかった。このように低濃度であっても、ace-Kが2つの細菌種で異なる反応を示したという事実は、異なる種がace-Kに対して異なる様式で反応するという以前の仮説を支持するものであった。興味深いことに、天然型能力を持つA. baylyiのトランスクリプトームおよび表現型研究（Yu et al, 2022）は、ace-Kがpil遺伝子（T4Pをコードする；Ellison et al, 2021；Vesel & Blokesch, 2021）の発現を誘導し、自然形質転換を促進することを示した。逆に、我々の作業用ace-K濃度では、高濃度でそれらの遺伝子群の発現が著しく低下し、A. baumanniiの非運動性表現型と自然形質転換の廃絶が確認された。このことは、ace-Kの細菌に対する効果が用量依存的に変化することを明確に示している。

また、dRNA-seq解析により、制御が異なる遺伝子の多くが膜に関連するタンパク質をコードしていることが明らかになった（データセットEV3）。これは、ace-Kが細胞膜の完全性に影響を及ぼしていることを示唆している。評価したところ、膜透過性に明らかな影響が、DNA色素の取り込みの増加によって見られた（Appendix Fig S8）。ライブセルイメージングにより、大腸菌およびA. baumanniiのace-K曝露による細胞形態への影響の程度が明らかになり、それぞれ細胞が糸状化または膨張することが分かった。細胞が本来の形態を失うと、透明な膜の膨らみが現れ、その後、細胞が溶解/死滅することが確認された。細胞が形態的完全性を失い、溶解前に膜に膨らみが形成されるこの細胞死のメカニズムは、β-ラクタム系抗生物質の細胞に対する特異的な形態学的効果を彷彿とさせます（Chung et al, 2009; Wood et al, 2019）。実際、陽イオンの添加は、これらのβ-ラクタム誘導の膨らみを安定化させ、細胞の生存を可能にすることが以前に示された（Yao et al, 2012）。私たちはすでに、陽イオン補充によって細胞がace-Kの影響から部分的に救出されることを実証し、ace-Kにさらされたときに異なる種で膜バルジが形成される視覚的証拠を得たことを考えると、ace-Kの抗菌効果がバルジを介した細胞溶解であることを強く支持します。この効果は、膜のレベルで媒介されるか、あるいは、dRNA-seqデータセットで差次的に発現しているペプチドグリカンアミドおよびグリコシドヒドロラーゼがあることを考えると（例：ABUW_0928、ABUW_0928、ABUW_0928）、膜のレベルで媒介される可能性がある。ABUW_0928, ABUW_3204, ABUW_4116, ABUW_0928 and ABUW_4116）、異常な細胞壁のペプチドグリカンの増殖・分解動態とターンオーバーのバランスの乱れを通じて、細胞膜構造の完全性の喪失に至る可能性がある（Dik et al, 2017）。さらに、この現象は、ace-Kの存在下でのカルバペネム系抗生物質に対する感受性の向上にも関与している可能性がある。

A. baumanniiにおける特徴の組み合わせは、この生物を抗生物質治療に難渋させる強固な多剤耐性プロファイルを付与する（McCarthy et al, 2021）。このため、これらの耐性機構を破壊する代替手段を見つけることが、将来の治療法の大きな課題となっています。我々は、亜致死濃度のace-Kが、多くの抗生物質、特にカルバペネム系抗生物質に対するA. baumanniiの感受性を高める能力を有することを明らかにした。カルバペネム系抗生物質が最初に遭遇するバリアは外膜であり、この外膜を貫通してペリプラズム空間に到達し、そこで活性を発現する必要がある。我々は、膜透過性が増加し、細胞が総体的に形態変化することを示した（図6；Appendix Fig S8）。これらのデータを総合すると、ace-Kは外膜を透過させることでカルバペネムの浸透率を高めていることが示唆された。

本研究で試験したASが示す増殖抑制および抗ウイルス作用は、感染症の予防や治療への可能性を示唆している。これを検証するために、我々はin vitroのコロニーバイオフィルムモデルと、洗浄と浸したガーゼという2種類のace-Kのアプリケーションを使用した。洗顔は、定着したバイオフィルムに甘味料がより浸透しやすいため（Lewis & Pay, 2022）、浸したガーゼは、ace-Kを長時間局所的に濃縮できるため、それぞれ選択された。両者とも生菌数の大幅な減少につながった。ASの臨床的可能性をさらに検証するために、ブタのex vivo皮膚モデルにおいて、感染した熱傷および物理的外傷の創傷を治療するace-Kの能力を評価しました（Alves et al, 2018）。創傷治療および管理は、医療システムにとって大きな経済的負担であり、英国の国民保健サービス（NHS）は、創傷管理に年間83億ポンドを費やしていると推定されています（Guest et al, 2020）。感染は創傷治療に伴う主な臨床的合併症の1つであり、そのため、特に外科的創傷では、細菌コロニー形成のリスクを最小限に抑えるために経口抗生物質が定期的に予防的に処方されている。ace-Kを増強ガーゼドレッシングとして適用すると、1時間の処置で熱傷および裂傷モデルの生存細菌を著しく減少させることに成功した。実際、この製剤はブタのex vivo創傷モデルにおいて、クロルヘキシジンベースの創傷消毒剤よりも生菌を大きく減少させた（図9B）。抗生物質の局所投与は、正確な投与が困難なため、比較的まれである。しかし、ポリミキシンは、全身的なポリミキシン投与に伴う神経毒性や腎毒性を制限するため、局所治療に比較的日常的に使用されてきた（Shatri & Tadi、2022）。Ace-Kはin vitroでポリミキシンBの活性を増強する能力を示し、ex vivo創傷モデルで評価したところ、どちらかのアプリケーションを単独で使用した場合と比較して、併用処理では生存細菌の著しい減少がみられた。これらの結果は、単独または併用で、フロントライン治療に耐性のある病原体に関連する感染症を治療するための強固な選択肢を提供できる可能性を示唆しています。

ace-KのようなASを治療薬やアジュバントとしてさらに前臨床開発することの特別な利点は、FDAの認可を受けていることであり、そのため、1日の推奨摂取量15mg/kgをはるかに超える濃度でも安全性に関する研究が数多く行われてきた。例えば、1日5,700mg/kgまで40週間摂取させたマウス試験では、何の悪影響もなく、この暴露の結果、どの組織にも炎症の証拠は見られなかった（Sinkeldam et al, 1991; National Toxicology Program, 2005; Chappell et al, 2020）。さらに、ace-K は、免疫系への影響も示していない（Reuzel & van der Heijden, 1991）。食事に含まれるこの他のASの急増と、個人レベルでの摂取量に関する規制がないことを考えると、これらの化合物は体内、特に口や腸で1日の推奨摂取量をはるかに超える濃度に達している可能性がある。しかし、ASの臨床的可能性、特に創傷環境における可能性を十分に探るには、さらなる研究が必要である。しかしながら、この研究は、創傷治療として、さらには既存の抗菌剤に対して病原菌を再感作する能力を持つことから、抗生物質アジュバントとして、ASに基づく治療法の将来の開発のための基礎を確立するものである。

材料と方法
細菌株と増殖条件
A. baumannii AB5075（コロニータイプVIR-O；Chin et al, 2018）、P. aeruginosa PA14およびこの研究で使用した残りの細菌種は、特に明記しない限り、液体（180rpmで振盪）または固体LB培地（ミラー）で37℃で日常的に培養された。必要に応じて、LBはCaCl2 2 mMおよびMgSO4 1 mMで補った。本研究で使用した細菌株、プラスミド、オリゴヌクレオチドを表EV2に示す。すべてのプラスミドは、複製起点に従って、大腸菌DH5⍺またはDH5⍺λpirで保存された。

プラスミドと菌株の構築
AB5075に選択的miniTn7T挿入物を作製するために、pUC18T-miniTn7T-lacIq-Ptac誘導体を構築した。そのために、テトラサイクリン耐性遺伝子tetAを、オリゴヌクレオチドtetA fwおよびtetA rv（デ・ディオスら、2022）を用いてpSEVA524（シルバ・ロシャら、2013）から増幅させた。PCR産物を、EagIおよびBsrGIで消化し、Klenowで鈍化したpUC18T-miniTn7T-Gm-lacIq-Ptac (Meisner & Goldberg, 2016; Addgene #110558) にライゲートし、pUC18T-miniTn7T-Tc-lacIq-Ptacを生成させた。

PpilAプロモーターからの発現をモニターするために、miniTn7ベースのPpilA::gfpmut3転写融合を構築した。PpilA fw EcoRIとPpilA rv BamHIのオリゴヌクレオチドを用いて、PpilA PCR産物を増幅した。次に、それを消化し、pUC18T-miniTn7T-zeo-gfpmut3（Choi & Schweizer, 2006; Addgene #65037）にライゲートし、pUC18T-miniTn7T-zeo-PpilA：：gfpmut3が得られた。

全てのクローン化された断片は、サンガー配列決定によって検証された。

A. baumannii AB5075のminiTn7T挿入体（AB5075/miniTn7T-Tc-lacIq-Ptac, AB5075/miniTn7T-zeo-gfpmut3 and AB5075/miniTn7T-zeo-PpilA:.gfpmut3) を作製した。 gfpmut3）は、pRK2013およびpTNS2をヘルパープラスミド（Figurski & Helinski, 1979; Choi et al, 2005）として用いて、以前に記載したように4親交配によって生成した（Ducas-Mowchun et al, 2019）。それぞれの挿入物を有するクローンを、miniTn7Tバックボーンに担持された耐性マーカーに従って、テトラサイクリン（5 mg/l）またはゼオシン（250 mg/l）で選択し、プライマーAB5075-glmS fwおよびTn7R（Kumar et al, 2010）を用いたPCRによって検証した。

MICおよびMBICの決定
96ウェルプレートで一晩培養したものを、P. aeruginosa PA14はOD600 0.1に、A. baumannii AB5075は0.05に希釈し、各エースK希釈液について、ビークルコントロールを含む0.09～7.08％の濃度のエースKを添加したLB培地を使用した。培養は37℃、180rpmで18時間行った。培養後、OD600の読み取りにより浮遊菌の増殖を評価した。MICは、対応するビヒクル対照と比較してプランクトン増殖の有意な減少をもたらしたace-Kの最低濃度と定義された。

プランクトン増殖の測定に続いて、バイオフィルム形成が測定された。ウェルから培地と浮遊細胞を除去し、バイオフィルムを脱イオン水で穏やかに3回洗浄した。その後、200μlの0.1%クリスタルバイオレットを各ウェルに加え、プレートを室温で15分間静置した。その後、染色を除去し、ウェルを脱イオン水で5回洗浄した。プレートを自然乾燥させた後、200μlの99%エタノールを各ウェルに加え、室温で6時間静置して、保持されたクリスタルバイオレットを再溶解させた。MBICは、ビヒクル対照と比較してバイオフィルム形成が有意に減少したace-Kの最低濃度と定義した。MICとMBICの結果は、3回の独立した複製（1回の実験につき3つの技術的複製）の平均を表している。

バイオフィルム根絶アッセイ
確立されたバイオフィルムを根絶するエース-Kの能力を評価するために、96ウェルプレートで一晩培養したものをLB培地中でP. aeruginosa PA14はOD600 0.1に、A. baumannii AB5075は0.05に希釈した。プレートは、37℃、180rpmで18時間培養し、バイオフィルムを形成させた。培養後、ウェルから培地を除去し、バイオフィルムを200μlの滅菌PBSで3回洗浄し、結合していない浮遊細胞を除去した。8.85% ace-Kまたは適切なビヒクルコントロールを添加した新鮮なLB培地をウェルに添加した。プレートを37℃、180rpmでさらに24時間インキュベートした。この処理後、バイオフィルムを0.1%クリスタルバイオレットで上記のように染色した。バイオフィルムの減少は、コントロールと比較した減少率で表した。

dRNA-seqと遺伝子エンリッチメント解析
細胞は、1.3% ace-Kまたは同量のビヒクルコントロールを添加した20 ml LBで、指数関数的な中位相（OD600 0.6-0.7 ）まで増殖させた。細胞はスピンダウンされ、RNAの完全性を保つためにRNAlaterで洗浄された。RNAは、RNAeasy KitとオンカラムDNAase消化（Qiagen）を用いて単離した。RNAの完全性はBioanalyzerで測定した。サンプルはさらに、Illumina MiSeqを用いたRNA配列決定用に処理し、サンプルあたり1200万リードを得た。配列決定と下流解析は、Microbial Genome Sequencing Center（米国ペンシルバニア州ピッツバーグ）で行った。品質管理およびアダプターのトリミングはbcl2fastqで行った。リードマッピングはHISATで行った。発現差解析は、推定分散値0.1の負2項カウントの2群間の差についてedgeRの正確検定を用い、A. baumannii AB5075-UWゲノムアノテーションを参照として行った（Gallagher et al, 2015）。464の遺伝子が、¦logFC¦ > 1およびP < 0.05より大きく有意に差次的に発現していると同定された。有意に制御された遺伝子は、機能的クラスタリングのためにGene Set Enrichment Analysis (FUNAGE-Pro v1.0) に供された (de Jong et al, 2022)。

GFPを用いた遺伝子発現アッセイ
PpilAプロモーターからの発現は、PpilA::gfpmu転写融合を有するminiTn7Tベースの挿入物（AB5075/miniTn7T-zeo-PpilA::gfpmut3）を用いて測定された。対照として、空のminiTn7Tバックボーンを持つAB5075/miniTn7T-zeo-gfpmut3株を用いた。PpilA::gfpmut3 融合体または空のトランスポゾンを持つ株の一晩培養物を、0.33、0.66、1.33% ace-K を添加した新鮮なLBブロス、またはモック処理で1：100 (v/v) に希釈した。培養液は37℃、180rpmで2時間培養した。その後、サンプルを培養物から取り出し、PBSで洗浄し、最終的にPBSに再懸濁した。各サンプルのテクニカルリピートを96ウェルプレートに2つ割り付け、そのOD600とGFP蛍光（励起：485 nm、発光：535 nm）を測定した。蛍光測定値は、それぞれのOD600で正規化し、空のトランスポゾン対照から得られたベースライン蛍光を、PpilA::gfpmut3 the promoter融合測定を有する株で得られた蛍光から差し引いた。各実験条件について3つの生物学的複製を実施した。

トゥイッチング運動性アッセイ
トゥイッチングアッセイは、トゥイッチング培地（トリプトン10g/l、酵母エキス5g/l、NaCl 2.5g/l 、寒天10g/l）中で行った。オートクレーブ滅菌後、培地に異なる量のace-Kまたは水（同量を加えるように調整）を加え、十分に混合し、溶液10 mlを90 mmシャーレに注いだ。開いたプレートは、ブンゼンバーナーの横で10分間冷却させた。プレートに接種するために、生育したばかりのプレート培養物からピペットチップでコロニーを摘み、プレートの底に突き刺した。プレートは37℃で48時間培養した。各実験条件について5つの生物学的複製を実施した。

自然形質転換アッセイ
自然形質転換アッセイは、Vesel & Blokesch（2021）により発表されたプロトコルに修正を加えながら実施した。定常期のA. baumannii AB5075培養物を、異なる量のace-Kまたは水対照を補充した新鮮なLB培地で1：100（v／v）希釈した。必要に応じて、培地はCaCl2 2mMおよびMgSO4 1mMも補充した。培養物を37℃、180rpmでOD600 0.5になるまでインキュベートした。次に、細胞培養物20μlを、染色体に部位特異的miniTn7T-Tc誘導体トランスポゾン（AB5075/miniTn7T-Tc-lacIq-Ptac、Tcr）を挿入した野生型AB5075からの精製ゲノムDNA800ngと混合した（Ducas-Mowchun et al、2019）。混合物を、前述と同じサプリメントを担持したLB寒天（pH6.0）上にパッチし、層流フード内で風乾させ、その後、37℃で4時間インキュベートした。次に、バイオマスを1 mlのLBブロスに再懸濁し、連続希釈液を、形質転換細胞については選択的LB寒天培地（テトラサイクリン5 mg/l）上に、生存率についてはプレーンLB寒天培地上にプレーティングして評価した。形質転換頻度は、1ミリリットル当たりの形質転換細胞数を1ミリリットル当たりの生存細胞数で割った値として計算し、対数目盛り軸で表現した。各実験条件について5つの生物学的複製を実施した。

膜透過性評価のための微分蛍光顕微鏡法
膜透過性は、細菌膜と染色体DNAをそれぞれ染色する2つの蛍光染色、ナイルレッドとDAPIを用いて評価した。100ml三角フラスコに1.33% ace-Kを含むLBブロスまたは同量の水を15ml入れ、OD600 0.05のAB5075の培養液を調製した。培養後、10μlの1mg/ml DAPI溶液と10μlの5mg/mlナイルレッド溶液を各フラスコに加え、30分間インキュベーターに戻した。染色後、培養物を5000rpmで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットを10mlの滅菌済み4%ホルムアルデヒド（PBS）中に再懸濁し、暗所で30分間インキュベートして固定した。固定後、サンプルを5000rpmで遠心分離し、ペレットを10mlの滅菌PBSで2回洗浄した。洗浄後、ペレットを10 mlの滅菌PBSに再懸濁し、10 μlの細胞懸濁液をスライドグラスにスポットし、暗所で風乾させた。1フラスコあたり3スポット作成した。スライドにカバースリップを貼り付け、CY3 (Ex: 542-568 nm, Em: 579-631 nm) とDAPI (Ex 325-375 nm, Em: 435-485 nm) フィルターを用いてLeica HF14 DM4000 顕微鏡でサンプルを撮像した。画像の取り込みには、ネイティブのLeica Application Suite Advanced Fluoresenceソフトウェア（V4.0.0.11706）を使用した。画像は、両染色とも876 msの露光と2.5のゲインを用いて、400倍の倍率で取り込まれた。

単一画像顕微鏡観察
対象菌株の新鮮な一晩培養液をLBブロス（Miller社製）で1：100（v/v）に希釈し、OD600が0.2になるまで37℃で激しく通気しながらインキュベートした。Ace-Kを必要な濃度で添加し、最初のサンプルは直ちに取り出した。以下のサンプルは、示された時間に採取した。メンブレンの染色には、10-nonyl acridine orange (Invitrogen™) を200 nMの最終濃度になるようにサンプルに加え、室温で5分間インキュベートした。サンプル1μlをアガロースパッドにピペッティングし、風乾させた。パッドの生成には、従来の顕微鏡用スライドに65 μl (15 × 16 mm) のGeneFrame (Thermo Scientific™) を追加した。1%のSeaKem LEアガロース（Lonza）を1×M9最小培地（5×ストックから希釈、Sigma-Aldrich）に加え、アガロースが完全に溶けるまで加熱した。95μlの溶液をGeneFrameチャンバーに加え、チャンバーを従来の顕微鏡用スライドですぐに密閉した。セット後、上部のスライドを取り外し、アガロースパッドを室温で20分間風乾させ、直ちに使用した。サンプルを加えて風乾させた後、22×22 mmのカバースリップを加えてGeneFrameチャンバーを密閉した。可視化は、CFI Plan Fluor DLL 100 ×対物レンズ（Nikon）およびORCA Flash 4.0 LT plusカメラ（Hamamatsu）を備えたTi-U倒立顕微鏡（Nikon）を用いて行われた。位相差画像は、pE-100単体LED波長源（CoolLED）を用いて撮影した。蛍光については、pE-4000照明システム（CoolLED）を使用した。CFP、10-ノニルアクリジンオレンジおよびmCherryの可視化のための関連フィルターは、Zeissフィルターセット47（CFP）および46（YFP）、ならびにNikon TXRED-A-Basic Filter（mCherry）であった。画像はNIS Elements-BR software V4.51 (Nikon)を用いて撮影し、tiffファイルに書き出した。トリミングや回転などの後処理はAdobe Photoshop CC (V23.0.0)で行った。

タイムラプス顕微鏡観察
対象株の新鮮な一晩培養液を新鮮なLBブロス（Miller社製）で1：100（v/v）に希釈し、OD600が0.2になるまで37℃で激しく通気しながら培養した。1μlの試料をアガロースパッドにピペッティングし、風乾させた。パッドの作製には、65 μl (15 × 16 mm) の GeneFrame (Thermo Scientific™) を使用した。GeneFrameを5枚重ね、従来の顕微鏡用スライドに追加した。1%のSeaKem LEアガロース（Lonza）をLB broth（Miller composition）に加え、アガロースが完全に溶けるまで加熱した。必要であれば、ace-Kを必要な濃度で溶融アガロース溶液に添加した。500μlの溶液を積み重ねたGeneFrameのチャンバーに加え、チャンバーを従来の顕微鏡用スライドですぐに密閉した。セット後、上部のスライドを取り外し、GeneFrameスタックの4辺に2mm幅の通気孔を切り込んだ。その後、アガロースパッドを室温で20分間風乾させ、すぐに使用した。サンプルを加えて風乾した後、22×22 mmのカバースリップを加えてGeneFrameチャンバーを密閉した。細胞は、上述のTi-Uシステムを用いて可視化した。タイムラプスイメージングのために、環境チャンバー（Digital Pixel）を用いて温度を37℃に維持した。タイムラプススタックは、NIS Elements-BR software V4.51 (Nikon) を用いて撮影し、mp4またはtiffにエクスポートした。トリミングや回転などのtiff画像の後処理はAdobe Photoshop CC（V23.0.0）で行った。

抗生物質感受性試験
抗生物質感受性試験は、陽イオン調整Mueller-Hinton pH 7.4 medium (CAMH, Sigma-Aldrich; CaCl2 2 mM, MgSO4 1 mM)で実施した。A. baumannii AB5075の一晩培養液をCAMHブロスで0.5マクファーランド単位に希釈し、滅菌綿棒を用いてace-K 2.2または2.4％（または模擬処理）を添加したCAMH寒天培地プレート上に撒いた。阻止域測定には，polymyxin B（300 U），gentamicin（10μg），doripenem（10μg），imipenem（10μg）またはmeropenem（10μg）ディスク（Oxoid）をCAMH寒天培地プレートの中央に配置した。MIC測定のため、ドリペネム、イミペネムまたはメロペネムEtestストリップ（bioMérieux）をプレートの中央に配置した。プレートを37℃で24時間インキュベートした後、阻害域の直径を測定し、またはMIC値を読み取った。

コロニーウォッシュアッセイ
12ウェルプレートのウェルに1mlのLB寒天を加えてプレートを準備した。AB5075の培養物を、滅菌PBSを用いて前述のようにOD調整し、5μlの細菌懸濁液を寒天の表面に添加し、乾燥させた。その後、プレートを37℃で3.5時間インキュベートして、コロニーバイオフィルムを形成させた。形成されたら、1 mlの8.85% ace-K溶液をバイオフィルムに添加した。バイオフィルムの破壊を避けるため、溶液はウェルの壁面を静かにピペッティングした。対照は、未処理のままか、滅菌脱イオン水1mlで処理した。処理したバイオフィルムは、37℃でさらに1時間静置培養した。処理後、液体をピペッティングによりウェルから除去し、1mlの滅菌PBSを加えた。各バイオフィルムは、PBSを激しくピペッティングすることにより再懸濁させた。再懸濁させたバイオフィルムを希釈し、生細胞を計数した。

ガーゼで処理したコロニーバイオフィルムについては、同じプロトコルを以下の修正で使用した。3.5時間の培養後、8.85%アセ-K溶液に浸した2cm2の滅菌綿ガーゼをバイオフィルムの表面に加え、ガーゼとバイオフィルムが完全に接触するように静かに押さえた。コントロールは、未処理のままか、滅菌脱イオン水に浸した同じガーゼで処理した。37℃で1時間処理した後、ガーゼ片を注意深く取り除き、各バイオフィルムを再懸濁し、前述のように生細胞を計数した。

処理前と処理後のバイオフィルムの画像化
A. baumanniiに対するace-k処理の効果を画像化するために、バイオフィルムをガラス製顕微鏡スライド上に増殖させた。滅菌したスライドガラスを滅菌チューブに入れた。AB5075 (OD600 0.5) の培養液を、スライドの半分が隠れるようにチューブに加え（総容量20 ml）、サンプルを37℃で18時間静置培養した。培養後、スライドを取り出し、バイオフィルムを滅菌脱イオン水に3回静かに浸漬して洗浄した。その後，バイオフィルムを無菌環境下で風乾し，製造者のガイダンスに従って調製した200μlのBacLight試薬（ThermoFisher，UK）で染色した．バイオフィルムは，暗黒の無菌環境で30分間染色した．バイオフィルムは，Lieca HF14 DM4000顕微鏡を用いて，L5およびCY3フィルターを用いて画像化した．画像取り込みには、ネイティブのLAS AFソフトウェアを使用した。撮像中、5つの視野が可視化され、それぞれの正確な座標と撮像パラメータが記録された。次に、同じバイオフィルムを8.85%のace-Kを浸したガーゼで1時間処理した後、先に詳述したように洗浄・染色を行った。同じ5つの視野を同じイメージングパラメータで再度撮影し、処理前と処理後を比較した。ヒートマップおよび3次元表現は、ImageJ "3D Interactive Surface Plot "プラグインを使用してPandianら（2021）により以前に記載されたように作成された。

エクスビボモデル
豚の皮膚は、Fine Food Specialists (London, UK) またはGridIron Meat Co. (Skipton, UK) から入手した。Ex vivo実験に使用した皮膚はすべて豚の腹部のもので、決して冷凍されておらず、塩や追加の水などの添加物を含まないものであった。急性裂傷をモデル化するために、皮膚を2.5 cm2 に分割して個々のペトリ皿に入れ、皮膚の各片をメスの刃で切断した。切り口は長さ2 cm、深さ2 mmとした。皮膚切片を片面1時間ずつ紫外線滅菌した。滅菌後、AB5075（OD600 0.05）の懸濁液を5μl、創傷床に加えた。その後、皮膚サンプルを37℃で3.5時間培養し、創傷バイオフィルムが形成されるようにした。培養後、1.5 mlの8.85%アセ-K溶液に浸した2 cm2の滅菌ガーゼ片を皮膚表面に加えた。皮膚サンプルは37℃でさらに1時間培養した。処理後、ガーゼ片を取り除き、傷口を1 mlの滅菌PBSで洗浄した。創傷は、バイオフィルムを除去するためにピペットチップで創傷床をこすりながら洗浄された。この洗浄を同量のPBSで3回繰り返し、すべてのバイオフィルムが回収されたことを確認した。その後、PBSを希釈し、生細胞を計数した。

急性熱傷を模擬するため、皮膚を10cm2に切断した。20本のスチールピン（各々直径8mm）をヒートブロックで140℃に1時間加熱した後、皮膚切片に60秒間設置した。火傷後、各火傷を切除し、24ウェルプレートに加えた。火傷した皮膚切片は、先に述べたように紫外線滅菌した。滅菌後、各火傷に5μlのAB5075懸濁液（OD600 0.05）を接種し、接種液は乾燥させた。接種した火傷は3.5時間培養し、バイオフィルムを形成させた。2cm2のガーゼに1.5mlの所望の処理剤（水、8.85％エースK、ユニセプト、500μg/ml硫酸ポリミキシンB、またはポリミキシンBとエースKの組み合わせ）を浸し、さらに1時間培養した。処理後、ガーゼを取り出して、火傷創バイオフィルムを集め、上記のように計数した。

統計解析
GraphPad Prismソフトウェアを用いて、適宜、統計解析を行った。すべての実験は、特に断らない限り、生物学的三重奏で行った。すべての統計的検定の完全な詳細は、「材料と方法」のセクションで見つけることができ、対応する結果は図の凡例で見つけることができる。

データの利用可能性
本研究で作成したRNA-seqデータセット（「Alteration of global transcription by the artificial sweetener acesulfame-K in Acinetobacter baumannii AB5075」と題する遺伝子発現データセットシリーズ）は、National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus公開データベースでアクセッション番号 GSE199706 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE199706) として利用可能である。

謝辞
RRMCはBritish Society for Antimicrobial Chemotherapy BSAC-2018-0095の支援を受けています。RRMCとEMはNC3Rs PhD Studentship NC/V001582/1の支援を受けています。RRMCとRDはBiotechnology and Biological Sciences Research Council New Investigator Award BB/V007823/1の支援を受けています。RRMCとCPは、Academy of Medical Sciences/the Wellcome Trust/the Government Department of Business, Energy and Industrial Strategy/the British Heart Foundation/Diabetes UK Springboard Award [SBF0061040] の支援を受けています。この研究は、Biotechnology and Biological Sciences Research CouncilからCJRへの研究助成金BB/T007168/1の支援を受けている。

著者協力
Rubén de Dios: Rubén de Dios: データキュレーション、形式分析、調査、方法論、執筆（原案）。Chris Proctor: Data curation, formal analysis, investigation, methodology, writing-original draft. Evgenia Maslova：データキュレーション、フォーマルな分析。Sindija Dzalbe: データキュレーション Christian J Rudolph: Christian J Rudolph：データキュレーション、形式的分析、方法論、執筆-レビューと編集。Ronan R McCarthy: 概念化、データキュレーション、正式解析、監督、資金獲得、調査、執筆-原案、プロジェクト管理、執筆-レビューと編集。

利益相反に関する声明
ブルネル大学ロンドンは、人工甘味料の治療的使用と抗生物質の活性を増強するための使用に関する2つの特許を有しています。

論文の説明
問題点
世界では、細菌感染症の治療に有効な抗生物質が急速に不足しており、かつては治療可能であった感染症が生命を脅かすようになってきています。一つは、1960年代と1970年代の抗生物質発見の黄金時代以来、新しい抗生物質の発見が大幅に遅れていることである。もうひとつは、現在使用されている抗生物質の管理が不適切で、誤った使い方をしたために、既知のすべての抗生物質に対して耐性を持つ細菌が出現したことである。世界保健機関（WHO）は、Acinetobacter baumanniiやPseudomonas aeruginosaといったこれらの病原菌にスポットライトを当て、これらの病原菌に対処するための新しい治療薬が緊急に必要であることを強調しています。

研究成果
本研究では、食品産業で頻繁に使用されている人工甘味料について、多剤耐性菌であるA. baumanniiおよび抗生物質耐性菌であるP. aeruginosaの増殖を抑制する能力を評価するために、そのパネルをスクリーニングしました。その結果、アセスルファム-K（ace-K）が両菌種に対して顕著な効果を示し、このことは後に臨床的に関連する他の病原体にも応用できる可能性があることがわかりました。その後、A. baumanniiのグローバルな遺伝子発現に対するace-Kの影響を調べたところ、バイオフィルムの形成、表面上の移動、外来DNAの取得を阻害することが確認された。さらに、カルバペネム耐性A. baumanniiは、ace-Kの存在下で、これらの最後の抗生物質に対して再感受性を示した。我々の顕微鏡実験によると、ace-Kは細菌の細胞外被を破壊することで増殖阻害を起こし、最終的に異常な形態、膜の膨張、細胞の溶解に至った。最後に、我々はこれらの知見をex vivoブタ皮膚モデルで検証し、ace-Kを新しい抗菌製剤、特に外用剤に配合する可能性を持つ化合物と位置づけることができた。

インパクト
新規抗菌薬の開発には、時間的・金銭的に非常に大きな投資が必要である。しかし、ace-Kのような人工甘味料は、すでに広範な安全性試験を経ており、その使用は世界中の規制当局から広く認められている。本研究では、ace-Kを、新規治療製剤の抗菌剤または抗生物質アジュバントとして使用できる、容易に入手可能な化合物として紹介する。

参考資料
添付資料

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参考文献
Ahmed SAKS, Rudden M, Smyth TJ, Dooley JSG, Marchant R, Banat IM (2019) Natural quorum sensing inhibitors effectively downregulate gene expression of Pseudomonas aeruginosa virulence factors（天然のクオラムセンシング阻害剤は緑膿菌の病原因子の遺伝子発現を効果的に抑制する。Appl Microbiol Biotechnol 103：3521-3535
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Alves DR, Booth SP, Scavone P, Schellenberger P, Salvage J, Dedi C, Thet N, Jenkins ATA, Waters R, Ng KW et al (2018) Development of a high-throughput ex-vivo burn wound model using porcine skin, and its application to evaluate new approaches to control wound infection.ブタ皮膚を用いた高生産性熱傷モデルの開発と、創傷感染制御のための新しいアプローチの評価への応用。フロント・セル・インフェクト・マイクロバイオル 8: 196
CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar
Andrade FF, Silva D, Rodrigues A, Pina-Vaz C (2020) Colistin update on its mechanism of action and resistance, present and future challenges. マイクロオーガニズムズ 8: 1-12
CrossrefWeb of Science®Google Scholar
Banerjee S, Vogt Sionov R, Feldman M, Smoum R, Mechoulam R, Steinberg D (2021) Anandamide alters the membrane properties, halts the cell division and prevents drug efflux in multidrug resistant Staphylococcus aureus.アナンダミドは多剤耐性黄色ブドウ球菌の膜特性を変え、細胞分裂を停止させ、薬剤の排出を妨げる。サイ・レップ 11: 8690
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Bi E, Lutkenhaus J (1991) 大腸菌の分裂に関連するFtsZリング構造。ネイチャー 354: 161-164
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Brown DG, Wobst HJ, Kapoor A, Kenna LA, Southall N (2022) Clinical development times for innovative drugs. Nat Rev Drug Discov 21: 793-794
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Cai B, Echols R, Magee G, Arjona-Ferreira JC, Morgan G, Ariyasu M, Sawada T, Nagata TD (2017) Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa predominated by the United Statesにおけるカルバペネム耐性グラム陰性感染症の有病率. オープンフォーラム インフェクトディズ 4: ofx176
CrossrefPubMedGoogle Scholar
Carocho M, Morales P, Ferreira ICFR (2017) Sweeteners as food additives in the XXI century: a review of what is known, and what is to come. フードケム・トキシコール 107: 302-317
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Chappell GA, Wikoff DS, Doepker CL, Borghoff SJ (2020) Lack of potential carcinogenicity for acesulfame potassium - systematic evaluation and integration of mechanistic data into the totality of the evidence.アセスルファムカリウムの発がん性の可能性の欠如-. フードケムルトキシコール141。111375
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Chin CY, Tipton KA, Farokhyfar M, Burd EM, Weiss DS, Rather PN (2018) A high-frequency phenotypic switch links bacterial virulence and environmental survival in Acinetobacter baumannii. ナット・マイクロビオール 3: 563-569
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Chlebek JL, Hughes HQ, Ratkiewicz AS, Rayyan R, Wang JC, Herrin BE, Dalia TN, Biais N, Dalia AB (2019) PilT and PilU are homohexameric ATPases that coordinate to retract type IVa pili. PLoS Genet 15: e1008448
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Cho BK, Knight EM, Barrett CL, Palsson B (2008) Genome-wide analysis of Fis binding in Escherichia coli shows a causative role for A-/AT-tracts. Genome Res 18: 900-910
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Choi KH, Schweizer HP (2006) 単一attTn7サイトを持つ細菌におけるmini-Tn7挿入：例 緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa). Nat Protoc 1: 153-161
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Choi KH, Gaynor JB, White KG, Lopez C, Bosio CM, Karkhoff-Schweizer RR, Schweizer HP (2005) A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods 2: 443-448
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Chung HS, Yao Z, Goehring NW, Kishony R, Kahne JB (2009) 迅速なβ-ラクタム誘発溶解には、細胞分裂装置の組み立てに成功することが必要である。を参照。
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Clifton LA, Skoda MWA, Le Brun AP, Ciesielski F, Kuzmenko I, Holt SA, Lakey JH (2015) Effect of divalent cation removal on the structure of gram-negative bacterial outer membrane models. ラングミュア 31: 404-412
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Dik DA, Marous DR, Fisher JF, Mobashery S (2017) Lytic transglycosylases: concinnity in concision of the bacterial cell wall. クリット・レヴ・バイオケム・モル・バイオル 52: 503-542
CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar
de Dios R, Gadar K, McCarthy RR (2022) A high-efficiency scar-free genome editing toolkit for Acinetobacter baumannii. J Antimicrob Chemother https://doi.org/10.1093/jac/dkac328
CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar
Ducas-Mowchun K, De Silva PM, Crisostomo L, Fernando DM, Chao TC, Pelka P, Schweizer HP, Kumar A (2019) 次世代のTn7ベースのシングルコピー挿入エレメントは、Acinetobacter baumanniiのマルチおよびパンドラッグ耐性株で使用するために使用します。Appl Environ Microbiol 85: e00066-19
CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar
エリソンCK、ダリアTN、クランチャーCA、シェービッツJW、ギタイZ、ダリアAB（2021）アシネトバクター・ベイリイは2つの伸長モーターとモータータンパク質阻害剤を用いてIV型ピルス合成を調節している。Nat Commun 12: 3744
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Figurski DH, Helinski DR (1979) プラスミドRK2のオリジン含有誘導体の複製は、トランスで提供されるプラスミド機能に依存している。プロック・ナトル・アカッド・サイ・U S A 76: 1648-1652
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Gallagher LA, Ramage E, Weiss EJ, Radey M, Hayden HS, Held KG, Huse HK, Zurawski DV, Brittnacher MJ, Manoil C (2015) Resources for genetic and genomic analysis of emerging pathogen Acinetobacter baumannii. J Bacteriol 197: 2027-2035 (日本語訳)
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Giri P, Krishnaraj B, Chandra Sistla S, Sistla S, Basu D, Shankar G, Akkilagunta S, Ruparelia J (2020) 従来の陰圧創傷治療と比較して、生理食塩水を浸透させた陰圧創傷治療は創傷治癒を改善するのか？四肢の潰瘍患者を対象とした無作為化比較試験。Ann Med Surg 61: 73-80
CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar
Guest JF, Fuller GW, Vowden P (2020) 2017/2018年の英国の国民保健サービスに対する創傷の負担を評価するコホート研究：2012/2013からの更新。BMJオープン10: e045253
CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar（グーグルスクーラー
Guoqi W, Zhirui L, Song W, Tongtong L, Lihai Z, Licheng Z, Peifu T (2018) 陰圧創傷療法は緑膿菌の運動性を低下させ、ウサギ耳バイオフィルム感染モデルにおける創傷治癒を促進します。アントニー・ヴァン・レーウェンフック 111: 1557-1570
CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar
Gutiérrez-Barranquero JA, Reen FJ, McCarthy RR, O'Gara F (2015) Deciphering the role of coumarin as a novel quorum sensing inhibitor suppressing virulence phenotypes in bacterial pathogens.（細菌病原体における病原性の表現型を抑制する新規クオラムセンシング阻害剤としてのクマリンの役割を解明する）。Appl Microbiol Biotechnol 99: 3303-3316
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Harding CM, Tracy EN, Carruthers MD, Rather PN, Actis LA, Munson RS (2013) Acinetobacter baumannii strain M2 produces type IV pili which play a role in natural transformation and twitching motility but not surface-associated motility.mBio 4: e00360-13
CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar
Harding CM, Hennon SW, Feldman MF (2018) Uncovering the mechanisms of Acinetobacter baumannii virulence. ナット・レヴ・マイクロバイオル 16: 91-102
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
HM Goverment (2019) UK 5-year Action Plan for antimicrobial resistance 2019 to 2024 (https://www.gov.uk/government/publications/uk-5-year-action-plan-for-antimicrobial-resistance-2019-to-2024)
グーグル・スカラー
Hooppaw AJ, McGuffey JC, Di Venanzio G, Ortiz-Marquez JC, Weber BS, Lightly TJ, van Opijnen T, Scott NE, Cardona ST, Feldman MF (2022) The phenylacetic acid catabolic pathway regulates antibiotic and oxidative stress response in Acinetobacter.mBio 13: e0186321.
CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar
WHO食品添加物シリーズ28 (https://apps.who.int/food-additives-contaminants-jecfa-database/Home/Chemical/926)
Google Scholar
Hua X, He J, Wang J, Zhang L, Zhang L, Xu Q, Shi K, Leptihn S, Shi Y, Fu X (2021) Acinetobacter baumanniiにおけるadeS、rpoBおよびrrfの変異を介した新しいチゲサイクリン耐性機構．エマージェンシー・マイクロベス・インフェクツ 10: 1404-1417
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Hutchings M, Truman A, Wilkinson B (2019) Antibiotics: Past, Present and Future. Curr Opin Microbiol 51: 72-80
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Jamal M, Ahmad W, Andleeb S, Jalil F, Imran M, Nawaz MA, Hussain T, Ali M, Rafiq M, Kamil MA (2018) Bacterial biofilm and associated infections.（細菌バイオフィルムと関連感染症）. J Chin Med Assoc 81: 7-11
CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar
de Jong A, Kuipers OP, Kok J (2022) FUNAGE-pro: comprehensive web server for gene set enrichment analysis of prokaryotes.（原核生物の遺伝子セット濃縮解析のための包括的なウェブサーバー）. Nucleic Acids Res 50: W330-W336
CrossrefWeb of Science®Google Scholar
このような場合、「遺伝子組換え技術」を活用することで、「遺伝子組換え技術」を活用することができます。J Microbiol Methods 82: 296-300
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Lewis K (2020) 抗生物質探索の科学. セル 181: 29-45
クロスリファレンスCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Lewis K, Pay JL (2022) 創傷潅注。StatPearlsにて。トレジャーアイランド、フロリダ州。StatPearls出版
Google Scholar
Lipsky BA, Hoey C (2009) 慢性創傷の治療における局所抗菌療法。Clin Infect Dis 49: 1541-1549
CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar
Mahmud R, Shehreen S, Shahriar S, Rahman MS, Akhteruzzaman S, Sajib AA (2019) Noncaloric artificial sweeteners modulate the expression of key metabolic genes in the omnipresent gut microbe Escherichia coli. J Mol Microbiol Biotechnol 29: 43-56
CASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Markus V, Share O, Shagan M, Halpern B, Bar T, Kramarsky-Winter E, Teralı K, Özer N, Marks RS, Kushmaro A (2021) Inhibitory effects of artificial sweeteners on bacterial quorum sensing（人工甘味料のバクテリアクォーラムセンシングに対する抑制効果）. Int J Mol Sci 22: 9863
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Maslova E, Eisaiankhongi L, Sjöberg F, McCarthy RR (2021) Burns and biofilms: priority pathogens and in vivo models. NPJ バイオフィルム・マイクロバイオーム 7: 73
CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar（グーグルスクーラー
McCarthy RR, O'Gara F (2015) The impact of phytochemicals present in the diet on microbial signalling in the human gut. J Funct Foods 14: 684-691
CrossrefCASWeb of Science®Google Scholar
McCarthy RR, Larrouy-Maumus GJ, Tan M, Mei Gei C, Wareham DW (2021) Acinetobacter baumanniiにおける抗生物質耐性機構とその伝播. In Microbial pathogenesis, U Kishor (ed), pp 135-153. Cham: シュプリンガー・インターナショナル・パブリッシング
CrossrefGoogle Scholar
Meisner J, Goldberg JB (2016) The Escherichia coli rhaSR-PrhaBAD inducible promoter system allows tight controlled gene expression over a wide range in Pseudomonas aeruginosa.大腸菌rhaSR-PrhaBAD誘導性プロモーターシステムは、緑膿菌の広い範囲での遺伝子発現を可能にする。Appl Environ Microbiol 82: 6715-6727
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Mileykovskaya E, Dowhan W (2000) カルジオリピン特異的蛍光色素10-N-nonyl acridine orangeを用いた大腸菌のリン脂質ドメインの可視化。J Bacteriol 182: 1172-1175
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Mitchell AM, Silhavy TJ (2019) Envelope stress responses: Balancing damage repair and toxicity. ナット・レヴ・マイクロビオール 17: 417-428
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Moon KH, Weber BS, Feldman MF (2017) Subinhibitory concentration of trimethoprim and sulfamethoxazole prevent biofilm formation by Acinetobacter baumannii through inhibition of Csu pilus expression. Antimicrob Agents Chemother 61: e00778-e00717
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Mulani MS, Kamble EE, Kumkar SN, Tawre MS, Pardesi KR (2019) Emerging strategies to combat ESKAPE pathogens in the era of antimicrobial resistance: a review.抗菌剤耐性時代におけるESKAPE病原体と戦うための新たな戦略。フロント・マイクロバイオル 10: 539
CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar
Mulcahy LR, Isabella VM, Lewis K (2013) Pseudomonas aeruginosa biofilms in disease. Microb Ecol 68: 1-12
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Murray CJ, Ikuta KS, Swetschinski L, Robles Aguilar G, Gray A, Han C, Bisignano C, Rao P, Wool E, Johnson SC et al (2022) Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet 399: 629-655
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Naik AQ, Zafar T, Shrivastava VK (2021) Emerging sources of pollution as the presence, distribution, and use of artificial sweetenersの環境影響。J Environ Public Health 2021: 6624569
CrossrefPubMedGoogle Scholar
National Toxicology Program (2005) Toxicity Studies Of Acesulfame Potassium (Cas No. 55589-62-3) In Fvb/N-Tgn(V-Ha-Ras)Led (Tg.Ac) Hemizygous Mice And Carcinogenicity Studies Of Acesulfame Potassium In B6.129-Trp53tm1brd (N5) Haploinsufficient Mice. National Toxicology Program. P.O. Box 12233. Research Triangle Park, Nc 27709: NIH Publication (https://ntp.niehs.nih.gov/ntp/htdocs/gmm_rpts/gmm02_508.pdf?utm_source=direct&utm_medium=prod&utm_campaign=ntpgolinks&utm_term=gmm02)
Google Scholar
Pakharukova N, Tuittila M, Paavilainen S, Malmi H, Parilova O, Teneberg S, Knight SD, Zavialov AV (2018) Structural basis for Acinetobacter baumannii biofilm formation. プロック・ナトル・アカッド・サイ・ユーエスエー 115: 5558-5563
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
このような場合、「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」........................................... Int J Biol Macromol 188: 501-511
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Proctor CR, McCarron PA, Ternan NG (2020) Furanone quorum-sensing inhibitors with potential as novel therapeutics against Pseudomonas aeruginosa.（緑膿菌に対する新規治療薬としての可能性を持つフラノン・クォーラムセンシング阻害剤）。J Med Microbiol 2020: jmm001144
Google Scholar
Reuzel PGJ, van der Heijden CA (1991) ビーグルにおけるアセスルファム-Kの長期経口毒性試験。アセスルファム-K, D Mayer, F Kemper (eds), pp 71-86. ニューヨーク、NY。マルセルデッカー
Google Scholar
Roberts A, Renwick AG, Sims J, Snodin DJ (2000) Sucralose metabolism and pharmacokinetics in man. Food Chem Toxicol 38: 31-41
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
ロメロ M、メイヤー C、ヒーブ S、ワッタナヴェキン K、カマラ M、オテロ A、ウィリアムズ P (2022) ローラー型バイオリアクターで増殖したアシネトバクター・バウマニ・バイオフィルムに形成されるキノコ型構造は、クオラムセンシング依存の Csu-pilus 会合に関連している。エンバイロン・マイクロバイオロジー 24: 4329-4339
Wiley Online LibraryCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Ronish LA, Lillehoj E, Fields JK, Sundberg EJ, Piepenbrink KH (2019) The structure of PilA from Acinetobacter baumannii AB5075 suggests a mechanism for functional specialization in Acinetobacter type IV pili. ジェイ・バイオル・ケム 294: 218-230
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Scheurer M, Brauch H, Lange FT (2009) ドイツの排水、地表水、土壌帯水処理（SAT）における7種類の人工甘味料の分析と発生状況。Anal Bioanal Chem 394: 1585-1594
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Shahriar S, Ahsan T, Khan A, Akhteruzzaman S, Shehreen S, Sajib AA (2020) Aspartame, acesulfame K and sucralose- influence on the metabolism of Escherichia coli.大腸菌の代謝に対するアスパルテーム、アセスルファムKおよびスクラロースの影響。メタボルオープン 8: 100072
クロスリファレンスPubMedGoogle Scholar
Shatri G, Tadi P (2022) Polymyxin. StatPearlsで。トレジャーアイランド、フロリダ州。StatPearls出版
Google Scholar
Silva-Rocha R, Martínez-García E, Calles B, Chavarría M, Arce-Rodríguez A, de Las HA, Páez-Espino AD, Durante-Rodríguez G, Kim J, Nikel PI et al (2013) The standard European vector architecture (SEVA): a coherent platform for the analysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes.（標準ヨーロッパベクターアーキテクチャ：SEVAは複雑な原核生物の表現型の解析と展開のための首尾一貫したプラットフォームです）. ヌクレイック・アシッズ・レゾ 41: D666-D675
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Sinkeldam E, Kuper C, Beems R (1991) ラットにおけるアセスルファム-Kの慢性毒性および発がん性の複合試験。アセスルファム-K, D Mayer, F Kemper (eds), pp 43-58.において。New York, NY: マルセルデッカー
Google Scholar
Slachmuylders L, Van Acker H, Brackman G, Sass A, Van Nieuwerburgh F, Coenye T (2018) Elucidation of the mechanism behind the potentiating activity of baicalin against Burkholderia cenocepacia biofilms.（バイカリンのBurkholderia cenocepaciaに対するバイオフィルムに対する効力増強作用のメカニズムの解明）。PLoS One 13: e0190533
CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar
Smyth AR, Cifelli PM, Ortori CA, Righetti K, Lewis S, Erskine P, Holland ED, Givskov M, Williams P, Cámara M et al (2010) Garlic as an inhibitor of Pseudomonas aeruginosa quorum sensing in cystic fibrosis-a pilot randomized control trial. 小児科医Pulmonol 45: 356-362
Wiley Online LibraryPubMedWeb of Science®Google Scholar
Suez J, Korem T, Zeevi D, Zilberman-Schapira G, Thaiss CA, Maza O, Israeli D, Zmora N, Gilad S, Weinberger A et al (2014) Artificial sweeteners induce glucose intolerance by altering the gut microbiota. ネイチャー 514: 181-186
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Suez J, Cohen Y, Valdés-Mas R, Mor U, Dori-Bachash M, Federici S, Zmora N, Leshem A, Heinemann M, Linevsky R et al (2022) Personalized microbiome-driven effects of non-nutritive sweeteners on human glucose tolerance.（栄養価のない甘味料のヒト耐糖能に対する微生物群の個別化効果）。セル185: 3307-3328.e19
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Tacconelli E, Carrara E, Savoldi A, Harbarth S, Mendelson M, Monnet DL, Pulcini C, Kahlmeter G, Kluytmans J, Carmeli Y et al (2018) Discovery, research, and development of new antibiotics: the WHO priority list of antibiotic-resistant bacteria and tuberculosis.（新しい抗生物質の発見と研究と開発：抗生物質耐性菌と結核に関するWHO優先リスト）。ランセット・インフェクト・ディス 18: 318-327
CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar
Tandel KR (2011) 砂糖代替物：認識された利点をめぐる健康論争。J Pharmacol Pharmacother 2: 236-243
CrossrefCASPubMedGoogle Scholar
Traglia GM, Quinn B, Schramm STJ, Soler-Bistue A, Ramirez MS (2016) Serum albumin and Ca2+ are natural competence inducers in the human pathogen Acinetobacter baumannii. アンチミクロブ・アージェント・ケマザー 60: 4920-4929
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Van den Bossche S, De Broe E, Coenye T, Van Braeckel E, Crabbé A (2021) The cystic fibrosis lung microenvironment alters antibiotic activity: causes and effects. Eur Respir Rev 30: 210055
CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar
Vesel N, Blokesch M (2021) Acinetobacter baumanniiのPilus産生は増殖期依存性であり、自然形質転換に必須である。J Bacteriol 203: e00034-21
CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar
Wang Q, Browman D, Herzog H, Gregory Neely G (2018) Non-nutritive sweeteners possess a bacteriostatic effect and alter gut microbiota in mice. PLoS One 13: e0199080
クロスリファレンスPubMedWeb of Science®Google Scholar
Wood TE, Howard SA, Förster A, Nolan LM, Manoli E, Bullen NP, Yau HCL, Hachani A, Hayward RD, Whitney JC et al (2019) Pseudomonas aeruginosa T6SS delivers a periplasm toxin that disrupts bacterial cell morphology. セルレップ 29: 187-201.e7
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Wouters OJ, McKee M, Luyten J (2020) 新薬の上市に必要な研究開発投資の推定値、2009-2018年. JAMA 323: 844-853
CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar
Yao Z, Kahne D, Kishony R (2012) Distinct single-cell morphological dynamics under beta-lactam antibiotics（β-ラクタム系抗生物質による単細胞の形態学的動態の違い）。Mol Cell 48: 705-712
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Yu Z, Wang Y, Lu J, Bond PL, Guo J (2021) Nonnutritive sweeteners can promote the dissemination of antibiotic resistance through conjugative gene transfer（非栄養性甘味料は共役的遺伝子移入を通じて抗生物質耐性の普及を促進する）。ISME J 15: 2117-2130
CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar
Yu Z, Wang Y, Henderson IR, Guo J (2022) 人工甘味料は、自然形質転換による細胞外抗生物質耐性遺伝子の水平伝播を刺激する。ISME J 16: 543-554