ラクトバチルス・ロイテリ菌のトリプトファン代謝は、中枢神経系の自己免疫に対する宿主の感受性を促進する

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公開日：2022年11月23日
ラクトバチルス・ロイテリ菌のトリプトファン代謝は、中枢神経系の自己免疫に対する宿主の感受性を促進する
Theresa L. Montgomery, Korin Eckstrom, ...Dimitry N. Krementsov 著者名を表示する
Microbiome 10巻 記事番号：198（2022） この記事を引用する

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指標詳細

概要
背景
多発性硬化症患者では、腸内細菌叢に関連したトリプトファン代謝の調節異常が観察されている。しかし、この明らかな代謝の再配列と腸内細菌叢の個々の構成要素との間の直接的な機構的関連を定義することは依然として困難である。私たちは、腸内常在菌でありプロバイオティクスと考えられているLactobacillus reuteriのコロニー形成が、多発性硬化症のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）に対する感受性を予想外に高めることを以前に明らかにした。そのメカニズムを明らかにするために、我々は常在菌であるL. reuteriのゲノムを解析し、in vitroおよびin vivoのメタボロームプロファイリング、食事基質の調整、腸内細菌叢の操作などを行った。

研究成果
L. reuteriのゲノムには、食事性トリプトファンを免疫調節性のインドール誘導体に代謝するのに必要な酵素（araT, fldH, amiE）が豊富に含まれていた。さらに、L. reuteri単培養菌とL. reuteri感染マウスの血清の代謝物プロファイリングにより、キヌレニンが減少し、インドール酢酸、インドール3-グリオキシル酸、トリプタミン、p-クレゾール、種々のイミダゾール誘導体を含む既知および新規トリプトファン由来AhRアゴニストおよびアンタゴニストが生成していることが明らかとなった。機能的には、食事性トリプトファンはL. reuteri依存性のEAE悪化に必要であり、食事性トリプトファンの枯渇は疾患活動およびCNSの炎症性T細胞応答を抑制した。L. reuteriトリプトファン由来代謝物はAhRを活性化し、T細胞のIL-17産生を促進することが示唆された。

結論
L. reuteriのような腸内常在菌によるトリプトファン代謝は、予想外に自己免疫を増強し、メタボロームや免疫レパートリーの幅広いシフトを引き起こす可能性があることが示唆された。

ビデオ アブストラクト

背景
多発性硬化症（MS）は、中枢神経系（CNS）の慢性自己免疫疾患であり、若年成人における非外傷性神経障害の主な原因となっています[1,2,3]。世界的な有病率と発症率は上昇を続けており、MSは米国で100万人、世界で200万人以上が罹患しています[4,5]。MSの病理学的変化には、神経炎症、髄鞘変性、軸索損傷、血液脳関門の完全性の喪失などがあります[6, 7]。MSにおける自己免疫反応は、Th1/Th17細胞によって開始され、自然免疫細胞およびB細胞によって伝播する炎症性細胞のCNS浸潤によって特徴付けられる。その結果、四肢の脱力、感覚障害、視覚および疲労を伴う中枢神経機能の変化、認知障害、うつ病、気分の変化、および無数の胃腸障害など、幅広い臨床症状が生じる[7, 8]。MSの主要な自己免疫動物モデルである実験的自己免疫脳脊髄炎（EAE）は、ミエリン抗原の免疫化によって誘導され、ミエリン特異的なTh1/Th17反応を刺激し、CNS炎症病変、脱髄、軸索喪失、神経機能障害をもたらす [9, 10]。

MSの病因は、遺伝的背景と環境的背景の両方があり、複雑である。MSの環境的危険因子には、EBV感染、低ビタミンD3レベル、低紫外線照射、喫煙、肥満、および潜在的な食事が含まれる[5、11、12]。MSの推定環境危険因子として最近同定されたのは、腸内細菌叢の組成の変化である[13]。哺乳類の腸内マイクロバイオームは、細菌、古細菌、ウイルス、真菌からなる複雑な生態系であり、合計10兆個を超える細胞と数千の微生物種からなり、ヒトゲノム自体よりも100倍多い遺伝子をコードしています[14, 15]。1）腸内細菌と免疫細胞の直接的な相互作用（おそらくミエリン反応性T細胞のプライミングに影響する）、および（2）腸内細菌による免疫調節および/または神経調節異化物の生産[13, 16]である。

MS発症における腸内細菌叢由来代謝物の研究は、主に微生物叢が産生する短鎖脂肪酸（SCFA）、胆汁酸、およびトリプトファン代謝物に焦点を当ててきた。MS患者では、SCFA産生菌の存在量 [17, 18] および糞便中の酪酸、プロピオン酸、酢酸レベル [17, 19, 20] が低下している。さらに、SCFAの補給は、EAEの再発率および重症度を低下させる[19, 21, 22, 23, 24, 25]。胆汁酸もまた、MSおよびEAEにおいて低く、胆汁酸の補充または胆汁酸受容体の調節がEAEを改善します[27,30]。興味深いことに、宿主または腸内細菌叢によって産生されるトリプトファン代謝物は、MSの病因に関して代謝物特有の影響を持ち、しばしば矛盾する所見を呈する[31,32,33,34,35,36,37,38,39]。

哺乳類のトリプトファン代謝は主に2つの主要経路で行われ、セロトニン/5-ヒドロキシトリプタミンまたはキヌレニンの産生をもたらす [40]。5-ヒドロキシトリプタミンレベルは、MS患者の血漿および血清において減少している［41、42］。しかし、選択的セロトニン再取り込み阻害剤による治療は、EAEモデルにおいて肯定的な知見が得られているにもかかわらず、再発率のわずかな減少にとどまる[43,44,45,46,47,48,49,50]。キヌレン酸（KA）やキノリン酸（QA）などのキヌレニン経路（KP）代謝物の存在量は、MS患者で変化するが、変化の方向はコホート間で一致していない［36, 37, 38, 51, 52］。さらに、KA/QAの比率はMS患者のサブタイプを層別化するのに十分であり、KP経路のバランスが代謝物固有の存在量よりも重要である可能性が示唆される[39]。

トリプトファン代謝に関与する細菌経路は、それをコードすることが知られている種間で広く分離しているが、関与する特定の酵素、制御機構、および宿主への影響は、しばしば明確ではない[53, 54]。トリプトファナーゼ（TNA）は歴史的に大腸菌に関連し、宿主の食物トリプトファンをインドールに変換する機能を持ち、その後宿主によってインドキシル硫酸に変換される[55,56,57]。あるいは、トリプトファンは、クロストリジウム属の種によってよく特徴付けられたオペロンにコードされるトリプトファンデカルボキシラーゼ（TrpD）によってトリプタミンに異化されることができる[58]。第三の経路では、トリプトファンは、いくつかの乳酸菌で保存されている芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ArAT）によって、様々なインドール誘導体に異化されることができる[59,60,61]。重要なことは、ArAT経路で生成される置換インドールは、MS患者において上昇または減少することが報告されており、インドール-3-プロピオン酸（IPA）、インドール-3-乳酸（ILA）、インドール-3-酢酸（I3A）の濃度が変化したという報告がある[31, 32, 33, 62, 63]。これらのインドール誘導体は、免疫調節転写因子であるアリール炭化水素受容体（AhR）のリガンドとして知られている[64, 65]。MS患者では、これらの推定上の乳酸菌産生代謝物のレベルが変化しているにもかかわらず、MSにおけるマイクロバイオームの役割を検討した14のケースコントロール研究のうち10は、乳酸菌の存在量に差がないことを見出し［66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76］、単一の研究のみがMSマイクロバイオームにおける乳酸菌存在量の明確な減少を報告していた[77］。残りの3つの研究は、分類学的解像度の不足によって混乱しており [28、78]、または疾患修飾治療に関連する変化を報告している [79]。これらの研究を総合すると、哺乳類と細菌の両方のトリプトファン代謝がMSの病因の重要な調節因子である可能性が高いことが示される。しかしながら、正確な作用機序、腸内細菌叢における原因となる変化、および宿主との相互作用は不明である。

動物実験では、EAE発症の調節における乳酸菌の役割に関しても、最近レビューしたように、より数が多いものの、多様な知見が報告されている[80]。この事実にもかかわらず、乳酸菌のプロバイオティクス投与は、潜在的なMS治療介入戦略として検討されている[81,82,83,84,85]。我々および他の研究者は最近、常在菌で推定プロバイオティック細菌種であるラクトバチルス・ロイテリ（L. reuteri）による安定したコロニー形成が、マウスにおけるEAE病態を悪化させるのに十分であることを報告した［86, 87］。さらに、L. reuteriの存在は、循環トリプトファン代謝産物のレベルの変化と関連していることを発見した[87]。ここでは、常在菌のL. reuteri分離株の全ゲノム配列決定を活用し、食事のトリプトファンを多様なインドール誘導体に異化するのに必要な酵素装置の保存を明らかにした。また、L. reuteri単培養株の代謝物プロファイリングから、トリプトファン誘導体の幅広いレパートリーを生産していることが明らかになった。機能的には、L. reuteriがEAEを悪化させるためには食事性トリプトファンを必要とし、それはIL-17産生γδT細胞の中枢神経系への浸潤の増大と関連していることを明らかにした。さらに、トリプトファンの利用を制限すると、腸内細菌叢依存的に中枢神経系の自己免疫性が抑制されることを見いだした。さらに、L. reuteriを接種したマウスの血清は、クレゾールや新規トリプトファン由来イミダゾールが増加し、キヌレニンが減少するという、食事性トリプトファン依存性のユニークな代謝プロフィールを示した。L. reuteri 由来の代謝物は、in vitro において AhR を活性化し、T 細胞による IL-17 産生を促進することが明らかになった。これらの結果は、哺乳類腸内常在菌のトリプトファン異化の遺伝的・代謝的特徴を明らかにし、中枢神経系の自己免疫を促進する種特異的・宿主食依存的な機構を確立するものであった。

研究成果
マウス腸内常在菌からの多様な乳酸菌の単離とゲノム特性解析
我々は、遺伝学的に多様なマウス系統の正常な腸内細菌叢から、3種の優勢な乳酸菌を同定した（図1）。L. reuteri、L. murinus、L. johnsoniiである[87]。Lactobacillus属は最近複数の属に再分類され、これら3種はそれぞれLimosilactobacillus reuteri, Ligilactobacillus murinus, Lactobacillus johnsoniiと命名されていることに注目されたい[88]。我々は、これまでの研究との一貫性を保つために、元の名前で呼ぶことを選択した。重要なことは、C57BL/6J（B6）マウス由来の微生物叢におけるL. murinusの存在が低いEAE感受性と関連する一方、遺伝的に異なる野生由来のPWD/PhJ（PWD）マウスの微生物叢由来のL. reuteriの存在が高いEAE感受性と関連し、これがB6マウスへの移植によって機能的に確認されたことが以前に示されたことである[87]。細菌種レベルの遺伝的変異が、EAEの病原性を変化させる能力の差に関与しているかどうかを調べるために、我々は、全ゲノム配列決定と、対象となる各生物種の独立した2つの分離株のアセンブリを活用した。

種の同一性を確認し、各単離株の最近接系統を同定するために、NCBI非冗長原核生物ゲノムデータベース[89]を用いて、Microbial Genomes Atlas (MiGA) online server (http://www.microbial-genomes.org) に対して各細菌種の2つの独立分離株のドラフトゲノムを照会した。各単離株の種レベルの同一性は、L. reuteri分離株#1を除いてp<0.05で確認された（図1A-Cおよび表S1）。平均塩基同一性（ANI）と平均アミノ酸同一性（AAI）の両方を、同一性パーセントとゲノムの共有割合として解析し、それぞれ近縁種と遠縁種の間の最近接系統樹を決定した。各生物種の中で、2つの分離株は、両方の指標で示されるように、同じ亜種に最も近縁であった。L. reuteri、L. murinus、L. johnsonii分離株のドラフトゲノムは、それぞれL. reuteri subspecies I5007、L. murinus subspecies CR141、L. johnsonii subspecies Byun-jo-01 に最も近い関係にあった（図 1D-F、表 S2、図 S1）。

図1
図1
Lactobacillus属の分離株は非常に多様であり、代謝能に世界的な違いが見られる。L. reuteri (A), L. murinus (B), L. johnsonii (C) の代表的なドラフトゲノムを NCBI non-redundant prokaryotic genomes データベースと照会し、系統分類を行ったもので、p値は系統分類の信頼性を表す。D-F 各Lactobacillusドラフトゲノムの最近接亜種の系統樹は、平均塩基同一性（ANI）対平均アミノ酸同一性（AAI）としてグラフ化された共有ゲノムコンテンツのパーセントによって決定されます。Lactobacillus分離株と公開されている同種の株の参照ゲノムとの系統樹として表したAAI。L. reuteriは青、L. murinusは赤、L. johnsoniiは緑で、直接分離株と最近接亜種の系統樹は赤で表示されており、色分けはそれぞれの種を示している。外側の色帯は、各単離株の由来宿主を示す。H L. reuteriのアクセサリーゲノムのKEGGパスウェイ濃縮解析に用いた分離株間のコアおよびアクセサリー推定プロテオミクス要素の円グラフ。(Lactobacillus分離株と最近接系統の上位20クラスタのオーソログ遺伝子（COG）アバンダンスプロファイルのヒートマップ（暖かい色は各COGに割り当てられた遺伝子数の増加を示す）。

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私たちの分離株と同種の細菌株との間のゲノムおよび推定されるプロテオミクス上の変異の範囲を広く決定するために、MIGAが特定した最近接系統樹を含む入手可能な完全な高品質ドラフトゲノムを、私たちの分離株ドラフトゲノムとともにANI/AAI-Matrix計算機 [90] で分析しました。AAIは系統樹として表現され、種間クレードが明確になった。特に、L. reuteriとL. murinusはL. johnsoniiよりも互いに類似しており、ヒトおよびマウス由来の株と最も密接にクラスタリングされていた（図1G）。L. reuteri特有の分岐遺伝子座の機構的可能性を推測するため、タンパク質コード遺伝子をBacterial Pan Genome Analysisツール（BPGA）を用いてコアコンテンツとアクセサリーコンテンツに分離し、KEGGとCOGの両データベースにマッピングを行った。BPGAを用いた種間クラスタリングにより、アクセサリーとして推定されるプロテオームコンテンツの割合は86.3～88.7%と高く、コアプロテオームは11.3～13.7%、合計400遺伝子のみでした（図1Hおよび表S3）。L. reuteri ゲノムでどの要素が濃縮されているかを具体的に調べるため、コア、アクセサリー、およびユニークなゲノムの KEGG orthology 識別子を抽出し、clusterProfiler [91] を用いて KEGG 濃縮分析を行った。L. reuteriのアクセサリーゲノムは、アミノ酸代謝と生合成に富むことがわかった（図1I、表S4-S6）。また、L. reuteriゲノム内のCOG要素のうち、トランスポーター、パーミアーゼ、ジペプチダーゼ、トリプトファンのプロセシングに関与する可能性のあるアミノトランスフェラーゼなどのアミノ酸輸送および分解に関わる遺伝子座の濃縮が示唆された（図1J、表S7）。これらのデータを総合すると、Lactobacillus分離株における代謝能の世界的な違いが示唆され、L. reuteri分離株ではアミノ酸の利用が促進されていることがわかった。

L. reuteriゲノムは、トリプトファンの異化を含むアミノ酸の生産と利用に関与する遺伝子に富んでいる
L. reuteriゲノムはトリプトファン代謝に関わる遺伝子に富んでいる可能性が示された。これは、乳酸菌の間で宿主の食物トリプトファンをインドール誘導体に異化するのに必要な機械が保存されていることが知られていることと一致する[59,60,61]。L. reuteriがこの機能を果たすのに必要な酵素をコードしているかどうかを調べるために、我々の乳酸菌のゲノムにコードされているトリプトファン利用に不可欠な既知の主要遺伝子座の有無と数を、(1) PATRICで公開されている182種類のLactobacillus代表ゲノム、 (2) 種ごとの高品質の完全参照ゲノム、 (3) それぞれの分離株の系統樹上隣接株のものと比較検討した。

細菌では、トリプトファナーゼ（TNA）、トリプトファンモノオキシゲナーゼ（TMO）、トリプトファンデカルボキシラーゼ（TrpD）、芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素（ArAT）というインドール経路の4大酵素がトリプトファンを直接基質に利用します（Fig. 2A）。その結果、すべてのLactobacillus参照ゲノムと私たちの分離株は、TNA、TMO、TrpDの明確なオルソログをコードしていないことがわかった。しかし、トリプトファンをインドール-3-ピルビン酸に変換するArATをコードする遺伝子座は、トリプトファンを基質として親和性が異なることが知られている幅広い酵素クラス（表S8-S14）として、Lactobacillus属間で広く保存されていた[92]。我々の各分離株は、系統的に最も近い隣人と比較して、アミノトランスフェラーゼの数とクラスの両方で広く類似しており、L. reuteriのゲノム内にコードされる数と種類がより多かった（図2B、Cおよび表S11〜S14）。さらに、L. reuteri分離株は、トリプトファン高親和性クラスのArAT（EC 2.6.1.1）に富み、L. murinusはこの酵素の低親和性変異体（E. C. 2.6.1.57 ）をコードする唯一の種だった（図2C、表 S10）。予測されるarata遺伝子座のmRNA発現プロファイルを評価するために、L. reuteriを1mMトリプトファン添加または無添加の脳心臓注入培地（BHI）で4時間または24時間培養し、qRT-PCRで解析した。1mM トリプトファン補給は、L. reuteri が小腸内で暴露されるのと同様の生理的関連濃度として選択された [93,94,95]。単培養の4時間後までに、6つの推定aratgenesのうち5つでトリプトファンに反応する強固な発現が観察され、これは24時間の時点でも持続した（図S2CとD）。発現レベルやトリプトファンへの反応の程度にはばらつきが見られたが、これらのデータはゲノム的に想定された機能的な遺伝子座がそのまま存在することを示している。

図2.
図2
L. reuteriゲノムは、トリプトファンの異化を含む、アミノ酸の生産と利用に関わる遺伝子に富んでいる。A 細菌および哺乳類のトリプトファン代謝の経路概略図。Lactobacillus単離株でゲノム上の証拠がある酵素は、オレンジ色（ArAT）、青色（FldH）、黄色（AmiE）で囲んである。B Lactobacillus単離株でゲノム上の証拠を持つ細菌トリプトファン特異的酵素のヒートマップ。酵素は、A の経路に対応する色で左側に沿ってリストアップし、上側に沿って分離株と同種の代表株を、暖色系はコピー数が増加することを示している。CとDには、それぞれArATとFldHのクラスごとに色分けされた遺伝子数がグラフ化されている。

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我々の知る限り、細菌のトリプトファン代謝に関わる他の酵素の大部分（図2A）は、乳酸菌についてこれまで詳細な特性評価がなされていない。インドールアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALD）とインドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ（IPDC）の存在を示すゲノム上の証拠は見つからず、Lactobacillus参照ゲノムの中でも保存状態が不安定である（表S15）。しかし、フェニル乳酸脱水素酵素（fldH）とインドールアセトアミドヒドロラーゼ（脂肪族アミダーゼE/amiE）については保存の証拠が見つかった（図2B、D、表S16とS17）。FldHはArATによって生成されたインドール-3-ピルビン酸に作用し、インドール乳酸を生成する（図2A）。クロストリジウム属で以前に報告された特異的なfldH遺伝子は、乳酸菌では注釈されていなかったが、同じ酵素委員会番号とクロス属グローバルファミリーの指定を受けた乳酸脱水素酵素は、L. murinusまたはL. johnsonii分離株および参照株と比較して、L. reuteri分離株に存在し濃縮されていた（図2B, D）。重要なことは、L. reuteriはfldHがaraTに直接隣接して見つかった唯一のゲノムであり（図S3）、他の2種ではそのままではない、L. reuteriの機能的代謝遺伝子群/オペロンの存在が示唆されたことである。さらに、Clostridial種で同定され特徴付けられたオリジナルのFldH酵素とのBLAST解析により[96]、L. reuteri分離体がコードするfldHとのカバー率〜98%、アミノ酸配列相同性〜40%と高い配列保存性が示された（表S16）。最後に、L. reuteriは、非AhRアゴニストであるインドール-3-アセトアミドを既知のAhRリガンドであるインドール-3-酢酸に変換する機能を有するAmiE（図2B、表S18およびS19）をコードする唯一の分離株であった。重要なことは、この酵素の上流基質であるインドール-3-アセトアミドを生成するTMOが保存されているというゲノム上の証拠がないことを考えると、amiEの存在は驚くべきものであったことである。これらのデータを総合すると、他の乳酸菌と比較して、我々の分離株を含むL. reuteriのゲノムは、宿主の食物トリプトファンをインドール誘導体に代謝するのに必要な遺伝子をより多く、より多様にコードしていることが示唆された。

L. reuteriは多種多様なトリプトファン由来代謝物を産生する
L. reuteriが多種類のトリプトファン由来代謝物を産生することを示すゲノム情報に基づき、L. reuteriがトリプトファン供給量の調節に反応して産生する代謝物のレパートリーをin vitroで直接評価しようと考えた。L. reuteriの単培養体を、超高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法（UPLC-MS/MS）（表S20）を介して代謝プロファイリングを行うために、1 mMのトリプトファンを補充したまたは補充しないBHI培地で嫌気性条件下で培養した（97）[表S20]。部分最小二乗法判別分析（PLS-DA）および基底BHI培地とL. reuteri単培養からの総代謝物のユークリッド距離による階層的クラスタリングにより、サンプルは個別のクラスタに分離し、トリプトファンの利用性に応じたL. reuteriによる代謝物生産の差が示された（図S4A、Bおよび表S21）。

L. reuteriが生産するトリプトファン異化物のレパートリーを直接評価するため、トリプトファン経路に関連する哺乳類および細菌産物に限定して解析を行った（図3A）。ArAT酵素をコードする遺伝子座の存在を示すゲノム証拠（図2B、C）に基づき、乳酸菌特異的トリプトファン代謝の第一段階および速度制限段階として、トリプトファン依存的にインドール-3-ピルビン酸が増加することを観察すると予想された（図3B）。インドール-3-ピルビン酸はどのサンプルからも検出されなかったが、これはおそらくこの代謝物がインドール経路の2つの主要な分岐に速やかに振り分けられ（図3A）、インドール-3-乳酸またはインドール-3-アセトアルデヒドのどちらかを生成するためであろう。この概念と一致し、D-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子の存在（図2BおよびD）により、L. reuteri培養液はインドール-3-乳酸を多く含み、トリプトファンの補充によりさらに増加した（図3B、Eおよび表S22）。同様に、L. reuteriゲノムにおけるAmiE酵素の保存状態（図2B）と一致し、トリプトファン依存的にインドール-3-アセテート量が増加した（図3B、F、および表S22）。驚くべきことに、L. reuteriは、基礎培地と比較して有意なレベルでトリプタミンを生成した（図3B、G、表S22）。トリプトファンをトリプタミンに異化する脱炭酸酵素を確信をもって同定することはできなかったが[58]、L. reuteriのゲノム内に、この機能を果たす既知のClostridial identified decarboxylaseと約40％の配列相同性を有する酵素を一つ発見した（表S16およびS17）。さらに、L. reuteriのトリプトファン依存的なインドール-3-グリオキシル酸とインドール-3-アルデヒドの生産も観察された（図3A、B、H、Iおよび表S22）、前者は他の属では証拠があるが、乳酸菌ではこれまで報告されていない[98]。驚くべきことに、L. reuteriの存在によってトリプトファンのレベルもわずかに上昇した（図3B、Dおよび表S22）。これは、トリプトファンの異化に加え、この種がこのアミノ酸を容易にデノボ合成できることを示唆している。

図3
図3
L. reuteriは、免疫系を調節することが知られているトリプトファン由来の代謝物を幅広く産生する。A 細菌および哺乳類のトリプトファン代謝の経路概略図。Lactobacillus単離株でゲノム上の証拠がある酵素をオレンジ色（ArAT）、青色（FldH）、黄色（AmiE）で囲み、L. reuteri単培養で生産される代謝物を赤で示した。1mMトリプトファン添加の有無にかかわらず、培地のみのコントロール（グループあたりn=3）と比較して、モノカルチャー（グループあたりn=2）においてL. reuteriによって有意に調節された細菌（B）および哺乳類（C）トリプトファン代謝物のヒートマップ（p<0.05）ここで暖かい色は相対存在度の増加を示している。対応する存在量プロファイルはD-Lに示されている。

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典型的な哺乳類」トリプトファン代謝物は、L. reuteriの単培養では生成または変化しないと予想されたが、いくつかの代謝物は基底培地のみと比較して変化していた。L. reuteriの培養液は、N-アセチルトリプトファンの蓄積によって特徴付けられた（図3C、Jおよび表S22）。さらに、キヌレニンは基底培地中にかなりのレベルで存在したが、L. reuteriはこの代謝物を積極的に枯渇させているように見えた（図3C、K、表S22）。一方、L. reuteriの培養液は、基底培地がキヌレン酸をほとんど含まないのに対し、トリプトファン依存的にキヌレン酸を蓄積した（図3C、L、および表S22）。ゲノムデータと合わせて、私たちのメタボローム解析は、L. reuteriが新規および既知のトリプトファン由来代謝物の多様なプロファイルを生成できることを示し、この細菌が宿主キヌレニン経路と競合する可能性を示唆している。

トリプトファンの利用可能性は、微生物叢依存的にCNS自己免疫を調節する
トリプトファン利用能力におけるゲノムおよびメタボローム上の濃縮（図2および3）が、L. reuteri依存性のCNS自己免疫の悪化に直接関与しているかどうかを調べるために、我々は以前に確立した腸内細菌叢移植および垂直伝播モデル［87］を活用した。このモデルでは、目的の乳酸菌種を含む、または含まない、3つの異なる微生物叢構成でコロニー化した遺伝的に同一のマウスホストを作成し、食事のトリプトファンレベルの操作と組み合わせた（図4A、Bに模式的にまとめた）。具体的には、無菌（GF）B6マウスに、（1）B6腸内細菌叢（B6→B6-GF、L. murinusとL. johnsoniiを自然に保有）、（2）B6腸内細菌叢に109 CFU L. reuteri（B6+L.）を補充してコロニー形成させた（B6→B6-GF、L. johnsoniiとL. reuteriを添加したB6腸内微生物叢）。 reuteri→B6-GF）、（3）同じくB6腸内細菌叢と比較してEAEを悪化させた凍結保存PWD腸内細菌叢（PWD→B6-GF、L. reuteriとL. johnsoniiを自然に保有）［87］が挙げられる。コロニー形成された元GFマウスを使用して、G0（世代ゼロ）繁殖ペアを確立し、その子孫（G1）に微生物叢を垂直に受け渡すようにした。得られたG1子孫は、EAE誘発の1週間前に0.02％（低）または0.8％（高）のトリプトファン食のいずれかに無作為化され、実験終了までこれらの食で継続的に維持された。EAEは、以前に記載されたように、MOG35-55による免疫化によって誘導された[87]。高レベルの食事性トリプトファンの存在下で、B6微生物叢にL.ロイテリを導入すると、B6ベースライン微生物叢と比較してEAEが悪化し（図4C、E）、通常のトリプトファン補充食の状況における我々の以前の知見を再現した[87]。重要なのは、トリプトファン制限食は、L.ロイテリのEAE悪化能力を無効にしたことである。低トリプトファン食でB6微生物叢を保有するマウスとB6＋L.ロイテリ微生物叢との間でEAE重症度に差がなく、両方の微生物叢構成でEAEがほぼ完全に抑制された（図4D, E）。一方、PWD微生物叢を保有するマウスは、高または低食餌トリプトファン存在下でB6微生物叢を保有するマウスよりも有意に高いEAE重症度を示し（図4F-H）、PWD微生物叢がトリプトファンとは独立してEAEを増強することができることが示唆された。糞便サンプル中のL.ロイテリ存在量の測定は、個々のL.ロイテリコロニー化マウス全体のL.ロイテリ存在量が疾患の重症度と強く相関しない一方で、高トリプトファン食を与えたマウスは食事介入の経過を通じてL.ロイテリ存在量を高く維持した（Fig. S5）。これらのデータは、トリプトファンの枯渇が中枢神経系の自己免疫を抑制すること、そしてトリプトファン依存性のEAE発症がL. reuteriと因果関係があることを初めて示している。

図4
図4
トリプトファンの利用可能性は、マイクロバイオータ依存的にCNS自己免疫を調節する。Aマイクロバイオーム移植と食餌性トリプトファン調節モデルの模式図。B6→B6-GF（n=38）、B6+L. reuteri→B6-GF（n=37）、またはPWD→B6-GF（n=22）と表記し、垂直感染モデルのG0交配ペアとしてB6、B6+L. reuteriまたはPWD腸管マイクロバイオータ移植を受けた無胚芽マウスを使用した。子孫はEAE誘発の1週間前に低トリプトファン食（0.02％）または高トリプトファン食（0.8％）にランダム化し、ナイーブおよびEAE後のマウスから血清を採取した（B）。C-H EAEは、毎日の平均臨床スコアとして反映された元GF GMTレシピエントで評価され、全体の有意性はFriedmanのノンパラメトリック二元配置ANOVAと曲線下面積（AUC）の一元配置ANOVAによって決定された。

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トリプトファンは、食事および微生物叢に依存した明確なメカニズムで、中枢神経系に浸潤する免疫細胞集団を変化させる
L. reuteriおよびトリプトファン依存的なEAEの増悪に関連する細胞メカニズムを明らかにするために、トリプトファン低食または高食でB6マイクロバイオータまたはB6+L. reuteriマイクロバイオータを保有する疾患マウスの脊髄に浸潤する免疫細胞のフローサイトメトリーを用いて解析した。食餌介入による表現型の変化は2つのカテゴリーに分類された。L. reuteri依存型とL. reuteri非依存型である。L. reuteriに依存しない変化には、L. reuteriの存在に関係なく、トリプトファン枯渇に反応して脊髄の総CD45+CD11b-白血球、ならびにTCRβ+、CD4+およびCD8+ T細胞の割合および数の顕著な減少が含まれた（図5B-I）。IL-17およびIFNγを産生するCD4+ T細胞の数も、サイトカインを産生するCD4+ T細胞の頻度には有意な影響がなかったが、低トリプトファンでは減少した（Fig. 5J-M）。一方、L. reuteriのコロニー形成は、高い食餌性トリプトファンの存在下で、TCRγδ細胞の数および頻度、ならびにIL-17の産生を上昇させた（図5N-P）。一方、TCRγδ細胞によるIFNγの産生は、逆の傾向を示した（図5Q）。これらのデータは、トリプトファンの制限によって中枢神経系における脳原性リンパ球の蓄積が全体的に減少し、EAE症状の抑制と相関する一方で、トリプトファンを多く含む食事は、従来とは異なる細胞メカニズムを通じてマイクロバイオータ依存的に中枢神経系の自己免疫を増強し、潜在的に非従来型のT細胞サブセットが関与することを示唆している。

図5
図5
トリプトファンは、食事および微生物に依存する明確なメカニズムによって、CNS浸潤免疫細胞集団を変化させる。B6またはB6+L. reuteri細菌を保有する元GF GMTレシピエントを低トリプトファン食または高トリプトファン食にランダム化して、EAE発症30日後にCNS浸潤白血球を分離しフローサイトメトリーで解析した（A）（図4C-E）。B、C）総CD45+HighCD11b-集団の数および頻度、D、E TCRb+、F、G CD4+ 、H、I CD8+T細胞、J、K CD4+ IL17およびL、M IFNγを含む食事単独の主要な効果。TCRγδT細胞（N、O）および表示サイトカイン陽性細胞（P、Q）におけるL. reuteriとトリプトファン依存性免疫学的反応

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食事によるトリプトファンの摂取は、全身の宿主および細菌の代謝産物を大きく変化させる
トリプトファン制限がin vivoの全身代謝プロファイルに及ぼすグローバルな影響を決定するために、30日間のEAE疾患経過の後、低トリプトファン食または高トリプトファン食を与えたマウスから血清を採取し、UPLC-MS／MSを介して分析した（図4B、表S23及びS24並びに図S6）。データは、食事のみによる変化を明確に分析するために、微生物叢（B6およびB6+L. reuteri）とは無関係にプールされた。PLS-DA解析では、成分1に沿って食餌による明確な分離が見られ、全分散の約20%を占めた（図6A）。成分1に沿ったPLS-DA投影で上位15代謝物を重要変数（VIP）として抽出すると（表S25）、L. reuteriが単培養で生産する多数の細菌性インドールなど、予想通りのトリプトファン関連代謝物が明らかになりました（図3B-Lおよび図6B）。さらに、N-アセチル-キヌレニンやN-アセチル-トリプトファン（Fig. 6B）、トリプトファン依存的なp-クレゾール硫酸の顕著な増加など、古典的な哺乳類のトリプトファン代謝物が多数観察された。同様の結果は、低トリプトファン食と高トリプトファン食を与えたマウスの間で直接倍数変化を解析し、volcano plot（図6Cおよび表S26）またはヒートマップ（図6C、D、表S27、S28）として表した。全身のトリプトファン関連代謝物の変化に加えて、低トリプトファン食を与えたマウスは、4-コレステン-3-オン、ヒポタウリン、ウルゼドキシコール酸、および6-β-ヒドロキシリトコール酸などの胆汁酸関連代謝物が増加した（図6E-Hおよび8B）。注目すべきは、低トリプトファン食用マウスにおける共役胆汁酸と二次胆汁酸の増加は、L. reuteriに依存するように見えたことである（図6F-H）。さらに、低トリプトファン食を与えたマウスは、N1-メチル-4-ピリドン-3-カルボキサミド、N1-メチル-2-ピリドン-5-カルボキシミドおよびニコチンアミド自体を含む循環ニコチンアミドも枯渇した（図6C、I、Jおよび表S26）、トリプトファンはニコチンアミド合成の前駆体としての役割と一致していた [99]．まとめると、低トリプトファン食によるEAEの抑制は、ニコチンアミド代謝の減少及び胆汁酸の増加を伴う細菌及び哺乳類の両方のトリプトファン代謝物の顕著な減少によって特徴付けられる。

図6
図6
食餌性トリプトファンの利用可能性は、全身の循環宿主および細菌代謝産物を変化させる。30日間のEAE経過後、B6またはB6+L.ロイテリ微生物群にコロニー形成した低トリプトファンまたは高トリプトファン食を与えたマウスから血清を採取し、図4A、Bに概要を示すようにUPLC-MS/MSを介して分析した。データは、食事のみの効果を強調するために、微生物叢とは無関係に分析された。A 総代謝物の部分最小二乗法-判別分析（PLS-DA）。B 成分1に沿ったPLS-DA投影（VIP）において重要な変数として上位15代謝物。C｜FoldChange｜>1.5およびP<0.05の閾値を通過した、異なる量の代謝物のボルケーノプロット。正のfold-changeは、より高いEAE重症度を示す高トリプトファン食用マウスにおいてより高い存在量を示す（Fig.4）。一元配置分散分析による、細菌（C）および哺乳類（D）のトリプトファン関連代謝物の異なる存在比のヒートマップ。胆汁酸（E-H）およびニコチンアミド関連（I, J）のフィッシャーLSDによるポストホック解析は、対数変換および平均中心存在量プロットで表される。

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芳香族クレゾールは、L. reuteriトリプトファン依存性の自己免疫素因亢進のマーカーである
次に、L. reuteriによる代謝の変化が、食事性トリプトファンの存在下でどのように自己免疫素因につながるかを理解しようとした（図4C-E）。この疑問に答えるため、UPLC-MS/MSを用いて、B6対照微生物叢またはB6+L.reuteri微生物叢でコロニー形成したマウスの血清代謝物を2つの異なる時点で分析した：（1）EAE誘導直前の1週間の食事介入後（ナイーブ；図7）、（2）EAE誘導後30日および合計5週間の食事介入時（図8）。ナイーブマウスでは、PLS-DA解析により、低トリプトファン食と高トリプトファン食の両方で、L. reuteriの存在に基づくサンプルクラスタリングが認められた（図7A, C）。しかし、L. reuteriの存在は、食餌に依存する明確な代謝プロファイルと関連していた（図7B、D、表S29およびS30）。注目すべきは、トリプトファンを制限した条件下でさえ、L. reuteriの存在は、インドールプロピオン酸のレベルを上昇させるのに十分であった（Fig. 7B）ことである。L. reuteriのアミノ酸代謝に関する高いゲノムポテンシャル（細菌のジペプチダーゼおよびトランスペプチダーゼの濃縮を含む）と一致し（図1Jおよび表S7）、L. reuteriの存在は、不飽和長鎖脂肪酸の減少とともに、グルタミン含有ジペプチドの上昇によっても特徴的であった（図7B）。重要なことは、L. reuteriのコロニー形成により、トリプトファンの利用可能性が増加すると、クレゾールを含む代謝物、p-クレゾール硫酸およびp-クレゾールグルクロニドが著しく増加したことである（図7D-F）。興味深いことに、両クレゾールの存在量は、30日間にわたる毎日のEAEスコアの合計である累積疾患スコアとして表される疾患の重症度とも相関していた（図S7および表S31）。神経毒性を持ち、MS患者の脳脊髄液内でレベルが上昇しているという最近の報告から、これらの細菌由来の代謝物は特に注目された[100]。L. reuteri自体がクレゾールを生成できるかどうかを判断するために、細菌の単培養データを活用して、その存在を具体的に評価しました。実際、L. reuteriはp-クレゾール硫酸塩とp-クレゾールグルクロニドの両方を生成し、前者はトリプトファン依存的に蓄積することがわかった（図7F）。以上のことから、L. reuteriはナイーブマウスにおいて循環代謝物のレベルを調節し、トリプトファン依存的なクレゾール代謝物の増加は、その後の疾患病態の亢進のマーカーとなることが明らかとなった。

図7
図7
芳香族クレゾールは、L. reuteriトリプトファン依存性の自己免疫素因亢進のマーカーである。B6またはB6+L. reuteri微生物叢を植え付けた低トリプトファンまたは高トリプトファン食を与えたナイーブマウスから血清を採取し、図4A、BのようにUPLC-MS/MSで分析した。低トリプトファン食マウス（A、B）または高トリプトファン食マウス（C、D）において、｜FoldChange｜>1.5 および P<0.05 の閾値を通過した、異なる豊富な代謝物の部分最小二乗-判別分析（PLS-DA）および火山噴火プロット。血清（E）またはL. reuteri単培養（F）中の芳香族クレゾールのフィッシャーのLSDを用いたポストホック分析は、対数変換および平均中心存在量プロットで表される

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図8
図8
哺乳類と新規L. reuteriトリプトファン代謝産物間の不均衡は、自己免疫の亢進と関連している。30日間のEAE経過後にB6またはB6+L.reuteri微生物叢のいずれかでコロニー形成した低トリプトファンまたは高トリプトファン食を与えたマウスから血清を採取し、図4A、Bに概要を示すようにUPLC-MS/MSを介して分析した。部分最小二乗判別分析（PLS-DA）およびボルケーノプロットにより、低トリプトファン負荷マウス（A、B）または高トリプトファン負荷マウス（C、D）で｜FoldChange｜>1.5およびP<0.05の閾値を通過した、有意に豊富な代謝産物の図。高トリプトファン摂取マウス（E）またはL. reuteri単培養体（F）の血清中に豊富に含まれるイミダゾールの差のヒートマップ。血清中のイミダゾール（G-J）、インドキシルグルクロニド（L）、N-アセチルキヌレニン（M）のFisherのLSDによるポストホック解析は、対数変換および平均中心存在量プロットで表される。

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哺乳類と新規L. reuteriのトリプトファン代謝物の間のアンバランスは、自己免疫の亢進と関連している
次に、L. reuteriによるトリプトファン依存的なEAEの増悪に関連する代謝的変化を明らかにするために、高トリプトファン食または低トリプトファン食を合計5週間与えたマウスの30日間のEAE全経過後のL. reuteriコロニー化の代謝的影響を評価した。トリプトファン非添加の場合、L. reuteriが定着したマウスと対照マウスのEAE重症度はほぼ同じであったが（図4C）、低トリプトファン食を与えたマウスは、循環代謝物のレベルに基づいて微生物群に依存した固有のクラスタに分離した（図8A）。フォールドチェンジ分析により、トリプトファン枯渇のグローバルな効果（図6B、C）を反映して、グルタミン酸ジペプチドと胆汁酸のタウロキノデオキシコール酸、タウロウルソデオキシコール酸、コール酸が減少し、L. reuteri完全菌体ではSCFAs、ブチレート、イソバレートの増加（図8B）していた（表S32）。

低トリプトファン食と同様に、高トリプトファン食マウスのサンプルにおける循環代謝産物のレベルに基づくクラスタリングでは、L. reuteriの存在によって明確に分離された（図8C）。高トリプトファン負荷マウスにおいて、L. reuteriは、ホルミノグルタミン酸およびγ-グルタミルヒスチジン、ならびにトリプトファン代謝物インドキシルグルクロニド、およびアセチル化キヌレニンを含むヒスチジン関連代謝物の減少を促し、カルニチン共役長鎖脂肪酸およびスフィンゴミリンまたはスフィンゴシン含有代謝物の増加をもたらした（図8C、L-M）。細菌TNA由来のインドールの肝臓代謝物であるインドキシルグルクロニドの減少は、L. reuteriによってトリプトファンが腸内細菌叢の他の構成要素から隔離されたことを示唆している。同様に、アセチル化キヌレニンの枯渇は、トリプトファンに対する宿主との競争を示しており、L. reuteriは、バランスを細菌代謝物の方に、哺乳類キヌレニン経路から離れるように積極的にシフトさせた（表S33）。さらに、L. reuteriは、様々なイミダゾール含有代謝物をトリプトファン依存的に著しく増加させた（図8D、E、G〜Jおよび表S34）。細菌の単培養物を調べたところ、L. reuteriもin vitroで類似のイミダゾールを幅広く生産しており、そのうちの2つ（イミダゾールプロピオン酸および1-メチル-5-イミダゾール酢酸）はトリプトファンの添加により生産が増強された（図8F）。これらのデータから、L. reuteriによる自己免疫の増強は、新規トリプトファン由来イミダゾールの上昇と関連しており、インドキシルおよび哺乳類キヌレニン代謝物の減少が見られることが確認された。.

L. reuteri代謝産物は、in vitroでアリール炭化水素受容体を活性化し、T細胞によるIL-17産生を増大させる
L. reuteri単培養物およびL. reuteri定着マウスの血清のプロファイリングで同定された代謝物がAhRのリガンドとして機能するかどうかを調べるために、ルシフェラーゼ発現とリガンド依存性のAhR活性化を結びつける細胞ベースのレポーターアッセイを活用した。合計 15 種類の代謝物を選択し、1μM、10μM、または 100μM で、AhR 拮抗薬 CH-223191 とともに、あるいはなしで処理した。試験したすべてのインドール誘導体は、濃度依存的にAhRを活性化した（図9A、Bおよび図S8）。興味深いことに、L. reuteriの新規トリプトファン代謝物であるトリプタミンとインドール-3-グリオキシル酸は、最も強力にAhR活性化を誘導した。さらに、インドール-3-グリオキシル酸はAhRアンタゴニストに対する反応が最も小さく（図9C）、これは受容体への高い親和性結合、細胞膜を介した拡散の促進、またはAhRアゴニストCH-223181による阻害に対する感度の差を示唆している [101]-L. reuteriの4つの代謝物のうち、インドール-3-グリオキシル酸はAhRアンタゴニストへの反応が最も小さい。L. reuteri が生産した 4 種類のイミダゾールのうち、1-メチル-4 イミダゾールアセテートのアゴニストとしての機能は、以前に AhR を活性化することが立証された Lactobacillus 特有の代謝物であるインドール-3-アセテート（図 9A, B）に匹敵した [59]（Fig. 2）。驚くべきことに、5-アミノイミダゾール-4-カルボキサミド、4-イミダゾールアセテート、およびp-クレゾール硫酸は、ベースラインのAhR活性（おそらく培養液に存在するリガンドによるAhRの活性化）を阻害した（図9A、B）。これはL. reuteri産生の代謝物による受容体活性の複雑な制御を示唆する。L. reuteri は、高親和性結合リガンドを含む、免疫調節型 AhR のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能する能力を持つトリプトファン由来の代謝物を幅広く生産している。

図9
図9
L. reuteri代謝産物は、アリール炭化水素受容体のリガンドであり、Th17免疫応答を引き起こすのに十分である。L. reuteri 単培養または血清の UPLC-MS/MS で同定された選択した代謝物を、細胞ベースのルシフェラーゼアッセイで、A 10μM および B 100μM の処理で各代謝物の AhR を活性化する能力について分析した。各代謝物によるAhR活性化の阻害率は、100μMでの最大ルシフェラーゼ反応とAhRアンタゴニストであるCH-223191で4時間前処理した後の活性との間で計算された（C）。脾臓細胞は、IGoxA、IAA、および/またはAhRアンタゴニスト処理の有無にかかわらず、Th17条件下で分化させ、その後、細胞内サイトカイン染色とフローサイトメトリーにより解析した。代謝物処理の主な効果は、全CD45+Live集団のCD4+ T細胞の頻度（D）、CD4+ T細胞におけるIL-17産生の割合（E）、全CD45+Live集団のCD8+ T細胞の頻度（F）、CD8+ T細胞におけるIL-17産生の割合（G）であった。記号は、以下のように0μM処理と示された代謝物濃度との間の有意差を示す、*, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; ****, P < 0.0001. 結果は、各条件につき少なくとも(3)テクニカルリプリケートを含む。

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L. reuteri産生代謝物によるAhR活性化の免疫学的影響を明らかにするために、細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリーにより評価した、リンパ球のTh17分極に対する選択した代謝物の効果を調べた（図9D-Gおよび図S9）。インドール-3-グリオキシル酸処理は、培養中のCD8+ T細胞を犠牲にしてCD4+ T細胞の適度な拡大を促し（図9D）、CD4+およびCD8+ T細胞の両方におけるIL-17産生の強固な濃度依存性の増加を伴っていた（図9E）。対照的に、比較的弱いAhR活性化剤であるインドール-3-アセテートは、CD4+ T細胞数およびCD4+とCD8+細胞の両方のIL-17産生を減少させた（図9F, G）。さらに、IL-17産生は、AhRアンタゴニストであるCH-223191での処理によって阻害され（図9E、G）、両方の代謝物に対するAhR依存性の応答が確認された。注目すべきは、CH-223191がインドール添加とは無関係にIL-17産生を低いベースラインまで抑制したことであり、以前に報告されたように、細胞培養液に存在するリガンドによるAhR活性化の抑制を表していると考えられる（図9E、G）[102]。これらのデータを総合すると、異なるインドール誘導体によるAhR活性化は、非常にリガンド特異的な方法でIL-17産生を増大させることができることが実証された。

考察
腸内細菌は、関節リウマチや全身性エリテマトーデスから炎症性腸疾患や多発性硬化症に至るまで、様々な自己免疫疾患に関与していることが示唆されている。この事実にもかかわらず、腸内細菌群集構造の変化を特徴づける相関的研究から、個々の生物種と疾患の擾乱との因果関係を明らかにする機構的研究へと移行することは、依然として困難な課題となっています。私たちや他の研究者は、腸内細菌叢の単一種であるL. reuteriが、常在コロニー化の文脈で自己免疫の増悪と関連していることを示した [86, 87, 103]。興味深いことに、L. reuteriは、プロバイオティクスとして毎日投与すると、CNS自己免疫を改善することも示された[61, 104, 105]。このように、異なる知見を機構的に調和させる必要性は、腸内細菌叢の研究における現在の課題を浮き彫りにし、宿主と腸内細菌叢の間の文脈特異的相互作用を解明するために、ゲノムおよびメタボロミクス手法を取り入れた統合的「オミックス」分析の必要性を示唆するものであった。そのため、マルチオミクス的アプローチを用いて、L. reuteriによる自己免疫の増強は、宿主の食事性トリプトファンの利用可能性によって機構的に駆動されること、宿主の免疫反応を再構築し、ユニークな血清メタボロームシグネチャーを付与することを明らかにした。さらに、L. reuteriの詳細なゲノムおよびメタボローム研究を通じて、細菌と宿主のトリプトファン代謝の相互関係のニュアンスを明らかにし、EAE/MSの病態に影響を与える可能性のある新規トリプトファン依存性代謝物を幅広く同定しました。

乳酸菌のトリプトファン代謝は、主にインドールピルビン酸経路で行われると考えられており、免疫調節作用のあるインドール誘導体が多数生成されます。しかし、この経路に関与する主要な酵素の保存に関する直接的な証拠は乏しく、しばしば他の細菌属における実験的な特徴づけに依存している[92, 96, 106, 107]。ここでは、L. reuteriのトリプトファン経路の広範なゲノム特性を明らかにし、多様な酵素ファミリーとしてのArATの存在を確認する。これまでの研究で、L. reuteriによるArAT駆動のインドール生産は、AhR駆動のIL-22生産を通じて粘膜免疫のバランスをとるために重要であることが示されている[59]。しかし、arAT遺伝子座の1つを不活性化しても、AhRの直接的な活性化能は変化しない[108]。1つの可能な説明は、乳酸菌における我々のデータで例示されたArATのゲノムの冗長性と、以前に大腸菌で同定されたもので、その機能的影響はさらなる実験的探求が必要である [92, 107]。さらに、我々は細菌のトリプトファン経路において、ArATの下流に3つの重要な酵素、FldH、AmiE、そしておそらくTrpDを同定した。後者の存在は、L. reuteriの単培養データによるトリプタミン生産と、Clostridium sporogenesで同定された既知の酵素と約40%の配列相同性を持つゲノム証拠によって裏付けられている[96]。さらに、L. reuteriによるAmiEの保存は、これまで報告されていない。AmiEのようなインドール経路の中間酵素をコードしていることは、L. reuteriが腸内細菌群の他の構成要素と協調して免疫調節性のインドールを生産している可能性を示している。これらのデータを総合すると、アノテーションに基づく酵素同定に依存することの固有の欠陥が浮き彫りになり、ゲノムに基づく予測を実証するメタボローム解析の重要性が強調されるとともに、乳酸菌全般においてこれらの酵素ステップが保存されていることが一般に認められているにもかかわらず、これらの経路を正式に検証する必要性が強調されている。さらに、単一の細菌種内であっても、菌株間の遺伝的差異を考慮する必要がある[109]が、我々のデータ（図2B）は、主要なトリプトファン代謝酵素の存在が、L. reuteriのほとんどの菌株間で保存されていることを示唆している。

我々のデータは、やや意外なことに、食餌性トリプトファンの枯渇がEAEの重症度を強く抑制することを実証している。単一のランダム化比較試験で、MS患者コホートにおけるトリプトファン補給の効果を直接評価した［110］。記憶の改善が観察されたが、この研究は、特に疾患活動性（障害スコア、再発率、MRI）を評価するように設計されていなかった [110]。しかしながら、3つの先行研究は、EAEマウスモデルにおけるCNS自己免疫における食物トリプトファンの役割を特徴付けた[111,112,113]。Lanzらは、標準的なEAEコースの疾患発症の直前から、トリプトファンを毎日経口投与した[112]。これはトリプトファンの血中濃度を上げるには十分であったが、最終的には病態に影響を与えなかった[112]。逆に、EAE22日目からのトリプトファン欠乏食は、疾患を悪化させ、その表現型は、トリプトファンの補充によって救済され得る[113]。私たちの研究と同様の食餌発明モデルにおいて、Sonnerらは、トリプトファン欠乏食またはトリプトファン〜0.3％を含む通常食のいずれかを、疾患誘発の1〜2週間前から疾患経過の終わりまでマウスに与え、飼料中のトリプトファンを直接調節した。私たちのデータと同様に、トリプトファンを制限すると、EAEの発症は完全に停止しました。さらに、トリプトファン制限とEAE抑制の間に乳酸菌の枯渇を含む腸内細菌叢の幅広いシフトが観察され、この観察は、L. reuteriトリプトファン依存性のCNS自己免疫の増強に関連する私たちの研究と関連するものであった。興味深いことに、トリプトファンの枯渇は、全身性エリテマトーデスやコラーゲン誘発関節炎を含む他の自己免疫モデルにおける疾患を改善した[114,115,116]。重要なことは、これまでの研究では、トリプトファン存在下での自己免疫の増強に関連する原因腸内細菌種を特定することができなかったことである。したがって、これらの研究におけるトリプトファン調節の結果の相違は、我々の研究におけるB6、B6+L. reuteriおよびPWD微生物群コロニー化マウスの場合と同様に、部分的に微生物群に起因している可能性が高い（Fig. 4）。このことは、PWD微生物叢を導入したマウスではトリプトファン制限の抑制効果が低下していることに示されている。おそらく、中枢神経系自己免疫を悪化させるのにトリプトファンを必要としない種が存在するためであろう。さらに、L. reuteriが存在するPWD微生物叢とB6+L. reuteri微生物叢の間でトリプトファン制限に対する反応が異なることから、モノコロニーゼーション研究固有の限界（すなわち、微生物叢全体の状況を考慮できない）が強調されることになった。これらのデータを総合すると、おそらく最も重要なことは、腸内細菌叢由来のトリプトファン代謝物の影響は、疾患の進行よりもむしろ疾患感受性という文脈で主に機能することが示唆されることである。

MS患者においてトリプトファンを直接操作するための食事介入は十分に検討されていないが、細菌および宿主のトリプトファン代謝物のプロファイリングはかなり広範囲にわたって行われている。コホート間の所見はしばしば異なるが、脳脊髄液中の神経保護性キヌレン酸のレベルは、おそらく代償機構として疾患活動中に上昇し、寛解中に低下することが複数の研究で観察されている [36,37,38,51] 。キヌレン酸は血液脳関門を通過できないため、CNSのレベルは末梢のキヌレニンの能動輸送に依存する。したがって、L. reuteriによってキヌレニン／アセチル化キヌレニンが活発に枯渇し、キヌレネートが優先されることが観察された（図3C、K、Lおよび8M）ことから、CNSにおける神経保護レベルが低下することは十分にあり得ることである。キヌレニンからキヌレン酸への変換は主に哺乳類宿主に関連しており、したがってL. reuteriの単培養という文脈では驚くべき発見だったが、細菌や酵母におけるいくつかの証拠は、このプロセスがより広く保存されている可能性を示唆している[117, 118]。インドール-3-アセテートおよびインドールプロピオン酸を含む細菌性インドールは、それぞれ二次進行性および再発寛解性MSで増加している[31, 33]。このように、我々の研究では、食事によるトリプトファン枯渇によるEAE抑制は、広範囲の細菌性インドールおよび宿主由来の哺乳類トリプトファン代謝物の減少に関連していた（図6）。しかし、in vitroでは既知および新規の様々なインドールを産生するにもかかわらず、L. reuteriによるコロニー形成（正常な微生物叢との関連）では、EAE30日目までにこれらの代謝物の血清レベルの測定可能な増加を誘発することができなかった。興味深いことに、低トリプトファン食のマウスでは、L. reuteriは、この種を補充したマウスまたは欠損したマウスで同様のEAE抑制にもかかわらず、血清インドールプロピオン酸を増加させるのに十分であった。さらに、インドールに構造的に関連する様々なトリプトファン依存性代謝物が、自己免疫増悪の状況下でL. reuteriによって調節された。最近の2件の研究では、神経毒性を持つクレゾールがMS患者で増加していることが判明し、この観察は私たちのデータでも繰り返されています[63, 100]。我々の研究では、p-クレゾール硫酸塩とグルクロニドの両方がトリプトファン依存的に上昇し、MS患者の研究と同様に、これらの代謝物が自己免疫の亢進と相関していることを示唆している（Fig.6C）。さらに、L. reuteriは単培養で両方の代謝物を直接生産し、硫酸誘導体の上昇はトリプトファン依存的に起こることがわかった(Fig. 7F)。このデータは、ナイーブマウスの血清中のp-クレゾール硫酸がL. reuteriとトリプトファン依存的に上昇したことからも裏付けられる（Fig. 7E）。このことは、クレゾール量の変化が疾患の発症に先行している可能性を示唆しており、ヒト集団で検証すべき興味深い仮説である。興味深いことに、前述の2つの研究のうちの1つでは、イミダゾール誘導体もMSと対照群の間で存在量に差があったが、その方向性の変化は我々の研究とは矛盾していた[63]。重要なことは、L. reuteriの単培養で生産されたイミダゾール誘導体と、生体内の高食餌トリプトファンの状況下で全身的に調節された誘導体の間に高い重複が見られたことである（図8E-J）。さらに、今回調べた特定の新規イミダゾールは、これまでAhRを調節することが知られていなかったが、イミダゾールによる正規のAhR依存性CYP1Aまたは非正規の免疫調節性CYP1A活性化を示唆する証拠がいくつか存在する[119, 120]。さらに、TCDD誘発のAhR活性化に対抗するイミダゾール誘導体のアンタゴニスト活性の証拠 [121] は、この代謝物クラスがAhRの活性化剤または阻害剤のいずれかとして機能することを示しており、これは我々の知見と一致する（図9A-C）。最近のMS患者のメタボロームデータと合わせると、これらのデータは、イミダゾールがL. reuteriを含む腸内細菌叢の構成要素によって生成されるAhR調節代謝物の新しいクラスであり、特定の誘導体はおそらく多様な免疫調節機能を持つことを示唆している。トリプトファンによる中枢神経系の自己免疫制御は、インドールやキヌレニンなどの古典的なトリプトファン関連代謝物や、L. reuteriが直接生産する新規クレゾールやイミダゾールの生体内での存在量の変化によって特徴づけられる。

乳酸菌特異的な代謝産物によるAhR活性化は、有益な免疫学的結果を引き出すものとして広く特徴づけられてきた。EAEでは、インドールは、ミクログリアまたはアストロサイトにおけるAhR活性化を介して抗炎症効果を発揮することが提案されており、L. reuteriの豊富さと相関している[122, 123]。L. reuteriが産生するインドール-3-アルデヒドは、AhR依存性のIL-22産生を介して粘膜免疫も強化する[59]。重要なことは、EAEモデルにおいて、AhR活性化は、FICZが疾患を悪化させ、TCDDとトリプタミンが疾患を改善するというリガンド特異的な方法で、分岐した方向にCNS自己免疫を調節することができることである［124,125,126］。興味深いことに、FICZはTCDDよりもAhRへの結合親和性が高いにもかかわらず、急速に代謝されるため、活性化の強さと持続時間の両方が免疫学的結果に重要であることを示唆している。In vitroでは、AhRはT細胞におけるIL-17の最大産生に必要であり [102, 125, 127] 、TCDDとFICZはともにTh17分化を促進する。インドール-3-ラクテートは、EAEの脾臓および脊髄におけるCD4+ IL-17産生の減少と相関して、in vitroでのTh17分化を減少させるが [61]、キヌレニンによるAhRの活性化はTregの生成をサポートしている [128]。ここで、我々は、L. reuteri依存性代謝物の幅広い配列がAhRのアゴニストまたはアンタゴニストとして機能し、強いAhR活性化剤であるIGoxAがCD4+ T細胞およびIL-17産生の維持を強固に支持する一方、弱いAhR活性化剤であるIAAが抑制効果を示すことを示した（Fig. 9G）。AhRシグナル伝達の多様な結果をもたらす正確な分子メカニズムを明らかにするために、さらなる機構研究が必要である。さらに、自己免疫に関連するAhR活性における微生物と宿主のトリプトファン代謝の相互作用を完全に理解するためには、AhRリガンド産生につながる細菌経路を完全な腸内細菌叢の文脈で正確に実験特性化し、AhR駆動型免疫調節への複合効果を探索する必要がある。

腸内細菌は、健康な集団において顕著な個人差を示し、その一部は宿主の遺伝学と様々な重層的な環境影響によって駆動されています。この事実は、疾患との関連で腸内細菌叢の変化を調査するMS患者コホート研究間の著しいばらつきの主要なドライバーであると考えられ、さらに疾患修飾療法の使用によって混乱させられている。重要なことは、特定の分類群の多さは人によって大きく異なるかもしれませんが、健康な腸内細菌叢の代謝出力は比較的よく保存されているということです。したがって、細菌と宿主の代謝的相互作用を利用することは、疾患の発症、発症機序、治療介入戦略に関連する生物学的異常の状態をよりよく理解するための魅力的な方法であると言える。私たちの研究は、細菌と宿主の複雑な代謝経路を分離し、それらを疾患発症に関連付けるために、定義された微生物叢システムにおいて多角的なアプローチを採用することの有用性を強調するものである。このアプローチにより、トリプトファン依存性のEAE発症が、主要な腸内常在菌であるL. reuteriと因果関係があることを初めて証明することができた。今後、さらに還元的な方法を用いて、腸内細菌叢の構成要素と宿主との間の代謝的クロストークの複雑なネットワークを解明することがますます重要になると思われる。

結論
L. reuteriのような特定の腸内常在菌による食事性トリプトファンの代謝は、予想外に実験的自己免疫疾患を促進することが明らかになった。L. reuteriのゲノムおよびメタボロームの解析により、トリプトファン異化のための多様な代謝アーセナルが明らかになり、トリプトファンのバイオアベイラビリティの制限はEAEを改善し、インドール誘導体の豊富さを減らし、CNS標的T細胞応答を調節した。MS患者における細菌性トリプトファン代謝異常の新たな研究とともに、本研究は、この代謝軸の原因的役割を確認し、原因菌種、その遺伝経路、および下流代謝物の可能性を特定することにより、機構的基礎を提供するものである。

研究方法
Lactobacillus属菌の分離
PWD/PhJ（PWD）マウス19匹（雄9匹、雌10匹）を16S配列決定でスクリーニングし、L. reuteriが陽性であることが判明した[87]。その後、種特異的プライマーを用いたqPCRでスクリーニングしたすべてのPWDマウスもL. reuteriに陽性であった。L. reuteriは以前[87]に以下のように単離された。雄の野生由来近交系（PWD）マウス3匹の全便を嫌気的に採取してプールし、0.25g/L L-システインおよび20μg/mlバンコマイシンを補充してpH5に調整したMRS培地（サーモフィッシャー、Inc、米国）中に再懸濁した。 内容物を37℃、200rpmで一晩嫌気的に培養し、得られた培養物を同じ処方の寒天培地に分離するために筋入れを行った。乳酸菌と一致する形態からシングルコロニーを選択し，同製剤の5ml MRS培地で一晩培養して凍結保存した後，標準煮沸調製でDNA抽出し，種特異的プライマーを用いたqPCRでスクリーニングした。陽性クローンはグリセロールストックから回収し，バンコマイシンフリー培地で培養して純度を確認し，qPCR分析を繰り返した。L. murinusとL. johnsoniiは、L. johnsoniiの選択においてバンコマイシンを除外した上で、それぞれ3匹の雄の古典的近交系C57BL/6J（B6）マウス株のセカールまたは胃内容から同様の方法で分離された。B6およびPWDマウスには、乳酸菌の分離前に、トリプトファン0.28％の標準飼料（PROLAB RMH 3000 cat# 5P00）を与えた。コロニー形成研究では、1種につき3つの分離株を対数増殖させ、新鮮な培養液でOD600=0.5に調整し、等量で混合して凍結保存し、その後、プールした各ストックのqPCR検証を繰り返した。すべての細菌分離株は、要請に応じて著者から容易に入手可能である。

全ゲノム配列決定とアセンブリー
DNeasy UltraClean Microbial Kit (Qiagen, USA)を用いて、上記凍結保存と同様に1種につき2つの純粋な乳酸菌単離株からDNAを抽出した。濃度と品質は、Qubit (250 ng cut-off range 160-268 ng/μl) と 2100 Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis (predominant peak at upper marker size 10,390bp) を用いてそれぞれ評価され た。フラグメントフリーライブラリーの調製とバーコーディング（Ligation Sequencing Kit, SQK-LSK10 and Native Barcoding Expansion, EXP-NBD104, Nanopore, USA）後、分離株をマルチプレックスしてNanopore GridIon X5 Long Read Sequencer (Flow Cell ID, FAL58627, Nanopore, USA) でシーケンスし、ベースコールは Guppy version 3.2.8 で行いました。NanoPack version 1.0.1内のNanoQCとNanoplotで配列品質を評価し、Oxford Nanoporeのロングリード配列に関する推奨事項に基づいて品質スコア7以上でフィルタリング、Trimomatic version 0.39 (Leading:10, Trailing:10, and Headcrop:50)でトリミングし、Flie version 2.6 とUnicycler version 0.4.8 で細菌ゲノムアセンブリを実施しました。アセンブリのドラフトは、QUAST (Quality Assessment Tool for Genome Assemblies) version 5.0.2 [129]を用いて比較された。FLYEアセンブリは、全体的な品質評価（N50、ミスアセンブリおよび未アラインメントのコンティグまたはコンティグ塩基、対象となる遺伝子およびオペロンなど）に基づいて、さらなるアノテーションと解析のために選択された。アセンブリーはPROKKA version 1.14.5 とPathosystems Resource Integration Center (PATRIC)を用いてアノテーションされた。ゲノムドラフトはPATRIC上で公開されている（ID: 186826.38 L. reuteri Isolate 1, genome ID: 186826.48, L. reuteri Isolate 2, genome ID: 186826.44L. murinus Isolate 1, genome ID: 186826.45L. murinus Isolate 2, genome ID: 186826.46 L. johnsonii Isolate 1, and genome ID: 186826.47 L. Johnsonii Isolate 2, L. johnsonii isolite 1,genome ID: 178.4, 188.4）。johnsonii Isolate 2）、Integrated Microbial Genomes and Microbiomes (IMG/M) （ID: 2870538698 L. reuteri Isolate 1, ID: 2870542885 L. reuteri Isolate 2, ID: 2870555403 L. murinus Isolate 1, ID: 2870555403 L. johnsonii Isolate 2）。murinus Isolate 1, ID: 2870560610 L. murinus Isolate 2, ID: 2870565740 L. johnsonii Isolate 1, and ID: 2870569636 L. johnsonii Isolate 2)に対してクエリーを行った。

アセンブリーは、Microbial Genomes Atlas Online (MIGA) (Database update 12/28/2019) 内のNCBI nonredundant prokaryotic genomes databaseに対してクエリした[89]。分類確率の読み出しとして、各分類レベルでNCBIのRefSeqの全参照ゲノムにおける分布から推定したp値で、データベース内の全ゲノムに対する最大平均アミノ酸同一性（AAI）により分類を推定した。データベース内の上位50の参照ヒットの平均塩基同一性（ANI）およびAAI表を抽出し、x-y散布図としてグラフ化し、最も近い亜種の系統樹の近傍を決定した。分離株とMIGAが同定した近傍種の系統樹を作成するため、PROKKA分離株アノテーションから、あるいはNCBIで公開されている参照ゲノムから干渉プロテオームをANI/AAI-Matrix計算機にアップロードした[90]。AAIに基づく系統樹は、interactive tree of life (iTOL)[130]を用いて編集された。各株/種の宿主由来は手動でキュレーションした。コアゲノムとアクセサリゲノムを区別し、PROKKA注釈付きプロテオームを用いて、Bacterial Pan Genome Analysis (BPGA) pipeline version 1.3.0 で KEGG データベースにマップした。clusterProfiler version 3.10.1 [82]を用いて、KEGG濃縮解析のためにコア、アクセサリー、ユニークゲノムのKEGGオーソロジーの識別子を抽出した。上位20のCOG要素のアバンダンスプロファイルは、Joint Genome Institute (JGI) の Integrated Microbial Genomes & Microbiomes (IMG/M) システムの比較ゲノムツールを用いて同定した[131]。

細菌トリプトファン関連酵素は、先行研究[53, 132,133,134] に基づいて同定され、TNA, TMO, TrpD, ArAT, ALD, IPDC, FldH, AmiEなど、補足（表S8）に詳述されている。PATRICでは、酵素の受託番号または酵素名を検索し、PATRIC Global Family (PGF) のクロスジャンル識別子を抽出し、単離ゲノム内で検索できるようにコンパイルした。分離された酵素のタンパク質配列をInterProScanで解析し、さらに機能予測を行った。また、他の細菌種で実験的に検証された酵素との配列相同性をBlastpを用いて、各生物種内で30%のクロスジャンル識別と90%の同一性で決定した。

細菌培養
ラクトバチルス種の分離」のセクションに記載した3つの純粋なL.ロイテリ分離株のプールしたガベージストックを、5g/L酵母エキス（シグマ、米国）を補充したブレインハートインフュージョン（BHI）培地（シグマ、米国）中で嫌気的に培養し、0. 5g/L-システイン（Thermo Fisher, USA）、0.2mlビタミンK（Sigma, USA）、0.2mg/Lヘミン（Sigma, USA）および新生子牛血清、（Thermo Fisher, USA）、馬血清（Thermo Fisher, 26050088）および羊血清（ミリポアシグマ、 USA）各5％を添加したBHI培地で、嫌気培養した。トリプトファン（Thermo Fisher, USA）は、必要に応じて基礎培地に1 mMで補充した。細菌培養物を37℃で24時間振盪せずに培養し、3500rpmで10分間遠心分離し、上清を0.22μmでろ過し、アリコートを超高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法（UPLC-MS/MS）（Metabolon Inc. Durham, NC）による分析まで-80℃で保存した[97]。培地のみの無菌培養物（1 mM 添加あり、なし）を処理し、対照として並行して分析した。

細菌 RNA 抽出および芳香族アミノトランスフェラーゼ mRNA 発現の定量化
培養物を8000rpmで10分間遠心分離し、上清を除去した後、ペレットを55℃に予熱した800μl TRIzol reagent（Invitrogen, USA）に再懸濁し、55℃で10分間インキュベートした。TRIzol懸濁液をZR BashingBead Lysis Tubes（Zymo Research, USA）に移し、Mini-Beadbeater（Biospec Products, USA）を用いて30秒間ホモジナイズし、Direct-zol™ RNA Miniprep kit（Zymo Research, USA）を用いてRNA抽出を行った。RNA濃度はnanodrop (Thermo Scientific NanoDrop 2000 Spectrophotometer)で測定し、cDNAはqScript cDNA Super MIX kit (QuantBio, USA)を用いて製造者の指示に従って合成した。araT発現はDyNAmo ColorFlash SYBR Green kit (Thermo Fisher Scientific, USA), Quant Studio 3 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific, USA) でraT特異プライマーによるqPCRにより定量化された。データは汎真正細菌特異的プライマーセット[87]に正規化し、相対量は比較Ct法式2-（deltaCt）により算出した。プライマーセットは表S35で入手可能である。

微生物DNAの単離と乳酸菌の定量化
糞便サンプルは、個々のマウスを寝具のない空のケージに入れ、排便を待ち、その後、氷上で短時間保管し、抽出まで-80℃で長期保管することにより収集した。QIAamp PowerFecal Pro DNA extraction kit (Qiagen, USA)を用いて糞便ペレットからDNAを抽出し、NanoDropでDNAの質と量を評価した。細菌量は、16S rRNA遺伝子に対する種特異的プライマーを用いてqPCRにより定量し、上述のように汎真正細菌特異的プライマーセットに正規化した。プライマーセットは表S35に記載されている。

動物および微生物叢の移植
腸内細菌叢移植（GMT）は、以前に記載されたように行った[87]。簡単に言えば、B6又はPWDマウスから嫌気条件下で糞便内容物を凍結保存し、ハンゲートチューブ中で最終濃度20％のグリセロールで瞬間凍結し、使用するまで-80℃で保存した。無菌（GF）4〜5週齢のC57BL／6Jマウスをノースカロライナ大学医学部（米国ノースカロライナ州チャペルヒル）の国立Gnotobiotic Rodent Resource Centerから購入し、層流フード下で開封した無菌クレートで出荷し、直ちに100μlの冷凍保存PWDまたはB6セカール内容物を胃ろうにより接種した。B6＋L.ロイテリ微生物叢を生成するために、GFマウスは、109CFUのL.ロイテリ100μlを補充したB6微生物叢100μlを受けた。得られた元GFマウスは、腸内細菌叢の垂直伝播モデルの繁殖ペアとして使用された。すべての動物は、滅菌された餌、水、およびケージを備えたバリア条件下で維持され、追加の微生物の導入や交差汚染が最小限になるように取り扱いが最小限にされた。本研究で用いた実験手順は、バーモント大学の動物愛護使用委員会により承認された。

実験用微生物群の完全性保持に関連した動物飼育の実践
実験用微生物群の完全性を維持するため、厳格な取り扱い命令と無菌技術の使用を制定し、クロスコンタミネーションを回避した。ケージ交換を含むすべての動物飼育は、訓練を受けた研究所の職員によって以下のように管理された。バイオセーフティキャビネットの清掃にはPeroxigard™をたっぷりスプレーし、フード内のゴミを拭き取ってから再度スプレーし、作業開始前とすべての実験グループ間で最低10分間乾燥させる。手袋とガウンも実験微生物群ごとに新しいものを使用する。オートクレーブ滅菌したケージ、照射済み真空パックフード、フィルター滅菌水を用いて、バイオセーフティキャビネット内で新鮮なケージを一括作成し、その後必要に応じて準備した個々のケージをフード内に噴霧して動物への曝露を回避する。本試験での取り扱い順は以下の通り。PWD（天然にL. reuteriを含む）飼育ペア、PWD実験ケージ、B6（天然にL. murinusを含む）飼育ペア、B6実験ケージ、B6+L. reuteri飼育ペア、B6+L. reuteri実験ケージの順とした。実験飼料は、実験開始前にオートクレーブ滅菌した容器に、各微生物群ごとにストック容器を持つように分注した。実験飼料は、各微生物群ごとにオートクレーブ滅菌した容器を使用し、以下の順序で取り扱った。PWD 0.02% Trp食、PWD 0.8%食、B6 0.02% Trp食、B6 0.8% Trp食、B6 + L.reuteri 0.02% Trp食、B6 + L.reuteri 0.8% Trp high食の順で取り扱った。

EAEの誘発と評価
2×MOG35-55/CFAプロトコルを用いて、元GF-B6 GMTレシピエントにEAEを誘導した[135]。簡潔には、マウスに、0日目（下腹部）及び7日目（上腹部）に、0.1mgのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド35-55（MOG35-55）（New England Peptide，Inc．MA，USA）をPBSで乳化し、さらに4mg／mlの結核菌H37Ra（Difco，USA）を添加した50％完全フロイントアジュバント（CFA；Sigma，USA）を添加した。10日目から、以下のように、マウスを採点した。1-尾の張りの喪失、2-尾の張りの喪失と後肢の弱化、3-後肢の麻痺、4-後肢の麻痺と失禁、5-四肢麻痺または死。疾患経過における有意差は、以前に記載したように、Friedmanのノンパラメトリック二元配置ANOVAを用いて、治療×時間の相互作用項を用い、差を評価した[135]。全体的な疾患の重症度は、それぞれのEAEコースの曲線下面積（AUC）を使用して、総ピーク面積と平均の標準誤差をグラフ化し、一元配置分散分析と多重比較のためのŠidák補正によって有意性を計算して計算された。

食餌介入研究については、定義された微生物叢を持つマウスを、低0.02または0.8％高トリプトファン食（TD.200350およびTD.200352、Envigo Teklad Diets、Madison、WI）に無作為化し、8〜12週齢でのEAE誘発の1週間前にケージ当たり2〜3匹で飼育した。飼料は真空包装し、放射線照射し、使用まで4℃で保存し、毎週実験ケージ内でリフレッシュし、臨床スコアが3以上に達したマウス（後肢麻痺が認められた場合）には、ケージの床面にナパネクターと一緒に提供した。実験期間中、1日おきに体重を測定した。高トリプトファン食および低トリプトファン食への無作為化の前に、定義された微生物叢のコロニー化マウスに、0.30％のトリプトファン含有食（Prolab Isopro RMH 3000 cat# 5P75）を与えた。

フローサイトメトリー
EAE誘導後30日目のCNS浸潤細胞を特徴付けるために、マウスをイソフルラン麻酔下でPBSによる経心臓灌流により失血死させた。脊髄からリンパ球をDounceホモジナイズにより単細胞懸濁液を生成し、これを70μmストレーナーで濾過した後、Percoll gradient（37％／70％）遠心分離して間相を収集した。細胞内サイトカイン解析のため，20 ng/ml PMA，1 μg/ml ionomycin，1 mg/ml brefeldin A（Golgi Plug reagent，BD Bioscience）で4時間刺激し，UV-Blue Live/Dead fixable stain（Thermo Fisher, USA）で染色し，CD45，CD11b，CD19，TCRβ，CD4，CD8およびTCRγδに対する抗体で表面染色をした（Biolegend， USA）．細胞内サイトカイン染色では、細胞を固定し、0.05%サポニンで透過処理し、抗IL-17A、抗IFNγ、抗GM-CSF抗体（Biolegend、USA）で標識化した。細胞はCytek Aurora (Cytek Biosciences, USA) を用いて解析した。スペクトルアンミキシングは、非染色群コントロールからの自家蛍光補正を用いた適切な単色コントロールで行った。データはFlowJoソフトウェア、バージョン10.8.1 (Tree Star Inc, Ashland, OR) を用いて解析した。

メタボロミクス
図4AおよびBに概要を示すように、低（0.02%）または高（0.8%）トリプトファン食を1週間（ナイーブマウス）または5週間（30日間のEAE全コース後）与えたB6またはB6+L. reuteriマイクロバイオータでコロニー形成したマウスから血清を収集した。具体的には、心臓穿刺によって血液を採取し、1.5mLチューブに移して室温で30分間固化させてから30分冷蔵保存した。その後、5000rpm、4℃で5分間スピンダウンし、凝血塊の上部から血清を除去し、新しい1.5mlチューブに移して7000rpm、4℃で5分間遠心分離し、最終血清試料を新しい1.5mlチューブに移した。サンプルは-80℃で保存し、ドライアイスでMetabolon社（ノースカロライナ州ダーラム）に輸送した。Durham, NC, にドライアイスで輸送し、以前に記載したようにUPLC-MS/MSで処理・分析した[97]。簡単に言うと、サンプルは自動化されたMicroLab STARシステム（Hamilton Company、Franklin、MA）を使用して調製された。タンパク質は、メタノール (Glen Mills GenoGrinder 2000) で 2 分間振とうし、遠心分離することで沈殿させた。得られた抽出液を5つのフラクションに分け、TurboVap（Zymark）に載せて有機溶媒を除去し、窒素下で一晩保存して乾燥させ、以下のように再構成した。(1) 親水性化合物に最適化された酸性ポジティブイオン条件では、0.05%パーフルオロペンタン酸（PFPA）および0.7μmを含む水およびメタノールを用いてC18カラム（Waters UPLC BEH C18-2.1x100 mm, 1.7μm）から抽出物をグラジェント溶出させた。 1%ギ酸（FA）、（2）疎水性化合物に最適化した酸性正イオン条件では、メタノール、アセトニトリル、水、0.05%PFPA、0.01%FAを用いて同じC18カラムから抽出液をグラジエント溶出させ、0.05%PFPA、0.01%FAで操作しました。 (3)別の専用C18カラムを用いた塩基性マイナスイオン最適化条件では、pH8で6.5mM重炭酸アンモニウムを含むメタノールと水を用いてカラムから抽出物をグラジエント溶出させ、 (4)HILIC column (Waters UPLC BEH Amide 2.1x150 mm, 1.7 μm) では水とギ酸アンモニウム10mM、pH10.8でアセトニトリルからなるグラジエントを用いて溶出してマイナスイオン化しました。すべてのメソッドは、Waters ACQUITY超高速液体クロマトグラフィー（UPLC）と、加熱エレクトロスプレーイオン化（HESI-II）源とOrbitrap質量分析器をインターフェースしたQ-Exactive高分解能/高精度質量分析計（35000質量分解能で作動）を使用しています。分析は、ダイナミック排除を使用し、70 から 1000 m/z の範囲で MS とデータ依存の MSn スキャンを交互に行いました。生データはMetabolonのハードウェアとソフトウェアを使用して抽出、ピーク同定、QC処理を行いました。化合物は、3300の認証済み精製標準物質のライブラリと比較することで同定され、構造的に未名の生化学物質が繰り返し出現する場合は、追加のマススペクトルエントリーが使用されました。

データはMetaboAnalyst, version 5.0 [136]を用いて解析しました。データは対数変換し、平均値を中心に置き、いずれかのサンプルで値が欠落しているエントリーは除外されました。低トリプトファンと高トリプトファンの間のトリプトファンの倍数変化と一致するように、p≤0.05および｜FoldChange｜>1.5の閾値で適宜一元配置ANOVAまたはT-検定を使用して、差次的に豊富な代謝物が同定されました。ポストホック分析では、fisher least significant difference (LSD)法を用いた。すべてのヒートマップは、ユークリッド距離とウォードの連鎖によってクラスタリングされた正規化オートスケールデータを反映している。多変量次元削減プロットは、部分最小二乗法-判別分析（PLS-DA）を利用している。トリプトファン関連代謝物の手動キュレーションリストを使用して、直接解析のためのデータをサブセットしました。各解析と一致する生データおよびデータ表は、表S20〜S34に含まれる。

AhR活性アッセイおよびT細胞インビトロ培養代謝物処理
HEK293T細胞を、10％熱不活性化一発ウシ胎児血清（Thermo Fisher, USA）、1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Thermo Fisher, USA）、50μM 2-メルカプトエタノール（Thermo Fisher, USA）、2.5μM 2-グルコース（Thermo Fisher, USA）で補充したRPMI-1640で培養した。 5g/L D-グルコース（シグマ、米国）、2mM L-グルタミン（サーモフィッシャー、米国）、10μg/ml葉酸（シグマ、米国）、1mMピルビン酸（サーモフィッシャー、米国）である。pAhRとレポーター構築物pGud-Luc（Francisco Quintana博士、ハーバード大学医学部からの贈り物）を用いてLipofectamine 2000（Thermo Fisher、米国）を用いてトランスフェクションする24時間前に、細胞を96ウェルプレートにウェル当たり2×104個でプレーティングした。24 時間後、細胞を 100μM、10μM、1μM、または 0.1μM で個々の代謝産物で処理した。一部の実験では、100μM、10μM、1μM、または0.1μMでの個々の代謝物処理の前に、細胞をAhR阻害剤CH223191（Sigma、米国）で4時間前処理した。ルミノメーターの613nmでPierce Firefly Luciferase Glow Assay Kit (Thermo Fisher, USA)を用いて、48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。データは、AhR活性化を評価する際に、適切なDMSOビヒクル対照に正規化した。阻害率は、100μMでの最大ルシフェラーゼ反応と、AhRアンタゴニストであるCH-223191を用いた前処理後の活性との間で計算された。

代謝物処理に応じたT細胞分化の特徴付けのために、脾臓細胞を8〜10週齢のマウスから採取し、Th0（追加のサイトカインなし）またはTh17（IL-1β、IL-23 TGFβ、10ng／mlおよびIL-6、20ng／ml）偏光条件下でプレート結合抗CD3（5μg／mlでコート）で刺激した。3日間の培養後、細胞を20ng/mlのPMA、1μg/mlのイオノマイシン、1mg/mlのブレフェルジンA（Golgi Plug reagent, BD Bioscience）で4時間刺激し、上記の脊髄サンプルについて述べたように染色し、フローサイトメトリーにより評価した。

データおよび材料の入手方法
本研究で作成または解析したゲノムおよびメタボロームデータセットは、本誌およびその補足情報ファイルに含まれている。本研究で使用または解析したその他のデータセットについては、対応する著者から要請があれば入手可能である。

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参考文献のダウンロード

謝辞
pAhRおよびpGud-Lucレポータープラスミドの提供には、Francisco Quintana博士（ハーバード大学医学部）のご厚意に感謝します。Gary Mawe博士、Jessica Crothers博士、Jon Boyson博士、Cory Teuscher博士（バーモント大学）には、有益な議論とご意見をいただきました。

資金提供
この研究は、以下の助成金によって支援された。NIH/NINDS から DNK への R01 NS097596 と NIH/NINDS から TLM への F31NS120381-01A1, Gary Ward 博士へのトレーニンググラント T32AI055402-16A1, および Ralph Budd 博士への Vermont Center for Immunology and Infectious Diseases grant P30GM118228-05S3 によるものである。Flow Cytometry and Cell Sorting Facilityで実施した研究は、S10OD026843-01の一部助成を受けた。Vermont Integrative Genomics Resourceで行われた研究は、P01CA09893-15の部分的支援を受けています。

著者情報
著者名および所属
バーモント大学バイオメディカル・ヘルスサイエンス学部、バーリントン、VT、05401、USA

Theresa L. Montgomery、Katarina H. Lile, Sydney Caldwell, Eamonn R. Heney, Karolyn G. Lahue & Dimitry N. Krementsov

バーモント大学微生物学・分子遺伝学教室、バーリントン、VT、05401、USA

コーリン・エクストロム＆マシュー・J・ウォーゴ

コロラド大学生化学・分子遺伝学教室、オーロラ、CO、80045、USA

アンジェロ・ダレッサンドロ

寄稿
TLM、MJW、AD、DNK が研究をデザインし、TLM、KHL、SC、ERH、KGL、DNK が研究を行い、TLM、KE、DNK がデータを分析し、TLM、AD、DNK が論文を執筆した。全著者が原稿を確認した。最終原稿は著者が読み、承認した。

共著者
Dimitry N. Krementsovに連絡する。

倫理に関する宣言
倫理的承認と参加への同意
本研究で使用した実験手順は、プロトコルID PROTO202000037のもと、バーモント大学の動物愛護使用委員会により承認された。

論文発表の同意
該当なし

競合する利益
著者らは、競合する利害関係がないことを宣言する。

追加情報
出版社からのコメント
Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権主張に関して中立的な立場をとっています。

補足情報
追加ファイル1: 図S1.
Lactobacillus分離株と最近接亜種の放射状の完全系統樹。L. reuteri (A-B), L. murinus (C-D), L. johnsonii (E-F) の重複した分離株ドラフトゲノムを比較した拡張分類学データ。各ラクトバチルス・ドラフトゲノムの近縁種（亜種近縁種を含む）を、平均アミノ酸同定度（AAI）、共有ゲノム量のパーセントで決定し、系統樹として表現している。カラーグラデーションは、各単離株とそれぞれの最近接亜種の系統樹の間の保存された平均ヌクレオチド同一性（ANI）パーセントを示す。

追加ファイル2: 図S2.
L. reuteriゲノムで同定された推定芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素（ArAT）遺伝子座の発現レベル。(A）図2Aからの細菌および略図による哺乳類トリプトファン代謝の経路概略図。Lactobacillus分離株でゲノム上の証拠がある酵素は、オレンジ色（ArAT）、青色（FldH）、黄色（AmiE）で囲んである。(B）ラクトバチルス（Lactobacillus）単離株におけるゲノム上の証拠を持つ細菌トリプトファン特異的酵素のヒートマップ。酵素は、（A）の経路に対応する色で左側に沿ってリストアップし、上側に沿って分離株と同種の代表株を、暖色系はコピー数の増加を示す。(C) 脳心筋梗塞培地に0または1mMのトリプトファンを添加し、4時間または24時間単培養したL. reuteriのarat遺伝子座の発現量をqRT-PCRで測定したもの。データは(B)のヒートマップに対応して上から下へ整理されている。培養は三重で行い、発現レベルは16S rRNA遺伝子に対する汎真正細菌プライマーセットで正規化した。プライマーセットは表S35に掲載されている。

追加ファイル3：図S3.
L. reuteri分離株および参照分類群におけるD-乳酸脱水素酵素（fldH）および隣接する芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（araT）の代表的な遺伝子座の収容。全Lactobacillus分離株の各arat（赤）、fldH（緑）遺伝子座を、PATRICの比較領域ビューアーを用いて代表的な参照ゲノムと比較した。L. reuteriの遺伝子座は、araTとfldHが疑似オペロンとして構造化されており、近縁の参照分類群では保存されていることを模式的に示している。

追加ファイル4：図S4.
トリプトファンの利用可能性がL. reuteriの単培養での代謝出力を書き換える。(A) 部分最小二乗判別分析 (PLS-DA) と (B) Wardの連結を用いたユークリッド距離による階層的クラスタリングは、基礎BHI培地とL. reuteri単培養に1mMトリプトファンを添加したものと添加しないものの全代謝物のヒートマップで表される。ヒートマップは、L. reuteriのトリプトファン代謝に最も影響を受ける代謝物のサブセットを生成するために、p≤0.05の閾値でt検定によって分析された、1mMトリプトファンの有無によるL. reuteri単培養物間の差異のある上位25代謝物の反映です。得られたリストは、4つの実験グループすべて（培地のみのコントロールを含む）において、p≤0.05で一元配置分散分析し、ヒートマップとして表現した。

追加ファイル5：図S5.
実験的繁殖ペアおよび食事介入研究内のL. reuteriの存在量ダイナミクス。創設者のG0 B6-GFマウスに、PWD、B6、または109CFUのL. reuteriを添加したB6糞便の凍結保存ドナー内容物を接種し、G1子孫への垂直伝播のために繁殖ペアを確立した。糞便サンプルは接種後4週目に、実験子孫では食餌介入前（pre-diet）、無作為化食餌1週間後（naive）、30日間の全病過後（post-EAE）に収集した。L. reuteriとL. murinusの存在量は、（A）G0ブリーダーとG1子孫、（B）食餌介入期間中、種特異的プライマーを用いたqPCRによって決定した。EAE誘導後30日目におけるL. reuteriの相対的存在量は、累積疾患スコア（CDS）で測定した疾患の重症度と線形回帰を用いて相関し、P値は、食餌前（C）、ナイーブ（D）、EAE後（E）のサンプルについてゼロ以外のスロープからの有意な逸脱（すなわち有意相関）を示す。

追加ファイル6: 図S6.
血清メタボロームデータのプール解析におけるマイクロバイオームと食事のシグネチャー。30日間のEAE経過後にB6またはB6+L.ロイテリマイクロバイオームでコロニー形成した低トリプトファンまたは高トリプトファン食を与えたマウスから血清を採取し、（図4AおよびB）で概説したようにUPLC-MS/MSを介して分析した。データは、4つの実験グループすべてについて分析した。B6またはB6+L.reuteriコロニー化マウスを0.02%の低トリプトファン食または0.8%の高トリプトファン食に無作為に割り付け、データを解析した。(A) 総代謝物の部分最小二乗法-判別分析 (PLS-DA) 。(B) PLS-DAの投影（VIP）において、食事ごとにサンプルを分離するためのコンポーネント1に沿って重要な変数として上位10代謝物を表示。(C) マイクロバイオームによるサンプルの分離を担うコンポーネント2に沿ったPLS-DAプロジェクション(VIP)において、重要な変数として上位10代謝物を示した。統計解析は、表S24に記載されています。

追加ファイル7：図S7.
p-クレゾール硫酸およびp-クレゾールグルクロニドの存在量は、疾患の重症度と相関している。30日間のEAE経過後にB6またはB6+L.ロイテリ微生物群のいずれかでコロニー形成した低トリプトファンまたは高トリプトファン食を与えたマウスから血清を採取し、（図4AおよびB）に概略を示すようにUPLC-MS/MSを介して分析した。データは、4つの実験グループすべてについて分析した。B6またはB6+L. reuteriコロニー化マウスを0.02%の低トリプトファン食または0.8%の高トリプトファン食に無作為に割り付け、データを解析した。(A) 疾病の重症度と相関する上位25代謝物（30日間の疾病経過における毎日の全スコアの合計である累積疾病スコア（CDS）により測定）。(B) 線形回帰によるp-クレゾール硫酸およびp-クレゾールグルクロニド存在量とCDSのX-Y散布図、P値はゼロでない傾きからの有意な逸脱（すなわち有意な相関）を示す。低トリプトファン食マウスのp-クレゾールグルクロニド存在量については、検出限界以下の場合、ゼロ値を入力した。統計解析は、表S31に記載した。

追加ファイル8：図S8
. L. reuteri代謝産物はアリール炭化水素受容体のリガンドである。UPLC-MS/MSによってL. reuteri単培養物または血清中に同定された選択された代謝物を、10μMのAhRアンタゴニスト、CH223191で4時間の前処理を行うか行わないかして、100μM、10μM、1μMおよび0.1μMでAhRを活性化または阻害する能力について細胞ベースルキフェラーゼアッセイで分析した。トランスフェクションおよびDMSOビヒクルのコントロールは、比較のために含まれている。

追加ファイル9：図S9.
L. reuteri代謝産物は、Th17免疫応答を誘発するのに十分である。脾臓細胞は、0、1、10または100μMのIGoxA、IAA、および／またはAhRアンタゴニスト処理なしまたは処理なしでTh17条件下で分化させ、その後、細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリーにより染色された。CD4+およびCD8+ T細胞（A）全CD45+ T細胞の頻度およびIL-17産生（BおよびC）AhR阻害剤を含むおよび含まないIGoxA処理に反応した各親集団の頻度として。CD4+およびCD8+ T細胞（D）総CD45+ T細胞の頻度およびIL-17産生（EおよびF）各親集団の頻度として、AhR阻害剤を含むおよび含まないIAA処理に応答した場合。

追加ファイル10：表S1-S36。
本研究で使用したゲノムおよびメタボロミクス生データおよび解析結果、メタデータ、プライマーセット。

権利と許可
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Montgomery, T.L., Eckstrom, K., Lile, K.H. et al. Lactobacillus reuteriトリプトファン代謝はCNS自己免疫に対する宿主感受性を促進する. Microbiome 10, 198 (2022)。https://doi.org/10.1186/s40168-022-01408-7。

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受付終了
2022年6月17日

受理済
2022年11月01日

公開日
2022年11月23日発行

DOI
https://doi.org/10.1186/s40168-022-01408-7

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キーワード
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トリプトファン
多発性硬化症
実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)
アリール炭化水素受容体(AhR)
マイクロバイオーム