腸の反応？攻撃性におけるマイクロバイオームの役割
脳・行動・免疫
第122巻、2024年11月、301-312ページ
腸の反応？攻撃性におけるマイクロバイオームの役割
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0889159124005336?via%3Dihub
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ハイライト
-本研究は、尿プロファイリングを通じてマイクロバイオームが攻撃性とどのように相互作用するかを検討した初めての研究である。この解析は、微生物叢操作（上記の4つのユニークな研究グループ）に反応する基礎尿メタボロームを比較しただけでなく、行動アッセイの前後に採取したサンプルを比較することで、攻撃的な相互作用に対するリアルタイムの代謝反応も捉えているため、特にニュアンスが異なる。
-ここでは、攻撃性と微生物叢の相互作用における脳機能の研究を拡大し、HPLCを用いてセロトニン、セロトニンターンオーバー、トリプトファンレベルを定量化するとともに、脳の5つの異なる領域でトランスクリプトミクスを用いて主要な遺伝子発現パターンを同定した。複数の脳領域でセロトニンや他の神経伝達物質受容体に関連する遺伝子発現を調べ、攻撃性の制御に重要な脳領域として中隔を同定した。また、遺伝子セット濃縮解析を用いて、腸-脳-マイクロバイオーム軸の文脈で攻撃的行動に関連する、あまり研究されていない他の経路（Rho GTPaseとReelin）を強調した。
-本研究で得られたデータは豊富で（尿の非標的メタボロミクスと5つの脳領域のトランスクリプトミクス）、4つの微生物叢操作状態にまたがる。
-ヒト化マウスの研究では、 生後1ヶ月の乳児の糞便サンプルを 用いた。以前の研究（Uzan-Yulzariら, 2021, Nat Comm）で、われわれは、この重要な時期のABXが小児期の成長に永続的な影響を及ぼす可能性があることを示した。今回われわれは、同じコホートからのサンプルを用いて、この知見を拡張した。ABX投与数週間後に採取した糞便サンプルを用いることで、ABXの宿主に対する直接的な化学的影響も減少し、攻撃的行動の原動力となる宿主の微生物叢の異常と関連するメタボロームの原因的な役割が浮き彫りになった。我々は、生後48時間以内に乱された乳児の微生物叢が、生後1ヵ月まで持続するシグネチャーを持ち、それをGFマウスに移植すると、生後間もない抗生物質に曝露されていない乳児の便の影響と比較して、 攻撃性が増大する（移植後 3～5週間）ことを実証した。この研究結果は、 重要な発達の時期にABXによって変化した微生物叢が 、 持続的な行動障害に つながる ことを示す画期的なもので ある。
要旨
最近の研究では、攻撃性と腸内細菌叢との関連について、相反する証拠が明らかにされている。本研究では、腸内細菌叢が攻撃性に及ぼす影響を理解するために、コントロールマウス、無菌マウス（GF）、抗生物質投与マウス、および再コロニー化GFマウスの行動プロファイルを、常駐侵入者パラダイムを用いて比較した。その結果、腸内細菌叢の枯渇と攻撃性の亢進との間に関連性があることが明らかになり、尿中代謝産物プロファイルや脳内遺伝子発現にも顕著な変化が認められた。この研究は、古典的なマウスモデルからヒト化マウスへと拡張され、攻撃性に及ぼす早期の抗生物質使用の臨床的関連性を明らかにするものである。生後間もない時期に抗生物質に曝露された乳児の糞便マイクロバイオームをマウスに移植（1ヵ月後にサンプリング）すると、曝露されていない乳児からの移植を受けたマウスと比較して攻撃性が増加した。この研究は、攻撃性の調節における腸内細菌叢の役割に光を当て、その潜在的な作用経路を明らかにするものであり、攻撃性に関連する疾患の治療戦略の開発に示唆を与えるものである。
キーワード
マイクロバイオーム
攻撃性
メタボロミクス
トランスクリプトミクス
ヒト化無菌マウス
1. はじめに
攻撃は意図的で複雑、多面的な社会行動であり、ほとんどすべての種に広く見られ、宿主の生存と密接に関連している。動物が攻撃性を示すのは、縄張りを守るとき、餌や仲間を確保・防衛するとき、支配階層を確立するときなどである。この行動は、特定の遺伝子、神経伝達物質、環境要因、フェロモン、ホルモンなど数多くの要因によって調節されており（Bartholow, 2018,Edwards et al., 2009a,Edwards et al., 2009b,Nelson and Trainor, 2007 ）、一般にミバエからマウス、ヒトに至るまで種を超えて保存されていると考えられている（Thomas et al., 2015,Zhang-James et al.） そのようなホルモンの一つがセロトニンであり、モノアミン神経伝達物質であり、主に消化管で産生される（Fidalgo et al.） 中枢性セロトニン濃度が高いことは、マウスでもヒトでも攻撃性と負の相関関係がある（Holmes et al.） セロトニンレベルに影響を与える要因の一つは、食事によるトリプトファンの摂取である（Bartholow, 2018 ）。さらに最近の研究では、腸内細菌叢がセロトニンレベルの調節に重要な役割を果たしていることが示されている（Frankiensztajn et al., 2020,Weiner et al., 2023,Yano et al., 2015 ）。微生物のコロニー形成がない状態（無菌状態、GF）で飼育されたマウスは、従来通りコロニー形成された状態（特異的病原体フリー、SPF）の対照群と比較して、血清中のセロトニン濃度が低い（Sjogren et al.）
攻撃性におけるセロトニンの直接的な役割に加え、様々な研究が、セロトニン作動性システムがこの関係にどのような影響を及ぼすかを理解することに焦点を当てながら、様々な遺伝子と攻撃性の相関関係を明らかにしている（2006年、Popovaによる総説）。これらの研究は、遺伝的に決定される攻撃性の個人差の根底にある脳内セロトニンの重要な役割を強調している。さらに、セロトニン代謝の主要な酵素、セロトニントランスポーター、特定のセロトニン受容体をコードする遺伝子が、攻撃性の調節に重要な役割を果たしていることも示されている（Popova, 2006 ）。
数多くの研究が、マイクロバイオームを介したクロストークによる腸脳軸の概念を支持する証拠を提示している（Kayyalら、2020 、Leclercqら、2017 、Morelら、2023 、Ritzら、2024 、Zhang-Jamesら、2019 ）。攻撃性におけるマイクロバイオームの役割に関する研究はまだ始まったばかりであるが、ミバエ（Grinbergら、2022年）、イヌ（Craddockら、2022年）、マウス（Leclercqら、2017年 、Watanabeら、2021年）、ヒト（Dengら、2022年）において関連が確認されている。しかし、微生物組成の変化が攻撃性に及ぼす影響についてはまだ不明である。いくつかの研究では、ミバエ（Jia et al., 2021 ）とハムスターにおいて、それぞれ細菌の不在または抗生物質処理によって攻撃性が低下することが判明しているが（Sylvia et al., 2017 ）、他のいくつかの研究では、抗生物質処理後または無菌環境下で攻撃性が増加することが明らかになっている（Grinberg et al., 2022,Leclercq et al.） 発表された研究の多くは予備的あるいは記述的なものであり、現在までのところ、攻撃性、ホルモンレベル、遺伝子発現、代謝産物プロファイル、腸内マイクロバイオーム間の相互作用のメカニズムを明らかにしたり、そのネットワークを説明したりしたものはない。
また、乳幼児期の抗生物質使用と子どもの行動との関係、特に腸と脳の関連性を理解することへの関心も高まっている。我々は最近、乳幼児期に抗生物質治療にさらされると、腸内細菌叢に有意な差が生じ、それが2歳まで持続することを報告した（Uzan-Yulzari et al.） さらに、複数の研究により、マウスやヒトにおいて、生後早期の抗生物質投与と神経発達障害との関連が示されている（Diamanti et al., 2022,Lynch et al., 2023,Neuman et al., 2018 ）。米国では全新生児の2-42 %に抗生物質が投与されており（Schulman et al., 2019 ）、新生児期を過ぎると子どもは2歳までに平均3コース近くの抗生物質を投与されている（Cox and Blaser, 2015 ）ことを考えると、生後早期の抗生物質曝露と攻撃性の潜在的関連性は臨床的に重要かもしれない。一方、攻撃性や反社会的行動を特徴とする行為障害は、学齢期の子どもの3％が罹患していると推定されている（Fairchild et al.）
ここでは、宿主の攻撃性を媒介する無傷のマイクロバイオームの重要性を明らかにするために、無菌動物、抗生物質操作動物、従来型動物、ヒト化動物を用いて、モデル生物におけるこの複雑なネットワークを検討する。
2. 結果
2.1. 攻撃性の媒介におけるマイクロバイオームの役割
最近の研究では結論が出ていないため、まずマウスモデルで腸内細菌群集が攻撃性に及ぼす影響を調べることを目的とした。この目的のため、無菌マウス（GF）、特定病原体非存在マウス（SPF、野生型ベースライン）、抗生物質投与SPFマウス（ABX）、5週齢でSPFの糞便サンプルを再投与したGFマウス（C-GF）の行動プロファイル（常駐侵入者テスト（Kaliste-Korhonen and Eskola, 2000 ））を比較した。GFマウスとABXマウスの両方を用いたのは、ABXマウスでは、微生物叢を介したものに加えて、宿主の行動に対する直接的な化学的影響が考えられるからである。ABXマウスとGFマウスの糞便サンプルは、(Binyamin et al., 2020)に記載されているように、16S rRNA遺伝子のPCRによって細菌がいないことが確認された。3回の常駐侵入行動アッセイ（Kaliste-Korhonen and Eskola, 2000 ）が行われ、各試験は10分間であった（図1A、詳細はMethods参照）。
図1. 腸内細菌叢はマウスの攻撃性を調節する。(A）実験デザイン-攻撃性は常駐-侵入者テストを用いて調べた。常駐雄マウスを雌マウスと7日間隔離し、同じ群（すなわちSPF-SPF、GF-GF）の侵入雄マウスに対して2-4日間隔で3回テストを行った。雌は実験の1時間前に取り除き、各実験は10分間であった。実験終了後、侵入者を取り除き、メスをケージに戻した。攻撃性は2つのパラメーターを用いて測定された：(B)攻撃潜時：侵入者を導入してから最初の攻撃を受けるまでの時間-10分間の試行で攻撃を受けなかったマウスは11点、(C)攻撃回数：各試行における全体的な攻撃回数（SPF N = 9、GF N = 9、ABX N = 9、C-GF N = 14、nはペア数、レジデントと侵入者、#p=0. 06、* p<0. 06、*p<0.05、**p<0.01、攻撃回数は平均±SEMを表す）。
GFマウスはSPFマウスに比べ、攻撃速度が速く、攻撃回数が多いという2つのパラメータで有意に高い攻撃性を示した（それぞれ図1Bおよび1C）。さらに、10分間の試行におけるGFマウスの平均攻撃回数は、SPFマウスと比較して3つの試行すべてで高く、第1試行と第2試行では統計的に有意な差がみられた（図1C）。GFマウスの結果と同様に、抗生物質の投与は攻撃性の上昇につながった。ABXを投与したマウスの攻撃までの潜伏時間は、2回目の試験ではSPF群に比べ、2回目と3回目の試験ではC-GF群に比べ有意に短く、GFマウスの行動プロファイルと一致した（図1B）。さらに、ABX投与群では発作回数が増加し、第2試験で有意差が認められた（図1C）。興味深いことに、GFマウスのコロニー形成は攻撃性の有意な減少を示した。C-GFマウスはGF群と比較して攻撃速度が遅く（図1B）、攻撃回数も有意に少なかった（図1C）。居住者-侵入者試験では、侵入者が優位性やテリトリー防衛を求めて攻撃性を助長するだけでなく、繰り返し暴露されることで、その後の遭遇における侵入者の反応性や攻撃性が高まる可能性がある。この現象は全群で観察され、試行回数を重ねるごとに攻撃性がエスカレートしていく。
2.2. ABX投与マウスにおける攻撃性亢進のメカニズム
マイクロバイオームが存在しない場合（GF）、あるいはマイクロバイオームに大きな影響を与えた場合（ABX）、攻撃性が増加することを明らかにした後、この関係の根底にある相互作用の網の目を探った。マウスの主なコミュニケーション手段は匂いであり、尿は揮発性・不揮発性化合物の主な供給源となることから、まず攻撃性に関連する可能性のある化合物を探索するため、アンターゲットメタボロミクスを用いてマウスの尿の代謝物プロファイルを調べた。主成分分析（PCA）を行い、メスマウスとの同居およびその後の攻撃性アッセイ（T0）前と、SPFマウスから採取した常駐侵入者テスト（T14）前後のサンプル間の代謝プロファイルの全体的な違いを評価した（図2）。PCAプロットによると、SPF-T0群とGF群の間に明確な分離が見られる。さらに、SPFマウスに抗生物質を投与すると、SPF-T0群と比較して代謝プロファイルが劇的に変化した。同様に、C-GFマウスの代謝物プロファイルは、GF群よりもむしろSPF群に類似していた。全群を一緒に調べたところ、SPF群では2つの時点の間に明確な隔たりは見られなかった： T0とT14である（図2A）。しかし、この2つの群のみについてPCAを行ったところ、攻撃性試験に起因すると思われる分離が見られた（図2B）。尿サンプル（同定または推定アノテーションされたもの）から合計99の代謝物が、4つの実験グループ間で実施された統計的比較の少なくとも1つにおいて、有意に豊富であった（q < 0.05）か、SPFグループのT0とT14の間で有意に異なっていた（p < 0.05）（補足図S1～S8、補足表S1）。興味深いことに、抗生物質投与によって変化する代謝物をいくつか同定したところ、それらはSPFマウスの攻撃性試験後にも同じように変化することがわかった。試験後、操作していないSPFマウス（攻撃性試験に曝露）のプロファイルは、（曝露していない）GFマウスやABXマウスに似てきた（図2C-H）。トリプトファン（Trp）とクレアチニンは、細菌群の有無によって変化した代謝物の例であり、GF群ではSPF群に比べてTrpとクレアチニンのレベルが有意に高かった。同様に、SPFマウスに抗生物質を3週間投与すると、Trpとクレアチニン濃度はSPF群に比べて上昇したが、GFマウス（C-GF）に細菌をコロニー形成させると、Trpとクレアチニン濃度は低下した（図2C,E）。Trpとクレアチニンの代謝物レベルも、SPFマウスではベースラインと比較して複数回の攻撃試行後に変化し、抗生物質投与後に見られるような高いレベルを示した（図2D,F）。Trpの代謝産物であるDL-インドール-3-乳酸（I3LA）も同じパターンを示したが、その方向は逆であった。GF群とABX群に細菌集団が存在しないとI3LA濃度は低くなり、細菌が存在するとI3LA濃度は高くなった（図2G）。攻撃性の影響はここでも観察された。ベースラインT0と比較して、攻撃性試験後には有意に低いI3LAレベルが観察された（図2H）。
図2. 腸内細菌叢と攻撃性が雄マウスの尿代謝物プロファイルに変化を引き起こす。アンターゲット尿メタボロミクスを用いた雄マウスの尿サンプルの全体的な代謝物プロファイルのPCA。解析では2つのサンプルセットを比較している： (A）SPF（N＝4）、ABX（N＝4）、GF（N＝4）、C-GF（N＝4）を含む4群から採取したサンプルで、尿代謝物プロファイルに対する腸内細菌叢擾乱の影響を評価するために、攻撃性試験前の時点T0で採取した。(B）攻撃性が尿代謝物プロファイルに及ぼす影響を調べるため、攻撃性試験前（T0、N＝4）と試験後（T14、N＝4）に採取したSPFマウスのサンプル。(C+D)D-トリプトファン、(E+F)クレアチニン、(G+H)DL-インドール-3-乳酸の量を、(C+E+G)SPFマウス（灰色）、ABXマウス（紺色）、GFマウス（水色）、C-GFマウス（緑色）と、(D+F+H)SPF-T0マウス（灰色）およびSPF-T14マウス（橙色）の攻撃性試験との間で変化させた箱ひげ図。レベルは正規化した存在量（ピーク面積）で示した（N = 4）。(この図の凡例にある色の解釈については、この論文のウェブ版を参照されたい）。
腸-脳-微生物-代謝の相互作用についてさらに理解を深めるため、次に全脳におけるTrp、セロトニン（5-HT）およびセロトニン代謝産物（5-HIAA）のレベルをHPLCを用いて定量した（図3A）。組織はT0時に採取し、メスとの同居前と攻撃性試験前のベースライン基準とした。これにより、実験操作前のこれらの化合物の初期状態を評価することができた。GFマウスは脳の発達が明瞭であり、交絡変数が生じる可能性があるため、脳を含むすべての実験において、SPFマウスと抗生物質処理SPFマウスのみを比較した。
Fig.3. 抗生物質処理による腸内細菌組成の変化は、トリプトファン 5-HT、5-HIAAおよび5-HTターンオーバーの変化につながる 。(A)実験デザイン-8週齢のSPF雄マウス（N = 5）と抗生物質投与雄マウス（N = 5）の脳全体について、隔離および攻撃性試験前に高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）を行った。抗生物質投与3週間後、(B)トリプトファン、(C)5-HT、(D)5-HIAA、(E)5-HTターンオーバーのレベルに有意差が観察された。(n = 5, *p<0.05, **p<0.01, 数値は平均+/- SEMを表す）。
SPF群に抗生物質を投与して細菌を減少させると（図3A）、5-HTの有意な減少（図3C）に加えて、Trpレベルの有意な上昇（図3B）が誘導された。さらに、5-HIAAと5-HTのターンオーバー（5-HIAA/5-HT比）は、SPF群と比較してABX群で有意に高かった（それぞれ図3D,E）。
次に、5つの脳領域（前頭前皮質、扁桃体、海馬、視床下部、中隔）を対象にトランスクリプトミクス・プロファイリングを行ったところ、SPF群とABX群の間で、何千もの遺伝子やパスウェイの発現に差があることが明らかになった（図4A-Eおよび補足表S2 ）。我々は、Zhang-Jamesら（Zhang-James et al., 2019 ）によって発表された40の攻撃性関連遺伝子と主要な5-HT関連遺伝子（Soga et al. この遺伝子群の中で、抗生物質投与後に有意に変化した攻撃性関連遺伝子を同定した。特に、セロトニン受容体遺伝子1A（htr1A）、1B（htr1B）、2A（htr2A）を含むセロトニン受容体スーパーファミリーのいくつかのメンバーの発現レベルが、抗生物質投与後に少なくとも3つの脳領域で有意に変化した（図4F-J）。脳の発達に不可欠な広範な神経細胞遺伝子ネットワークの代替スプライシングに関与するスプライシング因子をコードするRBFOX1（Fernandez-Castillo et al.
図4. 抗生物質による腸内細菌組成の変化は、脳の5つの領域における遺伝子発現に影響を与える。RNAシーケンス解析は2群のマウスで行った： SPF（青、N=3）とABX（ピンク、N=3）。この研究では、5つの異なる脳領域に焦点を当てた： 前頭前皮質（A+F）、扁桃体（B+G）、海馬（C+H）、視床下部（D+I）、中隔（E+J）。(A-E）各脳領域におけるSPF群とABX群間の遺伝子発現パターンの差をボルケーノプロットで示す。青い点は、SPF群と比較してABX群で有意に発現が増加（右側）または減少（左側）したと同定された数千の差次的発現遺伝子を表す。赤い点は重要でない差次的発現遺伝子を表す。(F-J)ヒートマップは、SPF群とABX群の両方について、5つの脳領域にわたる攻撃性に関連する47遺伝子の相対発現レベル（zスコア）を示している。(この図の凡例における色の参照については、読者はこの論文のウェブ版を参照されたい)。
抗生物質投与後に有意に変化した攻撃性関連遺伝子を同定した後、次のステップとして、攻撃性に関連する遺伝子セットを同定するために遺伝子セット濃縮解析（GSEA）を行った（図5）。解析の結果、すべての脳領域で、抗生物質投与後に有意に発現が増加または減少した、多数の濃縮パスウェイが同定された（補足表S3 ）。海馬ではRho GTPase経路が最も濃縮された上位20経路の一つであり（図5A,B, q = 0.01）、扁桃体ではReelin経路が有意に濃縮されていた（図5C,D, q = 0.003）。これらの経路に加えて、セロトニン関連経路も同定されたことは注目に値するが、それらは上位50の濃縮経路にはランクインしなかった。扁桃体におけるセロトニン神経伝達物質放出サイクル（q = 0.03）と海馬におけるセロトニン受容体活性（q = 0.04、補足表S3 ）は、他の有意に濃縮された経路の一つであった。
図5. 抗生物質による腸内細菌組成の変化は、5つの脳領域において数百のパスウェイを変化させた。RNAシーケンスに基づく遺伝子セット濃縮解析（Gene Set Enrichment Analysis）を用いて、濃縮されたパスウェイを同定した。(A+C)海馬のRho GTPaseサイクルと扁桃体のReelinパスウェイの濃縮プロットはそれぞれ、SPF群とABX群の間で同定された発現差のある遺伝子（DEG）を示している。プロットの上部は各遺伝子の濃縮スコアを示し、下部はランク付けされた遺伝子を示す。(B+D) ヒートマップは、各経路、Rho GTPaseサイクルおよびReelin経路で同定されたコア濃縮遺伝子の相対発現（zスコア）を表示する。
2.3. 早期の抗生物質使用はヒト化マウスの攻撃性を増加させた
次に、今回の研究結果を臨床的な文脈に反映させ、幼少期の抗生物質使用が攻撃性にどのような影響を及ぼすかを探ることを目的とした。この目的のために、生後48時間に抗生物質に曝露された生後1ヶ月の乳児と曝露されなかった生後5週間のGFマウス（乳児の属性については補足表S4を参照）の糞便から、糞便マイクロバイオーム移植（FMT）を行った。以前に発表された研究では、ドナーの便の微生物叢が治療後1ヶ月経っても変化していること、そしてこの変化した便がマウスの表現型の違い（すなわち成長）につながることを明らかにし、このアプローチを検証した（Uzan-Yulzari et al.） このFMT法では、抗生物質の投与とサンプル採取の間に1ヶ月近くが経過したため、抗生物質が行動に及ぼす直接的な化学的影響をコントロールすることもできた。ABXとコントロールのサンプルプールでは、微生物叢プロファイルが有意に異なっていた（補足図S9）。印象的なことに、移植後4週間の成熟マウスを用いた行動アッセイで、上記の知見が確認された。抗生物質の使用が終わり、マイクロバイオームが回復し始めた（サンプルは抗生物質曝露から1ヵ月後に採取）時点でも、抗生物質によって変化した微生物群集（ここでは乳幼児）が攻撃性を増加させたのである（図6）。
図6. 抗生物質投与1ヵ月後に採取した乳児からGFマウスへの糞便マイクロバイオーム移植（FMT）により、マウスの攻撃性が亢進する。(A）実験デザイン-抗生物質投与児と対照児から5週齢のGFマウスへのFMT。8週齢の時点で、コントロール-FMT（N = 8）とABX-FMT（N = 8）の両群で攻撃性を調べた。(B)攻撃潜時：侵入者が現れてから最初の攻撃を受けるまでの時間-10分間の試行で攻撃を受けなかったマウスは11点、(C)攻撃回数：各試行における全体的な攻撃回数(*p<0.05, **p<0.01、攻撃回数は平均+/- SEMを表す)。
3. 考察
本研究は、マウスモデルおよびヒト化マウスにおける攻撃性の調節における腸内細菌叢の役割に関する知見を提供し、社会的行動、すなわち攻撃性の調節に微生物叢-腸-脳軸が関与していることを支持するものであり、先行研究（Jossin, 2020 ）と一致している。今回の研究結果は、FMTを用いることで、腸内細菌叢が攻撃性に原因的な影響を及ぼすことを示しただけでなく、この行動を制御する複数の因子や経路への影響も明らかにした。腸-脳-微生物叢のクロストークをより深く理解するために、まずアンターゲットメタボロミクスを用いて尿中代謝物プロファイルを探索した。その結果、トリプトファンおよびクレアチニンレベルの上昇と、DL-インドール-3-乳酸の減少に関連する、細菌摂動および攻撃性試験後の代謝物プロファイルの明確なシフトが示された。トリプトファン（Trp）は必須アミノ酸であり、神経伝達物質セロトニンの前駆体である。双生児を対象とした最近の研究では、攻撃的な双生児では攻撃的でない双生児に比べてTrp濃度が低いことが明らかになった（Hagenbeek et al.） 以前の研究では、血漿中Trp濃度と攻撃性との間に正の相関があることが示されているが（Suarez and Krishnan, 2006 ）、対照的な結果が得られている。クレアチニン値に関する我々の結果は、同じく小児期の攻撃性とクレアチニン値との間に正の関連を同定したHagenbeekら（Hagenbeek et al.） インドールおよびその誘導体は、微生物叢-腸-脳軸の必須メディエーターとして重要な役割を果たしており、脳に様々な影響を与え、うつ病などの神経疾患や精神神経疾患の発症や進行に大きく寄与している（Zhou et al.） しかし、攻撃性に関するデータは不足している。今回の我々の知見は、腸内細菌叢が攻撃性に及ぼす影響を浮き彫りにするだけでなく、攻撃性の制御に関与する代謝産物の複雑なネットワークに、腸内細菌叢がどのような影響を及ぼすのかも示している。これらの知見は、攻撃性を調節する腸脳軸のメカニズムに関するより広範な理解に貢献するものである。これらの複雑な相互作用をより深く理解するためには、継続的な研究が必要である。
さらに、脳内セロトニンの解析から、抗生物質投与後にセロトニンレベルが低下し、Trp、5-HIAA、セロトニンのターンオーバーが上昇することが示された。これらの結果は、抗生物質投与後に脳内のセロトニンレベルが低下し、セロトニン代謝物およびセロトニンのターンオーバーのレベルが上昇することを示したラットを用いた以前の研究によって支持される。さらに、血漿中のTrp測定値も抗生物質投与後に同様に上昇した（Hoban et al.） 抗生物質投与後のセロトニンと関連代謝物のこのような変化は、腸の健康と脳機能の相互関係を強調し、神経化学と行動の調節における腸脳軸の重要な役割を強調している。脳全体の検査に加え、遺伝子発現解析により、抗生物質投与後の特定の脳領域におけるセロトニン受容体遺伝子の変化が示された。47の攻撃性関連遺伝子（40）と5-HT関連遺伝子（7）に関する差異の大部分は、中隔に認められ、次いで前頭前皮質と扁桃体であった。最初の2つの領域は、攻撃性の制御に重要な部位である可能性が指摘されている（Lischinsky and Lin, 2020 ）。変化した遺伝子はセロトニン作動性神経伝達を調節する因子をコードしているため、攻撃性の制御に一役買っていると考えられている。シルバーフォックスに関する研究では、家畜化されたキツネは野生のキツネに比べて視床下部の膜に存在する5-HT1Aの密度が著しく低いことが判明した（Popova et al.） さらに、5-HT1B受容体を欠損させたノックアウトマウスは、野生型マウスよりも高い攻撃性を示し（Saudou et al ., 1994 ）、さらなる研究では、セロトニンの受容体の1つをコードする遺伝子であるHTR2A遺伝子と、マウスとヒトの両方における攻撃性との関連が報告されている（Rosell et al.） 興味深いことに、RBFOX1によってコードされるタンパク質は、抗生物質投与後に変化したもう一つの潜在的関連遺伝子であり、前述の上位40遺伝子のうち15遺伝子の発現を制御している（Lee et al.） このGSEAは、Rho GTPaseおよびReelin経路の機能と攻撃性を関連付けたZhang-Jamesら（Zhang-James et al. これらの経路は攻撃性と直接的な関係はないかもしれないが、脳のさまざまな細胞プロセスに関与している。Rho GTPアーゼシグナル伝達は、神経細胞の発達、成長、生存の様々な側面の制御に重要な役割を果たしており（Stankiewicz and Linseman, 2014 ）、Reelinシグナル伝達経路は神経系の発達に極めて重要であり、様々な精神神経疾患との関連が指摘されている（Jossin, 2020 ）。これらの知見は、腸内細菌叢、遺伝子発現、攻撃性の間の複雑な腸脳相互作用に関する貴重な洞察を提供し、攻撃性に対する腸内細菌叢の影響の媒介にセロトニンシグナル伝達経路が関与していることをさらに裏付けるものである。
攻撃性に関連する神経生物学的メカニズムにおけるマイクロバイオームの役割を調査した後、われわれは臨床的なシナリオ、すなわち生後早期の抗生物質曝露が行動にどのような影響を及ぼすかを検討することに興味を持った。そのため、ヒト化マウスモデルを確立した。その結果、新生児期に抗生物質に曝露された乳児のFMTが、ヒト化マウスの攻撃性を増加させたことが明らかになった。小児の攻撃性は、遺伝的危険因子と環境的危険因子の両方が関与する複雑な病因を持つが、興味深いことに、抗生物質の早期使用は、行動上の問題や行動障害と関連することが最近報告された。ニュージーランドの5,589人の小児を対象とした疫学調査によると、生後12ヵ月間の抗生物質への曝露は、4.5年後の行動困難スコアの増加と関連していた（Slykerman et al.） さらに、生後1年間の抗生物質への早期曝露は、実行機能得点の低下と受容言語能力の低下と関連していた。デンマークの100万人以上の小児と若年成人を対象とした集団ベースの登録研究では、抗生物質への曝露は、行為障害を含むその後の精神医学的診断のリスク増加とも関連していた（Kohler-Forsberg et al.） 疫学研究では、抗生物質曝露の影響と基礎となる感染症を区別できないことが多い。しかし、抗生物質に曝露された乳児から採取したFMTを用いた我々の実験データは、抗生物質による腸内細菌叢の摂動が行動問題の発症に因果的な役割を果たしている可能性を示唆しており、従来型GFマウスにおける攻撃性の低下は、腸内細菌叢を標的とした介入によって初期の抗生物質の有害な影響を改善する希望を与える。
これらの知見は、腸内細菌叢と攻撃性の間の複雑な相互作用を浮き彫りにし、その根底にある生物学的プロセスに関する貴重な洞察を提供するものである。しかし、腸内細菌叢、遺伝子発現、攻撃性の間の多面的な相互作用を完全に理解し、これらの知見をどのように臨床応用につなげるかについては、さらなる研究が必要である。
4. 材料と方法
4.1. マウス
スイス・ウェブスターマウスはTaconic Farms Inc.（米国ニューヨーク州ジャーマンタウン）から入手し、BIUのアズリエリ医学部の動物施設で飼育した。マウスは、標準的な12時間：12時間明期、暗期の飼育条件で維持された： 特定病原体フリーマウス（SPF）および抗生物質処理SPFマウス（ABX）は、Bar-Ilan大学（BIU）Azrieli医学部のSPF動物舎で飼育し、従来型無菌マウス（C-GF）およびヒト化マウスは、動物舎の従来型の部屋で飼育し、GF群は無菌アイソレーター内のケージで同じ明暗条件下で飼育したが、水、寝具および巣材はオートクレーブ滅菌した。さらに、GFマウスにはオートクレーブ処理した濃縮飼料を与えた。本研究はBar Ilan大学動物研究委員会（承認番号43-07-2015）により承認されたプロトコールのもとで実施され、オスとメスの両方のマウスが使用された。オスは焦点マウスである居住者および侵入者であり、メスは居住マウスの縄張り行動を増加させる行動パラダイム（下記）に使用された。
4.1.1. 抗生物質投与マウス
抗生物質処理SPF群では、5週齢のマウスにシプロフロキサシン(0.04gl-1)(Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA)、メトロニダゾール(0.2gl-1)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)およびバンコマイシン塩酸塩(0.1gl-1)(Gold Biotechnology, St. Louis, MO, USA)を組み合わせた飲料水を、実験前および実験中の3週間、週2回リフレッシュしながら投与した。マウスの糞便ペレットから細菌DNAを抽出し、続いて16S rRNA遺伝子のPCRを行い、アガロースゲル上で可視化した結果（Neuman et al.
4.1.2. 再馴化マウス
5週齢のGFマウスに、同年齢のSPFマウスから採取した便サンプルを経口移植してコロニー形成させた。便サンプルを滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に懸濁し（便ペレット1個／PBS1ml）、ボルテックスで1分間溶解した。合計150μlの糞便懸濁液をGFマウスに経口投与した。無菌隔離器からマウスを取り出した直後に1回行い、その後SPFと同じ条件で通常の動物飼育施設に収容した。
4.2. ヒト化マウス
4.2.1. 糞便サンプル提供者
糞便サンプルは、フィンランドのトゥルクにあるトゥルク大学病院で実施された臨床研究（Uzan-Yulzari et al.） 生後48時間以内にベンジルペニシリンとゲンタマイシンを静脈内投与され、早期の敗血症を示唆する症状や徴候のために抗生物質療法を受けた乳児5人と、サンプルの入手可能性に基づいて（対照として）曝露されていない乳児5人を選んだ（表S4 ）。サンプル（乳児が生後1ヵ月のときに採取）は-80℃で保存され、ドライアイスでBIUのアズリエリ医学部に送られた。登録基準はUzan-Yulzariら(Uzan-Yulzari et al., 2021)により示されており、本研究はフィンランド社会保健省管轄の国家専門機関であるフィンランド保健福祉研究所により承認された(Uzan-Yulzari et al., 2021)。
4.2.2. 糞便移植
抗生物質投与児（N = 5）および対照児（N = 5）の糞便サンプルを群別にプールし、5週齢のGF雄マウスに経口経口投与により移植した。各プールを800μlの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に懸濁し、ボルテックスで1分間溶解した。合計200μlの糞便懸濁液をGF雄マウス（Control-FMT N = 8, ABX-FMT N = 8）に経口投与した。投与はマウスをアイソレーターから出した直後に1回行い、その後SPFマウスと同じ条件で通常の動物飼育施設に収容した。
4.2.3. 常駐侵入者試験
攻撃性は4群すべてのマウスで常駐侵入者パラダイム(Kaliste-Korhonen and Eskola, 2000)を用いて測定した： SPF（N＝9）、GF（N＝9）、コロニー形成GF（N＝14）、抗生物質処理SPF（N＝9）の4群すべてにおいて、8～12週齢の間に実施した（nは常駐と侵入のペア数を示す）。マウスは2～4日間隔で3回試験され、試験は群内のみで行われた（すなわち、GF常在とGF侵入者）。試験はすべて明暗サイクルの明期である12～15時に行った。各オスは実験開始の1週間前からコンパニオンのメスと一緒に飼育され、メスは試験の1時間前に飼育ケージから出された。各居住者は自宅のケージで集団飼育の侵入者と10分間対戦した。試験終了後、侵入雄はケージから追い出され、コンパニオンの雌は次の試験まで居住雄と再会した。攻撃性は攻撃潜時と攻撃回数の2つのパラメータを用いて測定した。攻撃潜伏時間は最初の攻撃までの時間としてスコア化され、最初の1分間に攻撃したマウスは1、2分間に攻撃したマウスは2というようにスコア化された。10分間の試験で攻撃しなかったマウスは11点とした。無菌（GF）群では、コンタミネーションのリスクを避けるため、アイソレーター内で常駐侵入者試験を行った。そのため、評価の盲検化は不可能であった。その代わりに、行動観察は2人の個人によって視覚的にモニターされ、記録されたが、違いは観察されなかった。さらに、試験終了時に居住者と侵入者を区別するため、隔離段階の前に侵入者の耳に耳パンチを行った。記録された動画ではパンチを確認することはできず、各マウスを個別に識別することはできなかった。その代わりに、常駐マウスと侵入マウスの攻撃性スコアの合計を算出した。マウスの攻撃性試験に関する最初の統計的比較はKruskal-Wallis、補正なしDunn post-hocsで行い（SPF、GF、C-GF、ABX）、その後の2群間比較（SPF対ABX、ABX-FMT-レシピエント対コントロール-FMT-レシピエント）はPrism 9.5.0（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を用いて片側Mann WhitneyU検定で行った。
4.3. マウス尿の非標的メタボロミクス
4.3.1. サンプル調製
尿サンプルは、8～9週齢の雄マウスから、膀胱マッサージ法(Hoban et al., 2016)を用いて1.5mlエッペンドルフチューブに直接採取した。グループには、GF（N = 4）、SPF（N = 4）、コロニー形成GF（N = 4）および抗生物質処理SPF（N = 4）が含まれた。さらにSPF群については、加害試験前（T0、N=4）と試験後（T14、N=4）の尿サンプルを比較した。採尿は侵襲的であるため、サンプルを容易に提供しなかったマウスはこの解析から除外した。サンプルは-80℃で保存し、ドライアイスでフィンランドのAfekta Technologies Ltd.に輸送した。到着後、マウスの尿サンプルを氷水浴で解凍し、ボルテックス（10秒）し、希釈のため、アリコートをフィルタープレート（Captiva NDフィルタープレート0.2 µm）に移し、クラス1の超純水を加え、サンプル100 µlあたり300 µlの割合で混合した。代謝物抽出のため、冷アセトニトリルを尿サンプル100 µlあたり400 µlの割合で加え、混合した。その後、サンプルを700×g、4℃で5分間遠心分離し、分析まで4℃で保存した。各上清から50 µlを採取し、1本のチューブにまとめてプール品質管理（QC）試料を調製した。
4.3.2. LC-MS分析
サンプルは、1290 Infinity II UHPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, USA) と高分解能 QTOF 質量分析計 (Agilent 6546 with Jet Stream ion source, Agilent Technologies) を組み合わせた液体クロマトグラフィー質量分析 (LC-MS) により分析した。分析法については、すでに述べた（Hanhineva et al., 2015,Klavus et al.） 簡単に説明すると、逆相 (RP) 分離には Zorbax Eclipse XDB-C18 カラム (2.1 × 100 mm, 1.8 µm; Agilent Technologies) を、HILIC 分離には Aqcuity UPLC BEH amide カラム (Waters) を使用した。各クロマトグラフィーの実行後、ポジティブモードとネガティブモードでジェットストリームエレクトロスプレーイオン化（ESI）を用いてイオン化を行い、サンプルごとに4つのデータファイルを得た。MS/MS分析のコリジョンエネルギーは、スペクトルデータベースとの互換性を考慮して、10、20、40 Vを選択した。
4.4. データ前処理
ピーク検出とアライメントはMS-DIAL ver. 4.90 (Tsugawa et al., 2015)で行った。ピーク収集には、50～1500のm/z値とすべての保持時間を考慮した。最小ピーク高さの振幅は5000とした。ピークは線形加重移動平均アルゴリズムを用いて検出した。サンプル間のピークの位置合わせのため、保持時間の許容差は0.2分、m/zの許容差は0.015 Daとした。溶媒ブランクサンプルを用いて溶媒バックグラウンドを除去し、さらにデータ解析を行うためには、サンプル全体の最大シグナル量が溶媒ブランクサンプルの平均値の5倍以上である必要があった。
ピークピッキングの後、検出された86,194の分子フィーチャーがデータの前処理とクリーンアップステップに含まれた。低品質のフィーチャーにはフラグを立て、統計解析から除外した。欠損値が少ない、QCサンプルの70%以上に存在する、少なくとも1つの試験グループのサンプルの60%以上に存在する、RSD*が20%未満、D-ratio*が10%未満。さらに、RSD*またはD-ratio*のいずれかが閾値を超えている場合でも、古典的なRSD、RSD*および基本D-ratioがすべて10 %以下であれば、その特徴は高品質とみなされた。信号は信号ドリフトとバッチ効果のために正規化された。前処理とデータクリーンアップの結果、62,837の分子フィーチャーが高品質とみなされ、FDR補正計算に含まれた。データクリーンアップ前の分子フィーチャー数が多いのは、装置の感度が高く、実際の代謝物ごと に複数のシグナルが収集されるだけでなく、溶媒のバックグラウンドや検出器のノイズも収集されるためであ る。
4.4.1. データ解析
尿サンプルの代謝物プロファイルの統計解析には、特徴ごとのウェルチのt検定を使用しました。各分析における効果の大きさを測定するために、フォールドチェンジ（2群間の相対変化または差を群平均の比（前者を後者で割った値）で表したもの）およびコーエンのD値（効果の大きさを標準偏差の差で表したもの）を計算した。質の高い特徴のP値は、FDR補正を用いて多重検定用に調整した。すべての解析はRバージョン4.1.2で行った。
4.4.2. 化合物の同定
有意差のある分子フィーチャーのクロマトグラフィ特性および質量分析特性（保持時間、精密質量、MS/MS スペクトル）を、社内の標準ライブラリおよび METLIN や HMDB などの一般に利用可能なデータベースのエントリ、ならびに公表文献と比較しました。各代謝物のアノテーションと同定レベルは、Chemical Analysis Working Group (CAWG) Metabolomics Standards Initiative (MSI) (Sumner et al., 2007) が発表した推奨事項に基づいています。
4.5. 全脳の高速液体クロマトグラフィー（HPLC）
セロトニン、トリプトファン、および関連代謝産物5-HIAAのレベルを定量化するため、行動アッセイを行わず（急速断頭により犠牲にした）、(Mosienko et al., 2012)に記載された方法で調製した8～9週齢の雄マウスのSPF（N = 5）と抗生物質処理SPF（N = 5）の全脳について、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析を行った。Trp、5-HTおよびその代謝物である5-HIAA (Cat Nrs. T0254, 14927, 55697, それぞれ Merck KGaA, Darmstadt, Germany)の組織レベルは、蛍光検出器付きuHPLCを用いて分析した。
4.5.1. 統計分析
5-HT、Trpおよび5-HIAAの量は、統計解析のために湿潤組織重量に対して正規化し、物質レベルの算出は外部標準値に基づいて行った。5-HT、Trp、5-HIAAおよび5-HTターンオーバーの統計的比較は、Prism 9.5.0（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を用いて、片側Mann WhitneyU検定により行った。グラフは平均値±SEMで示し、アスタリスクは有意性を示す（*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.0001）。
4.6. RNA配列決定（トランスクリプトミクス）
生後8-9週齢のSPFマウス（N = 3）および抗生物質投与SPFマウス（N = 3）から、行動検査を行わずに脳を摘出した。マウスは急速断頭により犠牲とし、脳を摘出した。海馬、前頭前皮質、中隔は13ゲージの針で、扁桃体は16ゲージの針で、視床下部は14ゲージの針で分離した。サンプルは処理するまで-80℃で保存した。RNAeasy Mini Kitを用い、製造者の指示に従って全RNAを抽出した（QIAGEN, Manchester, UK）。単離されたRNAの完全性は、BIUのアズリエリ医学部のゲノムテクノロジーセンターで、Agilent RNA Pico Kitとバイオアナライザーを用いて検査した。NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, USA))を用いてmRNA単離のために全RNAを採取し、NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, USA))を用いてライブラリーを調製した。ライブラリーの定量は、dsDNA HS Assay KitとQubit 2.0を用いて行った。4nMのライブラリーを0.2M NaOHで5分間室温で変性させ、1.45pMを1 % PhiXライブラリーコントロールとともにフローセルにロードした。ライブラリーはIllumina NextSeq550装置で75サイクルシングルリードシーケンスした。
4.6.1. RNAデータ解析
RNAシーケンスデータ解析では、STAR（バージョン020201）（Dobin et al., 2013 ）を用いてリードをMus musculus参照ゲノムGRCm39にアライメントし、htseq-count（バージョン0.12.4）（Anders et al., 2015 ）と遺伝子リスト（Ensembl gtfファイル）（Howe et al., 2021 ）を用いてリードの定量を行った。その後、DESeq2（バージョン1.30.1）（Love et al., 2014 ）を用いて差次的遺伝子発現解析を行った。有意な差次的発現遺伝子は、p値が0.05より小さく、log2 fold changeが0.58以上の閾値を用いて選択した。ボルケーノプロットはggplot2（バージョン3.3.2）を用いてレンダリングし、ヒートマップはpheatmap（バージョン1.0.12）を用いて作成した（Wickham, 2016 ）。パスウェイ濃縮解析のために、遺伝子セット濃縮解析（GSEAバージョン4.0.3）（Subramanianら、2005 ）は、3つのデータセット：hallmark、Curated Canonical PathwaysおよびGO遺伝子セットを使用して、ヒト遺伝子に変換されたランク付け（-log10（p値）/sign（log2FoldChange））されたすべての遺伝子に対して使用された。GSEAの結果（q-value≤0.05）を分類し、プロットした（ggplot2 version 3.3.2を使用）。
CRediT著者貢献声明
Atara Uzan-Yulzari：原著論文執筆、視覚化、形式的解析、データキュレーション、概念化。ソンドラ・タージュマン 執筆-校閲・編集、執筆-原案、検証、監督、プロジェクト管理、方法論。Lelyan Moadi：方法論。ドミトリー・ゲツェルター 方法論。エフラット・シャロン：方法論 サムリ・ラウタヴァ 執筆-校閲・編集、リソース。Erika Isolauri:原稿執筆、リソース。ソリマン・カティブ 方法論。Evan Elliott：監督、方法論。オムリ・コレン 執筆-校閲・編集、執筆-原案、監修、プロジェクト管理、資金獲得、構想。
利益相反宣言
著者らは、本論文で報告された研究に影響を及ぼすと思われる競合する金銭的利益や個人的関係はないことを宣言する。
謝辞
ST、LM、ES、OKは、欧州連合（EU）の研究・イノベーションプログラム「Horizon 2020」の下、欧州研究会議（ERC）の支援を受けている（助成金協定