Fomes fomentariusの複雑な構造は、高性能な超軽量材料の建築設計を象徴している
Fomes fomentariusの複雑な構造は、高性能な超軽量材料の建築設計を象徴している
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ade5417
ROBERT PYLKKÄNEN HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-0081-5280, DANIEL WERNER HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-2906-8194, [...], AND PEZHMAN MOHAMMADI HTTPS://ORCID.ORG/0000-0003-4593-5371 +10 authorsAuthors Info & Affiliations
科学の進歩
2023年2月22日
第9巻 第8号
DOI: 10.1126/sciadv.ade5417
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概要
高強度、高硬度、および破壊靱性は、菌類の肉質体とはあまり結びつかない機械的特性である。本研究では、Fomes fomentariusが例外であり、その建築的デザインが、新たな超軽量高性能材料のインスピレーションの源となることを、構造、化学、力学的特性評価によって明らかにした。本研究の結果、Fomes fomentariusは、マルチスケールで階層的な自己組織化を行う3つの異なる層からなる、機能的にグレードの高い材料であることが明らかになった。すべての層で菌糸が主要な構成要素となっている。しかし、各層において、菌糸は独自の優先配向、アスペクト比、密度、枝の長さを持つ非常に明確な微細構造を示す。また、細胞外マトリックスが補強接着剤として働き、その量、高分子含有量、相互接続性が各層で異なることも示した。これらの知見は、前述の特徴の相乗的な相互作用により、各層で異なる機械的特性が得られることを示している。
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はじめに
木材、骨、絹などの多くの軽量生体材料は、卓越した強度、硬度、破壊靭性を示し、その生理的機能にとって極めて重要である(1-6)。これらの材料は、ナノからメソスケールまでの特徴的な寸法を持つハードおよびソフトなビルディングブロックが、複雑な多相多成分複合体に階層的に配置されたものである。これらの特性は、菌類の肉質体にはあまり見られないが、生物材料の多様性は極めて豊かであるため、菌類が作り出す多細胞子実体は、その外観や食味だけでなく、並外れた材料特性においても大きなバリエーションを持つことが予想される（7-9）。
この菌は、軽量なポリポア子実体を生産し、優れた機械的耐久性を持つ皮革や柔らかいフェルト状の材料として、数千年にわたり使用されてきた（10, 11）。F. fomentariusは、北半球全域のシラカバやブナ林にごく普通に生息しており、枯死木に吸収されたままの炭素やその他の栄養分を放出する重要な生物学的機能を有している(12)。具体的には、F. fomentariusの菌糸は、傷ついた表面から樹木に侵入して内部で成長し、セルロース、ヘミセルロース、リグニンを分解して、白腐病と呼ばれる過程を経る(13)。
樹木の外では子実体しか見えないが、子実体は子実体から担子胞子として放出され、菌の性的繁殖を行うという主要な生物学的機能を有している。F. fomentariusの場合、子のう膜は子のう膜管（H. tube）と呼ばれる多孔質構造に配列されており、子のう膜から大量の胞子を放出するための利用可能な表面積を増やす重要な役割を担っている(14)。胞子放出の誘因として、F. fomentariusは春と秋の比較的低温で胞子形成し、夜間胞子放出パターンを示すことが既存文献から報告されている(15, 16)。また、F. fomentarius については報告されていないが、一部の菌種では衝撃によって胞子を放出することが報告されている(17)。
リグノセルロース系バイオマスから生分解性皮革様材料を生産する大きな可能性を持っているにも関わらず、意外にも F. fomentarius の子実体とその材料特性は、ごく最近になって科学界から注目されるようになった (18, 19)。さらに、ブラケット菌の子実体に見られる様々な構造要素の特定の力学的役割については、将来的に天然素材を凌駕する特性を持つ多機能超軽量素材を製造するためのインスピレーション源となり得るにもかかわらず、我々の知る限り、広く受け入れられた説明は存在しない。しかし、多年生ポリポアは一般的に硬くて粘り気のある子実体を作るため、その存在期間中に遭遇するさまざまな自然障害に耐える必要がある。例えば、木の枝などの落下物による衝撃や、風や雪などの気候条件による負荷は比較的容易に想像できる。また、子実体は甲虫などの菌類食動物からの攻撃に対して十分な防御を備えている必要があるが、これらの生物の中には、菌類が胞子をより効率的に広げることを助けるものもあることに注意する必要がある(20)。
本研究では、F. fomentarius の子実体の複雑な構造設計を、クラスト、コンテクスト、H. チューブの 3 つの異なる層という観点から、構造的、化学的、機械的に詳細に評価した（Fig. 1）。さらに、各層における菌糸の優先配向、アスペクト比、密度、枝の長さが異なることを説明した。また、細胞壁や細胞外マトリックスの量、高分子量、相互結合性などが各層でどのように異なるかについても報告した。これらの結果は、今後、多様な医療・産業応用に向けて、優れた特性を持つ多機能材料を生み出すための大きなヒントになると考えられる（10, 21-23）。
図1. 本研究で使用したF. fomentariusの超構造体。
クラスト（I）、コンテクスト（II）、H.チューブ（III）の3つの主要領域とそれらに対応する界面（丸）のX線2次元投影図を示す。黄色の破線は後方から前方へ伸びており、コンテクストとH. tube層の境界を示している。
結果
F. fomentariusの超微細構造
ミクロスケールでは、このユニークな素材の有効な構成要素は、菌糸を形成する菌糸網である。菌糸の細胞壁は、多糖類、タンパク質、脂質、色素、およびごく少量の無機成分などの分子間の化学的相互作用によって形成されるナノスケール構造で構成されている。F. fomentariusの子実体の発生は、一般に、分化と多細胞化の多段階の過程を経ている。光、温度、重力、湿度、分子シグナルなどの外部刺激に応答して、ゲノムレベルから変化が起こり、最終的には菌糸の行動や生理機能が変化する(24)。F. fomentariusが作る大きな子嚢体は直径50cmにも達し、菌が木を分解する間に成長し、そのプロセスは30年以上に及ぶこともある。通常、毎年1～3層の新しい子実体が作られ、そこから1時間当たり最大2億4000万個/cm2の胞子を放出する(14)。F. fomentarius の子実体の人工的な室内培養は、我々の知る限りまだ報告されておらず、したがって、この種の子実体形成を誘導する正確なメカニズムやシグナルは不明なままである。
F. fomentarius の子実体の複雑な構造の特性評価を開始するために、我々は収集した標本を個々の切片に分解することから始めた。子実体の断面と表面を画像化したところ、子実体は厚みや微細構造が異なる3つのマクロスケール層からなるマルチスケール階層構造であることがわかった（図1、図2、A～C、動画S1～S6）。子実体の外側の領域は、クラストと呼ばれる硬い保護層からなる（図2A、動画S1）。高分解能X線マイクロCTと走査型電子顕微鏡を用い、クラスト層は緻密で均一な構造であり、空隙が少なく、微細な構造的特徴は見られないことを特徴とした。さらに、この層の菌糸ネットワークは、細胞外マトリックスに大きく埋め込まれ、接着していた。また、地殻の厚さは一様でないことに注目し、後部の900μmから前部の200μmまでと特徴づけました。さらに、クラスト表面にはSEMおよびμCT画像でマイクロメートルサイズのクラックが観察されたが、これはサンプルを薄切にした際に生じたと思われるアーチファクトとして処理した。
図2. X線μCTと高分解能SEMによる子実体の3つの主要な領域の詳細な観察。
(A) 地殻の断面と表面のμCTとSEM画像。(B）コンテキストのμCT像とSEM像。(C) 様々な回転位置でのH.チューブのX-Y-Z CTスライスと3D再構成。(C)は断面のSEM画像も示している。内部領域とチューブ壁は黄色の破線で示されている。(D）3つの領域すべてについて、μCTスライドから計算された空隙率。また、各層の計算密度も示している。(E と F) H. チューブと同様にコンテクスト内のハイファの計算された枝の長さ。
地殻に隣接するのは、コンテクストと呼ばれる泡のような柔らかい革のような層である。クラストとコンテキストの界面では、菌糸網の一部がクラストと同じ細胞外セメントに埋め込まれており、緩やかな移行が観察された。この勾配は最終的に、菌糸がコンテキストの細胞外マトリックスから解放されて見えるところまで到達し（図2Bおよび動画S1）、菌糸（直径、〜2μm）は部分的に整列し、数百マイクロメートルまでの枝分かれを持つようになる。
コンテクストに隣接する最終層は、H.チューブと呼ばれる中空管状構造からなり、優先配向性を持ち、重力によって平行に整列する（図2C、動画S2〜S4）(14)。H.チューブの壁は、隣接するチューブ間に明確な境界がなく、共有の菌糸網（厚さ約20〜50μm）からなり、菌糸はH.チューブの長手方向軸と平行に配向していることが好ましいとされています。また、チューブ内の菌糸網は、地殻と同様に細胞外マトリックスによって接着されているが、その量は実質的に少ない。
μCTおよびSEM画像から抽出された、各層で異なる他の顕著な特徴は、空隙率と密度である。各層で定量化された空隙率と密度は、地殻、文脈、H. 管でそれぞれ約 11.5 ± 3, 47.7 ± 4, 70.9 ± 7%、875 ± 23, 369 ± 57, 337 ± 31 kg/m3 と算出された（図 2D）。目視観察と一致するように、これらの値は、クラストが最も密度が高く、最も多孔質の層を形成し、コンテクストとH. チューブが最も密度が低く、最も多孔質の層を形成していることを確認するものである。3層とも菌糸網が主要な構成要素であることから、層間の主な構造の違いは、網目密度の割合、菌糸を埋め込む細胞外セメント、H. 管がかなりの空隙を含むという概念によって規定されると考えられる。
先に述べたように、文脈中の菌糸とH. tubeの間には枝の長さの違いも明らかであったので、μCTデータを解析することによって枝の長さをより詳細に定量化した（図2、EおよびF）。コンテキストの菌糸の平均枝長は約200μmであったのに対し、H. tubeでは約25μmと短い枝長であった。枝の長さに10倍もの差があることから、コンテキストの菌糸は枝分かれよりも伸長を好み、H. チューブでは伸長よりも枝分かれを好むと考えるのが妥当であろう。このような高度に配向したチューブ壁は、菌糸の成長方向の再調整につながる頻繁な分岐事象の結果であると思われる。μCTスライスでは菌糸網が識別できなかったため、痂皮の枝の長さを定量化することはできなかった。最後に、これら3つの主要な層に加えて、子実体には他の構造要素も存在する。例えば、子実体と木をつなぐコア構造（図1および動画S6）および文脈とH. 管の界面にある円錐形の転移点により、H. 管の出現が起こる（図1および動画S5）。
H.チューブは子実体の主要な部分を形成する
その結果、H.チューブは子実体内で最も顕著な構造構成要素であることがわかった。その結果、H. tubeは子実体の大部分に占める割合が約69%であり、地殻と文脈はそれぞれ約4%と約29%であることがわかった（図1）。H. tubeの構造をより深く理解するために、H. tubeの壁とそれに対応する空洞を3Dで再構築した（図3A）。これらの再構築により、管の配列、向き、間隔、サイズ、直径が極めて一貫していること、また、H. 管に斜めやその他のずれ/向きがないことが強調された。
図3. F. fomentariusの中で最も大きな面積を占める子宮腔管。
(A) ♀管（金茶色）と各♀管の計算上の空隙（青色）の3次元復元図。上面図と側面図からエアポケットを示した。(B) 5つのゾーンについて計算されたH. チューブの直径と、代表的なμCTスライス。(C) 脈絡管とH.チューブの界面（ゾーンIに対応）。脈絡管領域において、成長コーンに集合する前に菌糸網が優先的に配列し、最終的にチューブの形成をテンプレート化していることがわかる（個々のコーンは青い矢印で、チューブは赤い矢印で、成長コーンの配列は緑の角括弧で示されている）。(D）胞子が放出されるH. tubeの表面（子実体の最も活発な領域）を詳しく観察し、一次および三次菌糸を示したもの（ゾーンVに相当）。
次に、H. tubeはその長手方向に構造的に一貫しているのか、という疑問があった。そこで、縦軸方向に等間隔で5つのゾーンに分け、それぞれのゾーンにおける菌糸構造の一貫性を個別に分析した（図3B）。ゾーンIは子実体の上部に、ゾーンIIIは中部に、ゾーンVは下部にそれぞれ対応するような命名法を選んだ。これは、子実体の上部（古い領域）と下部（若い領域）にあるH. tubeの違いを識別するためである。チューブの長さは最大4cmに達するが、異なるゾーン間でその構造は一貫して徐々に変化しているようである。一般的なチューブ構造から最も大きく逸脱しているのは、界面領域に最も近いゾーンIとIIである。また、隣接する2本のH. チューブが融合していることも、大きな変異の原因であることがわかった。これは、菌糸が分化してH.チューブになるという考え方と一致する。したがって、ゾーンIとIIで観察されたチューブの形状や直径の不一致は、ゾーンII、IV、Vで完全に円形になる前の中間遷移点であることがわかる。
そこで、菌糸を形成する菌糸網がマイクロスケールの長さで時空間的に制御されていることに興味を持ち、ゾーンIの管状構造物の上方で、コンテクスト管とH. 管の間の移行境界を正確に調べることにした（図3C)。驚いたことに、菌糸は（i）コンテクスト内でかなり優先的に配列し、（ii）マイクロメートルサイズの円錐状の集合体（後に「成長コーン」と呼ぶ）の明確で等間隔な束に合体し、（iii）その後、これらの独特の制約を受けたドメインに十分な構造安定性と剛性を与える細胞外マトリックスが生成され、H. tubeの形成が開始されていることが分かった。最終的には、菌糸網の枝長が短く、アスペクト比が低いことにより、中空を持つ明確な管状形状を維持することができた（図2、EおよびF）。隣り合う2つのチューブ間の壁厚が20～50μm程度しかないことを考えると、このような限られた空間での密なパッキングを促進する最も効果的な手段である（Fig. 3A）。また、成熟したH. チューブにならなかった成長円錐は、成熟したH. チューブになった成長円錐と比較して、およそ45°の角度で存在していることに注目した。この2組の成長円錐の間には、文脈に類似した外観を持つ層が存在する。ブラケットポリポアは通常、重力形態形成反応を示し、新しい空間位置に適した新しい結実構造を作り出すので（25）、これらのずれた円錐は、菌類標本の寿命のある時点で、白樺の幹の向きが違っていたことを示すものかもしれない。
最後に、子実体の底部（ゾーンVに相当）にあるH. tubeの開孔部を調べた（図3C）。前述のように、これらのゾーンのH. 管は、各H. 管の開放端の空隙を中心とした中空球状領域が平坦な開口部とは対照的にあることを除いて、概ねゾーンIIIおよびIVと同様の外観であった。H. チューブの壁の内側に見られる一次菌糸は、チューブと平行な方向を好み、壁の表面を覆って胞子を放出する三次菌糸は、チューブの中心に向かって好ましい方向を持つ傾向があった (Fig. 3D) 。
構造解析と化学分析
次に、F. fomentarius の子実体に見られるナノスケールの構造的・化学的特徴をより深く理解するために、主要な3層について様々な非侵襲的スペクトル分析を行った。まず、放射光広角・小角X線散乱法（WAXS/SAXS）を用いて、3つの主要層とその界面を含む子実体のスライスのプロファイルを測定した（図4、A～C）。最も高い信号強度は地殻層から得られ、次いでH. tubeとcontextから得られ、ピーク強度は概ね同じq値の周辺に集中していた。この傾向は、各層の結晶化度と直接的な相関があり（図S1）、地殻は87 (±6) %と最も高い結晶化度を示している。その後、コンテクストでは42 (±4) %と大幅に減少し、H. チューブでは81 (±3) %と再び増加した。回折データ、SEM画像、およびμCTスライス（Fig. 4, A, B）はすべて、明らかに細胞外マトリックスのないコンテクストとは対照的に、結晶化した細胞外グルーにおける菌糸ネットワークの具体化と直接関連するクラストとH. チューブの高度の結晶性を描写するものであった。
図4. スペクトル解析により、クラスト、コンテクスト、H. チューブの間に明確な構造的・化学的差異があることが示された。
(A)クラスト-コンテクスト-H.チューブ界面のX-Y CTスライスと同領域の3次元再構成図。(A)はまた、対応する試料の外側から内側にかけての92のWAXS/SAXS同時測定結果を示している。(A)は(C)と同様に111個の円弧の方位角積分によるHOPの計算結果も示している。(B) 各層からの高分解能SEM画像。(C) 各層に対応する1次元および2次元のWAXS/SAXS測定。(D) (B)で撮像した層に対応するクラスト、コンテクスト、H.チューブのATR-FTIR測定結果。
菌糸網の向きの違いを推定するために、放射光WAXS測定から得られた111個の円弧の方位角積分からハーマンの配向パラメータ（HOP）を算出した（図4A）。この結果、地殻からH.チューブに向かうにつれて、配向が徐々に大きくなっていることがわかった。我々の計算によると、配向性は地殻層で最も低く（HOP値は約0.0）、文脈層でわずかに増加し（〜0.25）、H. チューブで最も高く（〜0.4）なります。これらの観察は、μCTデータから方位パラメータを計算することによってもさらに確認され、同様の傾向を示した（図S2）。この配向の定量的決定は、SEM画像から得られる定性的な観察結果とよく対応している。
各層における分子ビルディングブロックの組成をよりよく理解するために、各層についてWAXS一次元（1D）回折パターンを測定した（図4C）。その結果、すべての層の主要なピークプロファイルは、超分子集合体に結晶化することが示されている三重らせん状のβ-1,3-グルカンから主に生じていることがわかった(26)。しかし、クラスト層では、18.2 nm-1を中心とする幅広い回折ピークと、3.7、6.6、7.4 nm-1に文献上では明確に特定できないいくつかの狭いピークが見られた。これらのピークは、多糖類、タンパク質、脂質、色素、あるいは無機塩類に由来すると予想された。そこで、我々はさらに、attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) を用いて、クラスト、コンテクスト、H. チューブの化学組成全般を調べた（図4D）。X線回折による観察と一致するように、ATR-FTIRでも、コンテクストとH. チューブの類似性が明らかになった。一方、クラスト層は、特に脂質とタンパク質含量の点で他の2つの層と大きく異なっていた（図S3）。多糖類（〜45〜60%）が主成分で、タンパク質（〜20〜30%）、ワックス/脂質（〜20〜30%）がそれに続くことがわかった。
クラスト、コンテクスト、H.チューブの3つの異なる層に見られる主要な多糖類の組成と特定のグリコシド結合をさらに解明するために、我々は高磁場魔法角回転核磁気共鳴（NMR）を用い、プロトン検出双極子およびスカラー（Jベース）1H-13C相関実験を行った（図5A） (28). これは、以前に割り当てられたように、天然アバンダンス系に対する真菌細胞壁の剛直成分と可動成分を研究する手段を提供した(29)。予想通り、β-グルカンとキチンはすべての層で見つかった。α-グルカンの最初の炭素化学シフト [C1, ~103.87 parts per million (ppm)] は地殻層にのみ見いだされた。さらに、35 ppm (炭素) 付近のシグナルはクラスト層にのみ見出され、硬いタンパク質または/および脂質の存在を示唆した。さらに、13C標識真菌細胞壁モデルについて以前に述べたように、ピーク積分解析によって各多糖の相対存在量を推定した（図5B）(30)。その結果、クラスト層はα-グルカンとβ-グルカンの両方が55%、キチン1%、その他の多糖類が44%で構成されていると推定される。コンテクスト層は、69％がβ-グルカン、2％がキチン、29％がその他の多糖類から構成されている。同様に、H.チューブの層は、38%のβ-グルカン、5%のキチン、57%のその他の糖質から構成されている。その他の糖質とは、α-1,3-フカン、マンナン、β-1,6-グルカンなど、細胞壁の他の主要多糖の組み合わせを指す可能性がある（31, 32）。文脈とH-tubesの両方が同一の化学組成を示し、相対的な出現率にばらつきがある。β-グルカンはコンテクスト層に多く存在し、多糖の50%以上を占めている。また、脱アセチル化度（DDA = (Int. Ch8/Int. Ch2) × 100; Ch8とCh2はそれぞれキチンの炭素原子8と2を表す）は、クラスト層とHチューブ層でそれぞれ41%と54%と推定された。残念ながら、コンテクスト層ではS/N比が不十分であったため、この判定は不可能であった。さらに、移動性成分（多糖類／脂質／タンパク質）を明らかにするために、すべての層で2次元スカラー（Jベース）1H-13C異核相関（hCH）実験を記録した。我々は、すべての層で移動性脂質アシル鎖のシグナルと適合するような相関をほとんど観測した（割り付けは図S4に示す）(33)。
図5. 図5 各層に存在する菌糸の細胞壁は、異なる化学組成と構造編成を示す。
(A) クラスト、コンテクスト、H-チューブの1Hプロトン検出（交差偏光（CP）ベース）2次元1H-13C相関スペクトル（バックCPは200μs）。(B) Topspinを用いたピーク積分から算出した各層に存在する多糖類の相対量。(C) 地殻、コンテクスト、H. チューブにおける菌糸の細胞壁の模式図。主要な構成要素、それらの相互接続性、および細胞膜に対するおおよその位置が示されている。
結論として、細胞壁化学の複雑さは、Fig. 5C に描かれている。ここでは、各層について異なるスペクトル技術を用いて測定したおおよその細胞壁成分の模式図と、以前に報告した真菌細胞壁の構造と化学の一般的な理解を示す(31, 32)。
層の力学的特性
最後に、得られた各層のマルチスケール構造的・化学的特徴と機械的特性の相関を調べた。我々は、引張、圧縮、およびナノインデンテーション試験を行うことで、それらを系統的に研究した。一般に、生体材料は湿度に強く反応するため、相対湿度50%で特性評価を行った(34-38)。最初のステップとして、引張測定を行った。Fig. 6A は、文脈と H. 管の典型的な応力-ひずみ曲線を示している。コンテクストについては、厚みが薄く、もともと剛性が高いため、サンプル作成時に変形や割れが生じやすく、引張測定を行うことができなかった。H.チューブの応力-ひずみ応答は，瞬間的な破壊に至るまで正の勾配を持つ降伏曲線を示していた。しかし，その状況は，正の勾配の降伏曲線から始まり，初期破壊を経て，ギザギザの痕跡と二次破壊を示すという複雑な形状を示した。H.チューブの極限強度，ヤング率，極限ひずみは，それぞれ39.23±11.7 MPa，2.7±0.7 GPa，2.8±0.8 %であった。コンテクストでは，一次最大強度，弾性率，ひずみはそれぞれ5.8±2.1 MPa，0.3±0.13 GPa，4.3±2.6%， 二次応力，ひずみはそれぞれ 2.3±0.84 MPa，7.09±5.1% であった。H.チューブは針葉樹，広葉樹，コルク，皮革などの各種細胞質材料と比較して，密度を考慮したヤング率と強度を示していることは特筆される（図6，B，C）。
図6. 各層の機械的特性評価。
(A) コンテキストとH.チューブの代表的な引張応力-歪み曲線。応力、ひずみ、ヤング率、靭性の平均値±SD（n = 8）も示す。(B と C) 異なる種類の天然素材と合成素材を、文脈と H. 管の領域と比較したアシュビープロット。ヤング率対密度、および強度対密度を示す。(D) 機械的応答と破壊メカニズムをより明確にするために、引張試験後の破断面からもSEM画像を撮影した。
次に，上記の強化・靭性化メカニズムを検証するために，引張試験後の両層の破断面をSEMで観察し，変形と破壊の過程を想定した。その結果，2つのサンプルの間に大きな違いが確認された（Fig.6D）。H.チューブは鈍い表面を示し、引き抜きの領域が小さくなっているように見えた。これは、前節で述べた結果から明らかなように、ネットワークの高度な配列、低いアスペクト比、および結晶化度の高い細胞外接着剤への具現化の相乗作用によるものと考えられる（Fig. 4, A～C, および fig. S1）。したがって、菌糸微細繊維間の共有および非共有分子相互作用を通じて界面面積が劇的に増加した。その結果、H.チューブの菌糸網は、空隙率が高く密度が低いにもかかわらず、大きな転位や大きな塑性変形を起こすことなく、より大きな力に抵抗することができる。しかし、引張歪は小さくなる。しかし、H.チューブは最大強度とヤング率が約10倍高くなった。この結果、最終的にH. チューブの場合（0.73 ± 0.3 MJ/m3）、コンテキスト（0.2 ± 0.05 MJ/m3）に対して全体的に大きな靭性係数（応力-ひずみ曲線下の領域）が得られた。
一方、コンテキストの菌糸網は、二次破断後も両方の界面に接続されたままのセグメントを示した。これは、菌糸体が高いアスペクト比と低い界面接着力を示すことによる、引張応力-ひずみ測定時の機械的応答と観察された二段階破壊機構と直接的に相関する（Fig. 6A）。引張荷重を受けると、界面マトリックスの弾性反応に驚くほどの力が加わるまで、コンテクスト層の菌糸ネットワークは変形に抵抗する。その後、菌糸体は徐々に滑り、エネルギー散逸し、隠れた長さが伸び、伸長中に犠牲結合が解かれ（ギザギザの痕跡）、最終的に破局的な破壊に至る。細胞外マトリックスの塑性応答は、2～4%の歪みの範囲に収まっており、H. tubeとコンテキストの一次破壊点の両方の破壊応答から明らかである（Fig. 6A）。
ネットワークの異方性と界面マトリックスの役割をよりよく関連付けるために、菌糸の向きに平行または垂直に、H. チューブとコンテキストの両方について圧縮試験を行った。そのために、観察されたマクロスケール構造と菌糸の方向性から、縦方向または横方向に切断して試料を準備した。その結果、予想通り、圧縮の力が菌糸網の長手軸に平行な場合には、両層とも圧縮強度が優れており、さらに、H. tubeの配向が大きい場合には、圧縮力に対する抵抗力が縦方向および横方向の負荷でそれぞれ約8および2MPaとなり（図7Aおよび動画S7とS8）、一方、文脈の圧縮力は縦方向の切断でそれぞれ1.8および0.61 MPaであった（図7Bおよび動画S9）。また、コンテクストには存在しないH.チューブの細胞外マトリックスがH.チューブの菌糸網を接着する主要な構成要素となっており、H.チューブの機械的特性を向上させることがわかった。圧縮時の破壊メカニズムを調べるため，測定後に横方向と縦方向に切断した試験片をμCTで画像化した（図7，C，D）。横方向圧縮荷重の場合（図 7C）には，H.チューブの壁が曲がり，亀裂が発生し，その後，亀裂が隣接するH.チューブに沿って伝播する逐次エネルギー散逸型破壊が観察された。平行圧縮荷重の場合（図7D），H. tubeは座屈効果によってエネルギーを散逸し，長手方向に沿ってH. tubeの変形が生じる。
図7. 菌糸が長手方向に優先的に配向することで、材料の機械的性能が向上することがわかった。
(A, B) 縦方向と横方向に切断した試験片のコンテクストとH.チューブの代表的な圧縮応力-歪み曲線。(A）および（B）は、圧縮試験前の試料の高解像度SEM画像も示しており、文脈およびH.チューブの菌糸の長手方向の配向を説明している。H. チューブでは菌糸を埋め込んで接着している細胞外マトリックスの存在を、コンテキストの場合は細胞外マトリックスが見られないことを、偽色のSEM画像で示している。(C）圧縮試験後のH.チューブのX-Y CTスライスから、材料が連続的なエネルギー散逸型破壊を起こすことがわかる。これには曲げ、亀裂の発生、そして最後に横方向の切断のための亀裂の伝播が含まれる。(D）圧縮試験後のH.チューブを縦に切断したX-Y CTスライスで、材料が座屈効果によってエネルギーを放散している様子を示している。(E）クラスト、コンテクスト、H.チューブの押込み弾性率。
最後に、クラスト、コンテクスト、H.チューブの押込み弾性率を測定した（図7E）。この値は、クラスト、コンテクスト、H. チューブでそれぞれ 2.58 ± 0.48, 0.013 ± 0.02, 0.53 ± 0.15 GPa であり、硬い外層であるクラストは H. チューブとコンテクストに比べ、それぞれ約 20 倍と 200 倍の耐摩耗性と変形性を持っていることが分かる。
考察
F. fomentarius の子実体は、巧妙に軽量化された生物学的デザインであり、構成は単純であるが性能は高い。例えば、昆虫や倒木からの保護といった様々な機械的ニーズだけでなく、繁殖（胞子の形成と放出）、生存（動物にとって好ましくない食感と味）、季節の変化による複数年の子実体の繁茂といった機能的ニーズも満たす、エレガントな戦略を示している。このように、子実体の大部分は生きた細胞（菌糸体）で構成されているため、多くの生物素材とは一線を画している。その驚くべき点は、細胞形態と細胞外高分子組成のわずかな変化で、通常、特性のトレードオフ（例：強度／剛性／靭性を高めるために重量／密度を高める）に直面するほとんどの天然材料や人工材料を凌駕する、明確な物理化学的性能を有する多様な材料を形成することである。
この発見は、材料科学の幅広い読者、そしてそれ以上の読者を魅了するはずだと考えている(10, 22, 23, 39)。ナノコンポジットを開発する研究者にとって、我々の研究は、コンポジット作製を容易にし、その機械的特性を向上させるための生化学的原理の詳細な特性評価を提供するものである（40-42）。近年、「生きた材料」に対する関心が高まっていることから（43, 44）、我々のアプローチが引き金となり、センシング、学習、自己修復、適応などの高機能を持つ次世代のプログラマブル材料として、F. fomentariusの有望な作製経路が他のグループによって探求されることを期待している（45-48）。菌糸体からの材料生産は、他のシステムで広く研究されているように、個々の細胞の成長を下から上へと導き、ほとんどどんな複雑なものでも、その自己集合体の時空間制御によって所望の機能性を実現することができる（49-52）。さらに、シンプルな材料を用いて材料を成長させることは、将来的に材料の作り方や消費方法に関するコスト、時間、大量生産、持続可能性を克服するための代替ソリューションとなる。また、合成生物学やバイオテクノロジーを駆使して合理的に設計された糖質ベースの材料に取り組んでいる多糖類エンジニアにも注目されるはずである(53)。最後に、この結果は、例えば、組織工学や整形外科インプラント用の次世代3D足場を開発する生体材料科学者やバイオメディカル業界の研究者にとっても魅力的であるはずだ（21, 54）。
我々の知る限り、F. fomentarius の子実体の人工的な室内栽培は報告されていない。しかし、Phellinus ellipsoideus などの他のブラケット菌の子実体から製造されたアマドウは、耐引裂性や引張強度が低く、摩耗感受性が高いことが報告されている(55)。F. fomentariusの材料特性に関する研究は，実験室で生育した菌糸の複合材料という形で，ごく最近行われた(18)。基質と粒子サイズに依存するが、これらの菌糸体複合材料は、天然に存在する標本とは対照的に、比較的弱い機械的性能を示すことが報告されており、これまで天然の設計戦略から未開拓の戦略であった。一般に、実験室で作製された材料は、0.06～0.13 MPa の弾性率と 0.3～0.7 MPa の耐圧縮力を示す(18)。我々は、構造-化学-物性メカニズムの包括的な研究が、将来的に多機能な菌糸体ベースの材料を製造するためのインスピレーションの源になると考えている(54)。
方法
使用した試料の概要
F. fomentarius標本は、この菌種の子実体を含む白樺の幹の一部を採取した（フィンランド、Vantaa）。子実体の一般的な形状、大きさ、樹木に対する断面をFig.1に示す。具体的には、子実体の寸法を測定したところ、10 cm3であった。採取した標本は、まず凍結乾燥機を用いて乾燥させ、その後、常温下で試料の調製と保存を行った。採取した子実体は，クラスト，コンテクスト，H.チューブとその界面など，関連する各層に分割し，マイクロコンピュータトモグラフィーで観察した．
マイクロコンピュータトモグラフィー
トモグラフィ解析は、高解像度ナノフォーカスコンピュータ断層撮影装置 X-Ray Micro CT EasyTom 160 (RX Solutions, Chavanod, France)を用いて行われた。この装置には、ヨウ化セシウムフラットパネル検出器と2本のX線管があり、それぞれ3種類の焦点スポットモードを備えている。マイクロチューブはタングステンフィラメントを備え、最大出力150kV、500μAを供給する。4～89μmのボクセルサイズに到達することができます。ナノチューブはLaB6フィラメントを使用しており、最大出力は100kV、200μAです。0.4～4μmのボクセルサイズに到達することができる。すべてのスキャンと再構成は、RXソリューションズのソフトウェアXActを使用して実施した。(i)マイクロチューブを用いて15回のスキャンを実施した。ボクセルサイズ5～18μmのCTスキャンでは、小焦点モードで80kV+80μA=6.4Wのマイクロチューブを使用した。光源-検出器間距離は571.39～577.81 mm、光源-物体間距離は22.48～81.91 mmであった。フラットパネルディテクタのフレームレートは3、平均5フレームであった。1ターンあたり1120枚の画像を収集することにより、キャリブレーション期間20分を経て、スキャン時間は44分となった。 (ii) ナノチューブを用いて13回のスキャンを行った。1.50～4 μmのボクセルサイズのCTスキャンでは、大中心スポットモードで80 kV + 68 μA = 5.4 Wのnanotubeを使用した。光源-検出器間距離は 626.05 mm から 738.47 mm、光源-物体間距離は 8.69 mm から 21.14 mm であった。フラットパネル検出器のフレームレートは1または2で、平均8フレームであった。1ターンあたり1120枚の画像を収集することにより、20分のキャリブレーション期間後のスキャン時間は187分（フレームレート、1）および94分（フレームレート、2）であった。
走査型透過電子顕微鏡
SEM イメージングは，既報の通り，Zeiss FE-SEM 電界放射顕微鏡を用い，1.5 kV で作動させて行った（34, 35, 38）。短く，すべての試料は撮像前に 5 ～ 10 nm の白金パラジウム層でスパッタリングした．顕微鏡写真の可視化と解析には，ImageJ Fiji (version 1.47d) ソフトウェアパッケージを使用した．
シンクロトロン広角・小角X線回折法
WAXS/SAXSはBESSY II (Berliner Elektronenspeicherring-Gesellschaft für Synchrotronstrahlung, Helmholtz-Zentrum Berlin, für Materialien und Energie, Germany) のμSpotビームラインにて実施された。測定は、シリコン111モノクロメーターと100μmのビームサイズを用いて、15keV (0.82656 Å)のエネルギー照射で行われた。データはEiger X 9M検出器を用い、ピクセルサイズ75 μm × 75 μmで記録した。測定は、50%RHの環境条件下で実施した。試料は、ビームの経路に対して垂直に試料を配置するための電動ステージに取り付けられた特注の試料ホルダーにクランプされた。回折図は、試料に沿って100点（100μm間隔）で記録した。赤道と子午線付近の回折強度は、以前に報告したように、pyFAIパッケージの組み込みアルゴリズムでDPDAKソフトウェアを使用して放射状に積分された(35)。すべての測定において、空気散乱と暗電流は回折図から差し引かれた。(111)反射の方位角強度プロファイルは、(111)反射リングのみが見えるように回折像をマスキングした後、セクター単位の積分によって抽出した。その後、方位角強度プロファイルから、式1および式2によりHOPを、式3により配向指数を算出した。データの処理と可視化には、MATLABとOriginLabを組み合わせて使用しました。
=
3
2
⟨
cos
2
Φ
⟩
1
2
(1)
⟨
コス
2
Φ
⟩
∑
0
π
�
(
Φ
)
sin
Φ
cos
2
Φ
∑
π
�
(
Φ
)
sin
Φ
(2)
Π
180
FWHM
180
(3)
減衰全反射-フーリエ変換赤外分光法
ダイヤモンド結晶を搭載したSpectrum Two FTIR spectrometer（PerkinElmer社製）を用いて測定した。特に断りのない限り、スペクトルは400〜4000cm-1の範囲内で64回の累積スキャンを用い、1cm-1の分解能で吸光モードで収集された。
核磁気共鳴
各試料（すなわち、クラスト、コンテクスト、H.チューブ）を乳鉢と乳棒で粉砕・ホモジナイズし、蒸留水中で一晩水和させた。すべての試料を150,000gでスピンダウンして余分な水分を除去し、固体NMR測定のために別々の1.3mmローターに詰めた。すべての双極性 hCH プロトン検出固体 NMR 実験は、1.2 GHz (28.2 T) の磁場で測定された。さらに、スカラーベースのhCH 2次元実験は700 MHz (16.5 T)で記録された。すべての試料は、以前の校正(58)に従って、静磁場に対してマジックアングル(~54.74°)で60 kHzに回転させ、試料が室温で有効になるように冷却された。スペクトルの処理と積分解析にはTopspin 4.1を使用した。スペクトルの割り付けは、NMRFAM Sparkyソフトウェア(59)を用いて行った。さらなる詳細と実験パラメータは、補足資料（表S1）に記載されている。
引張試験
引張試験は、5-kN引張／圧縮モジュール（Kammrath & Weiss GmbH、ドイツ）を用いて、伸長速度2μm／秒、ゲージ長5mmの100-Nロードセルのいずれかを用いて行った。引張試験では，H 管とコンテクストを 2 mm 幅で 15 mm 長の縞状に切断した．測定中の滑りを防ぐため，試験片の端から5mmのところを2枚の研磨サンドペーパーで挟んで接着した。伸びと応力は，それぞれ式 4 と式 5 に従って算出した。試験片の断面を正確に測定するために，SEM 画像を使用した．すべてのデータ処理は，社内で作成した MATLAB スクリプトを使用して行い，ヤング率，最大強度，最大ひずみ，および靭性の平均値と SD を抽出した（n = 7）．測定はすべて50%RHの環境下で行った．すべての試料は，測定の 24 時間前に少なくとも 50%RHで平衡化させた．
ε
Δ
�
�
0
�
�
0
�
0
(4)
σ
�
�
�
(5)
圧縮試験
圧縮試験は，100Nロードセルを備えたTA.XTExpressC Texture Analyzer安定型マイクロシステムを用いて，約5m3 の寸法の試験片に対して実施された。特に断りのない限り、直径5mm、変形速度2.5μm/sのフラットフェイス円筒プローブを用いて、破局的破壊と高密度化の時点まで測定を実施した。記録されたデータは、Exponent ConnectソフトウェアとOriginLabバージョン2021の組み合わせで処理・分析されました。
ナノインデンテーション試験
ナノインデンテーション実験は、直径10μmのダイヤモンドフラットパンチチップを用いて、iMicro（KLA Corporation, Milpitas, CA）で行われました。動的圧痕は、7つの異なる周波数（10、17、28、45、74、122、200Hz）において、10～200Hzの範囲で局所的な動的力学解析を行うために使用された。各周波数掃引の前に、1μmの試験前圧縮が行われます。この手順をキノコサンプルの3つの異なる領域で行い、得られた弾性率を分析します。
謝辞
ドイツ・ポツダムのマックスプランク・コロイド・界面研究所の C. Li には，ドイツ・ベルリンの Helmholtz-Zentrum Berlin für Materialien und Energie にある BESSY の μSpot ビームラインでのシンクロトロン測定でお世話になった。また、アールト大学のオタナノナノミクロスコピーセンター（Aalto-NMC）による施設提供および技術サポートに感謝する。
資金提供 この研究は、フィンランドアカデミーのプロジェクト348628、Jenny and Antti Wihuri Foundation (Centre for Young Synbio Scientists)、フィンランドアカデミーCenter of Excellence Program (2022-2029) in Life-Inspired Hybrid Materials (LIBER) プロジェクト番号 346106、およびVTT Technical Research Center of Finland Ltdからの内部資金により行われたものである。また、NMR研究については、オランダ研究評議会（NWO, domain Applied and Engineering Sciences: MYCOAT project number 18425）および欧州連合のHorizon 2020プログラム（FUNGAR; project 58132 and iNEXT-Discovery, project 871037）にも感謝します。さらに、高磁場NMR実験は、uNMR-NL、オランダの国家ロードマップ大規模NMR施設（NWOグラント184.032.207）、uNMR-NLグリッド（NWOグラント184.035.002）の支援を受けている。
著者の貢献 コンセプト立案。著者：P.M., G.R.S., M.P., and A.P. Methodology: 調査：P.M., R.P., D.Wer., A.B., D.Wei., E.S., W.W., A.S., S.B., and M.B.,。P.M.、R.P.、D.Wer.、A.B.、D.Wei.、E.S.、W.W、A.S、S.B、M.B. 監修 P.M.執筆・原案作成。執筆-原案：P.M.、R.P. 執筆-校閲、編集：P.M.、R.P: P.M.、R.P.、D.Wer.、A.B.、D.Wei.、E.S.、W.W、A.S.、S.B、M.B.、 G.R.S., M.P., and A.P.
競合する利益 著者らは、競合する利害関係がないことを宣言する。
データおよび資料の入手 データ・資料：本論文の結論を得るために必要なデータは、論文および補足資料に掲載されている。
補足資料
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図S1〜S4
表S1
動画S1〜S9の凡例
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本原稿のその他の補足資料は以下の通りです。
映画S1～S9
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参考文献・注釈
1
Z. Liu, Z. Zhang, R. O. Ritchie, On the materials science of nature's arms race（リュー、チャン、リッチー、自然の軍拡競争に関する材料科学）. Adv. Mater. 30, 1705220 (2018).
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U. G. K. Wegst, H. Bai, E. Saiz, A. P. Tomsia, R. O. Ritchie, Bioinspired Structural Materials. Nat. Mater. 14, 23-36 (2015).
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S. E. Naleway, M. M. Porter, J. McKittrick, M. A. Meyers, 生物材料における構造設計要素: 生体インスパイアへの応用。このような場合、そのような材料が使用される。27, 5455-5476 (2015).
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