腹腔内ワクチン接種により誘発された腸内共生微生物叢の著しい変化がNEW Genetically Improved Farmed Tilapia (NEW GIFT, Oreochromis niloticus)の腸内代謝の変化を媒介する。
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公開日：2022年12月12日
腹腔内ワクチン接種により誘発された腸内共生微生物叢の著しい変化がNEW Genetically Improved Farmed Tilapia (NEW GIFT, Oreochromis niloticus)の腸内代謝の変化を媒介する。
Zhenbing Wu, Qianqian Zhang, ...Aihua Li 著者を表示する。
Microbiome volume 10, Article number: 221 (2022) Cite this article
詳細
概要
背景
数百万年にわたる共進化の結果、共生微生物叢は宿主の不可欠な一部となり、宿主の免疫、代謝、健康に重要な役割を果たすようになった。ワクチン接種は、感染症予防の有効な手段として、数十年にわたりヒトや動物の疾病予防と制御に重要な役割を担ってきた。しかし、これまでのところ、魚類共生微生物叢、特に粘膜微生物叢に対するワクチン接種の影響については最小限のことしか分かっておらず、腸管代謝との相関も不明なままである。
研究方法
Aeromonas hydrophila/Aeromonas veronii二価不活化ワクチンが養殖成魚ナイルティラピア（Oreochromis niloticus）の共生微生物叢に及ぼす影響と腸内代謝との相関について、16S rRNA遺伝子ハイスループットシーケンサーとガスクロマトグラフィー質量分析計によるメタボロミクスにより報告する。
結果
その結果、ワクチン接種は腸管粘膜微生物叢の構造、組成、予測機能を有意に変化させたが、鰓粘膜、胃内容物、胃粘膜など他の部位の共生微生物叢には有意な影響を与えなかった。さらに，ワクチン接種により，腸管粘膜におけるAeromonas，Escherichia-Shigella，Acinetobacterなどの潜在的日和見病原体の相対存在量が有意に減少した．また，不活化二価アエロモナスのワクチン接種は，ワクチン接種後の免疫機能の向上と相まって，ティラピアの腸管病原菌感染に対して防御効果を示した．また，代謝産物差分解析の結果，ワクチン接種によりティラピア腸内の乳酸，コハク酸，グルコン酸などの糖質関連代謝産物濃度が有意に上昇する一方，複数の脂質関連代謝産物濃度が有意に低下することが明らかとなった．ワクチン接種がティラピアの腸内代謝に影響を及ぼし，さらに腸内細菌叢の予測機能によって検証された．さらに，相関分析の結果，ワクチン接種後の腸内微量微生物の多くが腸内微量代謝物と有意な相関を示し，ワクチン接種の腸内代謝への影響が腸内細菌叢と密接に関連していることが確認された．
結論
本論文は，不活化ワクチン接種によって誘導される微生物応答と代謝応答を明らかにし，腸内細菌叢がワクチン接種のティラピアの腸内代謝に及ぼす影響を媒介する可能性を示唆するものであった．また、ワクチン接種がヒトの腸内細菌叢や代謝に及ぼす潜在的な影響について重要な示唆を与え、微生物および代謝の観点からワクチン防御機構に関する新たな理解を広げた。
ビデオ アブストラクト
背景
現在、進行中のコロナウイルス疾患2019（COVID-19）パンデミックは、世界の公衆衛生に深刻な脅威を与えています[1]。COVID-19ワクチン接種は、全体的な罹患率と死亡率をうまく減らすことができる、流行の予防と制御の効果的な手段です[2]。ワクチン接種は、ヒトおよび動物の感染症を予防するための最も安全で信頼できる手段です[3]。幅広い細菌性およびウイルス性疾患を予防する効果的な方法として、ワクチン接種は数十年にわたり養殖の疾病管理で重要な役割を果たし、その環境的、社会的、経済的な持続可能性に貢献しています[4]。特に、不活化細菌性病原体を用いたワクチンは、魚類に対して非常に有効であることが証明されています[5]。全細胞不活化ワクチンは、安全性、簡単な調製、保存の容易さなどの利点から、養殖における細菌性疾患の予防と制御に広く使用されてきました[4]。
過去30年以上、養殖産業の急成長と高度に集中的な発展に伴い、養殖動物は、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、またはその他の未診断の新興病原体に起因する深刻な病気の脅威にさらされてきました[6]。中でも，水産養殖の持続的な発展を制限する大きな脅威は，細菌性感染症の発生に起因する養殖動物の高い死亡率によってもたらされる経済的損失である[4]．ナイルティラピア（Oreochromis niloticus）は，中国における重要な養殖種であり，世界のティラピア生産量の50％以上を占めている[7]．しかし，近年，様々な細菌性感染症の頻繁な発生は，ティラピア産業の成長に対する主要な制約であり，継続的な課題であると考えられている[8]。これまでに，Flavobacterium columnare [9] や Aeromonas 属 [10, 11] ，Streptococcus 属 [12, 13] などによるティラピアの細菌感染症に関する研究が多数報告されている。Aeromonas hydrophila，Aeromonas veronii などの Aeromonas 属は，魚類の出血性疾患，潰瘍性症候群，運動性 Aeromonad 敗血症などを引き起こすユビキタスな病原体である[14]．長い間，養殖業では，魚を細菌感染から守るために，主に抗生物質や抗菌剤が使用されてきた[15]．しかし，抗生物質の乱用は耐性菌の発生を大幅に加速させるだけでなく，残留抗生物質の問題をもたらし，深刻な食品安全や公衆環境衛生のリスクを引き起こす[15, 16]。抗生物質の使用を減らすために，養殖業では感染症予防のためにワクチン接種が広く行われている[4, 5]。現在，Vibrio，A. hydrophila，Streptococcusなど，様々な病原体の感染に対して，多数の不活化全菌ワクチンが開発され，応用されている[4]．
魚類の三大感染部位は、皮膚、エラ、消化管であり、これらの部位には複雑な微生物群集が生息しています[17]。数百万年の共進化を経て、これらの共生微生物群は魚類の不可欠な構成要素となり、魚類の健康に重要な役割を果たしています [18, 19]。特に、魚類の腸内細菌叢は、消化と代謝に寄与し、免疫系の発達を刺激し、日和見病原体の付着と増殖を防ぐなど、多くの重要な生理的プロセスに関与している[20]。逆に，魚類の腸内細菌叢の異常は，重篤な疾病の発生と密接に関連している [21, 22]．近年，魚類の腸内細菌叢が腸管粘膜免疫と密接に関連していることが多くの研究により明らかにされている[23, 24]．魚類の腸内細菌叢はバリア細胞の働きによって直接または間接的に腸管粘膜免疫を制御し、一方、腸管粘膜免疫は腸内細菌叢の組成を制御している[24, 25]。免疫機能を強化するワクチンの能力を考えると、魚類の腸内細菌叢は、ワクチン開発において重要かつ過小評価されている要因である可能性が高い。
ワクチンは抗原特異的な全身および粘膜免疫の誘導に寄与するが、腸内細菌叢はワクチンの免疫誘導効果に影響を与える[26, 27]。ヒトの共生微生物叢とワクチン効果との相関は広く報告されている．ヒトの鼻咽頭の微生物組成は、インフルエンザウイルスの種類やワクチン接種の状況によって影響を受けます[28]。さらに、腸内細菌の異常はワクチンの効果を阻害する可能性があります[29, 30]。したがって、プロバイオティクスは、腸内細菌叢を調節することによって、ワクチン効果を向上させることができます[31, 32]。近年，魚類の腸内細菌叢とワクチン効果との相関に着目した研究がいくつかなされている[33,34,35]．以前報告したように，新しい組換えA. hydrophilaワクチンは，腸内細菌叢と密接に関連する組織の免疫反応を通じて，A. hydrophila感染に対する保護免疫をイシガキ稚魚に誘導することができた[33]．最近の研究では，イネ科コイ（Ctenopharyngodon idella）の経口Vibrio mimicusダブルターゲットDNAワクチンにより，特に後腸の腸内細菌叢の多様性と組成が大きく変化することが示された[35]．また，上記研究では，イネ科コイの腸内細菌叢と腸管粘膜の自然免疫との間に相関が認められ，二重標的DNAワクチンによって影響を受けた[35]．ティラピアについては，弱毒化したStreptococcus agalactiaeワクチンの経口投与により，ティラピアの腸内細菌叢の多様性と組成が変化したが，これらの変化は回復可能であることが，以前の研究により明らかにされている[34]．これらの研究により，魚類の腸内細菌叢とワクチン効果との間に密接な相関関係があることが示されました．その結果，ワクチン効果の維持における魚類共生微生物の役割に注目が集まっている．
しかし，ワクチン接種が魚類共生微生物叢，特に粘膜関連微生物叢に及ぼす影響機構については，これまでほとんど知られていない．また，ワクチン接種が魚類の腸内代謝に及ぼす影響や腸内細菌叢との相関関係についても未解明である．本論文では，NEW GIFT（New Genetically Improved Farmed Tilapia, O. niloticus）において，不活化二価Aeromonasワクチンが鰓，消化管粘膜関連，消化物関連の微生物叢の構造，組成，機能に及ぼす影響を，16S rRNA遺伝子ハイスループット配列とガスクロマトグラフ質量分析（GC-MS）メタボロミクスにより初めて検討した。さらに、ワクチン接種がティラピアの免疫・代謝機能に及ぼす影響を評価し、腸内細菌叢の変化と腸内代謝の相関を探った。これらの結果から、ワクチン接種に対するティラピアの微生物および代謝反応が明らかになり、ワクチン防御機構を理解するための新たな視点が提供されました。また、現在の流行の背景として、ワクチン接種がヒトの共生微生物叢や代謝機能に及ぼす影響について重要な示唆を与えている。
材料と方法
ワクチンの調製
A. hydrophilaとA. veroniiは、2006年8月1日に自然発病した魚の血液から入手し、中国科学院水圏生物学研究所国立水圏生物資源センター（中国武漢市）で維持管理されている。A. hydrophilaとA. veroniiの純コロニーをトリプティック大豆寒天培地（TSA; Becton, Dickinson and Company, USA）プレートで培養・分離し，500 mLのトリプティック大豆ブロス培地（Becton, Dickinson and Company, USA）中で培養を行った。その後，この2菌を振盪培養器（HZ-9210K，Jiangsu，China）で振盪（150rpm）しながら28℃で8時間培養した．菌種の同一性は，細菌用ユニバーサルプライマー27F/1492Rを用いた16SリボソームRNA遺伝子領域のPCR（ポリメラーゼ鎖反応）増幅により確認した[11]．PCR産物から約1500bpのアンプリコンを得、サンガーシークエンス用pMD18-Tベクターにクローニングした（Takara, Dalian, China）。BLASTn解析の結果、2株のアンプリコンはA. hydrophilaおよびA. veroniiとそれぞれ99%以上の塩基配列の同一性を有していた。
OD 600 nmが0.6の時点で，菌液に終濃度0.5%のホルマリンを添加し，菌液を28℃で24時間不活性化し，その間3回振盪を行った．上記溶液から遠心分離（2683g，4℃，5分）により菌体を採取し，3回洗浄後，リン酸緩衝生理食塩水（PBS，0.01M，pH7.4）に再懸濁させた．次に、滅菌PBSを用いた比濁法により、細菌細胞懸濁液の濃度を1.0×1010CFU/mLに調整した。次に，10 μLの菌体懸濁液をTSAプレートに3重まきし，28 ℃で48時間培養して生菌の検出を行った．2種類の菌体懸濁液を等量ずつ混合し，各菌体濃度が5.0 × 109 CFU/mLとなるように調製した，すなわち不活化二価A. hydrophila/A. veroniiワクチンとした．調製したワクチンは4℃で保存し，翌日すぐに使用した．
実験デザインおよびプロトコル
本実験は、中国湖北省黄岡市英山県にある商業養魚場で実施した。流水式養殖装置を備えた工業用セメント池（長さ8 m×幅5 m×高さ2.5 m）に、8個の吊り網カゴを設置した。ケージは1.2 m（長さ）×1 m（幅）×2 m（高さ）の長方形で、メッシュサイズ1 mmの青いポリエチレン製ネットで作られた。ケージは杭に固定し、池の底から約0.4 mのところに吊り下げた。捕食者や魚の逃亡を防ぐため、カゴはネットで完全に覆われた。実験水は地元の温泉水を使用し、水質は新鮮で汚染されていないものであった。エアレーションタンクによる浄化後、水質パラメータはティラピア養殖の正常範囲内であった。池には水深2mまで浄化水を入れ、約0.1m3 s-1の流速で浄化水を連続的に注水した。ケージ内の水深は1.6 mに保たれ、その結果、各ケージ内の有用体積は1.92 m3となった。餌の残滓や魚の糞は池の底にある汚水装置から取り除いた。空気は、池の底に穴を開けたパイプから送風機を通して連続的に供給した。
ティラピア（O. niloticusのNEW GIFT系統）成魚を上記池で飼育し、2週間家畜化した。実験に使用したティラピアはすべて、同じバッチの人工孵化種から供給されたものである。魚は馴化前に5ppmのKMnO4で30秒間消毒した。8個のケージを2群（対照群およびワクチン接種群）に分け、1群につき4個のケージを用いた。馴化後、ほぼ同じ大きさの160尾をこれらのケージに無作為に分けた（1ケージあたり20尾）。ワクチン接種群（V）には調製したワクチンを0.5mL腹腔内注射し、対照群（P）にはPBS（0.01M、pH7.4）を0.5mL腹腔内注射した。
ケージ実験は 2016 年 10 月 20 日に開始し、45 日間行った。実験期間中、魚には、中国Huai'an TianShen Feed Co., Ltd.で生産された浮き餌ペレットを用いた市販飼料を1日3％の体重で与えた（粗蛋白質≧30.0%、粗脂肪≧4.5%、粗繊維≧9.0%、粗灰≧12.0%、全リン≧0.8%、塩化ナトリウム0.4～4.0%、リシン≧1.7%、水分≧12.5%）。実験期間中、異常行動や死亡は発生しなかった。実験期間中、水産用薬剤を使用せず、大きな変動もなく、一貫した管理を行うなど、環境要因は安定したままであった。毎週記録される平均体重をもとに、各ケージの1日の餌量を適宜調整し、水位を適宜上昇させ、飼育密度を維持した。アンモニア性窒素（< 0.3 mg/L）、溶存酸素（> 3 mg/L）、水温（28 ± 2 ℃）、pH（7-8.5）などの水の物理化学パラメータは最適なレベルに維持された。
サンプルの収集と処理
馴化後、12匹のティラピアを無作為に選び、初期体重（0.24 ± 0.02 kg；追加ファイル1. 補足表1）として計量した。実験終了時、最後の給餌から6時間後に、すべてのケージから同程度の大きさのティラピアをランダムに採取した（1ケージあたり3匹）。採取後、ティラピアを低用量の3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸エチル（MS-222；シグマ、ドイツ）溶液で軽く麻酔し、直ちに体重を測定した。体重増加率（％）は、以下の式に従って算出した。WG（％）＝100×（FBW-IBW）／IBW；FBWは最終体重、IBWは初期体重である。次に、これらの魚の尾静脈から5mLシリンジを用いて直ちに血液サンプルを採取した。採取した血液サンプルは、2つの分画に分けた。1液は4℃で4時間凝固させ、2000g、4℃で5分間遠心分離した後、血清を得た。採取した血清は、その後の血液生化学パラメータの分析用に-20℃で保存した。別のアリコートを、その後の血液学的パラメータの分析に使用したエチレンジアミン四酢酸二カリウム（EDTAK2）含有採血管に入れた。次に、鰓膜（G）、胃内容物（S）、胃粘膜（W）、腸内容物（C）、腸粘膜（M）の試料を採取し、先の方法に従って処理した[36]。採取したサンプルは1.5mL遠心管に入れ、液体窒素で急速凍結した。その後、すべてのサンプルを-80 ℃で保存した。
血液学的および生化学的パラメーターの測定
採血後、直ちに血液サンプルの血液学的パラメータおよび血清生化学的パラメータを測定した。赤血球（RBC，1012 L-1）、白血球（WBC，109 L-1）、ヘモグロビン（Hb，g L-1）、パックセル体積（PCV，％，ヘマトクリットともいう）を含む主要血液学的パラメータの検出には、自動血液学分析装置（Sysmex XN9000-A， Kobe， Japan）が適用された．ヘマトクリット、HCTともいう）、平均体積（MCV、fL）、平均体積ヘモグロビン（MCH、pg）、平均体積ヘモグロビン濃度（MCHC、g L-1）、赤血球分布幅（RDW、％）、血小板（PLT、109 L-1）、平均血小板量（MPV、fL）および血小板分布幅（PDW、％）であった。全自動生化学分析装置（Beckman Coulter AU5400、Pasadena、USA）を、総蛋白（TP、g L-1）、アルブミン（ALB、g L-1）、グロブリン（GLO、g L-1）、アルブミン／グロブリン比（A/G）などの血清生化学パラメータの検査に使用した。血清リゾチーム（LZM；μg mL-1）およびスーパーオキシドジスムターゼ（SOD；U mL-1）の含有量は、市販の検査キット（Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China）を用いて、製造者の説明書に従って測定された。さらに，A. hydrophilaに対する血清抗体価（抗A. hydrophila力価）およびA. veroniiに対する血清抗体価（抗A. veronii力価）を抗原に対する血清の膠着効果により測定した．
DNA抽出、PCR増幅、Miseqシークエンス
すべての採取サンプルは，QIAamp® DNA Stool Mini Kit（Qiagen, Germany）を用いて，製造者の指示に従ってゲノムDNA抽出の準備を行った．各サンプルについて、サンプリングと抽出の偏りを減らすために、重複したDNAを抽出し、プールした。DNA の濃度と質は Nanodrop 2000 Spectrophotometer (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) を用いて測定した。その後、抽出したDNAを10ng/μLに希釈し、下流の研究に使用した。
16S rRNA遺伝子のV4-V5超可変領域を増幅するために、515Fの5′末端に12ntのユニークバーコードを有するユニバーサルプライマー515F（5′-CCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′）及び909R（5′-CCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′）が用いられた［37］。先に述べたように[36]、PCR反応混合物（25μL）は、10ngのDNAテンプル、1×PCRバッファ、1.5mM MgCl2、各デオキシヌクレオシド三リン酸0.4μM、各プライマー1.0μM、0.5UのEx Taq（TaKaRa、Dalian、中国）から構成された。PCRは以下のプログラムを用いて行った：94 ℃で3分間の初期変性、94 ℃で40秒間の変性、56 ℃で60秒間のアニーリング、72 ℃で60秒間の伸長を30サイクル行い、72 ℃で10分間の最終伸長を行った。各サンプルについてPCR反応を繰り返し行い、イルミナのライブラリー調製プロトコルに記載されているようにDNAライブラリーを構築した。最後に、精製したDNAライブラリーをIllumina Miseqシステムに適用し、成都生物学研究所の環境ゲノムプラットフォームでReagent Kit v2 2×250 bpを用いて配列決定した[36]。
腸内代謝産物の抽出・検出・アノテーション
腸管内容物からの代謝物抽出、検出、およびアノテーションは、以前の方法に従って実施した[36]。簡単に言うと、新鮮な腸内容物 100 mg を GC-MS 検出のための一連の前処理にかけた後、Agilent 5975C inert XL EI/CI 質量分析検出システム (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) に結合した Agilent 7890A GC システムを用いてサンプルを代謝物について定量した [36]．GCは、HP-5MSキャピラリーカラム（5％フェニル／95％メチルポリシロキサン30m×250μm内径、膜厚0.25μm、Agilent Scientific, Folsom, CA, USA）で1mL/minのヘリウム定流で誘導体を分離し、35から750（m/z）の範囲でフルスキャン法によりMS測定を行った。R software (v3.1.3) の XCMS (www.bioconductor.org) パッケージを使用して、GC-MS の生データを処理し、質量電荷比 (m/z) 、保持時間、強度などのデータマトリクスを取得した。Automatic Mass Spectral Deconvolution and Identification System を用いて、National Institute of Standards and Technology や Wiley Registry Metabolomics Database などの市販のデータベースから代謝物のアノテーションを検索し、代謝物の定性分析に使用した。次に、Golm Metabolome Database (http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/) が提供するアルカン保持指標によって物質の定性を行い、そのほとんどが標準物質によってさらに確認されました。最後に、さらなる解析のために、データを内部標準に正規化した。腸内メタボロームの実験操作と解析方法について詳しくまとめました（Additional file 2. Supplementary Methods）。
バイオインフォマティクスと統計解析
従来の方法[36]に従い、生DNA断片からのペアエンドリードをFLASHソフトウェアでマージし、Trimomaticで以下の基準で品質フィルタリングを行った。(1) 300 bpのリードは、50 bpのスライディングウィンドウで平均品質スコア<20となった部位で切り捨て、50 bpより短いリードやN塩基を含むリードは削除した。(2)ペアエンドリードをオーバーラップ関係に従って配列に統合し、最小オーバーラップ長を10 bpとした。(3）マージされた配列のオーバーラップ領域で許容される最大ミスマッチ比は0.2であった。(4)バーコードとプライマー配列により、配列の区別と補正を行った。バーコードで許容されるミスマッチ数は0、ミスマッチプライマーの最大数は2であった。操作上の分類単位（OTU）は、UPARSE（バージョン7.0 http://drive5.com/uparse/）を用いて類似度97%カットオフでクラスタリングし、キメラ配列はUCHIMEを用いて同定・除去した。各OTU代表配列の分類は、Bacterial Silva 16S rRNAデータベース（SILVA SSU 138）に対し、RDP Classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）を用いて信頼度閾値0.8で解析した。胃のサンプルは、有効配列数の最小値が他のサンプルに比べ著しく低いことを考慮し（Additional file 1: Supplementary Table 2）、他のサンプルのランダムリサンプリングリード数に影響しないよう、胃のサンプルは他のサンプルから分離してランダムリサンプリングした。胃内容物と粘膜のサンプルは最小リード数2671になるように、鰓粘膜、腸内容物、粘膜のサンプルは最小リード数5810になるようにランダム再サンプリングした。
α多様性は、観察された豊かさ（OTU）とChao、ShannonとSimpsonの多様性指標、Goodのカバー率（coverage）を用いて推定した。ベータ多様性は主座標分析（PCoA）とBray-Curtis指標に基づく類似性分析（ANOSIM）で解析した。線形判別分析（LDA）効果量（LEfSe）は、2つ以上の生物学的条件下での違いを特徴付けるゲノム特徴を特定する高次元のバイオマーカー発見と説明に用いられるアルゴリズムである[38]。本論文では、αパラメータを0.05、LDA閾値を2.0として、微生物バイオマーカーと機能的差異を特定するためにLEfSe分析を行った。独立した2つのグループ間の差は、Welchのt検定（Past、バージョン3.15）を用いて評価した。p値はBonferroni法を用いて補正した。細菌群集の機能プロファイルは、KEGG パスウェイから Tax4Fun を用いて予測した[39]。微生物機能の統計解析は、Statistical Analysis of Metagenomics Profiles [40]を用いて実施した。データは平均値±標準偏差（mean ± SD, n = 4）で表し、差の有意水準は 0.05, 0.01, または 0.001 とした。
結果
ワクチン接種が成長成績および生存率に及ぼす影響
実験開始時の初期群のティラピアの平均体重は0.24±0.02kgであった（追加ファイル1：補足表1）。実験終了時、対照群のティラピアの平均体重は0.32±0.04kgであったが、ワクチン接種群のそれは0.33±0.04kgであった（追加ファイル1: 補足表1）。ティラピアの体重増加については、対照群とワクチン接種群の間に有意差は認められなかった（Welch t-test, p > 0.05）。また、実験期間中、すべての網ケージでティラピアの死亡は観察されず、すなわち生存率は100％であった。これらの結果から，不活化ワクチン接種はティラピア成魚の成長成績および生存率に悪影響を及ぼさないことが示唆された．
血液学的パラメータおよび血清生化学的指標に対するワクチン接種の影響
ティラピアのすべての血液学的パラメータにおいて，対照群とワクチン接種群の間に有意差（Welch t-test, p > 0.05）は認められなかった（Fig. 1A）．さらに、血清総蛋白およびアルブミン値についても、対照群とワクチン接種群との間に有意な差（Welch t-test、p＞0.05）は認められなかった（図1B）。以上の結果から，ティラピアの健康状態および栄養状態は，ワクチン接種によって影響を受けないことが示唆された．逆に，ワクチン接種群のティラピアの血清グロブリン，アルブミン／グロブリン比，リゾチーム量，スーパーオキシドジスムターゼ活性は，コントロール群に比べ有意に高く（Welch t-test，p＜0.05 or p＜0.01），ワクチン接種によりティラピアの非特異的免疫力が高まったことが示された（Fig. 1B）．また，A. hydrophilaおよびA. veroniiに対する血清抗体価は，ワクチン接種群でそれぞれ16 ± 8.76 および14 ± 10.04 となったが，対照群では血清抗体価は検出されず（図1B），ワクチン接種によりティラピアの特異的抗体産生が誘導されることが示唆された．
Fig.
図1
A ティラピアの血液学的パラメータに及ぼすワクチン接種の影響．B ティラピアの血清生化学的パラメータに及ぼすワクチン接種の影響．** は極めて有意な差、すなわちp＜0.01；*は有意な差、すなわちp＜0.05；NAは有意な差なし、すなわちp＞0.05を意味する
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ワクチン接種が共生微生物群の多様性、構造、分布に与える影響
品質フィルタリングの結果、40サンプルから480,387の有効なリード（サンプルあたり2671から70,742の範囲）が生成されました。リサンプリング後、全サンプルのGood's coverageは97.53〜99.97%であった（Additional file 1: Supplementary Table 3）。また、Rarefaction曲線はすべてのサンプルでプラトー化し（Additional file 1: Supplementary Figures 1A and D）、Shannon曲線は安定していた（Additional file 1: Supplementary Figures 1B and C）。これらの結果は、サンプルに存在する微生物多様性の大部分が検出されたことを示しています。統計解析の結果，コントロール群とワクチン接種群の共生微生物群の豊富さ（OTUとChao）および多様性（ShannonとSimpson）に有意差（Welch t-test; p > 0.05）は見られず，ワクチン接種が共生微生物群の多様性と豊富さに大きな影響を与えないことがわかった（追加ファイル1: 補足表3）．ANOSIMにより，ワクチン接種は腸粘膜の細菌群集構造に有意に（R = 0.9896, p = 0.034）影響したが，ワクチン接種は他の試料タイプ（鰓粘膜，胃内容物と粘膜，腸内容物）の細菌群集構造には有意（p > 0.05）には影響しなかった（表1）．PCoAプロットはANOSIMの結果を視覚化したもので、腸粘膜の細菌群集は対照群とワクチン接種群の間で明確に分離していたが、他の試料タイプの細菌群集は対照群とワクチン接種群の間で有意な分離は見られなかった（図2A, B）。全体として、PCoAから得られた2つの主座標は、全試料間の変動の52.27%（図2A）および63.73%（図2B）を説明するものであった。
表1. Bray-Curtis指標に基づく細菌群集の構造と機能の類似性分析(ANOSIM)
フルサイズ表
Fig.
図2
細菌群集のBray-Curtis metricに基づく主座標分析。A 胃内容物および粘膜サンプルの細菌群集の構造解析、B 鰓および腸サンプルの細菌群集の構造解析。PS1-PS4：対照群の胃内容物、VS1-VS4：ワクチン接種群の胃内容物、PW1-PW4：対照群の胃粘膜、VW1-VW4：ワクチン接種群の胃粘膜、PG1-PG4：対照群の鰓粘膜、VG1-VG4: PC1-PC4：コントロール群腸管内容物、VC1-VC4：ワクチン群腸管内容物、PM1-PM4：コントロール群腸管粘膜、VM1-VM4：ワクチン群腸管粘膜
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胃内容物ではBacteroidota，Proteobacteria，Fusobacteriotaが，胃粘膜ではProteobacteria，Firmicutes，Bacteroidotaが優占していた（追加ファイル1：補足図2A）．鰓の粘膜では、Proteobacteriaが95%以上を占め、ActinobacteriaとFirmicutesがそれに続いた（Additional file 1: Supplementary Figure 2B）。腸管試料については、腸管内容物はFusobacteriotaが優占し、FirmicutesとProteobacteriaが続いた。一方、腸管粘膜はProteobacteriaが優占し、Firmicutes、Fusobacteriota、Cyanobacteria、Actinobacteriaが続いた（追加ファイル1: 補遺図2B）。門レベルでは、対照群と比較して、ワクチン接種群では腸管粘膜のアクチノバクテリアの相対量のみが有意に増加（Welch t-test、補正p＜0.01）したが、他の分類群では有意差は認められなかった（追加ファイル1: 補遺図3）。また、属レベルでは、対照群とワクチン接種群の微生物分布に差が認められた（追加ファイル1：補足図4A、B）。
共生微生物叢の分類学的組成に対するワクチン接種の影響
コントロール群とワクチン接種群の間で異なる部位における共生微生物群のOTUの差は、LEfSeによってさらに解析された。鰓の粘膜を比較した結果，Limnobacter thiooxidans OTU215はワクチン接種群で有意に濃縮されていたのに対し，Roseomonas gilardii OTU21，Ochrobactrum OTU37，Chloroplast sp. OTU87は対照群に有意に濃縮されていた（Additional file 1: 補足図5A）。LEfSeは，対照群とワクチン接種群の胃内容物において15の識別特徴（LDAスコア＞2）を同定し，そのうちワクチン接種群の胃内容物に有意に濃縮されたOTUは，Macellibacteroides OTU318，Alphaproteobacteria sp.OTU232，Bacteroidetes vadinHA17属 OTU236，Paludibacteraceae sp.OTU247，およびundefined sp. OTU247、および未分類の細菌 sp. OTU49 (追加ファイル1: 補足図5B)であった。逆に、対照群（LDAスコア＞2）の胃内容物では、さらに10個のOTUが有意に濃縮されており、その主なものはChloroplast sp. OTU81、HOC36 sp. OTU163、Calditrichaceae sp. OTU112, Lacunisphaera sp. OTU1, Fibrobacteraceae sp. OTU43、Sporobacter OTU72、Acidaminobacter OTU371、Caulobacter OTU151 (Additional file 1: Supplementary Figure 5B) であった。胃粘膜については、ワクチン接種群で13のOTUが有意に濃縮されており、L. thiooxidans OTU421およびOTU395、Comamonadaceae sp. OTU373、Chloroplast sp. OTU81、Armatimonas OTU107、Clostridium sensu stricto 14 OTU379、Mitochondria sp. OTU52、Polaromonas OTU297、Fibrobacter OTU78、Actinomycetaceae sp. OTU393、Flavobacterium OTU378、Bacteroidetes BD2-2 sp. OTU245、Clostridium sensu stricto 1 OTU315 であった。逆に、対照群では、未分類の細菌 sp. OTU204、OTU177、OTU173、Pelomonas OTU184、Thauera OTU190、Arcobacter OTU175、Arenimonas OTU228、Parvibium OTU65、Haliangium OTU217およびArmatimonas OTU278という10のOTUが著しく豊富になった (Additional file 1: 補足図5C).
腸管内容物を比較した結果、Pirellulaceae sp. OTU149、Bosea OTU122、Crenothrix OTU121、Enhydrobacter OTU139、Desulfomonile OTU148、Ralstonia OTU166がワクチン接種群に有意に濃縮されたのに対し、Macellibacteroides OTU11とEnterovibrio OTU8は対照群に有意に濃縮されていた(図3A)。LEfSeは、対照群とワクチン接種群の間で腸管粘膜に41の差分OTUを同定し（LDA > 2）、そのうち14のOTUが対照群に有意に濃縮され、Escherichia-Shigella OTU69とOTU48、Sphingobium amiense OTU50、Psychrobacter OTU96、Intrasmorpangiaceae sp. OTU45、Curvibacter OTU47、Veillonellales-Selenomonadales sp.OTU101、Pleomorphomonadaceae sp. OTU98、Chryseobacterium OTU74、Halomonas OTU72、Micrococcus OTU77、Acinetobacter OTU55とOTU42、Aeromonas OTU91 (Fig. 3B)が挙げられた。逆に，ワクチン接種群では他の27のOTUが有意に濃縮されており（LDAスコア＞2），主にSphingomonas aquatilis OTU218，OTU172，OTU167，Sphingomonas echinoides OTU207，Sphingomonas OTU216，Ralstonia OTU212，Cammonadaceae sp. OTU214、L. thiooxidans OTU215、Methylobacterium-Methylorubrum OTU196、OTU23、OTU171、OTU178、Methylobacterium jeotgali OTU198、Amnibacterium OTU194 および OTU20、Kocuria carniphila OTU202、Staphylococcus OTU217；R. gilardii OTU195 および OTU21; Rubellimicrobium OTU24 および OTU183; Bacillus OTU40; Belnapia OTU175 および OTU211; Novosphingobium OTU186; そして Bradyrhizobium OTU193 および OTU22 (Fig. 3B)。
図3.
図3
LEfSeによる腸内細菌群集のOTUレベルでの比較。Aコントロール群とワクチン接種群の腸管内容物の細菌群集の比較、Bコントロール群とワクチン接種群の腸管粘膜の細菌群集の比較。LDAスコアは、OTUの相対的存在度の違いの程度として解釈できる。PC：コントロール群の腸管内容物、VC：ワクチン接種群の腸管内容物、PM：コントロール群の腸管粘膜、VM：ワクチン接種群の腸管粘膜
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腸内代謝産物の組成および構造に及ぼすワクチン接種の影響
GC-MSメタボロミクスを用いて、ワクチン接種に対する腸内代謝物の反応を評価した。まず、元データの品質保証を行ったところ、30%特性ピーク比率が98.9%に達し、データの品質に問題がないことがわかった（Additional file 1: Supplementary Figure 6A）。次に、オリジナルデータの品質管理（QC）を行い、QCサンプルはPCAダイアグラムに集中し、データが安定して信頼できることを示しました（Additional file 1: 補足図6B）。さらに、グループ間の違いを区別するために、部分最小二乗法-判別分析（PLS-DA）を用いて、代謝物レベルとグループ分けの関係モデルを確立した。モデル X 変数の説明可能率は 0.577、モデル Y 変数の説明可能率は 0.994 であり、自動適合のための主成分数は 3 であった。 PLS-DA のスコアプロットは、対照群とワクチン接種群の間でティラピアの腸内代謝物の有意な分離を示した（図 4A）。主成分PC1は変数の28.6%を占め、PC2は変数の21.8%を占めた。全体として、PLS-DAの2つの主成分は、すべてのサンプルの変数の50.4%を占めた（Fig. 4A）。並べ替えプロットでは、Q2での回帰直線の交点が0より小さいため、今回のモデルはオーバーフィットしておらず、上記の統計結果は有効であった（Fig.4B）。
図4.
図4
対照群とワクチン接種群との腸内代謝物の差分解析。A部分最小二乗-判別分析（PLS-DA）、Bメタボロームデータ処理の順列プロット、C差分代謝物のクラスタリングヒートマップ分析、D差分代謝物の関連性を示すヒートマップ。相関係数は色の違いで表し、オレンジ-赤は正の相関（p<0.05）、青-緑は負の相関（p<0.05）を表します。大きな円は相関係数が大きいことを表しています。
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本論文では、腸管内容物からアミノ酸、脂質、炭水化物、ヌクレオチド、ビタミンなど95種類の代謝物を検出した。対照群とワクチン接種群の腸内代謝物を比較したところ、主に糖質代謝、脂質代謝、核酸代謝に関連する10種類の代謝物が検出された（Fig. 4C）。対照群と比較して、乳酸、コハク酸、グルコン酸の濃度はワクチン接種群で有意に高く（p＜0.05）、他の7つの腸内代謝産物の濃度はワクチン接種群で有意に低く（p＜0. 05），モノメチルリン酸，9，12-（Z，Z）-オクタデカジエン酸，1-モノオクタデカノイルグリセロール，グリセリン酸，マロン酸，ウリジン，グアニンがワクチン接種群で有意に低かった（図4C）．代謝物の相関解析では、ワクチン接種群で有意に濃度の高い3つの代謝物が有意に正の相関を示し（p＜0.05）、ワクチン接種群で有意に濃度の低い7つの代謝物の多くも有意に正の相関を示した（p＜0.05）。さらに、コハク酸は、モノメチルリン酸、9,12-(Z,Z)-オクタデカジエン酸、1-モノオクタデカノイルグリセロール、グリセリン酸という4つの脂質代謝物と有意な負の相関があった（図4D）。
腸内代謝物の差分と腸内細菌の相関関係
さらに、腸内 OTU と腸内代謝物 10 種の相関解析を行った (Fig. 5A, B)。対照群と比較して、ワクチン接種群で有意に減少した腸内細菌は、ワクチン接種群で有意に減少した7つの代謝物の変化と正の相関があり、この7つの代謝物の一部と有意に（p < 0.05） 正の相関があった。逆に、これらの微生物は、ワクチン接種群で有意に増加した3つの代謝物の変化と負の相関を示し、これらの3つの代謝物の一部と有意に（p＜0.05）負の相関を示した（図5A, B）。対照群と比較して、ワクチン接種群で有意に増加した腸内細菌は、ワクチン接種群で有意に減少した7つの代謝産物の変化と負の相関があり、これらの代謝産物の大部分と有意に（p＜0.05）負の相関があった。逆に，これらの微生物は，ワクチン接種群で有意に増加した3つの代謝産物の変化と正の相関を示し，特に腸管内容物のRalstonia OTU166は，腸管粘膜の差分微生物のほとんどがこれらの3つの代謝産物と有意に（p < 0.05 or 0.01）正の相関を示した（図5A，B）．これらの結果から，ワクチン接種が腸管代謝に及ぼす影響は，腸内微生物の変化と密接に関連していることが示唆された．
Fig.
図5
腸内細菌の差分と代謝産物との相関解析 A腸管内容物の差分代謝物と差分微生物との相関解析、B腸管粘膜の差分代謝物と差分微生物との相関解析。相関係数は色の違いで表し、赤は正の相関、青は負の相関を表す。赤は正の相関、青は負の相関を表す。 p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001
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共生微生物相の予測機能に対するワクチン接種の影響
Tax4Funを用いて、ティラピアの共生微生物叢の機能プロファイルを予測した。ANOSIMの結果、ワクチン接種は鰓粘膜、胃粘膜、胃内容物、腸内容物の細菌群集の機能構造には有意な（p > 0.05）影響を与えなかったが、腸粘膜の細菌群集の機能構造には有意な（p < 0.05）影響を与えた（Table 1）。PCAプロットはANOSIMの結果を可視化したものであり，コントロール群とワクチン接種群の間で腸管粘膜の機能プロファイルが有意に分離していることを示した（追加ファイル1：補遺図7）．コントロール群と比較して、ワクチン接種群の腸管消化管関連微生物叢では、代謝、特にアミノ酸代謝、テルペノイドやポリケチドの代謝、その他の二次代謝産物の生合成に関する機能パスウェイが有意に濃縮されていた（LDA > 2.0）（ 図6A）。また、ワクチン接種群の腸管粘膜関連微生物叢では、異種物質の生分解と代謝、エネルギー代謝、他の二次代謝産物の生合成、他のアミノ酸の代謝に関連する機能パスウェイが有意に濃縮されていた（LDA > 2.0）。逆に、対照群の腸管粘膜関連微生物叢では、細菌感染症、ヌクレオチド代謝、糖鎖生合成・代謝、脂質代謝、免疫疾患に関わる機能パスウェイが有意に濃縮されていた（LDA > 2.0）（図6B）。
図6.
図6
Tax4Funによる細菌群集の機能的組成の比較。A コントロール群とワクチン接種群の腸管内容物の細菌群集の機能的組成の比較、B コントロール群とワクチン接種群の腸管粘膜の細菌群集の機能的組成の比較。PC：コントロール群の腸管内容物，VC：ワクチン接種群の腸管内容物，PM：コントロール群の腸管粘膜，VM：ワクチン接種群の腸管粘膜
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考察
細菌性疾患の予防に用いられるワクチンは，養殖業において大きな可能性を秘めているが，その開発は極めて複雑である[4]．これまで，ティラピアの腸内細菌叢は広く研究されてきたが，ワクチン投与後のティラピアの腸内細菌叢の変化に関するエビデンスは限られている．本論文では，宿主の免疫と代謝における複雑な共生微生物叢の重要な役割から，不活化ワクチン接種後のティラピアの共生微生物叢の変化と免疫機能および代謝状態との相関を評価した[17]．腸内細菌は粘膜免疫の誘導に密接に関係している[23]。さらに，魚類の粘膜上皮細胞は，粘膜微生物叢と相互作用する免疫因子を分泌し，共生微生物叢のコロニーを形成することができる[24]．ワクチンによる防御免疫を考慮すると，ワクチン接種に対する魚類共生微生物叢，特に粘膜微生物叢の反応を評価することは，ワクチンと魚類共生微生物叢の相互作用機構の解明に寄与するものと思われる．
血液学的パラメータや生化学的指標は，宿主の免疫や代謝に関する情報をある程度提供することができ，魚類の健康状態や生理状態を評価するための貴重な生物学的指標と考えられている[41]．本論文では，ワクチン接種が血液学的パラメータに有意な影響を及ぼさないことから，不活化ワクチン接種が魚類の健康状態や生理状態に影響を及ぼさないことが示された．さらに，今回の結果では，ワクチン接種がティラピアの体重増加率および生存率に有意な影響を及ぼさなかったことから，上記の見解が支持された．しかし，ワクチン接種後に血清グロブリン，アルブミン／グロブリン比，リゾチーム量，スーパーオキシドディスムターゼ活性，A. hydrophilaおよびA. veroniiに対する抗体価は有意に上昇し，ワクチン接種によりティラピアの非特異免疫機能および特異免疫機能が向上したことが示され，先行研究 [42,43,44,45] と整合的であった．免疫機能の増強は，本論文で接種した不活化ワクチンがティラピアに対して保護的な免疫効果を有していることを示し，さらに他の効果を評価する前提ともなった[5]．
魚類のエラや消化管粘膜は病原体の主な侵入経路であり、その粘膜表面には生物学的バリアとして多数の共生微生物が存在する[23]。ティラピアに関する先行研究では，共生微生物の多様性，構造，組成は，消化管領域やサンプルの種類によって大きく異なることが示された[36, 46]．したがって，ティラピアの常在微生物および一時的な微生物を区別することは，微生物の機能を調査するために不可欠である[24]．近年、腸内細菌叢の構成がヒトのワクチン効果に影響を与える主要因と考えられています [47]。共生微生物叢の特定のメンバーは、粘膜免疫の産生に密接に関連している[23, 24]。宿主の特異的な微生物組成がワクチン応答の差に関連することを示した報告もいくつかある[48, 49]。ワクチン接種が共生微生物叢を崩壊させるかどうかを評価するために、微生物の多様性を利用した。今回の結果では，ワクチン接種はティラピアの共生微生物叢の豊かさと多様性指標に大きな影響を与えず，つまりワクチン接種は共生微生物叢を不安定にせず，これまでの見解と一致した[33, 35]．しかし，ワクチン接種は，腸管粘膜関連微生物叢の構造を有意に変化させたが，他の4部位の微生物構造には有意な変化を与えなかった．ワクチン接種は，ティラピアの共生微生物叢に地域特異的な影響を与え，腸管粘膜関連微生物叢に最も顕著な影響を与えた．ワクチンを介した粘膜保護免疫[4]を考えると，不活化ワクチンは腸粘膜免疫に大きな影響を与えるが，鰓や胃粘膜免疫には比較的軽い影響を与える可能性がある．したがって，腸管粘膜免疫と腸管粘膜関連細菌叢の相互作用機構に焦点を当てたさらなる研究が必要である．これまでの研究で，ワクチン接種が魚類の全身および粘膜免疫反応を誘導すること[33, 50]，魚類の免疫機能は粘膜微生物の恒常性維持に重要な役割を果たすこと[24, 25]が明らかにされている．したがって，本研究における不活化ワクチン接種は，免疫機能を高めることで魚類の粘膜微生物叢に影響を与える可能性がある[51]．
また，新規組換えA. hydrophilaワクチンは，組織免疫反応を効果的に誘導し，イサキの腸内内容物中のAeromonasの相対存在量を有意に減少させることが，以前の研究で明らかにされている[33]．しかし，ティラピアでは腸管内のアエロモナスの相対量が有意に減少しないことが示された．この矛盾は，ワクチンの種類や投与量，接種された宿主の種類の違いに関連している可能性がある[4]．また，本論文では，ワクチン接種後に腸管粘膜のAeromonasの相対量が有意に減少したが，これはワクチンによって誘導された特異的な抗体の産生によるものであると思われる．また，腸管内容物中のMacellibacteroidesとEnterovibrio，腸管粘膜中のEscherichia-Shigella，Acinetobacter，Micrococcus，Chryseobacteriumの相対存在量もワクチン接種後有意に減少した．エンテロビブリオは，腸内乳酸菌に有害な毒素であるインドールの産生を過剰に促進する[52, 53]．Escherichia-ShigellaおよびAcinetobacterの中の細菌種は、魚類の一般的な潜在的日和見病原体である[54]。Micrococcusは一般的に腐生菌または共生微生物と考えられており、特に免疫系が低下した宿主では日和見病原体となる可能性があり、例えばMicrococcus lysodeikticusとWSSVの共感染や反復感染によりエビに重度の感染症を引き起こす可能性がある[55]。Chryseobacteriumは，宿主の免疫力の低下や抗生物質の無理な使用により，外来感染や内生感染を引き起こす可能性がある[56]．上記のように，不活化Aeromonasワクチン接種は，Aeromonasや他の潜在的な病原体に対するティラピア腸管感染防御効果を持つ可能性があり，これはワクチン接種後の腸管粘膜関連微生物群の予測機能において，細菌感染症や免疫疾患に関連する経路の存在量が有意に減少することと一致した（図6B）．粘膜ワクチンは，抗原特異的かつ全身性の粘膜免疫応答を効果的に誘導し，粘膜病原体のコロニー形成を抑制することができるため，新興感染症の制御のための魅力的な戦略であると広く信じられている[57]．したがって，これらの粘膜病原体の弱毒化株を利用することで，養殖業における魚類粘膜ワクチンの開発が促進される。また，ワクチン接種後，多くの腸内細菌の相対量が有意に増加した．腸内細菌叢の異常はワクチン効果に影響を与えるため[29, 30]，プロバイオティクスは腸内細菌叢を調節することでワクチン効果を改善すると広く考えられている[31, 32]．したがって，ワクチン接種後に有意に増加したこれらの腸内共生微生物は，ワクチン接種魚に対するワクチン効果を高めるためのプロバイオティクス開発のための細菌指標となる可能性がある．
本結果は，ワクチン接種後，ティラピア腸内で糖質関連代謝物濃度が有意に増加し，いくつかの脂質関連代謝物濃度が有意に減少したこと（図4C）から，ワクチン接種はティラピア腸内の糖質および脂質代謝に影響を与える可能性が示唆された．また，機能予測の結果，ワクチン接種後に腸管消化器関連微生物叢で代謝の機能経路の存在量が有意に増加し（図6A），ワクチン接種後に腸管粘膜関連微生物叢で脂質の代謝経路の存在量が有意に減少した（図6B）ことも裏付けられた．免疫系は腸内細菌叢に影響を与え，様々な形で脂質代謝に関与する可能性がある[58]．逆に，腸内細菌叢は，免疫経路を通じて腸内分泌機能および宿主代謝を調節することができる[59]．このように，腸内共生微生物叢，宿主免疫，代謝の間には複雑な相互作用が存在する[60, 61]．ワクチン接種による魚類の免疫機能への直接的な刺激効果から，ワクチン接種は魚類の免疫系を刺激することで腸内細菌叢だけでなく腸管代謝にも影響を与える可能性がある[33, 35]．以上のことから，腸内細菌叢の組成や機能と腸内代謝物との間に整合性があることが示唆された[36]．さらに，ワクチン接種後に腸管粘膜関連微生物群の異種物質分解・代謝経路の存在量が有意に増加したことから，ワクチン接種後に粘膜関連微生物群が異種物質の分解能力を高め，外来ダメージから粘膜組織を保護する可能性が示唆された．予測された代謝経路の差は腸内代謝物の差では示されなかったものもあるが，それでも今回の結果は，ワクチン接種後の腸内代謝物の変化が腸内細菌叢の機能変化と関連している可能性を示唆するものであった[36]．したがって，ワクチン接種後に有意に増加した腸内代謝産物は，ワクチン接種魚に対するワクチン効果を高めるためのプレバイオティクス開発の代謝指標となる可能性が示唆された．
さらに相関解析を行ったところ，ワクチン接種後，腸内差分微生物と代謝物の間には同じ変動傾向の正の相関が見られ，逆に腸内差分微生物と代謝物の間には逆の変動傾向の負の相関が見られた（図5A, B）．腸内差分微生物と代謝物のほとんどに有意または極めて有意な相関（p < 0.05 or 0.01）が認められ、例えば、腸管内容物のRalstonia OTU166はほぼすべての差分代謝物と有意に（p < 0.01）正の相関があった。また、同じ変化傾向の腸内代謝物には一定の相関がみられた（Fig.4D）。また、各差分代謝産物は、ある微生物の相対量値と正の相関を示し、他の微生物の相対量値と負の相関を示しました（Fig. 5A, B）。この現象は，前者が産生する腸内代謝物が後者を抑制する可能性を示し，腸内代謝物が細菌群集の集団競争を直接的または間接的に駆動・制御している可能性を示唆した[62]．以上の結果から，ワクチン接種がティラピアの腸内代謝に及ぼす影響を腸内細菌が媒介する可能性が示唆された．このように，ワクチンの生物学的効果を免疫防御の観点から評価することに加え，共生微生物相や宿主の代謝機能もワクチン効率を評価する指標となり得る可能性がある．参考までに、現在、安全で効果的なワクチンは感染症制御のために最も期待されているが、ワクチンを受け入れることへのためらいは依然として一般的である[63]。したがって，ワクチン接種がヒトの共生微生物相および代謝機能に及ぼす影響に関する関連研究が早急に実施されなければならない．
結論
本論文では，ティラピアの共生微生物叢のワクチン接種に対する反応と，宿主の免疫や代謝との相関を初めて明らかにした．その結果，ワクチン接種が腸管粘膜微生物叢の構造と組成に大きな影響を与え，腸管粘膜におけるAeromonasなどの潜在的日和見病原体の相対量が著しく減少することが明らかとなった。また，不活化二価アエロモナスのワクチン接種は，ワクチン接種後の免疫機能の向上と相まって，免疫賦活化による腸内共生微生物叢への影響を与え，ティラピアの腸内アエロモナス感染に対する防御効果を発揮する可能性が示唆された．その結果，ワクチン接種がティラピア腸内の糖質・脂質代謝に有意な影響を及ぼし，さらに腸内細菌叢の予測機能によって検証された．さらに相関分析を行った結果、ほとんどの腸内差分微生物と代謝物の間に有意な相関が見られ、腸内細菌がティラピアの腸内代謝に及ぼすワクチン接種の影響を媒介する可能性が示唆された。ワクチン接種後に有意に増加した腸内細菌および代謝産物は，ワクチン接種魚に対するワクチン効果を高めるためのプロバイオティクスまたはプレバイオティクス開発の貴重な指標となる可能性がある．これらの観察結果は、共生微生物叢と代謝機能からワクチン防御機構を理解するための新たな視点を提供した。現在、ヒト用ワクチンが広く使用されていることを考えると、今回の発見は、ワクチン接種がヒトの共生微生物叢や代謝に及ぼす潜在的な影響について示唆を与えるものである。
データ・資料の利用
生データはNCBI Sequence Read Archiveにアクセッション番号PRJNA783994 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)で寄託されています。
略号
A. hydrophila :
Aeromonas hydrophila : アエロモナス・ハイドロフィラ
A. veronii :
Aeromonas veronii : アエロモナス・ベロニー
NEW GIFT:
NEW 遺伝子組換え養殖ティラピア
GC-MS:
ガスクロマトグラフ質量分析計
COVID-19
コロナウイルス感染症2019
TSA
トリプシン大豆寒天培地
PCR
ポリメラーゼ連鎖反応
PBS:
リン酸緩衝生理食塩水
EDTAK2 :
エチレンジアミンテトラ酢酸ジカリウム
OTUs。
操作上分類される単位
LEfSe:
線形判別分析の効果量
LDA:
線形判別分析
RBC:
赤血球
WBC:
白血球
Hb:
ヘモグロビン
PCV
パックドセル量
MCV
平均赤血球容積
MCH
平均体積ヘモグロビン
MCHC
平均赤血球ヘモグロビン濃度
RDW
赤血球分布幅
PLT：血小板
血小板、MPV:平均血小板容積
PDW
血小板の分布幅
TP
総蛋白
ALB:
アルブミン
GLO:
グロブリン
A/G:
アルブミン/グロブリン比
LZM
リゾチーム
SOD
スーパーオキシドジスムターゼ
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参考文献のダウンロード
謝辞
ハイスループット・シーケンスの生データを解析するために、Majorbio I-Sanger Cloud Platform（www.i-sanger.com）の無料オンラインプラットフォームを提供してくださった上海Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltdに感謝します。また、Suzhou Smartnuclide. Co. Ltd (Jiangsu, China) から BioDeep メタボロミクス解析クラウドプラットフォーム (http://www.biodeep.cn/) を提供していただき、腸内代謝物データの統計解析および差分解析を行っています。
資金提供
本研究は、中国自然科学基金（第32073023号）、中国国家重点研究開発計画（2020YFD0900300号）、武漢科学技術プロジェクト（20190207011480号）により資金援助されたものである。
著者情報
著者および所属
中国科学院水圏生物研究所淡水生態・生物工学国家重点実験室、武漢、430072、中国
Zhenbing Wu、Qianqian Zhang、Jicheng Yang、Mansen Liu、Shuyi Wang、Yaoyao Lin、Jingwen Hao、Meiqi Weng、Derong Xie & Aihua Li
華中科技大学環境科学・工程学院 〒430074 中国武漢市楠町1-1-1
Zhenbing Wu、Jie Fu、Chenyuan Dang
大連海洋大学水産生命学院, 116023, 中国
張清賢・李愛華
青島農業大学海洋科学工程学院水生寄生虫学研究室 〒266237 中国青島市楠町1-1-1
張 倩倩・李 愛華
中国科学院大学先進農業科学院 〒100049 北京市錦江町1-1-1
楊吉成・王淑儀
中国農業部水産養殖病害対策重点実験室、北京、中国
張 金勇
国立水生生物資源センター, NABRC, 武漢, 430072, 中華人民共和国
Yaoyao Lin, Jingwen Hao, Meiqi Weng & Derong Xie （林耀耀耀、郝景文、孟美希、謝徳栄
寄稿
著者の貢献は以下の通りである。AL と ZW は実験の設計を行った。ZW、QZ、JY、ML、CDは実験を行った。ZW, QZ, JY, ML, SW, YL, JHは試料採取と試料分析を行った。ZW、QZ、JZ、CD、SW、YL、JH、MW、DXがマイクロバイオームデータを解析した。ZW、JY、CD、ML、MW、DXはメタボロームデータの解析を行った。ZWとALが原稿を作成した。ZW、AL、JZ、JFは原稿を編集した。最終原稿は全著者が読み、承認した。
共著者
Aihua Liにご連絡ください。
倫理に関する宣言
倫理的承認と参加への同意
このプロジェクトは、中国科学院水圏生物学研究所の動物倫理・福祉委員会により承認された（承認番号：IHBCAS-E011030601-2）。
論文発表の同意
該当なし
競合する利益
著者らは、競合する利害関係がないことを宣言する。
追加情報
出版社からのコメント
Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して、中立的な立場をとっています。
補足情報
追加ファイル1：補足表1.
各群におけるティラピアの体重(kg)の結果。補足表2. 異なるサンプルタイプにおけるハイスループット配列決定で得られた有効配列の分布範囲。補足表3. 16S rRNA配列の類似度97%をカットオフとして算出したα多様性指数のまとめ。補足図1. 全サンプルの配列同一性97%でクラスター化したOTUの希少化解析。(A) 胃内容物と粘膜のOTUレベルのRarefaction曲線、(B) 胃内容物と粘膜のOTUレベルのShannon曲線、 (C) 鰓と腸のサンプルのOTUレベルのRarefaction曲線、(D) 鰓と腸のサンプルのOTUレベルのShannon曲線。補足図2. 全試料における細菌群集の門レベル分布：（A）胃内容物と粘膜試料の細菌門、（B）鰓と腸試料の細菌門。補足図3. 腸管粘膜の細菌門の対照群とワクチン接種群との比較。Welch t-testの有意性。** p < 0.01. 補足図4. 全サンプルにおける細菌群集の属レベルでの分布：（A）胃内容物および粘膜サンプルの細菌属、（B）鰓および腸サンプルの細菌属。補足図5. LEfSeによる鰓と胃の試料中の細菌群集のOTUレベルでの比較：（A）鰓粘膜の細菌群集の対照群とワクチン接種群との比較、（B）胃内容物の細菌群集の対照群とワクチン接種群との比較、（C）胃粘膜の細菌群集の対照群とワクチン接種群との比較。ハイライトされた分類群は、各色に対応するグループに濃縮されている。LDAスコアは、OTUの相対的存在度の差の程度として解釈できる。補足図6. メタボロームデータ処理結果：（A）品質保証の結果、（B）品質管理（QC）の結果。QC特性ピークの相対標準偏差（RSD）、つまり変動係数が30％を超えないようにする。補足図7. Bray-Curtis 距離に基づく主成分分析（PCA）により、微生物機能の積分構造の非類似性を可視化したもの。
追補ファイル2.
補足方法
権利と許可
この記事は、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、いかなる媒体や形式においても使用、共有、適応、配布、複製を許可するクリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスの下に提供されています。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれます。もし素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合には、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの献呈放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）は、データへのクレジットラインに特に記載がない限り、この記事で利用可能となったデータに適用されます。
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この記事の引用
Wu, Z., Zhang, Q., Yang, J. et al. 腹腔内ワクチン接種によって誘発された腸内共生微生物叢の著しい変化が、NEW Genetically Improved Farmed Tilapia (NEW GIFT, Oreochromis niloticus) の腸内代謝における変化を媒介している。Microbiome 10, 221 (2022). https://doi.org/10.1186/s40168-022-01409-6
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受領日
2022年6月7日
受理済
2022年11月01日
掲載
2022年12月12日発行
DOI
https://doi.org/10.1186/s40168-022-01409-6
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