森林ジャコウジカの麝香分泌段階における化学組成と微生物相の変化
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原著論文
Front. 微生物学、2024年03月05日
微生物生理学・代謝学分野
第15巻 - 2024年｜https://doi.org/10.3389/fmicb.2024.1322316
この論文は次の研究テーマの一部です。
微生物二次代謝産物のバイオテクノロジー応用における最近の進歩
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森林ジャコウジカの麝香分泌段階における化学組成と微生物相の変化
https://www.frontiersin.org/journals/microbiology/articles/10.3389/fmicb.2024.1322316/full?utm_source=S-TWT&utm_medium=SNET&utm_campaign=ECO_FCIMB_XXXXXXXX_auto-dlvrit
徐中賢,徐中賢
1,2
李鳳,李鳳
1,2
銭劉銭劉
1
馬天元馬天元
2
シャオラン・フェンXiaolan Feng
3
趙桂俊趙桂俊
3
デジュン・ツェンDejun Zeng
3
ディヤン・リーDiyan Li
2
ハン・ジエ
ハン・ジエ
3
*
1中国西南部野生動物資源保護重点実験室（教育部）、四川野生動物リハビリテーション繁殖研究センター、中国西師範大学、南中、中国
2四川農業大学四川省農業動物遺伝資源探求イノベーション重点実験室、中国、成都
3四川・重慶生物資源研究利用共同重点実験室、重慶中医薬大学薬用植物栽培研究所、重慶、中国
森林ジャコウジカは天然の麝香を生産するための最も重要な動物であり、麝香の組成は麝香の分泌中に周期的に変化し、それに伴ってジャコウジカと共生細菌の組成も変化する。本研究では、GC-MSおよび16S rRNAシーケンシングを実施し、異なる交尾状態における血清テストステロン値を統合することにより、麝香分泌期間（麝香分泌最盛期、麝香分泌旺盛期、麝香分泌後期）における相関化学組成および微生物叢の動的変化を調査した。その結果、テストステロン値、麝香成分および微生物叢は、麝香分泌の年周期とともに変化し、交尾状態に影響されることがわかった。麝香の分泌が旺盛な時期には、麝香とテストステロン値はピークに達し、この時期の微生物相は他の2つの時期とは異なっていた。放線菌、ファーミキューテス、プロテオバクテリアが麝香分泌期を通じて優勢であった。PICRUSt分析により、バクテリアは麝香のさやに偏在し、麝香中の抗生物質とテルペノイドの代謝に関与していることが示された。「炭水化物とアミノ酸"、"脂肪酸とCoA"、"代謝物の分泌 "はそれぞれ3つの期間で濃縮された。Pseudomonas、Corynebacterium、Clostridium、Sulfuricurvumは、麝香の分泌における潜在的なバイオマーカーであった。本研究により、麝香分泌における遺伝的メカニズムがより包括的に理解され、麝香分泌におけるムスコーンとエチオコラノンの合成における放線菌とコリネバクテリウムの重要性が強調された。
1 はじめに
伝統的な漢方薬や香水製造の貴重な原料であるジャコウは、オスのジャコウジカ（Moschus berezovskii）（FMD）のへそと生殖器の間にある腺嚢から分泌される（Meng et al.） 麝香腺から最初に分泌された粘着性があり、白色で悪臭を放つ液状の麝香は、カテーテルによって麝香さやに運ばれ、最終的に発酵することによって、特有の麝香臭を持つ黒褐色の固形物に成熟する（Biら、1988）。麝香分泌前期（PMSP）には初期の液状麝香が合成され、麝香分泌旺盛期（VMSP）には多量の液状麝香が生成され半固形麝香となり、麝香さやに貯蔵された液状麝香は麝香分泌後期（LMSP）には完全に成熟し最終的な固形麝香となる（Bai et al.）
テストステロン（T）は、麝香形成を誘導するために精巣を標的とする最も不可欠な因子である（Wilslockiら、1947；Wangら、2012；Baiら、2013；Fanら、2018）。性ホルモン（テストステロンとエストラジオール）レベルは、麝香の形成と分泌の年間サイクルと一致していることが研究で示された（Zheng et al.） テストステロン濃度は、麝香分泌の3つの段階にわたって最初は増加し、その後減少し（Baiら、2013；Suoら、2020）、麝香分泌が旺盛な時期にピークに達し、他の時期よりも有意に高い（Baiら、2013；Fanら、2018）。一方、テストステロンはジャコウジカ、ジャコウネコ、インドジャコウネコなどの麝香分泌動物の麝香腺の季節的発達に大きな役割を果たしている（Zhangら、2017）。ジャコウジカの収量と血清Tレベルには正の相関があり、血清エストラジオールおよびプロゲステロンレベルには負の相関がある（Bai, 2012; Bai et al.） しかし、繁殖期におけるジャコウジカの交尾状態とT値が関連するかどうかは依然として不明である。
Jieは、麝香の化学組成の数が6月から8月にかけて増加し、8月から10月にかけて減少することを報告した。また、森林ジャコウジカの麝香分泌が旺盛な時期には、ケトン類が優勢な化学物質であることがわかった（Jie et al.） さらに、我々の以前の研究では、交尾していない雄（UM：22.79±3.6g、n＝5）では、交尾している雄（MM：1.12±0.34g、n＝5）よりも多量の麝香が分泌されることが示され、麝香の分泌が交尾状態と関連していることが示唆された（Li et al.） ムスコンは天然ムスクの主成分として、発情期のメスの性的誘引のための化学的コミュニケーションのためのフェロモンとして機能すると主張されており（Sokolovら、1987）、これはLMSPのUMからより多くのムスコンを検出することで検証された（Liら、2016）。
研究により、ジャコウジカ属の腸内細菌叢、糞便微生物叢、麝香微生物叢では中核となる細菌群集（ファーミキューテス属、バクテロイデーテス属、プロテオバクテリア属）が共有されているが、異なる種、交尾状態、年齢、性別、食物源では鍵となる属が異なっていることが示されている（Hu et al.、2017；Li et al.、2017；Hu et al.、2018；Li et al.、2018；Sun et al.、2019；Zhao et al.、2019）。哺乳類のケミカルコミュニケーションに関する発酵仮説では、香腺内の発酵菌によって分泌される匂いの代謝産物が、宿主のコミュニケーションに利用されるとされている（Theisら、2013）。我々の研究は、麝香の成熟が複雑な微生物群集と宿主によって産生される化学化合物との相互作用によって影響されることを証明し、共生細菌が動物間の交尾状態特異的な匂いの根底にあることは、多くの細菌属がUMに過剰発現していた事実によって説明されている（Li et al.）
2 材料と方法
2.1 動物とサンプル採取
重慶薬用植物栽培研究所（Chongqing Institute of Medicinal Plant Cultivation、中国重慶市）で、2.5～6歳の健康な飼育下FMD30頭（UM15頭、MM15頭）を飼育した。PMSP、VMSP、LMSPに相当する5月末から6月、9月、10月に麝香を採取した。各ステージについて、非交配個体については6生物学的複製を、交配個体については7生物学的複製を採取した。すべての実験は四川農業大学動物飼育使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee of Sichuan Agricultural University）（承認ID：B20160403）により承認されたガイドラインに従って実施し、動物の苦痛を最小限に抑えるよう努めた。麝香分泌期および非分泌期に血清 T 定量測定のため血液を採取した（各群 n = 10）；体重、麝香収量は LMSP で記録した（n = 10）。血清テストステロンは、テストステロンELISAキット（BNIBT、北京、中国）を用いて測定した。操作は明細書に従って行った。
2.2 マスクの化学成分抽出とGC-MS測定
試料の調製は、若干の修正を加えて既述のとおり行った（Li et al.） 各群の麝香試料20ミリグラムをプールし、2分割してジエチルエーテルおよびエーテルアルコール2.5 mLに溶解し、超音波処理および13,000×gで5分間の遠心分離により2時間抽出した。上清2mlをGC-MS装置（GCMS-QP2010 Plus、上海、中国）に入れ、カラム温度40℃、注入口温度290℃のクロマトグラフィー条件で化学組成を検出した： カラム温度：40℃、注入口温度：290℃、界面温度：220℃、圧力49.5 kPaでスプリット注入。カラム温度プログラムは以下の通り： 40℃（2分）、200℃（5分、10℃/分）、240℃（5分、5℃/分）、290℃で15分間維持。全流量およびカラム流量はそれぞれ9.0および1.0 mL/min、線速は36.1 cm/s、パージ流量は3.0 mL/min、質量走査範囲は33-600 m/zであった。全イオンクロマトグラム（TIC）の取得データは、米国標準技術局（NIST）のマススペクトルライブラリーのデータと比較した。データには80％以上の信頼係数を採用し、ピーク面積％値を用いて成分のばらつきを判定した。最後に、6つのグループ間で化学組成を識別するために、パレート・スケーリング後に偏最小二乗判別分析（PLS-DA）を行った。
2.3 細菌DNA単離と16S rRNA塩基配列決定
各サンプルの全細菌DNAは、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit (MOBIO, CA, USA)を用い、製造者の指示に従って単離した。DNAの品質は1.0％アガロースゲル電気泳動とNanoDrop分光光度計（NanoDrop Technologies, Wilmington, DE）で検査した。16S-rRNA遺伝子のV3-V4可変領域を標的とするプライマー515-F（5′- GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）および907-R（5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）を使用した（Merrifieldら、2013）。16S-rRNA遺伝子はPCR（95℃、3分間、続いて95℃、30秒間、55℃、30秒間、72℃、45秒間を35サイクル、最終伸長は72℃で8分間）で増幅した。PCR産物をEzgene TM Gel/PCR Extraction Kit（Biomiga、米国）で精製・回収し、TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit（イルミナ）を用いてライブラリー構築に供した。最終的に、合計39のライブラリーが構築され、Novogene社（中国、北京）のIllumina Hiseq 2,500プラットフォーム（Illumina Inc.
2.4 バイオインフォマティクス解析
Cutadaptソフトウェア（V1.9.1）を用いて、得られた低品質リードとキメラを除去し、FLASH（V1.2.71）を用いて、Read 1とRead 2のオーバーラップ塩基が10 bp以上であること、ミスマッチがないことを条件に、前処理したペアエンドリードをマージした。高品質のリードは、FastQC (V0.11.72)による品質管理後に生成された。高品質リードはQIIME (Quantitative Insights IntoMicrobial Ecology, Boulder, CO, USA, V1.8.0)のUPARSE (V7.0.10014)を用いて3%のunidentity閾値でoperational taxonomic unit (OTU)に割り当て、UsearchソフトウェアによりGreenGenes参照データベースに基づく種アノテーションから微生物分類群を同定した。上位10門と上位20属の相対存在量（RA）を分析し、4つのα多様性指標（Shannon、PD全木、観察OTU、Chao1）を推定し、TukeyのHSD検定によるANOVAを用いて6グループ間の有意差を比較した。β多様性の評価に先立ち、Bray-Curtis距離とUniFrac距離を算出するために、算術平均を用いた重み付けなしペアグループ法（UPGMA）クラスタリングツリーを構築し、微生物群集の分離を評価するために正準コレスポンデンス分析（CCA）と主座標分析（PCoA）をRパッケージ（V2.15.3）を用いて実施した。線形判別分析（LDA）効果量（LEfSe）は、6つのグループ間で異常に豊富な微生物を決定するために実行され（Segataら、2011）、LDAスコア> 4を有する選択された細菌は、上位20の化学成分とのスピアマン相関を計算するために使用された。最後に、Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt2) (Langille et al., 2013)を用いて、麝香微生物群の機能予測をオンラインで行った。
3 結果
3.1 血清テストステロン（T）濃度は麝香の分泌により変化する
T濃度はUM群（PMSPとVMSP）でMM群より有意に高かった。非分泌期（N）における血清T濃度は、UM群では7.37±1.78nmol/L、MM群では5.54±1.62nmol/Lと低く、基礎的なレベルであった。T値はN期からPMSP期にかけて有意に上昇し（UMで35.72±1.28nmol/L、MMで25.68±2.64nmol/L）、VMSP期にピークに達した（UMで69.44±3.24nmol/L、MMで57.24±6.65nmol/L）。VMSPからLMSP（UMでは31.32±2.03nmol/L、MMでは28.34±3.59nmol/L）へと徐々に減少した（図1A）。麝香分泌後期には、UMから21.161±5.434gの完熟分泌物を採取したが、これはMM由来の量（7.122±1.648g、p = 0.018）よりも有意に多かった。また、麝香の収量はMMでは血清T値と有意な正の相関（R = 0.719、p = 0.019）を示したが、UMでは相関は見られなかった（補足図S1）。
図1
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図1. ムスク分泌における血清テストステロンと化学組成の特徴。(A)血清テストステロン値のヒストグラム、(B,C)ジエチルエーテルとエチルアルコールに基づく麝香分泌物の部分最小二乗判別分析(PLS-DA)。(A) パネルAの列上の異なる文字は有意差を示し、同じ文字は有意差なし、p < 0.05。Nは非麝香分泌期を示す。PMSP、VMSP、LMSPはそれぞれ麝香分泌の盛期、旺盛期、晩期を示す。UMとMMはそれぞれ未交尾オスと交尾オスを表す。
3.2 麝香分泌に伴う化学組成の変化
一般に、TICから、ジエチルエーテルで抽出された化学物質の数（75.17±8.32）は、エチルアルコールで抽出された化学物質の数（66.00±11.09）よりも多く、天然麝香の主要な医療活性成分および芳香成分として、3-メチルシクロペンタデカノン（muscone）が最も豊富な成分であることが示された（UMで26. 99％、MMでは25.54％）、次いで3a-ヒドロキシ-5b-アンドロ スタン-17-オン（エチオコラノン）（UMでは12.95％、MMでは12.30％）、コレステロール（UMでは10.99％、MMでは7.82％）であった（補足図S2、S3；補足表S1）。PLS-DAの結果、LMSPの2つの溶媒で抽出された代謝物はPMSPとVMSPでより区別され、UMとMMの違いはLMSPの中で最も少なかった（図1B,C）。
3.3 16S rRNAシーケンスデータの統計学的解析
PMSP、VMSP、LMSPでは平均52,868リード、40,226リード、50,735リードが得られ、UMとMMにはそれぞれ45,202リードと51,141リードが割り当てられた（補足表S2）。97％の類似度で割り当てられたOTUは1,431個であった。OTUの平均数は各グループで977±64個で、865個（PMSP-MM）から1,014個（LMSP-UM）であり、PMSPでは1,075個、VMSPでは1,157個、LMSPでは1,248個であった。UMで検出されたOTU数はMMで検出されたOTU数よりも有意に多かった（UMで〜1,024、MMで〜930、p = 0.0002）。OTUの分類学的分類の結果、39門、84綱、162目、291科、569属、654種が検出され、このうち1,431OTU中391OTU、39門中19門、569属中257属が各グループ内の全個体で共有され、最もユニークなOTUはLMSP（UMで37、MMで14）とVMSP（MMで23、UMで4）で検出された（補足図S4）。
3.4 属レベルでの優占微生物相組成の違い
支配的な微生物叢の構成を説明するために、相対的な割合で上位10門と上位20属を選んだ。放線菌、ファーミキューテス属、プロテオバクテリア属、バクテロイデーテス属は、6つのグループに共通して優勢な微生物群集であり、その相対比率は全属の87％以上を占めた（図2上）。興味深いことに、VMSP-MM群では放線菌の相対比率が77.57％±11.24％と高く、UM群（20.39％±9.24％）を大きく上回り、他の2期間とは有意に異なっていた（p = 0.0017）。属レベルでは、コリネバクテリウム属とエアロコッカス科の未同定の属が、PMSPとVMSPの期間に共通して優勢な微生物群集であった。特にVMSP-MM群ではコリネバクテリウム属が63.63%と多く、他の群の平均相対比率（6.82%）やUMの相対比率（14.21%）よりも有意に高かった（p = 0.0261）。LMSP期間中、MMではオリゲラ属、エンテロコッカス属、セトバクテリウム属が、UMではシュードモナス属、セトバクテリウム属、アシネトバクター属が主に優勢であった（図2下）。
図2
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図2. 6群における門（上）および属（下）レベルの微生物相組成の相対存在量のヒストグラム。
3.5 麝香分泌物における微生物叢多様性の変化
6群内および6群間の微生物叢組成の違いをさらに評価するため、αおよびβ多様性を算出した。PMSPとLMSPの間で観察されたOTUのMM（p = 0.0477）とChao1指数（p = 0.0451）の有意差は、PD全木とShannon指数では示されなかった（図3A-D、補足表S3）。Bray-Curtis距離に基づくグループ間の微生物相組成の違いを補足表S3に示す。PMSPとVMSPの間に有意な不一致が観察され（MMではp = 0.0040、UMでは0.0100）、PMSPとLMSPの間の分散はMM内で検出されただけであった（p = 0.0090）。CCAの結果は、サンプル間の全分散の17.7％（p = 0.001）を説明した。VMSPの全サンプルはクラスター化し、PMSPとLMSPの大半のサンプルによってクラスター化されたコミュニティから明確に分離されており、これはPCoA 1（47.76%）でよく説明できた。しかし、このプロットでは、UM群とMM群の違いはごくわずかであった。予想通り、VMSPの麝香微生物叢についてもPCoAプロットで同じ結果が得られた（図3E,F）。
図3
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図3. 麝香微生物叢のα多様性（A-D）とβ多様性（E,F）の変動。アスタリスクはp < 0.05を意味する。
3.6 麝香の分泌を媒介する化学成分と相互作用する細菌群
バイオマーカーとみなされる可能性のある、発現量の異なる細菌分類群をさらに特定するために、6つのグループのLEfSe分析を行った。21の分類群が、3つの麝香分泌ステージにわたって有意に豊富なコミュニティ（LDA > 4およびp < 0.05）として同定され、上位3つの優勢な微生物コミュニティ（ファーミキューテス、プロテオバクテリア、およびアクチノバクテリア）に属していた。その中でも、ファーミキューテス属は3つの期間のMMで優勢であった（LDA > 5）。VMSP期間では、プロテオバクテリア属の5分類群（プロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリア、シュードモナデス属、シュードモナデス科、シュードモナス属）、およびアクチノバクテリア属の5分類群（コリネバクテリウム属）が、それぞれUMとMMで異なる細菌であった。LMSP期間では、ファーミキューテス属の6分類群（クロストリジウム属とエアロコックス科の未知の属）、およびプロテオバクテリア属の2分類群が、MMとUMで異なる微生物であった（図4A）。さらに、UMとMMの間で17の分類群が有意なバイオマーカー（LDA > 4、p < 0.05）として同定され、MMではより多くの分類群、すなわち5つのファーミキューテス、5つの放線菌、1つのプロテオバクテリア、特にCorynebacteriumとSulfuricurvumが検出された。UMのバイオマーカーとしては、Clostridiumを含むファーミキューテス属2種、Actinobacteria属1種、Proteobacteria属2種（Rhodobacteraceaeの未同定属）、Bacteroidetes属1種（Bacteroidaceaeの未同定属）が同定された（図4B）。
図4
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図4. 未交尾オスと交尾オス（B）の麝香分泌ステージ（A）間で有意差（LDA > 4）を示した分類群。UMとMMはそれぞれ未交尾オスと交尾オスを表す。Aは、3つの麝香分泌ステージにわたるUMとMMの間で有意に豊富な21の分類群のLEfSe分析を意味する。BはUMとMM間の有意なバイオマーカーとして17分類群のLEfSe解析を意味する。
同定されたバイオマーカーの相対的な存在量を用いて、上位20の化学成分のレベルとのスピアマン相関分析を行ったところ、p_Actinobacteriaの存在量はムスコンと正の相関があることがわかった（R = 0. 886, p = 0.019）、ノルムスコン（R = 0.829, p = 0.042）、17-オキソアンドロスト-5-エン-3-イル硫酸水素塩（R = 0.870, p = 0.024）、シス-9-ヘキサデセナール（R = 0.928, p = 0.008）、シクロトリデカノン（R = 0.928, p = 0.008）と正の相関があった。c_Gammaproteobacteriaの存在量は、3a-Hydroxy-5b-androstan-17-one（etiocholanone）と正の関係（R = -0.943, p = 0.005）、コレステロールと負の関係（R = -0.890, p = 0.019）を示した。g_Corynebacteriumの存在量は、エチオコラノン（R = 0.829, p = 0.042）およびコレステロール（R = 0.886, p = 0.019）と正の相関があったが、ジヒドロアンドロステロン（R = -0.943, p = 0.005）とは負の相関があった。また、エアロコッカス科植物の存在量は、アンドロスタン-17-オール、2,3-エポキシ（R = -0.845, p = 0.034）と負の相関があった（図5）。
図5
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図5. 優占細菌分類群と麝香の上位20化学成分との間のピアソン相関。アスタリスクはp＜0.05、赤四角は正の相関、青四角は負の相関を示す。
3.7 麝香微生物群の機能予測
各グループにおける微生物機能の違いを調べるために、割り当てられたOTUを用いて、PICRUSt2を通じて機能カテゴリの相対的な存在量を決定した。その結果、6つのグループで39のパスウェイが予測機能を共有していることがわかった。興味深いことに、テルペノイドやポリケチドの代謝に属する「アンサマイシンの生合成（ko01051）」、「バンコマイシン系抗生物質の生合成（ko01055）」、「テルペノイド骨格の生合成（ko00900）」、「ケトン体の合成と分解（ko00072）」が全サンプルで検出された。ステージ特異的な機能については、6つのパスウェイがPMSP-MMに特異的に濃縮されていることがわかった。「グリオキシル酸およびジカルボン酸代謝（ko00630）」はVMSP-MMで特異的に濃縮された。LMSP-UMでは3つのパスウェイが特異的に濃縮されていた。さらに、"Geraniol degradation (ko00281) "はLMSP中のUMで濃縮され、"Bacterial chemotaxis (ko02030) "は3つの期間を通してUM群でのみ割り当てられた（図6および補足表S4）。
図6
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図6. 麝香微生物叢の機能予測値のヒートマップ（Zスコアで正規化）。PMSP、VMSP、LMSPはそれぞれ、麝香分泌最盛期、旺盛期、後期を示す。UMは未交尾オス、MMは交尾オスを表す。*は6群で濃縮されたパスウェイ、△はPMSP-MMに特異的なパスウェイ、◇と○はそれぞれVMSP-MMとLMSP-MMに特異的に濃縮されたパスウェイを示す。
4 考察
サンプル収集の苦労と非侵襲的なサンプリングの原則から、本研究ではサンプル数が制限された。森林に生息するジャコウジカの臆病な特徴と猛烈な反応は、サンプリングの難易度を高めている。実際、初期段階で麝香を採取すると、その後の麝香分泌が減少し、次の段階での採取が困難になる。したがって、1回の採集で全個体の麝香を十分に採取することはできない。我々は以前の研究でUMとMMの化学組成と微生物相を研究したが、LMSP中の微生物相の変化と優占菌の重要な役割を解明したに過ぎなかった（Li et al.） 麝香腺に棲息する細菌群集によって麝香のTレベルと動的組成が変化するかどうかは不明であり、麝香の分泌段階を超えた交配状態と微生物叢の関係については、さらなる研究が必要である。我々は30頭の健康なジャコウジカを選び、麝香分泌中の未交尾個体6頭と交尾個体7頭をサンプリングした。合計39個体（UM 18個体、MM 21個体）のライブラリーを作成し、16S rRNA配列決定を行った。さらに、麝香は最も貴重な香りのある動物製品のひとつであり、金よりも高価である。DNA抽出に十分な量の麝香（少なくとも0.8 g）を優先的に採取し、各群20 mgの麝香をプールしてGC-MSで定量した。
さらに、異なる交尾状態における血清Tレベルを統合することで、麝香分泌に伴う化学組成と微生物叢の動的変化を調査した。HPG軸によって媒介される最も重要なアンドロゲンの1つとして、テストステロンは麝香腺の発達と生理的反応に影響を与えうる（Biら、1980；Knol、1991）。Baiは、麝香腺分泌期（2～7歳の雄の森林ジャコウジカ、n＝30）の糞便中T濃度に明らかな傾向があることを発見し、同様のパターンがエストラジオールにも見られたが、プロゲステロンには明らかな傾向は見られなかった。非分泌期（114.15±15.46ng/g）と比較して、PMSP（1731.50±95.66ng/g）およびVMSP（3766.82±98.48ng/g）のT値は有意に高く、麝香分泌期（412. 05±54.14ng/g）、PMSPで急速に増加し、VMSPでピークに達した後、LMSPで急減した（616.79±68.79ng/g）（Bai, 2012; Bai et al、 2013). 本研究の結果から、血清T値は麝香分泌期にダイナミックに変化し、同様にVMSPでピークを迎え、麝香分泌期に有意に上昇し、MMよりもUMではるかに高いことが示された。Zhangら（2015）とSuoら（2020）は、分泌の3段階で血清と糞便のT濃度がそれぞれ最初に上昇し、その後低下すると報告している。さらに、MMではより強い正の相関（R2＝0.719、p＝0.019）が見られたが、UMでは相関のない関係（R2＝0.084、p＝0.816）が見られた。Bai（2012）とBaiら（2013）は、ジャコウの収量がTレベルと正の相関があることを示した（R2 = 0.650、p < 0.05）。Sunら（2020）は、麝香の分泌量はTレベルが高い方が低い方よりも有意に多いことを発見した。以前の研究では、テストステロンの筋肉内注射によって麝香の分泌を促していた（Jie et al.） Fanは、性ホルモンが麝香分泌初期の麝香組成を決定し、麝香分泌を促進する可能性さえあることを示唆した（Fan et al.） ムスコンの含有量は、すべての成分の中で最も高い相対量を示した。以前の報告（Su et al., 2009）と一致し、ステロイド（コレステロール、コレスタノール、エチオコラノン）は麝香中で比較的高いレベルを示した。
α多様性には若干の個体差が見られたが、複数のα指標にわたる変動に一貫した傾向は見られなかった。β多様性値の主座標分析では、VMSPのサンプルは他の2つの期間と明確に分離しており、これはVMSPで観察された最も高いTレベルと一致していた。微生物叢の多様性は、宿主によって維持される麝香嚢のホメオスタシスに影響され、未交尾の雄が雌により魅力的な麝香を作るためには、やや豊富な微生物叢が特異的な匂い物質の合成に不可欠であると推測された（Li et al.、2016；Jie et al.、2021）。
一般に、麝香腺に集住する細菌群集の大幅な変化は、麝香分泌時の生理的活動に起因すると考えられている（Li et al.） ジャコウジカでは放線菌、ファーミキューテス、プロテオバクテリアが優勢細菌であるが（Sundset et al., 2007; Gruninger et al., 2014; Ishaq and Wright, 2014）、その組成は麝香分泌によってダイナミックに変化する。すなわち、VMSPでは放線菌（特に交尾した15頭と交尾していない15頭の2群）が絶対的に優勢であり、PMSPとLMSPではそれぞれファーミキューテスとプロテオバクテリアが細菌群集の大部分を占めた。Huらは、季節変動に伴ってファーミキューテス-バクテロイデーテス比が低下することを明らかにしたが、森林ジャコウジカの腸内細菌叢では優勢属に有意な変化は見られなかった（Hu et al.） 我々は、森林ジャコウジカの発育過程における相対的な微生物叢存在量の違いを報告しており、幼体ではClostridialesとBacteroidalesが多く、成体ではPseudomonasとLachnospiraceaeが多かった（Zhao et al.） Liら（2021）は、森林ジャコウジカの若齢個体における糞便微生物相組成が、7～10日齢で認められたものから属レベルで変化し、30日齢以降は安定し、放線菌、Spirochaetes、Ruminococcaceae_UCG-005、Treponema、Prevotellaの相対量が離乳前群よりも離乳後群で高いことを明らかにした（Liら、2020）。
LEfSe分析によると、セルロース分解菌を含むファーミキューテス属が3つのステージで優勢であった（Hugenholtz, 2002）。VMSPでは、抗菌性化合物に耐性を持つプロテオバクテリア（Leeら、2012）と、ムスク中の抗炎症成分の主な供給源であるアクチノバクテリア（Scharf and Brakhage、2013；O'Connor、2015；Motoyama and Osada、2016）が優勢であった。緑膿菌は、膿瘍性疾患を伴うFMDにおいてTrueperella pyogenesの増殖を抑制することができる（Yuanら、2020年）。放線菌には、経済的および医学的に重要なメンバーが含まれる。コリネバクテリウム（Corynebacterium）やストレプトマイセス（Streptomyces）などの糸状放線菌は、多くの生物活性二次代謝産物を産生することができ、これらの代謝化合物の多くは抗菌、抗がん、抗ウイルス、免疫抑制活性を有する（Prudence et al.、2020；Undabarrena et al.、2021；Seshadri et al.、2022）。コリネバクテリウムは、異種テルペノイドを合成するための商業用細菌株として、また芳香族炭化水素代謝研究のモデル系として使用されている（Shen et al.） コリネバクテリウムの代謝産物は、治療において鎮痛、抗がん、抗酸化機能を果たす（Heiderら、2012；Hariら、2019）。これらの細菌は、ムスコンおよびエチオコラノンと正の相関があることが確認された（ガンマプロテオバクテリア/コリネバクテリウム対エチオコラノンおよびアクチノバクテリア対ムスコン）。LMSPの間、Aerococcaceaeの代謝物は脂肪酸の供給源となり、外来菌の侵入を防いでいる可能性がある（Hugenholtz, 2002）。
全グループで濃縮されたパスウェイから、これらの細菌が抗生物質やテルペノイドの代謝に関与していることが示された。これらは、抗菌・抗炎症成分や麝香の特異的な匂い物質の合成に不可欠である。例えば、アンサマイシンやバンコマイシンは細菌感染症の治療に用いられる抗生物質であり（Yu et al., 2002; Watanabe et al., 2003; Okano et al., 2017）、テルペノイドはステロールやケトンの前駆体であり（Mookherjee and Wilson, 1982; Wriessnegger and Pichler, 2013）、これらは放線菌科（Hwang et al、 2014）、放線菌（放線菌とコリネバクテリウム）（van Bergeijkら、2020）、粘液細菌（Schaberleら、2014）、および産業におけるタンパク質細菌（大腸菌）（Yamadaら、2015；Leeら、2016；Wangら、2018）。PMSP特異的経路のうち、PTSは細菌が糖質を取り込むために用いる主要なメカニズムであり（Deutscher et al. グリオキシル酸およびジカルボン酸代謝は、脂肪酸またはCoAからの糖質の生合成と関連している（Yoo et al.） 細菌分泌系は、グラム陰性菌の膜を介したタンパク質輸出を媒介することが示されている（King et al.） 細菌の走化性は環境への適応反応であり、UMはMMよりもメスにとって魅力的である可能性が示唆され、この魅力はUMで細菌が産生する芳香物質によって駆動される（Miller et al.）
5 結論
結論として、麝香の血清Tレベル、化学組成および微生物叢は、麝香の分泌に伴って動的な変化を示した。VMSPの微生物叢は他の2期とは異なっていた。VMSPのバイオマーカー候補はPseudomonasとCorynebacteriumであり、LMSPのバイオマーカーはClostridiumであった。MMのCorynebacteriumとSulfuricurvum、UMのClostridiumはFMDの交配状態を区別するのに使用できる可能性がある。また、アクチノバクテリアとコリネバクテリウムは、麝香分泌中のムスコーンとエチオコラノンの合成に重要な役割を担っていると推測しており、これらの仮説を確認するためにはさらなる研究が必要である。しかしながら、これらの結果はメタゲノム機能を予測するものであり、我々の仮説を確認するためにはさらなる検証が必要である。
データの利用可能性
本研究で発表した16S rRNAシーケンスデータは、https://ngdc.cncb.ac.cn/bioproject、アクセッション番号PRJCA002782に寄託されている。
倫理声明
動物実験は四川農業大学のInstitutional Animal Care and Use Committeeの承認を得た（承認ID：B20160403）。本研究は、現地の法律および施設要件に従って実施された。
著者貢献
ZX：構想、方法論、プロジェクト管理、執筆（原案）、執筆（校閲・編集）、資金獲得。FL： 監修、執筆-校閲・編集、ソフトウェア。QL： 執筆-校閲・編集、データ管理、形式分析。TM: データキュレーション、執筆-校閲・編集、可視化。XF: 執筆-校閲・編集、データ管理、調査。GZ: データキュレーション、執筆-校閲・編集、リソース。DZ: リソース、執筆-校閲・編集、ソフトウェア。DL： ソフトウェア、執筆-校閲・編集、データ管理、形式分析。HJ：執筆-校閲・編集、構想、資金獲得、プロジェクト管理、監督。
資金提供
著者は、本論文の研究、執筆、および/または発表のために財政的支援を受けたことを表明する。本研究は、中国国家自然科学基金（81973428、82274046）、中国西師範大学基礎研究基金（21E037、21E038、KCXTD2022-7）、重慶人材プログラム（cstc2021jscx-bgzxm0201）の助成を受けた。
利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。
発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。
補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2024.1322316/full#supplementary-material。
脚注
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キーワード：森林ジャコウジカ、化学組成、微生物叢、麝香分泌段階、交尾状態
引用 Xu Z, Li F, Liu Q, Ma T, Feng X, Zhao G, Zeng D, Li D and Jie H (2024) 森林ジャコウジカの麝香分泌段階による化学組成と微生物叢の変化。Front. Microbiol. doi: 10.3389/fmicb.2024.1322316.
受理された： 16 October 2023; Accepted： 2024年2月16日；
発行：2024年03月05日
編集者
Vijay K. Sharma, 農業研究機構（ARO）, イスラエル
査読者
スニル・バンスカール（アリゾナ大学、米国
Chandni Talwar（インド、デリー大学
Copyright © 2024 Xu, Li, Liu, Ma, Feng, Zhao, Zeng, Li and Jie. 本記事は、クリエイティブ・コモンズ 表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。
*文責 Hang Jie, jiehangisgood@126.com
免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、あくまで著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。
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