腸内時計の乱れが大腸癌におけるバリア機能障害とディスバイオシスを引き起こす

哉百名

2024年10月1日 19:10

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研究論文

癌

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腸内時計の乱れが大腸癌におけるバリア機能障害とディスバイオシスを引き起こす

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ado1458

Rachel C. Fellows https://orcid.org/0000-0001-6454-7062,Sung Kook Chun https://orcid.org/0000-0001-8207-0034,[...], andSelma Masri https://orcid.org/0000-0002-8619-8331 +6 著者情報 & 所属機関

サイエンス・アドバンス
27 9月 2024
第10巻 39号
DOI: 10.1126/sciadv.ado1458

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要旨

食事は、腸内細菌叢の日内リズムを制御する強固な同調合図である。我々や他の研究者らは、概日時計の乱れが大腸癌（CRC）の進行を促進することを明らかにしてきた。特定の細菌種がCRCのドライバー的役割を果たすことが示唆されているが、腸内時計がマイクロバイオームに影響を及ぼしてCRCの発症を促進するかどうかは不明である。そこで、CRCのApc駆動マウスモデルを用いて、概日時計の遺伝子破壊を行い、腸内細菌叢への影響を明らかにした。時計破壊がCRCと組み合わされた場合、メタゲノム配列決定により、バクテロイデス、ヘリコバクター、メガファエラを含む多くの細菌属の調節異常が同定された。また、核酸、アミノ酸、炭水化物代謝の調節障害や腸管バリア機能の障害など、微生物経路の機能的変化が確認された。我々の発見は、時計の乱れが微生物叢の構成と腸管透過性に影響を及ぼし、それがCRC発症に寄与している可能性を示唆している。

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はじめに

概日リズムは、睡眠、摂食サイクル、代謝および内分泌の合図を24時間に集約することにより、生物生理学の基礎となっている(1 -5)。これらの生理過程は、転写因子CLOCKとBMAL1によって駆動される細胞自律的分子時計によって支配されている(6 -9)。さらに、Wntシグナルによって支配される腸管幹細胞や細胞増殖（10 -15 ）、免疫恒常性（16 -19 ）、腸管透過性（20 -23 ）など、多くの重要な消化管機能には概日リズムがある。腸内時計は、食物のタイミングや含有量を変えると、宿主の概日リズムやマイクロバイオームの構成に影響を及ぼす可能性があることから、特に注目されている(24 -29)。
腸内には体内で最も豊富で多様な共生微生物群集が存在し、消化系（30 -33 ）、免疫系（34 -37 ）、神経系（38 -41 ）に影響を及ぼすため、適切な腸管バリア機能は組織の恒常性維持に不可欠である。腸内細菌叢は組織特異的な概日リズムを調節する上で重要な役割を果たしており、細菌量、細菌種、代謝の日内変動が報告されている（25 、28 、42 -45 ）。逆に、概日リズムの乱れはマイクロバイオームのホメオスタシスも変化させる可能性がある。明暗サイクルを変化させると、マイクロバイオータの組成やリズムが変化し（46 -49 ）、腸管バリアの欠損が増加し（20,21 ）、タイトジャンクション遺伝子の発現が変化する（20,21,48 ）。環境の変化とは別に、Bmal1や Per1/2の遺伝子欠損が微生物量の振動パターンを変化させることから、分子時計が微生物のリズム制御に直接関与していることが示唆されている（44 -46 ）。
腸内細菌叢の組成を変化させることは、健康や疾患にとって重要な意味を持つ。腸内細菌叢の異常は、大腸癌（CRC）などの病態において広く報告されている(50 -57)。微生物量の変化とそれに続くバリア機能障害が、初期のCRC発症の重要な一因である可能性が示唆されている(52,58 -63)。CRCで濃縮されることが判明した細菌には、アリスティペス、バクテロイデス、ビロフィラ、コリオバクテリア、エシェリヒア、フソバクテリア、パラバクテロイデス、プレボテラなどがあり（50,52,55,64 -67 ）、ビフィズス菌、腸内細菌、フェーカリバクテリウム、ローズブリア、ストレプトコッカスなどは減少していた（51,52,64,68 ）。さらに、Fusobacteriumnucleatum（69 -72 ）やBacteroidesfragilis（73 -75 ）などの特定の細菌が、Wntシグナル伝達やc-Mycの活性を直接調節することにより、CRCの発症に重要な役割を果たすことが報告されている。これらの研究を総合すると、腸内細菌叢と腸管バリア機能がCRC発症に関与している可能性が示唆される。
夜勤労働による概日リズムのずれは、ある種の癌の危険因子として示唆されている(76 -86)。腸癌のマウスモデルを用いて、私たちや他の研究者は、概日時計の遺伝的・環境的破壊がCRCの進行を促進することを示してきた（87 -89 ）。したがって、概日時計の乱れと腸内細菌異常症の両方が、CRCの発症に独立して関連する重要な特徴である。しかし、腸内時計がCRC発症時の微生物種の多様性と存在量に直接影響を及ぼすかどうかは、まだ完全に解明されていない。この問題を解決するため、われわれはメタゲノムシークエンシングを用いて、がん依存性細菌と時計関連細菌を決定した。その結果、Fusobacterium mortiferum、Parasutterella excrementihominis、Paramuribaculum intestinaleなど、特定の細菌種が主にがんと関連していることがわかった。また、Bacteroides acidifaciens（バクテロイデスアシシファシエンス）、Bacteroides caecimuri（バクテロイデスカエシムリ）、Bacteroides thetaiotaomicron（バクテロイデステタイオタオミクロン）などのバクテロイデス属細菌が、単独またはがんとの組み合わせで時計が乱れると増加することもわかった。さらに、大腸腫瘍における粘液染色の減少に関連する粘液分解を含む、細菌の核酸、アミノ酸、脂肪酸、炭水化物代謝経路の変化を同定した。我々はまた、CRCの存在下で時計が乱されると、腸管バリア機能に重大な障害が起こることも発見した。タイトジャンクションとムチン遺伝子の発現が調節されなくなり、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）-デキストランに対する透過性がin vitroとin vivoで増加することが観察されたからである。全体として、概日時計は腸管透過性と細菌の恒常性の維持に重要であり、これらの因子はCRCの発症に重要である可能性が示された。

結果

CRCの遺伝子モデルにおいて、時計の破壊は腸内細菌叢の組成を変化させる

CRCの発症過程において、腸内細菌叢の異常と慢性炎症は患者(90,91)やマウスモデル(92,93)でよく報告されている。また、F.nucleatum（69 -72 ）やB.fragilis（73 -75 ）などの特定の細菌がCRCの進行に関与している可能性も提唱されている。概日リズムの乱れが腸内細菌叢を変化させるという知見が得られているにもかかわらず（46 〜49）、時計を介した細菌量の変化がCRCの病態にどのような影響を及ぼすかは現在のところ不明である。我々は最近、腫瘍抑制因子Apcのエクソン1〜15の腸特異的ヘテロ接合体欠失（Apc+/Δex1-15or Apc+/- ）と、Bmal1の両アレルにおけるエクソン8の欠失（Bmal1-/- ）を持つ新規遺伝子改変マウス（GEMM）を用いて、時計の乱れがCRCを促進することを証明した（図1A）（89）。このGEMMでは、BMAL1タンパク質のレベルが失われ（図S1A）、これが腸における概日性遺伝子発現の障害に寄与している（図S1B）(89)。時計を介したCRCの促進に関与している可能性のある細菌を同定するために、野生型マウス（WT）、Bmal1-/-マウス、Apc+/-マウス、およびApc+/- ;Bmal1-/-マウスの糞便のメタゲノムシークエンシングを行った（図1A ）。WTマウスとApc+/-;Bmal1-/-マウスの間では、シャノン分析（図1B）とチャオ分析（図1C）の両方のα多様性分析によると、種の豊かさの有意な減少が観察された。次に、Bray-Curtis原理共分散分析を用いてβ多様性を解析し、グループ間の微生物叢組成の全体的な違いを調べた。WT、Bmal1-/-、およびApc+/-マウスは互いに類似していたが、Apc+/- ;Bmal1-/-グループは異なっており、その楕円は他の遺伝子型から部分的に離れていた（図1D ）。類似性の分析（ANOSIM）を行い、群間の類似性が各群内の類似性より大きいか等しいかを検定した。効果量（R ）値は1より0に近く（R= 0.173）、グループ内と比較して、グループ間に小さいが有意に（P= 0.003）大きな差があることを示した（図1E ）。全体として、微生物組成のシフトは、腫瘍を持つApc+/-;Bmal1-/-マウスで認められた。

図1. 時計破壊とがんは微生物構造を変化させる。

(A) WTマウス、Bmal1-/-マウス、Apc+/-マウス、Apc+/-;Bmal1-/-マウスの糞便を用いたショットガン・マイクロバイオーム・シーケンスの実験デザイン（WTマウスはn= 9、Bmal1-/-マウスとApc+/-マウスはn= 8、Apc+/-;Bmal1-/-マウスはn= 10）。シャノン指数（B）およびチャオ指数（C）を用いた、属レベルでのマイクロバイオーム配列決定におけるα多様性の比較。データは平均値±最小値および最大値を含む箱ひげ図として表した。統計的有意性はWilcoxon符号順位検定で決定し、有意な多重比較によるP値はグラフ上に* < 0.05で示した。(D) Bray-Curtis距離を用いた原理的共分散分析（PCoA）によって決定されたβ-多様性。楕円は95％信頼区間を示す。(E)遺伝子型間の類似性の分析（ANOSIM）を箱ひげ図として表したもの。エフェクトサイズ(R)値はグループ間の差の程度を示し（0, 差なし; 1, 最大の差）、P値は有意性を示す。遺伝子型は以下のように示した： WT（W）、Bmal1-/-（B）、Apc+/-（A）、Apc+/-;Bmal1-/-（AB）。

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クロックディスラプションとCRCにより、細菌種の存在量が変化する。

どの特定の細菌が微生物叢構造の変化に関与しているかを調べるために、まず異なる分類群の存在量を調べた。最も多く存在したのはファーミキューテスとバクテロイデーテスの2つの系統で、遺伝子型全体の平均存在量はそれぞれ42％と40％であった（図2A）。WTから一重変異体、二重変異体に至るまで、ファーミキューテス類の平均存在量は順次減少し、バクテロイデーテス類の平均存在量は順次増加した（図2A ）。さらに細菌種を、時計型変異マウス、腫瘍を持つ動物、あるいは両方のグループにおける、WTに対する変化に基づいて分類した（図2、B～D）。MaAsLin2（線形モデルによるマイクロバイオーム多変量関連解析）解析は、メタオミクスデータ解析において不可欠な考慮事項である偽発見をコントロールしながら、統計的検出力を維持するために行われた(94)。時計関連細菌には、B. acidifaciens、B. caecimuris、Bacteroides congonensisが含まれ、これらはApc+/- ;Bmal1-/-マウスで有意に増加し、Bmal1-/-マウスでは非統計的に有意な増加を示した（図2B ）。もう1つの時計依存性細菌はHelicobacter apodemusで、Bmal1-/-およびApc+/-;Bmal1-/-の両方で有意に増加した（図2B ）。CRC関連菌として、P. intestinale、P. excrementihominis、Faecalibaculum rodentiumが同定され、これらはApc+/-;Bmal1-/-マウスで有意に増加し、Apc+/-では有意な増加は認められなかったが、F. mortiferumは Apc+/-マウスでのみ有意に増加した（図2C）。最後に、クロックミュータントマウスとCRCマウスの両方で変化した細菌種を同定した（図2D）。Helicobacter bilisはすべての変異マウスでWTに対して減少し、Apc+/-マウスでは有意であった。B. thetaiotaomicronは Apc+/-;Bmal1-/-マウスで有意に増加し、Bmal1-/-マウスとApc+/-マウスでは有意な増加を示さなかった（図2D ）。これらのデータを総合すると、腸内時計の乱れ、腫瘍の進行、あるいはその両方の組み合わせに関連する細菌種が分類される。

図2. 時計の乱れとCRCはマイクロバイオーム組成を変化させる。

(A) WTマウス、Bmal1-/-マウス、Apc+/-マウス、Apc+/-;Bmal1-/-マウス（WTマウスはn= 9、Bmal1-/-マウスとApc+/-マウスはn= 8、Apc+/-;Bmal1-/-マウスはn= 10）の微生物門と属の相対的存在量。遺伝子型は以下のように示した： WT（W）、Bmal1-/-（B）、Apc+/-（A）、Apc+/-;Bmal1-/-（AB）。時計変異体（B ）、癌変異体（C ）、および時計変異体と癌変異体の両方（D ）の糞便サンプルで変化した細菌の相対量。エラーバーはSEMを表し、有意性はMaAsLin2を用いて決定した。有意なq値（q> 0.25）を持つパスウェイのP値は、* < 0.05、** < 0.01、*** < 0.001でグラフ上に示されている。

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細菌バイオマーカー種の同定

微生物全体の表現型に有意に寄与する主要な細菌バイオマーカー種を同定するために、線形判別分析効果量（LEfSe）分析を行った（95 ）。クラドグラムは、中央の王国から円の外側の種までの分類学的レベル間の関係を示している（図3）。図上の色のブロックは、目、科、属、種レベルで有意な違いが確認された場所を示している。クラドグラム内の紫、緑、青、赤の円は、それぞれWT、Bmal1-/-、 Apc+/-、 Apc+/- ;Bmal1-/-における有意差を示す。グループ間の差の程度を表す線形判別分析（LDA）スコアで並べた細菌バイオマーカー種をfig. S2. Bmal1またはApc欠失のみの寄与を調べるために、WT対単一変異体の比較を行った（図3、AおよびB、ならびに図S2、AおよびB）。B. caecimuri（e）およびH. apodemus（b4）はBmal1-/-マイクロバイオームと関連し、Collinsella intestinalis（b）、Faecalibacterium rodentium（b1）およびSutterella wadsworthensis（b3）はWTマイクロバイオームと関連した（図3Aおよび図S2A）。F. mortiferum（b2）はApc+/-マウスにおいてのみCRCと関連していた（図3Bおよび図S2B）。MaAsLin2解析（図2D）と同様に、B. thetaiotaomicron（h）はBmal1-/-マウスとApc+/-マウスの両方に関連していた（図3、AおよびB、ならびにS2、AおよびB）。これらのバイオマーカーのデータは、バクテロイデス属とヘリコバクター属は概日時計の乱れによって影響を受け、一方、フソバクテリア属はCRCの発症において変化するという、われわれの先行研究を支持するものである（図2、B〜D）。

図3. クロックディスラプションとCRCはマイクロバイオームのバイオマーカー種を変化させる。

4つの遺伝子型（WTではn= 9、Bmal1-/-およびApc+/-マウスではn= 8、Apc+/-;Bmal1-/-マウスではn= 10）から得られたマイクロバイオーム配列データの線形判別分析の効果量（LEfSe）。クラドグラムは、WTとBmal1-/-（A ）、WTとApc+/-（B ）、Bmal1-/-と Apc+/-;Bmal1-/-（C ）、Apc+/-と Apc+/-;Bmal1-/-（D ）の比較を示す。各文字に対応する細菌種を、門ごとに分類して下のキーに示す。図中の紫（WT）、緑（Bmal1-/-）、青（Apc+/-）、赤（Apc+/-;Bmal1-/-）のブロックは、その遺伝子型の微生物叢が目、科、属、種レベルで有意に濃縮されていることを示す。同じ色の円は、属または種レベルで有意差がある場所を反映している。種は、図の下にある完全な種名の英数字キーで示され、門ごとにグループ化されている。

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Bmal1-/-マイクロバイオームとApc+/-;Bmal1-/-マイクロバイオームを比較すると、多様な門からより多くの細菌が同定された（図3Cおよび図S2C）。Bmal1-/-マウス（図3Cおよび図S2C）またはWTマウス（図S2E）の非腫瘍微生物叢には、固形化菌が多く含まれていた。Apc+/-;Bmal1-/-に関連する主な細菌は、LDAスコアが最も高い順に、Muribaculum intestinale(j)とP. intestinale(k)であった（図3Cおよび図S2C）。Apc+/-と Apc+/-;Bmal1-/-のマイクロバイオームを比較したところ、バクテロイデス科全体がApc+/-よりもむしろApc+/-;Bmal1-/-と強く関連していた（図3Dおよび図S2D）。Apc+/-で濃縮された多くの細菌は、Lactonifactor longoviformis(q)、Extibacter muris(y)、Roseburia hominis(a1)、Helicobacter typhlonius(b7)などのWTマウスやBmal1-/-マウスでも濃縮されていた（図3、CおよびD、ならびに図S2、CからE）。このことから、これらの細菌は、クロックディスラプションとCRCが組み合わさった場合にのみ、発現が低下することが示唆される。逆に、Megasphaera elsdenii（r）とBacteroides stercoris（g）は、WT、Bmal1-/-、またはApc+/-のマイクロバイオームと比較すると、Apc+/- ;Bmal1-/-の時計駆動性腺がん状態と関連していた（図3、CおよびD、ならびに図S2、C〜E）。M. elsdeniiは乳酸を利用する細菌であるため、腫瘍由来の乳酸が腸上皮に高濃度に存在するような、より進行したCRCと関連している可能性がある（96）。全体として、バクテロイデス属、ヘリコバクター属、フソバクテリウム属の細菌は、時計破壊やCRCに伴って変化するが、これらの変異が組み合わさることで、幅広い分類群から生じる、より実質的な細菌の変化が生じる。

時計破壊やCRCによって変化する代謝経路の同定

これまでの研究で、微生物種の個体間変動が大きいにもかかわらず、微生物叢の機能的出力は比較的保存されたままであることが示唆されている(97)。メタゲノム配列決定では16S遺伝子だけでなく多くの細菌遺伝子が同定されるため、HUMAnN 3.0を用いて細菌遺伝子配列を機能経路の変化に直接帰属させた（98）。グループ間で最も多かったパスウェイは、ウリジン5′-一リン酸生合成、トランスファーRNAチャージ、葉酸変換、スクロースとバリンの生合成などで、微生物叢の主要な代謝機能を反映していた（図S3）。MaAsLin2(94)によって決定された、有意に変化したパスウェイ上位50を図4Aに示す。Apc+/-;Bmal1-/-微生物叢で最も変化した6つの経路は、アミノ酸（メチオニンおよびPre-Q0）、ビタミン（葉酸）、炭水化物（アンヒドロムロペプチドおよびペプチドグリカン）、および核酸（プリン）代謝であった（図4Bおよび図S4A）。l-メチオニン、葉酸、プリンヌクレオチド代謝経路も、Apc+/-マイクロバイオームで有意に増加した（図4Bおよび図S4A）。腫瘍を持つApc+/-およびApc+/- ;Bmal1-/-微生物遺伝子配列では、核酸代謝に関わる多くの経路がアップレギュレートされていた（図4A ）。さらに、脂肪酸伸長や8-アミノ-7-オキソノナン酸生合成など、複数の脂肪酸代謝経路がApc+/-微生物群で増加し、アルギニン生合成やケオシン生合成などのアミノ酸代謝経路がApc+/-;Bmal1-/-微生物群で増加した（図4A ）。Apc+/-;Bmal1-/-マイクロバイオームで増加した上位6つの経路のうち、糖質代謝に関連するアンヒドロムロペプチドのリサイクリング経路とペプチドグリカンの成熟経路もBmal1-/-マイクロバイオームで有意に増加した（図S4A）。Bmal1-/-およびApc+/-;Bmal1-/-マイクロバイオームで増加した他の5つの経路を同定し、これらが概日リズムの乱れと関連していることを示唆した（図S4B）。これらはホモ乳酸発酵、チアミン代謝、リン脂質生合成、プリン核酸塩基分解に関与していた。

図4. 時計機能破壊マウスと腫瘍マウスにおける微生物パスウェイ解析。

微生物機能パスウェイは、4つの遺伝子型（WTではn= 9、Bmal1-/-およびApc+/-マウスではn= 8、Apc+/-;Bmal1-/-マウスではn= 10）から得られたマイクロバイオーム配列データを用いてHUMAnNでプロファイリングした。(Bmal1-/-,Apc+/-,Apc+/-;Bmal1-/-マウスで変化した微生物パスウェイのMaAsLin2による有意な変化。経路はq値で調整したエフェクトサイズで色分けし、符号は変化の方向を示す。Apc+/-;Bmal1-/-マウスでは、WTに対して最も増加（B）または減少（C）したパスウェイの全遺伝子型における相対存在量。その他の経路をfig. S4（AおよびB）に示す。エラーバーはSEMを表し、有意性はMaAsLin2を用いて判定した。有意なq値（q> 0.25）を持つパスウェイのP値は、グラフ上に** < 0.01、*** < 0.001、*** < 0.0001で示した。

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Apc+/-;Bmal1-/-マイクロバイオームで最も発現が低下した6つの経路は、炭水化物（スタキオース、グルコース、ヘクスロニド／ヘクスロン酸、シチジン5′-一リン酸レギオナミネート）、エネルギー（嫌気性）、ビタミン（ビオチン）代謝に関与していた（図4、AおよびC、ならびに図S4C）。我々のApc+/- ;Bmal1-/-マウス（図4C）において、ヘクスロニドおよびヘクスロン酸分解経路の顕著な制御低下は、炭水化物代謝の変化を示唆した。Apc+/-;Bmal1-/-微生物叢では、d-ガラクツロン酸、d-フルクチュロン酸、β-d-グルクロン酸（グルクロン酸とフルクチュロン酸からなる）を含むヘクスロン酸とヘクスロン酸の分解に関与する経路がさらに有意に発現低下していた（図S4D）。Bmal1-/-およびApc+/-;Bmal1-/-マイクロバイオームでは、ガラクトース分解を含む経路も減少していた（図S4、DおよびE）。このことから、Apc+/-;Bmal1-/-微生物叢では、粘液由来の糖質を含む、食事および宿主由来の糖質分解経路の制御が低下していることが示唆される。要約すると、時計の破壊またはCRCの発症のいずれかが、核酸、アミノ酸および脂肪酸関連経路の活性化、ならびに炭水化物およびエネルギー代謝の減少を伴う、多くの異なる細菌代謝経路を変化させることがわかった。

宿主粘液代謝は概日障害と腫瘍形成によって変化する

同定された炭水化物代謝経路のうち（図4および図S3）、多くは食餌性栄養素や粘液に含まれるヘクスロニドなどの糖の分解に関与していた(99)。これらのマウスでは、食餌組成と食餌摂取量は変化していないので（45,89 ）、下流の細菌糖代謝経路の変化は、宿主の粘液産生による変化から生じる可能性がある。粘液層は、無菌粘膜下層や血液中への細菌の移行（101,102 ）や腸および全身性炎症の増加（103 ）を防ぐ一方で、栄養の吸収を可能にする上皮バリアの重要な部分を形成しているので、このことは特に興味深い。そこで我々は、以前に発表したRNA配列決定（RNA-seq）データ（89）を用いて、4つの遺伝子型における粘液産生に関連する遺伝子の発現の変化を調べた。その結果、Apc+/- ;Bmal1-/-マウスの腸上皮から単離したオルガノイドでは、最も高発現している4つのムチン遺伝子-Muc2、Muc3、Muc3a、Muc13（図5A ）、および分泌細胞・杯細胞マーカーであるAtoh1、Clca1、Fcgbp（図S1C）の発現が有意に低下していることがわかった。

図5. CRCではムチン遺伝子の発現と粘液量が減少している。

(A ）4つの遺伝子型すべてから得られた小腸オルガノイドのRNA配列決定（RNA-seq）により決定された、最も高発現の上位4つのムチン遺伝子の発現（n= 独立したマウス由来の3つのオルガノイド株）。(B) 定量ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）により決定した、WTマウスのIECにおけるムチン遺伝子のツァイトゲーバー時間に対する発現。平均概日周期は、リズム性のP値が0.01未満の場合に示した。すべての値を表S2に示す。(C ）ZT4およびZT16でn= 3匹の独立したマウスから採取したWTおよびBmal1-/-IECにおけるムチン遺伝子の発現。(D）ZT4およびZT16でn= 3匹の独立したマウスから採取したWT IECsおよびApc+/-;Bmal1-/-腫瘍におけるムチン遺伝子の発現。(E）WT、Bmal1-/-、 Apc+/-、およびApc+/-;Bmal1-/-マウスのホルマリン固定パラフィン包埋小腸切片の過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色。腫瘍を持つ遺伝子型は、主に正常な領域（周囲）と主に腫瘍を含む領域（ポリープ）に分かれている。スケールバーは200μm。エラーバーはSEMを表し、統計的有意性は(A)ではDEseq2により、(C)と(D)ではTukeyの多重比較を用いた一元配置分散分析（ANOVA）により決定した。アスタリスクは偽発見率（FDR）または多重比較からのP値を表し、* < 0.05、** < 0.01、*** < 0.0001。ラベルのない比較は有意ではない。

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粘液の厚さは概日性であることが知られているので(42,104)、WTマウスの腸管上皮細胞(IEC)から概日周期にわたってムチン関連遺伝子の発現をプロファイリングした。その結果、IECにおけるBmal1、Cry2、Dbp、Reverb-α遺伝子の発現には、周期値が24に近い有意な概日リズムがあることが確認された（図S5A、表S2）。次に、RNA-seqデータに従って、最も発現量の多い4つのムチン遺伝子のリズミカルな発現を調べた。その結果、Muc2は有意にリズミカルであったが、他のムチン遺伝子は明確な概日リズムを示さなかった（図5Bおよび表S2）。以前の研究で、Muc2は従来のマウスや無胚葉マウスではリズミカルではないことがわかった(105)。しかし別の報告では、腸特異的Bmal1の欠損がMuc2のリズミカルさを消失させることが確認された(45)。そこで、概日時計の遺伝的破壊がムチン遺伝子の発現に影響するかどうかを調べるために、WTマウスとBmal1-/-マウスから2つの異なる時刻にIECを単離した。予想されたように、Bmal1-/-マウスのIECでは、時計および時計制御遺伝子の中核がWTに対して変化していた（図S5C）。図5Bと一致して、WT IECでは、ムチン遺伝子の発現において、ツァイトゲーバー時間4（ZT4）とZT16の間に有意な差は観察されなかった（図5C ）。しかし、Bmal1-/-マウスから単離したIECでは、ZT16でMuc2とMuc3の発現が有意に低下した（図5C ）。Muc2を除いて、多くのムチン遺伝子は生体内では動的なリズムを持たない。しかしながら、Muc2とMuc3の発現は、概日時計の遺伝子破壊によって影響を受けることから、腸管粘液のターンオーバーに影響を与える複雑な制御軸が存在する可能性が示唆される。
MaAsLin2パスウェイ解析により、粘液および腸管バリア経路に影響を与えると思われる糖質代謝の変化が同定された（図4）。大腸腫瘍において粘液レベルが変化しているかどうかを明らかにするために、WT IECまたはApc+/-;Bmal1-/-腫瘍のいずれかから、2つの時点でムチン遺伝子発現解析を行った。複数の時計遺伝子の発現の有意な減少が観察された（図S5E）。このことは、CRCにおいてコア時計遺伝子がミスレギュレーションされるという報告と一致している（13,106 -110 ）。Apc+/-;Bmal1-/-腫瘍ではムチン遺伝子の発現が低下しており（図5D）、これは腫瘍特異的な時計遺伝子の発現の消失に対応していた（図S5E）。ムチンの発現の変化が粘液レベルの機能的変化をもたらしたかどうかを決定するために、PAS（過ヨウ素酸シッフ）染色を行い、糖タンパク質やムチンに見られる糖をPASが酸化して着色することから、糖質を定量した。特に、粘液レベルが時計に依存しているのか腫瘍に依存しているのかを明らかにしたかった。杯細胞を示す黒い矢印のついた高倍率画像を図5Eに、生物学的複製の低倍率画像をfig. S6Aに示す。WTとBmal1-/-の間のPAS染色には、糖衣層を見ることによっても、杯細胞数を見ることによっても（図5Eと図S6A）、上皮面積に対するPAS染色を定量することによっても（図S6B）、質的な差は見られなかった。しかしながら、Apc+/-およびApc+/-;Bmal1-/-マウスの腫瘍では粘液染色が減少し、腫瘍の広い領域で杯細胞が完全に消失していることがわかった（図5Eおよび図S6、AおよびB）。まとめてみると、遺伝子時計が破壊されがんになると、ムチンの腸内発現が変化することがわかった。しかしPAS染色では、進行した腫瘍領域でのみ粘液レベルの減少が確認された。

腸内時計はタイトジャンクション遺伝子の発現を支配する

粘液産生はバリア機能の重要な部分であるが、腸の完全性にとってさらに不可欠な側面は、上皮細胞を接合し、細胞間透過性を媒介し、細菌が下層組織に侵入するのを防ぐタイトジャンクションである(111,112)。RNA-seqデータから、時計の乱れとCRC発症に伴うタイトジャンクション遺伝子の発現変化を同定した(89)。Apc+/-;Bmal1-/-オルガノイドでは、Cldn4と Tjp1（ZO-1）の発現が有意に増加し、Cldn7、Cldn15、Cldn23、OclnはWTに比べて有意に減少した（図6Aおよび図S1D）。Cldn8の発現はBmal1-/-オルガノイドで有意に増加し（図6A）、Apc+/-;Bmal1-/-オルガノイドでも同様の傾向が見られたことから、概日時計によって制御されている可能性が示唆された。

図6. タイトジャンクション遺伝子の発現は時計に依存しており、CRCでは破綻している。

(A）4つの遺伝子型由来の小腸オルガノイドのRNA-seqによって決定された5つの主要タイトジャンクション遺伝子の発現（n＝3つの独立したマウス由来のオルガノイド株）。(B)WTマウスのIECにおけるタイトジャンクション遺伝子の発現を、qPCRによって求めた。平均概日周期は、リズム性のP値が0.01未満であった場合に示した。すべての値を表S2に示す。(C）ZT4およびZT16でn= 3匹の独立したマウスから採取したWTおよびBmal1-/-IECにおけるタイトジャンクション遺伝子の発現。(D）ZT4およびZT16でn= 3匹の独立したマウスから採取したWT IECおよびApc+/-;Bmal1-/-腫瘍におけるタイトジャンクション遺伝子の発現。エラーバーはSEMを表し、統計的有意性は(A)についてはDEseq2により、(C)と(D)についてはTukeyの多重比較による一元配置分散分析により決定した。アスタリスクはFDRまたは多重比較からのP値を表し、* < 0.05、** < 0.01、*** < 0.0001。ラベルのない比較は有意ではない。

ビューアで開く

これまでの研究で、Cldn1、Cldn3、Oclnのような特定のタイトジャンクション遺伝子の発現は、腸において時間-日依存性の差異を示すことが見出されており(20,113,114)、腎臓や肝臓のような他の組織においてもCldn2、Cldn4、Cldn5を含むリズム遺伝子が同定されている(115 -117)。そこで、タイトジャンクション遺伝子の発現解析をWT IECで概日周期にわたって行った。Cldn8は、IECにおいて概日・概夜周期で有意な遺伝子発現の概日振動を示したが（図6Bおよび表S2）、他の遺伝子は有意なリズムを示さなかった（図6B 、図S5Bおよび表S2）。これらの遺伝子発現変化がBmal1にも依存しているかどうかを調べるために、2つの異なる時間に採取したWTおよびBmal1-/-IECを用いて、タイトジャンクション遺伝子について定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）を行った。Cldn8は Bmal1欠損により有意に発現が上昇し、Tjp1は低下したが、他のタイトジャンクション遺伝子の変化はあまり明らかではなかった（図6Cおよび図S5D）。腫瘍においてタイトジャンクション遺伝子の発現が変化しているかどうかを調べるために、WT IECとApc+/-;Bmal1-/-腫瘍サンプルを2つの概日時点で用いた。腫瘍サンプルでは、タイトジャンクション遺伝子発現の有意な減少がOclnと Tjp1で観察され、Cldn7と Cldn8では減少した（図6Dと図S5E）。これらのデータを総合すると、遺伝的な時計の乱れだけではタイトジャンクション遺伝子の発現にわずかな影響しか及ぼさないが、進行したCRCではこの影響が悪化することが示された。

時計に依存した腸管バリア機能の制御

腸管透過性は昼夜周期で振動することが報告されている(25)。しかし、腫瘍の進行過程における腸管透過性に対する時計の乱れの寄与はまだ不明である。これを検証するために、ヒトCaco-2細胞を用いたin vitro腸管上皮モデルを用いて、透過性アッセイ用の分化単層を樹立した（118 ）。24時間の概日周期全体を2つの時点で捉え、遺伝子発現と透過性を比較できるように、12時間間隔を選んだ。培養中のCaco-2細胞を同期化したところ、予想通りBMAL1とREVERBαの発現は、同期化後12時間に対して24時間で有意に高いことがわかった（図7A）。次にムチン遺伝子を調べたところ、MUC2とMUC17（マウスMuc3とオルソログ）には有意差があったが、MUC3AとMUC13には概日数12（CT12）とCT24の間に差がなかった（図7B）。タイトジャンクション遺伝子についても調べたところ、CLDN2、CLDN4、CLDN7は有意に減少し、CLDN8と OCLNは有意に増加した。これらの遺伝子発現の変化に基づいて、トランスウェル支持体上で培養したCaco-2上皮単層の4-kDa FITC-デキストランに対する透過性を、同期化から12時間後と24時間後に試験した。その結果、Caco-2単層におけるFITC-デキストラン透過性の時間依存的制御が観察された（図7D）。これはBMAL1、REVERBα、CLDN8、およびOCLNの発現量と逆相関しており、発現量の低下と透過性の上昇とは相関していた。

図7. 細胞単層の透過性は時計に依存しており、時計異常とCRCが組み合わさると腸管バリア機能が低下する。

DEXで同期化したCaco-2細胞におけるコアクロック（A）、ムチン（B）、タイトジャンクション（C）遺伝子の発現（n= 3独立実験）。(D）トランスウェルアッセイにおける4-kDa FITC-デキストラン転移によって決定されたDEX同期化Caco-2細胞の単層透過性（n= 3独立した実験）。(E）WTマウス、Bmal1マウス、Apc+/-マウス、およびApc+/-;Bmal1-/-マウスの腸管透過性を、ZT23での4-kDa FITC-デキストラン（600 mg/kg）の経口投与とZT0での血清採取によって測定した（n= 3から8匹の独立したマウス）。統計学的有意性は、(A)から(D)はStudentの対応のないt検定により、(E)はTukeyの多重比較による一元配置分散分析により決定した。アスタリスクは、* < 0.05、** < 0.01、*** < 0.001の無対t検定または多重比較によるP値を表す。ラベルのない比較は有意ではない。

ビューアで開く

我々のデータは、タイトジャンクションとムチン遺伝子の発現と腸管透過性との間に時間依存的な相関があることを示唆している。そこで、in vivoでの腸管透過性を調べるために、われわれはGEMMを活用して、概日時計が腸管バリア機能を単独で制御しているのか、あるいはCRCとの関連で制御しているのかを調べた。絶食マウスにZT23で4-kDa FITC-デキストランを投与し、ZT0で血清蛍光を測定して腸管透過性を読み取った。ZT0は、腸管バリア機能のピークを示す発表された知見に基づいて選ばれた（25 ）。WTマウスで透過性が最も低くなる時期を選びたかったからである。図7Eに示すように、Bmal1-/-および Apc+/-の単独変異マウスでは、腸管透過性の有意な増加は認められなかった。しかし、二重変異Apc+/-;Bmal1-/-マウスでは、腸管透過性が有意に増加した（図7E ）。このことは、時計の乱れとCRCの進行が一緒になって腸管バリア機能を悪化させることを示唆している。併せて、我々のデータは、時計の乱れとCRCの発症がマイクロバイオーム構成を変化させ、バクテロイデス、ヘリコバクター、メガファエラなどの細菌の存在量が変化し、広範な微生物代謝産物が変化することを示している。これらの細菌の変化は、腫瘍粘液染色の減少、タイトジャンクション遺伝子発現の変化、腸管バリア機能の欠損を伴い、CRCの進行を悪化させる可能性がある。

考察

われわれは、メタゲノムシークエンシングを用いて腸内細菌叢の変化を明らかにするために、時計の乱れとCRCに関するGEMMを活用した。B. caecimuriや H. apodemusなど、Bmal1欠損時に増加する細菌種や、F. mortiferumなど、Apc駆動型CRCモデルで増加する細菌種を同定した（図2および3）。クロックディスラプションとCRCを組み合わせると、マイクロバイオーム組成に大きな変化が見られ、バクテロイデス属の菌種がより大きく変化し、M. elsdeniiのような新たな菌種が同定された（図1～3）。機能的には、CRCマウスでは、核酸、アミノ酸、脂肪酸代謝に関連する多くの細菌経路が増加する一方、Apc+/- ;Bmal1-/-マイクロバイオームでは、食餌性糖や粘液性糖を含む多くの糖質分解経路が減少していた（図4）。このことは、進行した腫瘍では粘液染色が少ないことが確認されたことから、宿主粘液の減少と関連している可能性がある（図5）。また、WT IECでは、タイトジャンクション遺伝子Cldn8のリズミカルな発現が観察された（図6）。最後に、時計機能障害とCRCの組み合わせは、in vivoで腸管透過性の有意な増加をもたらすことが確認された（図7）。これらの知見を総合すると、概日時計は腸管バリアの完全性とマイクロバイオームの構成を制御する役割を担っており、これらの影響はCRCとの関連でさらに悪化することが示された。
タイトジャンクションは細胞外透過性を媒介するため、バリア機能の重要な構成要素であり、その破壊は循環系への内毒素の漏出をもたらす可能性がある(111,112)。我々は、Bmal1が欠損すると、Cldn8にリズムが生じ、Tjp1の発現が減少することを同定した。以前の研究で、マウス大腸のタイトジャンクション遺伝子Claudin1とOccludinの発現にPer2依存的なリズミシティが見られたことから（22）、コアクロックは全体としてタイトジャンクションの制御に重要な役割を果たしているのかもしれない。我々は、Bmal1-/-マウスの一部で腸管透過性の亢進を同定したが、これはCRCと合併すると非常に悪化した。以前の研究で、概日リズムの乱れはバリア機能障害、有益な宿主応答を促進する微生物経路のダウンレギュレーション、内毒素産生に関与する微生物遺伝子のアップレギュレーションを引き起こすことがわかった(48)。したがって、概日リズムの乱れは、タイトジャンクションタンパク質の制御を通じて、CRC発症時のバリア機能の破綻に重要な役割を果たしている可能性がある。
我々は、腫瘍を有するApc+/-マウスおよびApc+/-;Bmal1-/-マウスのマイクロバイオームにおいて、F. mortiferumが有意に増加していることを同定した。また、フソバクテリウムは、FadAを介してWntシグナルを調節することにより、CRCのドライバー的役割を果たすことが示唆されている(128)。我々はまた、M. elsdeniiが Apc+/-;Bmal1-/-の腸内細菌叢で上昇していたことから、M. elsdeniiが時計とがんに関連していることも見いだした。M. elsdeniiは乳酸を利用する細菌で、胃がんとの関連が指摘されているが、CRCとの関連は不明である（96 、129 ）。われわれは、進行したCRCでは、腫瘍が乳酸を大量に産生し、それが乳酸消費細菌を刺激しているのではないかと考えている。我々は以前、安定同位体トレーシングとメタボロミクスを用いて、Apc+/-;Bmal1-/-オルガノイドにおいて、乳酸、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質などの代謝物が変化していることを報告した(89)。この研究では、腫瘍の発生に伴い、核酸、脂肪酸、アミノ酸代謝に関連する同様の細菌代謝経路の調節異常が同定された。細菌と腫瘍由来の代謝産物との間の潜在的なクロストークを調べるためには、代謝トレーシングを用いたさらなる研究が必要である。
多くの研究で、CRC患者ではバクテロイデス属、特にB. fragilisが増加していることが確認されている（52,53,60,64,68,119,130 ）が、逆のデータも報告されている（55,63,66,131 ）。このことは、実験方法、癌の不均一性、環境条件、地理的条件などに起因する可能性のある研究間の差異を伴うマイクロバイオーム研究の課題を浮き彫りにしている（97,132,133 ）。我々は、複雑な糖質を分解する幅広い能力を持つ多くの異なるバクテロイデス種の存在量が、時計に関連して増加していることを同定した（134,135 ）。例えば、B. thetaiotaomicronは、食餌性多糖類が不足すると、その代謝を宿主粘液由来の糖鎖に切り替えることができ（136 ）、粘液分解細菌による過剰なコロニー形成は粘液層を薄くする（137,138 ）。我々のモデルでは、Bmal1-/-IECおよびApc+/-;Bmal1-/-腫瘍において、いくつかのムチン遺伝子の発現がWT IECに比べて低下していることがわかった。また、Apc+/-およびApc+/-;Bmal1-/-マウスの腫瘍領域における粘液染色の減少も確認され、これはApc変異マウスモデルを用いた観察結果（139 ）と一致している。しかしながら、我々の微生物経路解析では、Apc+/-;Bmal1-/-微生物群によるヘキスロン酸やガラクトースなどの粘液糖の分解の減少が確認された。一つの可能性として、時計が介在するバクテロイデス種の増加は、粘液の分解を増加させ、粘膜を薄くする。粘液の量が減少すると、細菌は粘液依存性の多糖代謝から他の代謝源へとシフトする。もう一つの可能性は、腫瘍の発生過程において、幹細胞のような状態へ移行する結果、粘液分泌を制御する分泌細胞や杯細胞などの分化細胞が減少することである。その結果、宿主の粘液産生が減少し、微生物の代謝が粘液分解から遠ざかることになる。生体内での粘液代謝におけるこのような変化をより明確にするためには、さらなる研究が必要である。
細菌量の時間的リズムは、遺伝子型に依存し、摂食に大きく影響されることが以前に報告されている（24,28,43,46 ）。以前の研究では、Per1/2の欠失はバクテロイデス属を含む常在細菌量のリズミカルな変動を消失させ、一方、軽い摂食はバクテロイデス属を含む循環する操作分類単位（OTU）のリズムをシフトさせることがわかった(42)。また、Bmal1が欠損すると、バクテロイデス属は非リズミカルに増殖した(44)。最近の研究では、腸内のBmal1が欠損すると、律動的なOTUの半数以上が不律動になることが確認された(45)。動物門レベルでは、Bmal1-/-では、相対存在量解析により、ファーミキューテス類とバクテロイデス類のリズム性は維持されていたが、腸特異的Bmal1欠損による定量解析では、ファーミキューテス類のリズム性が失われていた(45)。細菌量のリズムの変化がCRCの発症に影響を及ぼすかどうかを明らかにするためには、さらなる縦断的研究が必要であり、食事や生活習慣が根本的な疾患の病因に関与している可能性が高い早期発症CRC症例が憂慮すべきほど増加していることを考えると、このことは特に重要である（140 -142 ）。これらのデータを総合すると、概日時計が腸の恒常性の維持に関与していることがさらに明らかになり、概日時計の乱れがCRCのようなストレス因子に対する感受性にどのように関与しているかが明らかになった。

研究の限界

本研究では、腸管腫瘍の発生に関連するマイクロバイオームに対する時計の破壊の影響に焦点を当てた。しかし、我々の研究は、これらの時計調節細菌とCRC重症度亢進との因果関係を示すものではない。これらの細菌がCRCの発症を促進し、微生物叢の介入が疾患の表現型にどのような影響を与えるかを明らかにするためには、例えば主要なバクテロイデス属細菌を用いた単コロニー化など、今後の研究が必要である。

材料と方法

マウス

Apcエクソン1～15の片方の対立遺伝子にflox部位を持つマウス（Jackson Laboratory、009045株）(143)を、Bmal1のエクソン8の両対立遺伝子にflox部位を持つマウス（Jackson Laboratory、007668株）(144)と交配した。これらのマウスをVillin-Creマウス（Jackson Laboratory, strain004586）（145 ）と交配し、腸特異的Apc+/Δex1-15 ;Bmal1fl/fl動物を作製した。実験は、カリフォルニア大学アーバイン校のInstitutional Animal Care and Use Committee（IACUC）のガイドラインに従って行われた（IACUC研究番号AUP-23-069）。マウスは標準的な12時間明暗パラダイムで飼育し、飼料は自由摂取とした。実験には10ヶ月齢のマウスを用い、オスとメスを均等に分けた群に分けた。

マイクロバイオーム配列決定

糞便サンプルは、マウス間の摂餌量の差を最小にするため、ZT8の明期の途中に採取した。サンプルサイズは、マイクロバイオームデータに通常見られるばらつきを考慮して8～10匹とした(97,132,133)。糞便は1mlのDNA/RNAシールド（Zymo Research社、カリフォルニア州アーバイン）でホモジナイズした。糞便サンプルは、Zymo Research社（カリフォルニア州アーバイン）のZymoBIOMICS Shotgun Metagenomic Sequencing Service for Microbiome Analysisで処理、配列決定、解析した。ZymoBIOMICS-96 MagBead DNA Kit（Zymo Research社、カリフォルニア州アーバイン）を用いてDNAを抽出した。Nextera DNA Flex Library Prep Kit（Illumina, San Diego, CA）を用いて、100 ngのDNAインプットとNexteraアダプター（Illumina, San Diego, CA）を用いた内部デュアルインデックス8塩基対（bp）バーコードを用い、メーカーのプロトコールに従ってシーケンスライブラリーを調製した。すべてのライブラリーをTapeStation（Agilent Technologies、カリフォルニア州サンタクララ）で定量し、等量でプールした。最終プールはqPCRで定量し、ライブラリーはIllumina NovaSeq（San Diego, CA）でシーケンスした。生シーケンスリードは、Trimomatic-0.33 quality trimmingで6-bpスライディングウィンドウ、quality cutoff 20、length cutoff 70 bpでトリミングした(146)。微生物組成は、細菌、ウイルス、真菌、マウス、ヒトゲノムデータセットを用いて、Centrifuge (147)でプロファイリングした。α-多様性解析はRのphyloseqパッケージを用いて行い、統計的有意性はウィルコクソンの符号順位検定を用いて決定した。β-多様性解析はveganパッケージとecodistパッケージを用いてRで行い、Bray-Curtis距離を用い、ggplot2とstat ellipse関数を用いてグラフ化した。ANOSIM解析は、Rでveganパッケージとggveganパッケージを用い、Gower距離法を用いて行った。機能解析を行うために、まずKneadDataを用いてマウスおよびウイルスDNAを除去し、続いてChocoPhlAnヌクレオチドおよびuniref90タンパク質データベースを用いてHUMAnNを用いて機能パスウェイ解析を行った(98)。細菌種の存在量（Centrifuge）および機能的パスウェイの存在量（HUMAnN）の有意性は、デフォルトパラメーターおよびq値有意閾値0.25のMaAsLin2を用いて決定した(94)。バイオマーカー探索は、デフォルト設定（P> 0.05 および LDA エフェクトサイズ > 2）でLEfSe（95 ）を使用して実施した。

腸オルガノイド培養

腸管陰窩の単離およびオルガノイドの単離には、既報の方法（89,148 ）に基づき、以下のプロトコルを用いた。各遺伝子型のマウスの回腸を解剖し、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、縦に開いた。腸を2～5mmに切り、2mMのEDTAと10μMのRhoキナーゼ（ROCK）阻害剤（Y-27632）を加えた冷PBS中で1時間回転させた。次に、組織片を冷PBS中で激しく振盪し、70μmセルストレーナーで濾過した。クリプト濃縮画分を290gで遠心し、50μlの成長因子減少マトリゲル（コーニング社）に再懸濁した。マトリゲル重合後、上皮成長因子（EGF）-ノギン-R-スポンジン（ENR）培地を加えた。ENRは、3mM l-グルタミン、プリモシン（50mg/ml）、10mM Hepes、組換えマウスEGF（50ng/ml；PeproTech社）、組換えマウスNoggin（50ng/ml； PeproTech）、1 mMN-アセチルシステイン、20% v/vのR-スポンジン調整培地（Cultrex Rspo1発現細胞、Trevigen）をAdvanced Dulbecco's modified Eagle's medium/Ham's F12培地に添加した。5～7日後、マトリゲルを氷冷PBSで10分間可溶化し、遠心分離することでオルガノイドを継代した。ペレット化したオルガノイドを基底培地（成長因子を含まないENR培地）に再懸濁し、ピペッティングで激しくほぐし、遠心分離した。オルガノイドペレットをマトリゲルに懸濁し、24ウェルプレートにプレーティングした。37℃で重合後、ENR培地を加えた。

ウェスタンブロット

腸オルガノイドペレットを氷冷したラジオイムノ沈降アッセイ溶解バッファー［50mMトリス（pH8）、150mM NaCl、5mM EDTA、15mMMgCl2、および1％ NP-40］中で溶解し、適切な阻害剤［1×完全EDTAフリーカクテル錠（Sigma-Aldrich）、0.5mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、20mM NaF、1mMNa3VO4、および1μMトリコスタチンA］を加えた。溶解液を遠心分離し、上清のタンパク質濃度をBradford試薬（Thermo Fisher Scientific）を用いて測定した。タンパク質ライセートをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲルで分解し、BMAL1（Abcam、ab93806）およびα-チューブリン（Sigma-Aldrich、T516B）抗体を用いて免疫ブロッティングを行った。

IECの解離

マウスは12時間明期／12時間暗期の条件下で飼育し、必要なZTで犠牲にした。マウスの回腸を解剖し、縦に切り、PBSで洗浄した。組織を洗浄液［15mM Hepes（Sigma-Aldrich）および1% penicillin/streptomycinを含むHanks' balanced salt solution］中で激しく振盪し、720g、4℃で遠心した。腸を30秒間激しく振盪し、10mM EDTAと5％ウシ胎児血清（FBS）を添加した洗浄液中で37℃、10分間インキュベートした。再び激しく振盪した後、組織片を除去し、720g 、4℃で遠心して細胞を回収した。細胞をPBSで1回洗浄し、さらなる分析のためにペレット化した。

RNA単離、cDNA合成、qPCR

腸管オルガノイドについては、Direct-Zol RNA microprep kit（Zymo Research社、R2060）を用い、製造元の推奨に従ってRNAを単離した。サンプルは、技術的な偏りが生じるのを避けるため、まとめて調製した。IECsおよびCaco-2細胞については、Trizol試薬を用い、メーカーの推奨に従ってRNAを単離した。cDNAを合成するために、1μgのRNAをMaxima H Minus cDNA Synthesis Master Mix（Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, M1662）とインキュベートした。同量のcDNAを0.3μMのフォワードプライマーとリバースプライマー、1×PowerUp SYBR green Master Mix（Applied Biosystems, A25741）と合わせた。遺伝子発現を正規化するために18SリボソームRNAプライマーを用いた。qPCR実験に使用したすべてのプライマーを表S1に示す。統計的有意性を決定するために、GraphPad Prism version 10で推奨されているように、群数に応じてStudentの対になっていないt検定、またはTukeyの多重比較を用いた一元配置分散分析（ANOVA）を用いた。概日周期、位相、振幅、適合度、およびリズム性P値は、BioDare2線形デトレンド高速フーリエ変換非直線最小二乗法（FFT NLLS）を用いて各レプリケートについて計算し、平均した（149 ）。

オルガノイドRNA-seq

実験方法と解析の詳細については既報の通りである（89 ）。簡単に説明すると、各遺伝子型から陰窩を単離し、腸オルガノイドを誘導し、マトリゲルと必要な成長因子を用いて培養した。非同期オルガノイドを収集し、既報のようにRNA単離を行った(89)。リードのアライメントと定量を行い、差次的発現解析（DESeq2）を既述のように行った（89 ）。DESeq2統計学的アプローチは、差次的発現の強さを決定する定量的解析を可能にし、少ない複製数と大きなダイナミックレンジを調整するために使用した(150)。

Caco-2培養とバリア機能試験

ヒト男性結腸由来のCaco-2細胞株（American Type Culture Collection, HTB-37）を、20％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、1％非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム（0.11g/リットル）を添加したイーグル最小必須培地（EMEM）培養液（ECM）で培養した。Caco-2単層は、以前に発表された迅速法（151 ）に従って、継代2～6の細胞を用いて樹立した。24ウェルの1.0 μM Transwell透過性インサート（Corning）をコラーゲンI（5μg/cm2 ）でコートした。細胞を1ウェル当たり0.5×105～1×105個播種し、0.1% MITO+血清エクステンダー（Corning）を加えたECM中で培養した。24時間後、培地を0.1％MITO+と2mM酪酸ナトリウムを含むECMに変えた。播種から72時間後、光学顕微鏡でコンフルエントが確認されたモノレイヤーを使用した。バリアテストは、4-kDa FITC-デキストラン（1 mg/ml）を先端コンパートメントに添加し、15分ごとに基底コンパートメントから培地を回収することにより行った。蛍光はFITC-デキストラン標準曲線と並行して485/515 nmで測定した。累積FITC-デキストランを時間に対してプロットし、FITC-デキストランの輸送量を毎分1ミリリットル当たりナノグラムで測定した。単層細胞またはコンフルエント細胞を1mMデキサメタゾンで1時間同調させた。

FITC-デキストラン透過性アッセイ

マウスは経口投与前に12～16時間絶食させた。ZT23で、マウスに4-kDa FITC-デキストラン（600 mg/kg；Sigma-Aldrich）を経口投与した。1時間後、マウスを安楽死させ、血液を採取した。血清を採取するため、血液を室温で30分間凝固させ、800gで回転させた。希釈した血清の蛍光を530 nm、励起波長485 nmで測定し、4-kDa FITC-デキストラン濃度を0から8000 ng/mlまでの標準曲線を用いて決定した。

組織学

水洗し線状化した小腸をBouin液で固定し、Chao Family Comprehensive Cancer Center Experimental Tissue Resourceでパラフィン包埋・切片化した。スライドを再水和し、0.5％過ヨウ素酸で5分間、Schiff試薬で15分間、Harris修飾ヘマトキシリンで90秒間インキュベートし、その間に水で洗浄した。脱水後、スライドをVECTASHIELD（Vector Laboratories）でマウントした。

謝辞

このプロジェクトについて議論し、フィードバックしてくれたMasri研究室の全メンバーに感謝したい。カリフォルニア大学アーバイン校のChao Family Comprehensive Cancer Center（CFCCC）は、米国国立衛生研究所（NIH）/米国国立癌研究所（NCI）の支援を受けている（助成金番号P30 CA062203）。CFCCCを通じて利用される共有資源には、実験組織資源（Experimental Tissue Resource：ETR）が含まれる。
資金提供 Pannunzio研究室は、NIH助成金R37 CA266042およびR01 CA276470の支援を受けている。Seldin研究室はNIH助成金DP1 DK130640の支援を受けている。Masri研究室は、NIH（R01 CA244519およびR01 CA259370）、Concern Foundation、Johnson and Johnson、CFCCCを通じたAnti-Cancer Challengeから資金援助を受けている。B.M.F.は、NIH/NCI（助成金番号T32CA009054およびF31CA287992）およびエステローダーからの支援を受けている。A.L.M.は、全米科学財団大学院研究員プログラム（助成金DGE-1839285）の支援を受けている。
著者貢献： 構想： S.M.、R.C.F.、A.L.M. 方法論：方法論：S.M.、R.C.F.、S.K.C.、N.L.、B.M.F.、M.M.S.、N.R.P. リソース：資金獲得：A.L.M.、W.A.S.、N.R.P.、S.M.：データキュレーション：バリデーション： S.K.C.、N.L.、B.M.F.、S.M. 監修：プロジェクト管理：S.M：可視化：調査：R.C.F.、N.L.、W.A.S.、S.M：形式分析：R.C.F.、S.K.C.、N.L.、B.M.F.、A.L.M.、W.A.S： S.K.C.、N.L.、N.R.P. ソフトウェア：原案執筆：R.C.F., A.L.M., W.A.S： R.C.F.、A.L.M.、S.M. 執筆-校閲・編集： R.C.F.、S.K.C.、N.L.、B.M.F.、A.L.M.、W.A.S.、S.M.。
競合利益： 著者らは、競合する利益はないことを宣言する。
データおよび資料の入手： 論文の結論を評価するために必要なデータはすべて論文および/または補足資料に記載されている。マイクロバイオームのシーケンスデータはSequence Read Archive (SRA)のBioProjectアクセッション番号PRJNA1025260で入手可能である。過去に発表されたRNA-seqデータはBioProjectアクセッション番号PRJNA767410でSRAから入手可能。

補足資料

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図S1からS6

表S1およびS2

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参考文献と注釈

A. Verlande、S. Masri、概日時計とがん：タイムキーピングは細胞代謝を支配する。Trends Endocrinol. Metab. 30, 445-458 (2019).

参考文献へ

クロスレフ
PubMed
ウェブオブサイエンス
Google Scholar

J. Bass, M. A. Lazar, Circadian time signatures of fitness and disease. Science 354, 994-999 (2016).

Crossref

PubMed
ウェブ・オブ・サイエンス
Google Scholar

A. Chaix, A. Zarrinpar, S. Panda, The circadian coordination of cell biology. J. Cell Biol. 215, 15-25 (2016).

Crossref

PubMed
ウェブオブサイエンス
Google Scholar

K. コックス、高橋淳、概日時計遺伝子と時計機構の転写アーキテクチャー、J. Mol. J. Mol. Endocrinol. 63, r93-r102 (2019).

Crossref

PubMed
ウェブオブサイエンス
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