雄のBALB/Cマウスの腸内細菌叢組成と腸脳軸に対する食餌性アラキドン酸の影響

哉百名

雄のBALB/Cマウスの腸内細菌叢組成と腸脳軸に対する食餌性アラキドン酸の影響

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9786182/


Katleen Pinchaud, Methodology, Validation, Formal analysis, Investigation, Data curation, Writing - original draft, Zeeshan Hafeez, Methodology, Validation, Writing - review & editing, [...], and Jean Luc Olivier, Conceptualization, Validation, Formal analysis, Data curation, Writing - review & editing, Supervision, Project administration, Funding acquisition, (研究費の獲得).

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要旨
アラキドン酸（ARA）は、多くのエイコサノイドの前駆体であるが、食品成分として健康に与える影響についてはあまり知られていない。そこで、腸内細菌叢および腸脳軸に与える影響について検討した。雄のBALB/cマウスのグループに、5%の脂質を含む標準食（Std-ARA）、ARAを含まない15%脂質食（HL-ARA）または1%のARAを含む食（HL + ARA）を9週間摂取させた。3種類の餌の脂肪酸プロファイルはすべて同じであった。HL-ARA飼料はBifidobacterium pseudolongumの増殖を促進し、HL + ARA飼料は糞便中の炎症性Escherichia-Shigella属の増殖を促進した。ARA摂取により、炎症性マーカーであるIL-1βおよびCD40がそれぞれ4倍および15倍大腸で過剰発現したが、TNFαおよびadiponectinの発現には影響がなかった。脳では、ARAの摂取により、海馬と大脳皮質でGFAPの中程度の過剰発現が見られた。高脂質食はいずれも脳内のIL-6とIL-12を減少させた。初めて、食事性ARAが腸内細菌叢を変化させ、低悪性度の疝痛性炎症を引き起こし、脳内のアストログリオシスを誘導することが示された。今後、そのメカニズムを解明するための研究が必要である。

キーワード：アラキドン酸、高脂質食、腸内細菌叢、腸-脳軸、炎症

  1. はじめに
    食事性脂質は主なエネルギー源であり、ヒトの1日のエネルギー摂取量の10～58％を占める[1]。この量的な側面だけでなく、食事脂質の組成、特に様々な脂肪酸の分布は、健康や幸福に強く影響する。2000年代の初めから、多くの研究成果や栄養調査がω-6/ω-3多価不飽和脂肪酸（PUFAs）比率に着目しています[2,3,4]。ここ数十年、世界中で食生活の欧米化に伴い、ω-6系PUFAsの摂取量が増加していることが確認されています。したがって、現在のデータは、ω-6/ω-3比の推奨値である4-5からかけ離れている[5]。大半の食品において、ω-6とω-3 PUFAは、それぞれ最も短い前駆体であるリノール酸（LA）またはα-リノレン酸（ALA）の形で提供されています。最も長いω-6 PUFAであるアラキドン酸（ARA）とω-3 PUFAであるエイコサペンタエン酸（EPA）とドコサヘキサエン酸（DHA）は、それらの前駆体の伸長と脱飽和によって合成されるか、海産物や動物性食品の摂取によって直接提供されます。ARAとDHAの食事摂取量については、国際的な評価により、世界的に大きなばらつきがあることが示されている[6]。多くの国で栄養勧告を満たしていない [6]。食事性ARAおよびDHAは、部分的に細胞のリン脂質に取り込まれます。人間の健康状態に対する食事性ω-6/ω-3比率の影響は、ホスホリパーゼA2（PLA2）が細胞リン脂質からこれらのPUFAを放出した後に合成されるARAおよびDHA/EPA誘導体のそれぞれのプロおよび抗炎症活性によって説明することができます [7]。

食事性ω-3脂肪酸の欠乏は、動脈硬化や心血管疾患[8]から代謝性疾患[9]や神経変性疾患[10]まで様々な病態に関与することが、数多くの研究により示されています。にもかかわらず、この問題、特にARAの役割に関する研究の数がかなり少ないため、ω-6 PUFAsの過剰摂取が人間の幸福に及ぼす影響については、より議論の余地があります。しかしながら、いくつかの疫学的研究は、赤血球リン脂質中のARAの高い組み込みと、テロメア長の減少や認知障害などの老化促進の病的特徴との間の相関性を示している[11,12]。しかしながら、Zhuangら[13]は、アメリカと中国の集団において、死亡率に対するω-6 PUFAの高い割合の正の効果を逆に示唆し、中国人において6〜10の間のω-6/ω-3比率で死亡リスクがより低いことを述べてさえいる。研究により、ω-6 PUFA の分布と炎症レベルおよび関連する病態への影響は、リン脂質の合成および放出に関与するいくつかの遺伝子の多型によって影響を受けることが示されています[14,15,16]。これらの疫学的研究に加え、前臨床研究では、食事性ARAの摂取による負の影響が示唆されている。我々は以前、1％のARAを添加した10％脂肪食が、アルツハイマー病の主因であるアミロイドβ1-42ペプチドを脳室内注入したマウスの神経毒性を悪化させることを観察した[17]。一見すると、この悪影響はARAの脳内蓄積や炎症性エイコサノイドへの変換によるものではないかと推測される。しかし、このARAを多く含む食事は、ARAの取り込みが中程度である脳に比べ、肝臓や赤血球のARA濃度を非常に高めているのである。このことは、脳内ARAの直接作用に基づく機序をほとんど支持しない可能性がある。高脂肪食に1％のARAを添加すると、ラットの肥満が悪化し、骨塩量が減少した[18]。しかし、この研究では骨や他の組織へのARAの蓄積については言及されていない。一方、Boydら[19]は、最近、ARAを多く含む高脂肪食を過剰摂取すると、腰部後根神経節にARAとLAが蓄積することを明らかにした。ホスホリパーゼ A2 の活性が上昇すると、ARA の放出、侵害受容行動、アロディニアが連続的に起こる。Danio rerio モデルでは、ARA を添加した餌は、特に Streptococcus 感染後に免疫機能とエイコサノイド合成に関与するいくつかの遺伝子の発現レベルを変化させた [20,21]．興味深いことに、このゼブラフィッシュモデルでは、ARAを添加した餌は、腸内細菌叢の多様性と腸粘膜のシクロオキシゲナーゼ-2などのエイコサノイド産生遺伝子の発現を増加させた [22]．

腸内細菌の異常は、動脈硬化、肥満、II型糖尿病などの様々な全身性の病態に関与していることが報告されている[23,24]。さらに、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患 [25,26] 、自閉症スペクトラム障害 [27] 、うつ病などの精神神経疾患 [28] における微生物叢-腸-脳軸の役割を強調する研究が数多くなされている。これらの様々な病態の病因は様々であるが、腸と脳の双方向の関係はその発症と予後に影響を与え、特に神経変性疾患においてはいくつかのメカニズムに基づいていると考えられている[29]。これらのメカニズムには、迷走神経系を介した直接的な神経伝達、あるいはリポ多糖（LPS）などの細菌成分、短鎖脂肪酸などの微生物代謝物、炎症性サイトカインの分泌、神経活性分子の通過による間接的な代謝、内分泌、免疫伝達が含まれる[30]。これらの様々なメカニズムの中で、腸管バリアの変化と全身性炎症および神経炎症の関連性が重要な役割を担っています[31]。例えば、炎症性腸疾患はアルツハイマー病の危険因子であり [32] 、食事の脂肪酸組成は脳におけるインターロイキン-2およびインターフェロンγの発現の変化を通して大腸炎モデルのムチン2ノックアウトマウスにおけるミクログリア細胞の活性を調節する [33]．腸内細菌叢の60％の変動は食事に起因することから[34]、食事介入は神経変性疾患や腸-脳軸が関与する他の脳疾患に対する治療戦略に組み込むことが可能である。多糖類を多く含む食事 [35] とは対照的に、食事性脂肪酸が腸内細菌叢に及ぼす影響についてはほとんど知られていない。脂肪酸は小腸に統合されることになっている。しかし、食事性脂肪酸の摂取量の増加は、間接的に胆汁酸フラックスに影響を与え、その結果、微生物叢の組成を変調させる可能性がある[1]。さらに、いくつかの研究により、ω-6 脂肪酸が腸粘膜および微生物叢に特異的な作用を及ぼすことが実証されている。Ghoshら[36]は、高脂肪食が2歳のマウスの回腸粘膜と微生物叢の関連性を高めるが、ω-6-(LA)に富む食事のみが粘膜の細菌および好中球の浸潤を引き起こすことを見いだした。さらに最近、Selmin ら [37] は、脂質を 20% (w/w) 含む ω-6- リッチな大豆油ベースの飼料を投与すると、飽和脂肪酸を主とする脂質を 11% (w/w) 含む飼料と比較して、雄 C57BL/6j マウスの腸内で病的なプロファイルを引き起こすことを観察している。大豆油ベースの飼料を与えたマウスでは、Firmicutes、Clostridia、Lachnospiraceaeの存在が減少し、BacteroidetesとDeferribacteraceaeの存在量の増加がそれと釣り合う結果となった。これらの微生物相の変化は、シクロオキシゲナーゼ-2の過剰発現および結腸粘膜の慢性炎症の徴候と関連していたが、13週間後のみで、ω-6リッチ食の投与7週間では見られなかった[37]。これらの2つの研究で使用された食事は、測定可能なARA量を含まず、LAが主なω-6脂肪酸であった。食事性ARAの摂取が腸内細菌叢に及ぼす特異的な影響について、Zhuangら [38] は、1％のARA食補充がFirmicutes/Bacteroidetes比を低下させることによって炎症性微生物叢を好んで、雄C57BL/6jマウスにのみ全身および視床下部炎症を誘導し、雌雄ともに肥満を増進することを見いだした。この研究の特徴は、まずARAを含まない高脂肪食（脂肪分45％、脂質23,5％）を10週間与えて肥満を誘発し、その後、ARAを含む高脂肪食または含まない高脂肪食をさらに15週間与えて腸内細菌叢への影響を検証していることである。したがって、ARAに特異的な影響と肥満に関連した影響を区別することはできない。さらに、Benoitらは、20%の脂質摂取（w/w）が腸内細菌叢の組成を変化させ、マウスに代謝性内毒素症を誘発したが、より高い脂質摂取（45%w/w）はそのような影響を引き起こさないことを示している[39]。したがって、食事の脂質組成とその投与期間は、ARAの腸脳軸に対する病態生理学的効果を顕著に変化させることができる。この論文では、中程度の高脂肪食（脂肪分15％）中に1％のARA（1％w／w、ヒトでは417mg／日に相当）を摂取した場合の影響を、ARAを含まない同様の食事および従来のネズミの食事（脂肪分5％w／w）と比較検討した。その目的は、ヒトの食事で観察されるような中程度の高脂肪食の状況下で、食事によるARAの摂取が可能かどうかを判断することであった。(1) 腸内細菌叢の変化、(2) 腸および全身性の低悪性度炎症の誘発、(3) 神経炎症の発生を促進する。我々はまず、3種類の食餌を9週間投与した後の糞便中の微生物叢の構成と、大腸の炎症および透過性に関与するタンパク質の発現レベルの変化について検討した。さらに、食餌ARAが肝臓と脂肪組織における炎症性サイトカインの発現レベルを変化させるかどうかを検討した。最後に、微生物叢の変化と低グレードの腸内炎症が神経炎症の発生とアルツハイマー病の病理学的特徴に寄与する可能性を示唆する研究がいくつかあることから、神経炎症マーカーの発現を検討した[40,41]。

  1. 材料と方法
    2.1. 食事デザイン
    本研究では、3種類の食餌を使用した。最初の飼料は、ARAなしの標準飼料（Std-ARA）飼料と名付けられ、5％の脂質を含む従来のマウス飼料であった（w/w）。HL-ARA飼料とHL + ARA (1% ARA)飼料は脂質15%(w/w)の飼料である。3つの飼料の組成を表1に示す。Std-ARA飼料は、HL-ARAおよびHL + ARAの2つの飼料よりも重量あたりのエネルギーが少ない（それぞれ430 kCal/100 gの食品ではなく390 kCal/100 gの食品、Table 1）。

表1
表1
実験用飼料の栄養プロファイル。
アラスコ油（LifeTM ARA）はDSM Nutritional Product（フランス、クールベボア）から、麻油はFermes d'Ormes（フランス、オルム）から、ラードおよびその他の成分は3つの飼料を製造したUPAE（Unité de Préparation des Aliments Expérimentaux, INRAE, Jouy-En-Josas, France）から提供されたものである。飼料組成は、各種油脂とラードのガスクロマトグラフィー（GC）分析から算出し、飼料調製後に確認した。GC分析は、GC-2010アナライザー（島津製作所）とSM®-2380キャピラリーGCカラム（60 m × 0,25 mm, L × I.D., df 0.2 µm）を用いて、C17内部標準とダブル独立測定によりLIBIOラボ（Lolaine大学生体分子工学研究所）で実施した。脂質サンプルは、BF3-メタノール法 [42]を用いて分析した。表 2 は、各飼料の脂肪酸組成を報告するものである。本研究で使用した完全な飼料組成と脂質源は、補足資料の表S1に示す。飼料は、酸化を防ぐために4℃で遮光して保存した。

表2
表2
実験用飼料の脂肪酸組成（% w/w）。
2.2. 動物の取り扱い
雄のBALB/cマウスを6週齢でENVIGO RMS SARL（フランス、Gannat）から購入し、2週間の適応期間の間、動物施設に収容した。この期間中、マウスには標準的なTeklad global 16% protein rodent diet (Envigo, Madison, WI, USA)を与えた。その後、ベースラインの体重を測定し、微生物叢解析のために糞便サンプルを採取した（0週目）。その後、マウスを無作為に3群に分け（各群15匹）、餌と水の消費量をモニターするために個別のケージ（24 ×11 ×12 cm）に収容した。3群にはそれぞれ、Std-ARA飼料（脂質15%、ARA補充なし、群N°1）、HL-ARA飼料（脂質45%、ARA補充なし、群N°2）、HL + ARA飼料（脂質45%、ARA補充あり、群N°3）をアドリビタブルで与えた。Thomas ら[16]は、12 週間の食餌投与により Aβ オリゴマーの学習能力および α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor (AMPA receptor) の発現レベルに対する悪影響が悪化することを明らかにしている。前試験では、食餌投与開始後10週目にAβオリゴマーを脳室内に注入し、最後の2週目に行動評価を行ったことから、食餌ARAは10週目以前に効果を発揮する可能性があると考えられた。そこで、今回開発した3種類の飼料を9週間マウスに投与した。この期間終了後、犠牲となる前に糞便を採取した。血液、大腸、肝臓、脳、腸間膜脂肪組織は犠牲後に採取し、液体窒素で急速凍結した後、生化学的分析まで-80℃で保存した。

実験期間中、マウスは餌と水を自由に摂取することができた。マウスの体重は毎週測定した。湿度および温度条件は、それぞれ50%±5%の空気湿度および22±2℃であった。また、動物の生体周期を尊重しつつ取り扱いを容易にするために、明暗周期を逆転させた（午前8時30分から午後8時30分まで消灯）。

2.3. 糞便微生物叢の解析
Godonら[43]に従い、マウス糞便サンプルから全細菌DNAを抽出した。簡単には、250μLのGuanidine isothiocyanate (4 M) (Sigma-Aldrich G9277, St. Louis, MI, USA) と40μLのlaurylsarcosine (10%, Sigma-Aldrich L9150) を冷凍糞便（50 mg）試料に添加した。室温で10分間解凍後、糞を500 µLのN-ラウリルサルコシン（5% in phosphate buffer pH 8, 0.1 M）に再懸濁し、70℃で1時間攪拌しながらインキュベートした。ボールミル（Precellys®Evolution, Ozyme, France）で4℃にて粉砕後，1%ポリビニルプロリドン（Supelco® 77627）Tris-HCl 0,5 Mを含む溶液を粉砕したマトリックスに加え，4℃，20000×gで5分間遠心し，ペレットは1%ポリビニルプロリドントリス塩酸溶液に再懸濁して同様の条件下に遠心分離された。残ったペレットの再懸濁と遠心分離のステップを、同様の条件下でさらに2回繰り返した。4回の抽出で得られた上清をプールし、等量のイソプロパノールを加えてDNAを沈殿させた。20,000×gで10分間遠心分離した後、DNAペレットを450μLのPBSと50μLの酢酸カリウム3M (Sigma-Aldrich, P1190)に再懸濁させた。4℃で一晩インキュベートした後、20,000×g、4℃で30分間遠心分離した。DNAを含む上清を2 µL RNase A (Sigma-Aldrich, 10109142001) と共に攪拌下37%で30分間インキュベートした。50 µLの酢酸ナトリウムと3 M、1 mLの100%エタノールの存在下でDNAを再沈殿させた。20,000×gで10分間遠心分離した後、ペレットを70%エタノールで3回洗浄し、室温で2時間フード下で乾燥させた。乾燥したペレットをTris HCL 10 mM, EDTA 1 mMに再懸濁した。DNA濃度は、NanoDrop装置（Ozyme, France）を用いて測定した。16S rRNA遺伝子のV3-V4超可変領域は、2つのプライマーを用いて増幅した。MSQ-16SV3F（5′-TTCCCTACGACGCTTCCGATCTACGRAGGCWGCAG-3′）およびMSQ-16SV4R（5′-GGAGTTCAGACGTGCTTCCGATCTTACCAGGGTATCTAATCCT-3′）であった。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、10ngの細菌DNA、0.5μMのプライマーMSQ16SV3FおよびMSQ-16SV4R、各dNTPs 0.2mM および0.5 of U DNA-free Taq-polymerase (MolTaq 16S DNA Polymerase, Molzym) を含む混合物を用いて、熱サイクラーMastercycler® pro (Eppendorf, Hamburg, Germany) において実行された。増幅は94 ℃で60秒間開始し、94 ℃で60秒間変性、65 ℃で60秒間アニーリング、72 ℃で60秒間伸長を30サイクル行い、最後に72 ℃で10分間伸長した。得られたPCR産物を精製し、@BRIDGeプラットフォーム（INRA、Jouy-en-Josas）に送り、Illumina MiSeqテクノロジー（Illumina、カリフォルニア、米国）を使用して配列決定した。

配列はGalaxyがサポートするプログラムFROGSを用いて解析され、Operational Taxonomic Units (OTUs)の存在量とその分類学的所属の表が作成された。SWARMによる配列のデノイズとOTUへのクラスタリング、VSEARCHによるキメラ除去、SILVA SSU 123データベース上のRDP Classifierによる各OTUの分類学的所属を含む連続ステップを経た。統計解析は、"R "言語および環境バージョン3.2.3を用いて行った。アルファおよびベータ多様性の測定とサンプル間のOTUの差の解析は、アドオンパッケージ "Phyloseq" [44]を使用して実施した。OTU数表と分類学的分類は、Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt2; [45]) によるパスウェイ存在度解析を行った。

2.4. イムノブロット解析
皮質と海馬は、25 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v/v) Nonidet NP-40, 1% (m/v) Desoxycholate sodium, 0.1% (m/v) SDS, 1 mM PMSF, 1 mM Na3Vo4 およびプロテアーゼ阻害カクテル " Complete " (Roche, France) 中 でミニポットおよびピペットチップを用いて均質化処理した。凍結融解を2サイクル行った後、10,000 g、4 ℃で30分間遠心し、核と細胞片を除去した。上清は-80 ℃で保存した。一方、大腸サンプルからのタンパク質は、QIAGEN AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit（Hilden、ドイツ）により、供給者の推奨に従って抽出された。すべての上清中のタンパク質をBCA Protein Assay Kit (Thermo-Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)で定量してからウェスタンブロット解析を行った。

ウェスタンブロット解析では、サンプル上清をβ-メルカプトエタノール 0.004% (w/v) を含む等量の 2×Laemmli buffer と混合し、混合物を 95℃で 5 分間加熱して変性させた。次に、サンプルをMini-Protean II system (Biorad, USA) で12%ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) で分離し、ニトロセルロース膜 (GE Healthcare) にトランスファーした。ブロットを、マウスIgG抗GFAP一次抗体（抗GFAP 1：1000、Sigma-Aldrich）、ヤギIgG抗Iba1（1：1000、Novusbio）、ウサギIgG抗Claudine-1（1: 2000, Sigma-Aldrich）、またはマウスIgG抗β-チューブリン（1:2000, Sigma-Aldrich）、次いでHRP結合二次抗マウスIgG、抗ウサギIgG（1：5000、Sigma-Aldrich）、または抗ヤギIgG（1：2000、Novus）、。免疫複合体バンドは、enhanced chemiluminescence (ECL) プロトコル (GE Healthcare) を用いて検出された。その後、バンドの強度をImage LabTMソフトウェア（Bio-rad Laboratories, Hercules, CA, USA）を用いてChemidoc densitometer上で定量した。

2.5. RNA 抽出および RT-qPCR 解析
大腸と肝臓のサンプルからは QIAGEN AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit (Hilden, Germany) を用いて、脳と脂肪組織からは QIAGEN RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Hilden, Germany) を用いて Total RNA を製造者の指示に従い抽出し、 PrimeScript™ RT Master Mix (Takara Bio Inc, Shiga, Japan) により cDNA を製造者のプロトコルに従って逆転写 した。qPCR 解析に用いたプライマーを表 3 に示す。

表3
表3
RT-qPCR に使用したプライマー配列。
Biorad CFX Real-Time PCR system (Bio-rad Laboratories, Hercules, CA, USA) と TB Green® Premix Ex Taq™ (Tli RNase H Plus) (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) を用いて Real-time PCR を二重で実施した。相対定量は Pfaffl の方法 [46] に従って行い、発現量は GAPDH の mRNA レベルに対して正規化した。

2.6. 免疫組織化学的解析
マウス半球の冠状切片（12μm）を4％パラホルムアルデヒドで15分間固定し、リン酸緩衝生理食塩水 1×pH7.4 で5分間、3回洗浄した。1×-PBS中の0.1％トリトンで10分間透過処理し、ブロッキング緩衝液（PBS（2，7mM、1×）中の10％BSA、0.1％トリトン）中で室温で1時間インキュベートした。その後、スライスをブロッキング溶液中の一次抗体マウスIgG抗GFAP（1:800、Dako）と共に4℃で攪拌下、一晩インキュベートした。1x-PBSで5分間3回洗浄した後、切片を、ブロッキング溶液で希釈した二次抗体ヤギ抗マウスIgG AlexaFluor 488（1：1000、Invitrogen）で室温で2時間インキュベートした。最後に、DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) を含む ProlongTM Gold antifade mounting media (Thermo Fisher Scientific) でスライスをマウントし、細胞核の標識とした。

蛍光顕微鏡（Nikon, Nikon Instruments Europe B.V.）で観察した後、調べた各脳領域から4枚の画像で染色を定量化した。写真はNIS Element（Nikon）ソフトウェアで撮影し、ImageJソフトウェアで細胞のカウントと脳構造の表面積（mm2）の計測を行った。結果の定量化には、表面積、標識陽性細胞数、各スライスの厚さ（12μm）を用いて、マウス脳内の陽性細胞密度（mm2あたりの陽性標識細胞数）を算出した（各群n＝2）。

2.7. 統計解析
結果は、平均値±SEMで示した。統計解析は、GraphPad Prism Software（V9.4, San Diego, CA, USA）を用いて、一元配置分散分析後、ボンフェローニの多重比較ポストホックテスト、またはクラスカル・ウォリス検定後、ダンの多重比較テストによりポストホック解析を行った。糞便微生物叢の解析に関しては、ANOVAおよびDeSeqを行った。

  1. 結果
    3.1. ARAの食事摂取がマウスの成長および糞便微生物叢に与える影響
    Std-ARA、HL-ARA、HL + ARAの3種類の飼料を9週間投与した結果、いずれの飼料群でも摂餌量およびマウスの体重増加に有意差は認められなかった（図1A,B）。さらに、異なる食餌が臓器重量に及ぼす影響についても検討した。3群間で観察された唯一の違いは、HL + ARA食を与えたマウスで腸間膜脂肪組織重量が減少したことであった（図1C）。

図1
図1
雄性BALB/Cマウスに標準食（Std-ARA）、アラキドン酸無添加（HL-ARA）または添加（HL + ARA）の脂質リッチ食を9週間与えたときの動物の体重（A）および摂餌量（B）の動態を示す。腸間膜脂肪組織重量(C)は、飼料終了時に...
高脂肪食とARAリッチな食事がこの微生物叢の変動を誘発するかどうかを調べるために、0週目（実験開始）および9週目に糞便微生物叢組成を調査した。3つのマウス群は、食餌投与0週目から9週目にかけて、α-およびβ-多様性の減少を示した（補足資料、図S1A,B）。9週目では、3つの食餌群間でβ-diversityに有意な差は認められなかった（補足資料、図S1B）。しかし、9週目における各菌門の存在比を評価したところ、HL-ARA食はStd-ARA食に比べてActinobacteriota門の増加を誘導し、HL＋ARA食ではARA摂取によりそれが抑制された（図2A,B）。アクチノバクテリオタ門については、群間で有意差が強調されているが、各マウス群内で大きなばらつきがあることは注目される。さらに検討した結果、アクチノバクテリオタ門の変化は、HL＋ARA食とは逆に高脂質食であるHL-ARA食で有利になるビフィドバクテリウム・シュードロンガム種の増殖によることがわかった（Figure 2C）。Bifidobacterium属とは異なり、Proteobacteria属のEscherichia-Shigella属は、HL-ARA食を与えたマウスでは、Std-ARA食、およびARA摂取によりこの属の過繁殖が好まれたHL + ARA食を与えたマウスに比べ、存在量が少なかった（Figure 2D）. また、脂質摂取量が多いほど、これらの飼料中のARAの有無にかかわらず、Bilophila属およびBlautia属の増殖が促進された（図2E,F）。

図2
図2
Std-ARA、HL-ARAおよびHL + ARA飼料を9週間摂取させたマウスの糞便中の動物門および属組成。各群10匹のマウスについて、16S rRNA遺伝子のV3-V4超可変領域を用いて糞便微生物叢組成を決定した。その ...
Std-ARA飼料、HL-ARA飼料、HL + ARA飼料を与えたマウスの糞便微生物叢の分析に基づき、3つのマウス群の微生物叢に存在する代謝経路を比較した。Std-ARA群とHL + ARA群の間で最も少ない数の有意差が認められた（存在量の異なる7つのパスウェイ、表4）。Std-ARA群とHL-ARA群の比較では、パスウェイの数は中程度であった（20の代謝パスウェイ、表4）。驚くべきことに、HL-ARA群とHL + ARA群の間で最も多くの相違が観察されたが、これらの2つの食餌の相違はARAの有無だけであった。この最後の比較で同定された38の代謝経路のうち（表4）、20はHL＋ARA群でHL-ARA群より発現量が少なく、18はより多く発現していた。HL-ARAグループで最も多く発現している遺伝子の中には、アミノ酸や細菌壁の合成に関わるものがあり、HL + ARAグループで最も多く発現しているのは、葉酸、フラビン、B1およびB6合成に関わるものであった（表4）。

表4
表4
Std-ARA食、HL-ARA食、HL + ARA食を与えたマウスの微生物叢のKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）解析による代謝パスウェイの有意な違い。3群の餌の比較の種類は、太字で示されている．
Std-ARA群とHL-ARA群について、HL-ARA群の少ない代謝経路（13経路）はアミノ酸（アルギニン、イソロイシン、グルタミン、トリプトファン）、ヘム、タンパク質合成に関与し、Std-ARA群の少ない経路（7経路）はキノン、ヌクレオチド合成に関与していることが明らかになった。Std-ARA群ではHL + ARA群に比べ、還元的TCAサイクル、トリプトファン、テトラピロール合成に関わる4つの代謝経路のみが多く検出され（表4）、3つは少なく、そのうち2つはヌクレオチド合成に、最後の1つは解糖に関わるものであった（表4）。

3.2. ARAの食事摂取が大腸の炎症マーカーの発現量に与える影響
ARAの摂取によりEscherichia-Shigella属の増殖が促進され、Bifidobacterium pseudolongumの増殖が抑制されたことから、Escherichia-Shigella属は腸の炎症と関連し、Bifidobacterium pseudolongumは抗炎症活性を示すことがわかった[47]。食餌9週目に3群のマウスから採取した大腸サンプルで炎症性サイトカインの発現量を調べた。ARAを摂取した場合、HL＋ARA群ではStd-ARA群に比べIL-1βおよびCD40の発現量がそれぞれ3.8倍および15.1倍に有意に増加した（図3A,B）。一方、HL-ARA群ではStd-ARA群に比べ、それらの発現に変動は認められなかった（図3A,B）。CD40/TNFRS5はIL-1β産生に伴う大腸炎に関与するTNF-α受容体の一つであるが[49]、TNFα、IL-6、adiponectinの発現量についてはStd-ARA食摂取マウスと比較してHL-ARA群とHL＋ARA群で大きな変化は認められなかった（補足資料、図 S2）。

図3
図3
食餌9週目におけるIL-1β (A) およびCD40 (B) の大腸遺伝子発現量。データは平均値±平均値の標準誤差(SEM)で表した。標準食と比較して、* p < 0.05。データの解析結果 ...
さらに、腸のタイトジャンクションを形成するクローディン-1とオクルディンの発現レベルを調べ、大腸透過性に対する各種食餌の推定上の影響を評価した。その結果、3群のマウスでこれらの遺伝子の発現レベルに変化は見られなかった（補足資料、図S3）。これらのデータは、脂質またはARAの高摂取による腸管透過性の上昇を支持しない。

3.3. 肝臓および脂肪組織における低グレードの炎症とARA摂取量との関係
ARAや高脂質摂取が全身性の低級炎症を誘発するかどうかを調べるために、肝臓と腸間膜脂肪組織で炎症性サイトカインIL-1β、IL-6およびTNF-αの発現量を測定した。その結果、肝臓および腸間膜脂肪組織において、IL-1βおよびIL-6の発現量に有意な変化は認められなかった（補足資料、図S4）。TNFαについては、ARAリッチ飼料を与えたマウスの腸間膜組織における発現量は、HL-ARA飼料を与えたマウスと比較して31.6倍と激減していた。しかし、HL-ARA-飼料を与えたマウスは、Std-ARA飼料を与えたマウスと比較して平均3.4倍の発現量を示したが、個体差があり、有意水準には至らなかった（図4）。

図4
図4
食餌9週目における肝臓（A）および腸間膜脂肪組織（B）のTNF-αの遺伝子発現。データは平均値±平均値の標準誤差（SEM）で表した。n = 各食餌群につき4-5匹のマウス。** p < 0.01は...と比較した。
3.4. 食餌性ARAの脳グリア細胞および炎症性サイトカイン発現への影響
食餌性ARAの摂取により、腸内では炎症性細菌が増殖し、いくつかの低悪性度炎症マーカーの発現が増加することから、脳では炎症性サイトカインおよびグリアマーカーの発現を調節できるかどうかを検討した。まず、各種飼料を9週間投与した後に得られたマウスの半脳サンプルにおいて、炎症性サイトカインであるIL-6とIL-1βの発現を調べた。その結果、HL-ARA飼料およびHL＋ARA飼料を与えたマウスでは、Std-ARA飼料を与えたマウスと比較して、IL-6の発現レベルがそれぞれ2.2倍および3.5倍に減少していた（図5A）。IL-1βについては、HL-ARA食を与えたマウスの脳では、Std-ARA食を与えたマウスと比較して、有意水準に達することなく平均5.9倍の減少が認められた（図5B）。一方、食餌性ARAの摂取は、Std-ARA食およびHL-ARA食を与えたマウスで見られたIL-1βの発現レベルと比較して、それぞれ1.8倍および10.8倍増加させた（図5B）。そこで、我々はさらに、ミクログリア細胞でより多く発現しているCD40受容体とCD40応答性サイトカインIL-12の発現レベルを調べた[50]。CD40 mRNAレベルは、Std-ARAマウスと比較して、HL-ARAマウスおよびHL + ARAマウスの脳で、それぞれ平均2.1-および2.6倍減少したが、有意なレベルには達しなかった（図5C）。一方、IL-12は対照のStd-ARAマウスに比べ、HL-ARAおよびHL + ARA食でそれぞれ50倍および13.3倍と劇的に減少した（図5D）。

図5
図5
食餌9週目におけるIL-6 (A), IL-1β (B), CD40 (C), IL-12 (D)の半脳内遺伝子発現。データは平均±平均の標準誤差（SEM）で表される。n = 各食餌群につき2匹のマウス。* p < 0.05, ** p < 0.01, ...
さらに、脂質摂取が大脳皮質と海馬のGFAPとミクログリアマーカーの発現に影響を与え、IL-12の発現低下と相関があるかどうかを検討した。3つの食餌群のマウスの大脳皮質と海馬で、ミクログリアマーカーIba1のタンパク質発現量を測定した。その結果、HL-ARAおよびHL + ARA食は、Std-ARA食マウスの同じ脳構造で測定したものと比較して、大脳皮質および海馬におけるIba1の発現レベルに変動を示さなかった（図6A-C）。一方、アストロサイトマーカーであるGFAPのタンパク質発現は、HL + ARA食マウスの大脳皮質と海馬で、他の2つのマウスグループと比較してそれぞれ1.4倍と1.8倍に増加した（図6B,D）。

図6
図6
大脳皮質（A,B）および海馬（C,D）におけるIba1、GFAP、およびα-チューブリンのウェスタンブロット解析。タンパク質レベルはデンシトメトリーで定量し、α-チューブリンレベルで正規化し、相対的なタンパク質レベルとして表現した。データは代表的なものである ...
HL＋ARA食群の海馬におけるGFAPの発現が、Std-ARAマウス群およびHL-ARAマウス群と比較して増加していることは、免疫組織化学の結果からも確認された（図7）。

図7
図7
標準食（Std-ARA）、アラキドン酸無添加の高脂質食（HL-ARA）または（HL + ARA）を9週間与えたマウスの海馬におけるGFAP免疫染色（緑色部分）。核はDAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole, blue ...）で染色した。
4. 考察
本論文では、食事性ARAの摂取が腸脳軸を介した微生物叢および低悪性度炎症に及ぼす影響について検討した。ARAは、脂肪がエネルギー源の30％を占め、ω-6/ω-3比がフランスの食品安全機関AFSSAの推奨値である5-6の範囲にある、中程度の高脂質食の成分として提供された。各脂肪酸の割合からみた3つの飼料の脂肪酸プロファイルは、HL-ARA飼料が31.9%のLAを含むのに対し、HL + ARA飼料は6.6%のARAと25.3%のLAを含む以外はほぼ同様であった。HL + ARA飼料はALA酸の含有量がやや少ないが、ω-6/ω-3比は推奨値のままであった（表2）。ARA含有飼料（HL + ARA）がマウスの腸内細菌叢に及ぼす影響を、ARAを含まない脂肪5％含有標準飼料（Std-ARA）およびARAを含まない高脂質飼料（HL-ARA）を与えたマウスと比較したが、両者は同様のω-6/ω-3比率および同じ脂肪酸プロファイルを示した。

微生物叢の分析に関して、まず注目すべきは、HL-ARA食を与えたマウスの微生物叢におけるBifidobacterium pseudolongumの増殖であった。実際、Bifidobacterium pseudolongumは高脂肪食を与えたマウスのトリグリセリド血症軽減に関与し[51]、抗炎症活性を示した[52]。さらに、ビフィズス菌はリノール酸やリノレン酸を共役型誘導体に変換することが報告されており、これらは幸福度にプラスの影響を与える可能性があるとされている[53]。したがって、Bifidobacterium pseudolongumの増殖は、HL-ARA食のような最適なω-6/ω-3比を持つモノおよび多価不飽和脂肪酸の大部分を含む高いトリグリセリド摂取によってもたらされる可能性がある。逆説的ではあるが、HL + ARA食はBifidobacterium pseudolongumの増殖を抑制し、Escherichia-Shigella属の増殖を促進させることがわかった。後者は嫌気性の通性共生細菌で、腸の炎症を促進し[54,55]、いくつかのヒトの病態に関与している[55]。これらの増殖は、プロバイオティックなビフィズス菌の使用により減少する[56]。しかし、ARAがどのようにBifidobacterium pseudolongumとEscherichia-Shigella属の増殖を差動的に調節するのかは疑問であり、いくつかの仮説を立てることができる。第一に、LA（HL-ARAおよびHL + ARA飼料に多量に含まれる）およびARAなどの多価不飽和脂肪酸が抗菌作用を有することが報告されているが[57]、Bifidobacterium pseudolongumなどの細菌種に対するそれぞれの特異性はまだ不明である。第二に、ARAの変換によって生じるエイコサノイドが微生物叢に影響を与える可能性がある。実際、小腸で膵臓リパーゼによって放出されたARAは、免疫担当細胞に取り込まれ、様々なエイコサノイドに変換される可能性がある。Adamら[20]は、2％ARA飼料を与えたDanio rerio幼魚において、0.19％ARA飼料と比較してARA含有脂質の増加および5-および12-ヒドロキシエイコサテトラエン酸（5-および12-HETE）を中心とするエイコサノイドの生成を観察している。Naoeら[58]は、1％ARA添加飼料を与えたマウスの9つの組織および血漿のうち、脾臓と小腸で多量のプロスタグランジンとロイコトリエンを測定している。プロスタグランジンやロイコトリエンは多形核細胞やマクロファージの活性を刺激し、腸内細菌叢の構成に連続的に影響を与えることができる[57]。しかしながら、ARAが腸内細菌叢、特にBifidobacterium pseudolongumを変化させる正確なメカニズムについては、さらなる研究が必要である。さらに、Std-ARA食と比較して、両方の高脂質食、すなわちHL-ARAおよびHL + ARAによる別の微生物相の変化は、BlautiaおよびBilophila属の増殖の高さであった。Blautia属の増殖は、マウスでは高脂肪食と関連し[59]、ヒトでは加工食品や動物由来食品の摂取と関連している[60]。しかし、Blautiaの増殖は、エンドトキシン合成と相関している[50]が、抗肥満作用もある[61]ので、その結果には疑問がある。胆汁抵抗性のBilophila属の増殖も高脂肪食によって有利になる[62]。Bilophila wadsworthiaのようないくつかの種は、代謝の調節に侮れない影響を与える[63]。

腸内細菌叢は宿主の幸福に強く影響する。この重要性は、哺乳類では合成されない前駆体やビタミンの合成など、宿主の代謝経路を微生物叢の代謝経路で補完する可能性に基づいている。そこで、3つのマウス群の微生物叢に関連する代謝経路を検討した。代謝経路のインシリコ研究により、2つの高脂質食とStd-ARA食の間で、より多くの推定上の違いがあることが明らかになった。ARAの添加により、複合糖質合成、細菌壁形成、必須アミノ酸合成などの代謝経路が減少し、ビタミン合成、前駆体合成、複合糖質の分解など他の代謝経路が増加する可能性がある。なお、この in silico 研究では、脂質の合成や分解に関与する経路は明らかにされていない。これらの仮説は、大腸菌 M8 株が gnotobiotic マウスの脂質代謝に及ぼす影響を調査した Chakrabarti の研究などの実験的研究によって確認する必要がある[64]。

食事性ARAの摂取が腸内細菌叢に及ぼす影響の下流で、腸内組織の炎症レベルに及ぼす影響について研究された。ARAはデキストラン硫酸ナトリウムなどの外因性物質による大腸炎を悪化させないという研究もあるが [65,66]、本研究の結果では、中等度の高脂質食の摂取により、炎症性サイトカインIL-1βおよびCD40タンパク質の大腸での発現レベルが高くなることが明らかにされた。これらの発現の刺激は4-15倍の範囲であり、クローン病や潰瘍性大腸炎のモデルで観察されるような高度の炎症ではなく、低度の炎症状態と一致する。IL-1βの発現レベルの増加は、NLRP3インフラムマソームに応答する代謝性炎症におけるその以前に説明された役割と一致する[67]。さらに、CD40は、そのリガンドであるCD40-Lとともに、栄養素やインスリン反応に関連するものを含む、免疫細胞の相互作用や炎症調節の細かい調節に関与する受容体である[68]。クローン病や潰瘍性大腸炎患者の大腸粘膜では、CD40の過剰発現が観察される[69,70]。さらに、樹状細胞におけるCD40の構成的な発現は、トランスジェニックマウスにおいて致命的な大腸炎を発生させた[47]。腸内細菌叢は、CD40の刺激に影響を与える可能性がある[71]。特に，Bifidobacterium longumは，CD40およびCD80を介した腸管上皮細胞におけるIL-12の産生を介して，デキストラン硫酸誘発性大腸炎を緩和した[72]．しかし、CD40-CD40-Lのダイアドは、B細胞とマスト細胞の相互作用における抗炎症性IL-10産生にも寄与することができる[73]。

食事によって誘発される微生物叢の異常と腸の炎症が、肝臓や脂肪組織における低悪性度の炎症と関連していることは、多くの研究者によって報告されている[74]。したがって、腸管バリアの完全性の変化を支持する証拠が得られなかったにもかかわらず、炎症性サイトカインの発現レベルをこれら後者の2つの組織で測定した。肝臓では、3つの食餌群間で炎症性サイトカインの発現レベルに差があることを証明できなかった。腸間膜脂肪組織では、HL-ARA食を与えたマウスはStd-ARA食を与えたマウスと比較してTNFαの発現量が増加する傾向があった。ARAの食餌摂取はこのTNFαの発現量を有意に低下させた（図4）。IL-6についても、有意なレベルに達することなく、同じ傾向が見られた（補足資料、図S4）。Zhuangら[38]とは逆に、高脂質食HL-ARAまたはHL＋ARA食の両方を与えたマウスでは、肥満が観察されなかった。Zhuangら[38]は、まずC57BL/6J雄および雌マウスに45％脂肪食を10週間与えた後、さらに15週間ARAを補充してマウス群に肥満を誘発させた。さらに、著者らは脂質源として、通常、不飽和脂肪酸よりも飽和脂肪酸を多く含む脂肪乳を使用した。高脂肪食の一価または多価不飽和脂肪酸を飽和脂肪酸に置換すると、ネズミの体重と脂肪率の増加が抑制された[75]。Zhuangらの研究[38]では、ARAは雌雄マウスで肥満を促進したが、雄マウスでのみ炎症性微生物叢を好んで、脂肪組織の褐変を促進し、全身および視床下部の炎症レベルを増加させた。本研究では、Zhuangら[38]で用いられた期間より短い摂食期間では肥満は誘発されなかったが、HL + ARA食を与えたマウスでより顕著な腸間膜脂肪組織重量の減少が観察された。Wernstedt Asterholmら[76]は、TNFαに対する反応の抑制による脂肪組織での不十分な炎症反応は、脂肪形成の減少、体重不足、リーキーガットに関連していることを示している。したがって、ARAの食事摂取は、不適切な脂肪組織の成長と代謝応答を好むかもしれない。

最後の段階として、食事性ARAの摂取が脳に及ぼす影響について調べた。我々は以前、食事性ARAがAβ42の脳室内注入後のマウスの学習能力とAMPA受容体の発現を変化させることを証明した[16]。この以前の研究、および腸内細菌叢と結腸における炎症性サイトカインの高い発現レベルに関する上記の現在のデータに基づいて、神経炎症の証拠が予想された。実際、HL＋ARA食を9週間与えたマウスの海馬と大脳皮質では、Std-ARA食やHL-ARA食を与えたマウスと比較して、中程度のGFAPの過剰発現が観察された。しかし、ミクログリアIba1マーカーの発現に有意な差はなく、IL-6とIL-12の発現の低下も観察された。半脳の抽出液で、Il-1β、IL-6、CD40、IL-12のmRNAレベルを測定した。この結果は、異なる脳構造におけるレベルの平均を表しており、海馬のようないくつかの領域でより高い可能性がある。さらに、IL-6とIL-12は、炎症だけでなく、いくつかの神経細胞機能にも関与している。IL-6は海馬や視床下部での神経新生を刺激し、その神経細胞への活性は食物の制御やエネルギー消費の回復に寄与している[77]。また、IL-12は神経突起の伸長を促進することが報告されています[78]。アルツハイマー病では、炎症は保護と破壊の二重の役割を担っているため、神経細胞に対する活性の他に、IL-12の発現低下はAβペプチドオリゴマーなどの神経毒に対する脳の防御を変化させる可能性があります。IL-12のp40サブユニットの遺伝子欠損は、Aβペプチドを過剰に産生するトランスジェニック雌雄マウスにおいて、Aβ負荷または産生に異なる影響を与える[79]。ARA を多く含む餌を与えたマウスが Aβ ペプチドオリゴマーの神経毒性に対して高い感受性を示すのは、Aβ を脳室内注射する前に、神経細胞が弱くなるか、グリア細胞がこれらのオリゴマーを分解するのに邪魔されたためではないかと推測された。この仮説を確認するためには、さらなる研究が必要であり、これがこの研究の第一の弱点である。例えば、短鎖脂肪酸やその他の微生物代謝物、アディポカイン、その他のサイトカインファミリーのメンバーなど、腸脳軸のいくつかの作用因子が様々な臓器に関与すると仮定した研究が、反応を与える可能性がある。第二の弱点は、この研究がマウスで行われたものであり、無闇にヒトに外挿することができないことである。しかし、我々は、マウスの中等度の高脂肪食による微生物叢の変化と大腸の低グレードの炎症の誘発に続いて、食事性ARAが脳に影響を与えることを初めて明らかにした。さらに、不飽和脂肪酸を多く含む脂質摂取量を5％から15％に増やすと、マウスの腸内細菌叢において抗炎症作用を持つBifidobacterium pseudolongum種の増殖が促進されることを明らかにした。この2つの知見は、この研究の大きな強みである。

ARAは、赤肉、鶏肉、卵、魚など多くの食品に含まれているが、加工食品にも隠れた形で含まれている。178カ国における最近の評価では、1日のARA摂取量は100～350mg/日で、1日の総エネルギー量の0.1％未満であると推定された[6]。これらの評価に基づいて、著者らは研究をレビューし、ARAの摂取と人間の健康上の成果との間の相関を確立した[80]。しかし、彼らは様々な臓器または組織におけるARAの取り込みレベルにレビューを集中させた。我々の知る限り、食事性ARAの摂取と腸内細菌叢の変化の影響に関する研究はこれまでない。ヒトにおけるこれらの影響を調査し、細菌の代謝と腸の生理学に対するARAの影響を探ることは興味深いことである。

  1. 5.結論
    本研究では、中等度の高脂質食による食事アラキドン類の影響を、腸内細菌叢から結腸、肝臓、脂肪組織を経て脳まで特徴付けることにより、食事投与9週目に脂質摂取量が5％から15％に増加すると、腸内細菌叢において抗炎症作用を持つBifidobacterium pseudolongumの増殖に有利になることが示された。しかし、1％のARA摂取は、炎症性Escherichia-Shigella属を優遇し、低悪性度の疝痛炎症を引き起こし、脳内のアストログリオーシスを誘発した。食事性アラキドン酸による腸内細菌叢の変化と全身の低悪性度炎症は、神経変性疾患の発症をさらに促進する可能性がある。そのメカニズムはまだ解明されていない。

謝辞
LIBIO laboratory (Laboratoire d'Ingéniérie des Biomolécules, Université de Lorraine, France)には食事のガスクロマトグラフィー分析を、DSM Nutritional Product (France) にはアラスコオイルの提供に感謝する。また、動物の取り扱いに関する技術的支援として Aline Dosen に、事務的支援として Richard Lulewicz に感謝する。

補足資料
以下の補足資料は、https://www.mdpi.com/article/10.3390/nu14245338/s1、図S1: Std-ARA, HL-ARA, HL + ARA食を与えたマウスの0週と9週の糞便微生物叢のα-β-ダイバーシティをダウンロードすることができる。図S2：食餌9週目における大腸のIL-6、TNF-α、アディポネクチンの遺伝子発現。図S3: 食餌9週目におけるクローディン-1およびオクルーディンの結腸遺伝子発現。図S4. 食餌9週目における肝臓および腸間膜組織でのIL-1 βおよびIL-6の遺伝子発現レベル。表S1：完全食の組成。

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資金提供
本研究は、Association France Alzheimer（フランス）、助成金番号1531から助成を受けた。Katleen Pinchaudは、Association France AlzheimerおよびConseil Régional du Grand Est（フランス）から博士号取得のための奨学金を授与された。APCはAssociation des Chefs de Service du CHRU de Nancy（フランス）から資金提供を受けた。

執筆協力
コンセプト立案、J.L.O., A.D.-M. and K.M.-G.; 方法論、K.M.-G., Z.H., K.P. and S.A.; ソフトウェア, S.A.; バリデーション、 K.P., K.M.-G., Z.H., J.-A., S.A., J.L.O., A.M.-G., K.D.-M., K.M.-C., S.A. M.C.およびJ.L.O.；形式分析、K.P., K.M.-G., S.A., J.-M.C. および J.L.O.; 調査、K.P., K.M.-G., J.P. および S.C.; データキュレーション、K.P., K.M.-G. および J.L.O.; データ解析、J.P., J.L.O. 本論文は、K.P., K.M.-G., J.L.O., K.P., S.A., Z.H., K.M.-G., J.-M.C., P.L., A.D.-M., J.L.O., 監督、 K.M.-G. と J.L.O., プロジェクトの管理、 J.L.O., K.M.-G., 資金獲得、 J.L.O. 全著者が読み、合意した原稿の公表バージョンである。

施設審査委員会声明
動物を用いたすべての実験は，実験動物の使用と世話に関する欧州共同体のガイドライン（2010/63/EU）およびフランスの動物実験指令（2013/118）ならびに動物福祉のための3Rの要件に従って実施した。動物実験プロトコルは、ロレーヌ地方倫理委員会（CELMEA）の承認を受け、フランス研究省の承認（番号APAFIS#14324-2018032917508930）を受けています。

インフォームドコンセントの記述
該当事項はありません。

データの利用可能性に関する声明
該当事項はありません。

利益相反
著者らは利益相反を宣言していない．

脚注
出版社からのコメント：MDPIは、出版された地図や機関名における管轄権の主張に関して中立的な立場をとっています。

記事情報
Nutrients. 2022 Dec; 14(24): 5338.
オンライン公開 2022 Dec 15. doi: 10.3390/nu14245338
PMCID: PMC9786182
PMID：36558497
Katleen Pinchaud, Methodology, Validation, Formal analysis, Investigation, Data curation, Writing - original draft,1 Zeeshan Hafeez, Methodology, Validation, Writing - review & editing,1 Sandrine Auger, Methodology, Software, Formal analysis, Data curation, Writing - original draft,2 Jean-Marc Chatel, Validation, Formal analysis, Writing - review & editing,2 Sead Chadi, Investigation,2 Philippe Langella, Writing - review and editing.2 Justine Paoli, Methodology and Analysis and Analysis,Writing - original draft.2 Sandrine Ager,Methodology and Software,Formal analysis,Writing - review & editing,2 Sandrine Ager,Methodology & Analysis,2 Sandrise,Writing, 2 Sandrise,Writing,Writing,Writing- review and editing, 2 Justine Paoli, 調査、1 Annie Dary-Mourot, 概念化、1 Katy Maguin-Gaté, 概念化、方法論、検証、形式分析、調査、データキュレーション、執筆 - レビューと編集、監修、プロジェクト管理1 および Jean Luc Olivier、概念化、検証、形式分析、データキュレーション、執筆 - レビューと編集、監修、プロジェクト管理、資金獲得1,3,*...（敬称略
Olena Prykhodko、アカデミックエディター
1カルビノトックス(UR7488)、ロレーヌ大学、54000ナンシー、フランス
2INRAE, Université Paris-Saclay, AgroParisTech, UMR 1319 Micalis Institute, 78352 Jouy-en-Josas、France
3CHRU de Nancy, Pôle des Laboratoires, Service de Biochimie-Biologie Moléculaire-Nutrition, 54000 Nancy, France
*通信： rf.eniarrol-vinu@reivilo.cul-naej
Received 2022 Nov 24; Accepted 2022 Dec 12.
Copyright © 2022 by the authors.
ライセンシー：MDPI, Basel, Switzerland. この記事は、クリエイティブ・コモンズ表示（CC BY）ライセンス（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）の条件に基づいて配布されるオープンアクセス記事です。
Nutrientsからの記事は、Multidisciplinary Digital Publishing Institute（MDPI）の提供でここに提供されます。
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