早産性膜破裂および連続性早期発症新生児敗血症の妊婦における膣および新生児の微生物叢について

2023年3月14日 09:19

オープンアクセス
発行：2023年3月13日
早産性膜破裂および連続性早期発症新生児敗血症の妊婦における膣および新生児の微生物叢について

https://bmcmedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12916-023-02805-x

ルイス・グスタボ・ドス・アンジョス・ボルジェス
ヤーナ・パストゥシェック
PEONS研究会です。
...
ヤニーン・ツォルカウ
作家を表示する
BMC Medicine 21巻、記事番号：92（2023）この記事を引用する
2 Altmetric（アルトメトリック
メートル法詳細
アブストラクト
背景
早産性膜破裂症（PPROM）は、膣内細菌異常と関連しており、早産児の3分の1までがその原因となっている。膣内におけるコロニー形成、感染、炎症は、早発性新生児敗血症（EONS）を含む新生児の病的状態を引き起こす可能性がある。本研究の目的は、PPROM患者の膣内微生物組成と標準的な抗生物質治療下でのその発達を評価し、EONSの予測に膣内細菌叢が有用であることを評価することである。さらに、子宮内細菌叢の鏡となりうる出生時の新生児細菌叢を解読することを目的としている。
研究方法
PEONS前向き多施設コホート研究の一環として、PPROMを発症した女性78人とその新生児89人を募集した。母体膣および新生児の咽頭、直腸、臍帯血、メコニウムの微生物叢を16S rRNA遺伝子配列決定により解析した。サンプルグループ間の有意差は、順列多変量分散分析で、異なる分布の分類群はマン・ホイットニー検定で評価した。EONSを予測するための潜在的なバイオマーカーは、MetaboAnalystプラットフォームを使用して分析した。
結果
PPROM後の入院時の膣内細菌叢は、Lactobacillus属に支配されていた。標準的な抗生物質投与は、細菌の多様性、均一性、豊かさの増加を伴う微生物群集の著しい変化（Lactobacillus属の相対減少およびUreaplasma parvumの相対濃縮）の引き金となった。新生児期の微生物叢は、不均一な微生物組成を示し、メコニウムサンプルはこのニッチに濃縮された特定の分類群によって特徴づけられました。出生時の膣内細菌叢は、Escherichia/ShigellaとFacklamiaをリスク分類群として、Anaerococcus obesiensisとCampylobacter ureolyticusを保護分類群として、EONSを予測する可能性があることが示された。また、保護分類群であるBifidobacterium longum、Agathobacter rectale、S. epidermidisを特徴とする新生児メコニウム群集から、EONS症例を妥当な割合で予測することができる。
結論
PPROM 後の 16S rRNA 遺伝子配列決定による膣および新生児の微生物叢分析は、連続する EONS の個別リスク評価の基礎となる可能性があります。PPROM患者の臨床管理を最適化し、個人化するために、この技術が将来的にどこまで診断のギャップを埋めることができるかを評価するために、拡大コホートに関するさらなる研究が必要である。
試験登録
NCT03819192、ClinicalTrials.gov. 2019年1月28日に登録されました。
ピアレビュー報告書
背景
WHO（https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/preterm-birth）によると、毎年1500万人の赤ちゃんが早産（妊娠37週完成前）で生まれており、早産合併症は5歳未満の子どもの死亡原因の第一位で、2015年の死亡者数は約100万人を占めています［1］。30～40％の症例で、早産に先行して早産性膜破裂（PPROM）が起こっています[2]。このような膜破裂は、絨毛膜羊膜炎の発症、新生児のコロニー形成、その後の母体および新生児の病的状態の原因となる子宮腔への上昇性微生物の侵入口を提供します [3, 4]。
新生児敗血症は、世界中の新生児や小児に影響を与える致死的な疾患である [5, 6]。新生児敗血症は、感染時期により、生後3日以内に発症し、分娩前または分娩中に母親から乳児に垂直感染した細菌性病原体によって引き起こされる早期発症新生児敗血症（EONS）と、72時間後に発症し、垂直または水平感染した病原体によって引き起こされる遅発性新生児敗血症（LONS）に分類される［5，6］。健康な正期産の妊娠におけるEONSの発生率は、出生1000件あたり1件以下ですが[7]、PPROM後にEONSを発症する割合は14～22％です[4, 8]。
女性の泌尿器系疾患の予防や健康維持のために、膣マイクロバイオームの重要性がますます認識されるようになりました[9]。健康な女性では、膣内細菌叢は通常、異なるラクトバチルス種によって支配されています。乳酸菌は乳酸を産生することで、膣内の環境を低pHにし、潜在的な病原体の増殖を抑制します[10]。しかし、微生物叢の構成と安定性は女性によって異なり、主に月経周期の段階、性的活動、民族性に依存している[11]。ラクトバチルス属の劇的な減少は膣内ディスバイオシスとみなされ、Gardnerella、Prevotella、Atopobium、Fannyhesseaなどの病原性生物の増殖が促進されることが特徴です [12, 13]. 膣内環境の異常は、細菌性膣炎、性感染症のリスク増加、早産、早産性膜破裂、絨毛膜羊膜炎などのいくつかの病的状態と関連している[4、14、15]。妊娠中の乳酸菌の安定性は、生殖適性を高め、上行性感染症から保護するための進化的適応であることが示唆されました [16]。
PPROM の臨床管理は困難であり、胎児の成熟を可能にするための妊娠期間の延長と、感染症およびその後の新生児転帰不良のリスクとのバランスをとらなければならない。ほとんどの国で、特に妊娠初期（34週未満）にPPROMが発生した場合、新生児の罹患率を減らすために、妊娠延長中の抗生物質治療が推奨されています [17, 18] 。しかし、最近の分析では、エリスロマイシンの投与により、生物群集の構造が変化し、ラクトバチルス属が枯渇し、最適な群集が崩壊することが指摘されています[3, 4]。したがって、PPROMにおける抗生物質治療の役割を再考する時期に来ていることが示唆されました[3]。
母親の栄養、抗生物質の使用、母親のストレスなどのいくつかの周産期因子、ならびに妊娠中の母親の年齢、妊娠期間、分娩様式、母乳育児は、幼少期の腸内細菌叢の獲得と発達を調節することが頻繁に説明されています[19]。しかし、一般的には、新生児は無菌状態で生まれ、分娩後に初めて細菌が生息すると考えられていた。しかし、近年、胎盤、子宮、羊水中に細菌が存在すること、少なくとも細菌のDNAが存在することが、様々な報告で明らかになっている[20, 21]。膜が破れると、胎児へのバリアが損なわれるため、羊水への細菌汚染、ひいては胎児への細菌汚染が起こりやすくなる。実際、早産児の25%は羊水内感染のある母親から生まれたと報告されており、最も一般的な原因はウレアプラズマ種による羊水腔への侵入です [22] 。胎盤病原性コロニー形成は、上行性膣感染 [16] から始まり、出産後のメコニウム微生物群やその他の胎児微生物群は、子宮内微生物環境を反映する可能性があります [23] 。
本研究の目的は、PPROM患者の膣内微生物組成と標準的な抗生物質治療下でのその発達を評価し、EONSの予測に膣内微生物相が有用であることを評価することである。さらに、PPROM後のEONSの背景となる胎内微生物叢の鏡として、出生時の新生児微生物叢を解読することを目的としています。
研究方法
研究対象者
本研究は、妊娠22+0週から34+0週の間に入院した早産性膜破裂（PPROM）の妊婦とそれぞれの新生児を追跡調査するための前向き多施設ケースコホート研究であるPEONS試験（NCT03819192, ClinicalTrials.gov）の一部です。PPROMは、婦人科検診で臨床的に検出し、必要に応じて生化学的羊水ポイントオブケア検査（例：AmniSureまたはROMPlusテスト）を用いて検出した。合計78人の女性とその新生児89人（双子妊娠11人）がこの研究に参加した。78人全員がPPROMの診断後、国のガイドラインと研究センターの基準に従って抗生物質療法を受けた。ガイドラインに準拠した初回算出の抗生物質療法は、78人全員においてアミノペニシリンで行われ、大半の症例でマクロライドが追加された。臨床経過に応じて、調整、中止、継続が担当医の判断で行われた（Additional file 1: Table S1）。ほとんどのPPROM患者の出産は帝王切開であった（57.7％）。さらに41％の新生児は自然経膣分娩で、2例は真空抜去による補助分娩であった（Additional file 2: Table S2）。新生児の抗生物質治療の決定は、臨床症状、診療所の基準、母体の最新の微生物学的診断と抗感染症治療に応じて、担当の新生児科医が行った。45人の新生児が抗生物質治療を受けた（EONS18人、非EONS27人）。抗生物質は主にアンピシリン（新生児36人）とゲンタマイシン（新生児36人）を含んでいました。少数のケースでは、タゾバタム（8人）、セフォタキシム（6人）、メロペネム（14人）、テイコプラニン（3人）、バンコマイシン（12人）、クラリスロマイシン（13人）、エリスロマイシン（2人）、メトロニタゾール（1人）、セプタジジム（2人）またはセフロキシム（1人）が用いられた。
サンプル採取
マイクロバイオーム解析用のスワブは、妊婦の出産までと新生児の生後2日以内に縦断的に収集された。母体膣サンプルは、PPROMを発症したすべての妊婦から、滅菌したFLOQSwabs（コパン）を用いて最大3つの時点で収集した。最初のサンプル（V0）は、PPROMの確認後の最初の臨床検査で、抗生物質治療前に採取された。2回目のサンプルは、可能であれば抗生物質治療2-6日後に採取することを目標とした（V1）。したがって、抗生物質投与2日前に出産した場合、V1サンプルは入手できなかった。最後の母体サンプリングは、分娩前24時間以内に実施した（V2）。V2サンプルは、分娩前の抗生物質投与期間に基づいてサブグループ化された。抗生物質治療開始後48時間未満に採取したすべてのサンプルは、入院時に採取したサンプルと微生物群集構造が類似していると考えられた。したがって、抗生物質治療開始48時間未満に採取されたこれらのサンプル（V2eサンプル、V2early）は、V0サンプルと同等とみなされ、真のサンプルが存在しない場合にV0サンプルとして使用される対象となった。抗生物質投与48時間以上170時間未満の間に採取されたサンプルは、すべてV1サンプルと同等とみなされた。抗生物質の投与時間が48時間以上170時間未満のV2検体をV2m（V2medium）と呼ぶことにした。170時間以上の抗生物質投与後に採取した患者のV2サンプルをV2l（V2late、V2mのサブセット）、出産48時間以上前にAB治療を終了した患者をV2r（V2rrecovered、V2lのサブセット）とした（追加ファイル3：テーブルS3）。
新生児サンプルは、新生児の4つの異なる身体部位から収集した。臍帯血（UC）、直腸スワブ（RE）、咽頭スワブ（PH）は、滅菌済みのFLOQSwabs（コパン）を用いて出産時に採取し、メコニウム（ME）サンプルは生後48時間前に採取した。84人の新生児が、生後最初の瞬間のマイクロバイオームを評価するためのサンプリングに成功した。咽頭スワブ79本、直腸スワブ81本、血液サンプル74本、メコニウムサンプル75本の量が実験室に提出されました。
マイクロバイオーム解析のために採取したすべてのスワブとメコニウムサンプルは、-80℃で直ちに凍結した（-20℃で24時間までの凍結が適していた）。
DNA抽出と塩基配列決定
DNA は、FastDNA™SpinKit for Soil (MP Biomedicals, USA) を用いて、製造者の指示に従い抽出した。簡単に説明すると、Fast Prep®-24 (MP Biomedicals, USA)を用いた機械的溶解からなる。16S rRNA遺伝子のV1V2可変領域を増幅するために、3ステップのPCRアプローチを使用しました。Bifidobacteriaceaeも確実に増幅するように最適化されたプライマー27Bif（3′-AGRGTTHGATYMTGGCTCAG-5′）および338R（5′-TGCTGCCTCCCGTAGAGT-）を用いたPCRを行った。 3′）を20サイクル使用して標的配列を濃縮した後、短いオーバーハングを有する同じプライマーを使用して15サイクルの第2PCRを行い、2つの指標とイルミナのアダプターをアンプリコンに加える10サイクルの第3増幅ステップを行った［24］。増幅産物は、SequalPrep Normalization Plateを用いて精製、正規化、プールし、2×300bpペアエンドIllumina MiSeqシーケンス（イルミナ、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）に供した。使用した化学物質や抽出キットに由来するコンタミネーションをコントロールするため、PBSサンプルは定期的に同じ方法で抽出・処理された。
データ処理
fastQファイルは、Rのdada2パッケージバージョン1.12.1を使って解析した[25]。品質トリミングとフィルタリングのステップは、filterAndTrim関数を使用して実行されました。ForwardリードとReverseリードは、それぞれ20塩基と19塩基で5′末端をトリミングされた。リードは240塩基の長さに切り詰められ、リードあたり最大2つの予想エラーが許容された。ノイズ除去後、ペアエンドリードを結合し、キメラを除去した。配列バリアントは、RDP set18[26]を用いて、80%の疑似ブートストラップ閾値でナイーブベイズ分類に基づいてアノテーションされた。残りの非細菌配列（真核生物、ミトコンドリア、葉緑体）は手動で削除された。その後、各配列タイプの識別力を定義するために、Seqmatch機能を使用してRDPデータベースに対して配列バリアントを手動で解析した。種レベルの注釈は、単一種の既記載分離株の16S rRNA遺伝子断片のみが、この配列バリアントと最大2つのミスマッチを伴って整列した場合に、配列バリアントに割り当てられた[27]（追加ファイル4：表S4）。
抽出対照サンプルの分析により、Burkholderiaおよび/またはRalstonia配列タイプを安定的に含むFastDNA™SpinKit for Soilの汚染レベルがわずかながら変化していることが判明し（追加ファイル5：表S5）、生物量の少ない新生児サンプルでの分析を妨害する可能性があることがわかりました。これらの潜在的な汚染物質を特定するために、相関分析を実施した。新生児サンプルにおける相対存在量＞0.1％、有病率＞10％の配列変異についてスピアマン相関を計算し、Rのpsychパッケージバージョンv1.9.12.31を使用して、対のスピアマン相関に基づくネットワーク（p > 0.4）を構築した [28]. ネットワークはCytoscape（バージョン3.7.2）を用いて可視化し、解析した。Ralstonia solanacearum（ST2）、Burkholderia caribensis（ST34）に支配される主要クラスターを形成し、使用した抽出キットに由来する主要な汚染物質と同定された配列タイプは、下流の解析前に削除した。平均存在率が低い（0.1%以上）ものの、削除されたものと同じ種に属する配列タイプ、およびPlanctomycetia（ST25）とAcidobacteria（ST46）が小さなクラスタを形成し、少なくとも2つの強い相関（p > 0.4）を示したものは、削除されました。除去されたすべての配列バリアントは、異なるソースから発生した汚染物質に由来するものとして以前に指摘されている[29, 30]。洗浄後、2000リード未満のサンプルは、主に汚染物に由来するリードで構成され、したがって、標的細菌DNAの量はごくわずかであるため、解析から除外した（追加ファイル6：表S6）。
統計解析
絶対量カウントは、vegan Rパッケージのrarecurve関数[31]を用いて希釈した。希薄化されたデータは、アルファ多様性指数を決定するために使用された。多様性、豊かさ、均等性は、それぞれShannonの指数、Chao1の指数、Pielouの指数で推定した。指標はMicrobiome Rパッケージ[32]を用いて決定し、グループ間の有意差はMann-Whitney検定で判定した。
配列変異体、種、属の相対的な存在量からなるデータ行列は、Bray-Curtis（BC）アルゴリズムを使用してサンプル-類似度行列を構築し、非メトリック多次元尺度法（nMDS）を使用して可視化した。ヒートマップは、pheatmapパッケージ[33]を用いてプロットした。事前に定義されたグループ間の有意差は、順列多変量分散分析（PERMANOVA）を用いて評価した。p値が<0.05の場合、サンプルのグループは有意に異なるとみなされた。異なる分布の種レベルの分類群は、Kruskal-Wallis検定またはMann-Whitney検定によって決定された。特定の分類群の存在／非存在の差は、フィッシャーの正確検定で評価した。多重比較にはBenjamini-Hochberg補正を適用した[34]。少なくとも10％のサンプルの群集に存在する分類群のみが考慮された。補正後のp値(q)が<0.05である場合、サンプルのグループは有意に異なるとみなされた。補正前のp値が<0.05であった場合、サンプル群は異なる傾向にあると仮定した。Kruskal-Wallis検定に続くポストホック検定としてDunn検定を用い、複数の検定を適用した場合は補正検定を行った。
多変量解析はPRIMER（V.7.0.11, PRIMER-E, Plymouth Marine Laboratory, UK）を、単変量解析はPrism 8（GraphPad Software）を用いて実施した。
バイオマーカーの候補は、MetaboAnalyst 5.0 analysis platform (https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/) [35]を用いて、立方根変換した種存在量データを用いて解析した。
結果
PPROM患者の膣内細菌叢の組成について
入院時（V0）、抗生物質治療後（V1）、出産24時間前（V2）に採取した166個の膣スワブサンプルについて、16S rRNA遺伝子の塩基配列解析を実施した。全体的な上流解析の結果、20の異なる系統と752の種に割り当てられた2923のアンプリコン配列変異（ASV）が得られた（追加ファイル7：表S7）。膣内ASVのほぼ半分（1401/2983 ASV）は、V0サンプル（n = 78）で観察され、13 phylaと483種に属していた。
入院時（V0）には、65.4％の妊婦がLactobacillus属（相対存在量50％以上）、主にL. crispatus（32/78）およびL. iners（17/78）を中心とした膣内細菌叢を保有していた。Lactobacillus jensenii (3/78)とL. gasseri (1/78)も少数のサンプルで優勢であった（図1）。これは、PPROM患者の膣内細菌叢を対照群と比較した過去の報告のデータと一致しており、PPROM患者は対照群と比較して、Lactobacillusが優勢なコミュニティでコロニー形成される頻度が低かった（81-91%に対して56-77%）[36、37]。
図1
入院時（V0）のPPROM患者の膣サンプルの微生物組成。ヒートマップには、少なくとも1つのサンプルで相対存在量が10％を超える分類群が含まれています。単一の分類群が相対存在量＞50％を示すサンプルは、特定のカラーコード（優位グループ）で示される。V0サンプルの膣内細菌群集のBray-Curtis類似性分析に基づく階層的クラスター（n = 78)
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ラクトバチルス属が支配するこれらの群集は、群集状態I、III、V、およびIIと呼ばれている[9]。これらは，Shannon index (H′)が1.5以下（しばしば<1）で示されるように，低い多様性によって特徴付けられる．Lactobacillus属の他に、Gardnerella vaginalisが5つのサンプルで非常に多く、優勢であった。別の5つのサンプルでは、G. vaginalisとL. inersが同程度に多く、合わせて70%以上の配列リードを蓄積していた。同様に、G. vaginalisはL. gasseriと共起することが多く、4つのサンプルでは、両者を合わせて70%以上のシーケンスリードを占めた。一方、L. crispatusが大量に存在する場合は、G. vaginalisが大量に存在する場合とは相容れないようである。他の種が優勢になることはめったにない。Malacoplasma girerdii、Corynebacterium pyruviciproducens、Enterococcus faecalis、Fannyhessea vaginae、Escherichia/Shigellaはそれぞれ1サンプルで優勢であり、Malacoplasma girerdiiが優勢だったサンプルだけが非常に低い多様性を示した（H′ = 0.24）。
抗生物質治療中の膣内細菌叢の組成
Bray-Curtis類似度に基づく微生物群集組成の比較では、抗生物質投与開始後2日以内に採取した23検体のうち、抗生物質投与前の群集との類似度が50%未満であったのは4検体のみでした。これは、これらのケースのほとんどで、抗生物質の投与時間が16S rDNAレベルの細菌群集組成を変化させるのに不十分であったことを示しています。一方、抗生物質が2日以上投与された40例のうち、微生物群集が比較的安定している（類似度50%以上）のは4例のみであった（Additional file 8: Fig.S1）。
次に、V0とV1の44組のサンプル（入院時またはその後2日未満に採取されたサンプルと2日以上抗生物質を投与された患者のサンプル）のα多様性指標を分析した。その結果、細菌多様性の有意な増加（H′；p = 0.0054）が観察された（図2）。細菌の多様性の増加は、均等性（Pielou index; p = 0.03）と豊かさ（Chao1 index; p = 0.0084）の増加を伴っていた。
図2
シャノン多様性（H′），ピエロの均等性（J′），チャオ1の豊かさで示す膣内コミュニティの多様性。サンプル群（V0とV1）間の統計的に有意な差は、**p < 0.01とp < 0.05で示される。四分位数と中央値を示す
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これら44名の患者のうち31名は、抗生物質治療前にラクトバチルス属が優勢な膣内細菌叢を有していた（図1）。報告されているように、抗生物質投与はこれらのサンプルのほとんどでLactobacillus属の存在量に多大な影響を与え（図3）、V0とV1コミュニティの類似性は50％以下であった。しかし、5人の患者（J01、R11、R18、H15-Lactobacillus種、J18-Escherichia/Shigella）では、コミュニティは類似したままであった。
図3
抗生物質治療中の膣サンプルの優勢な細菌分類群の変化。ある菌種が50％以上の相対量で存在する場合、優勢菌と定義される。入院中のサンプル（V0）と抗生物質治療開始48時間以上170時間未満に採取したサンプル（V1）の両方が入手可能な44名の患者さんのサンプルのみを示しています。
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微生物相解析の結果，V1検体14検体がUreaplasma parvumに支配され（図3，4），そのうち8検体が低い多様性を示した（H′＜1）．U. parvumはV0検体で頻繁に観察されたが，抗生物質治療前の膣内細菌叢ではいずれも優勢ではなかった（図1，3）。Bifidobacterium breve、Corynebacterium jeikeium、Escherichia/Shigella、Metamycoplasma hominis、Prevotella bivia、P. melaninogenica、またはU. urealyticumによって支配されていたケースは少数であった。
図4
抗生物質治療中のPPROM患者の膣サンプルの微生物組成（V1）。ヒートマップには、少なくとも1つのサンプルで相対存在量＞10％の分類群が含まれています。単一の分類群が相対存在量＞50％を示すサンプルは、特定のカラーコード（優位グループ）で示されている。V1サンプルの膣内細菌群集のBray-Curtis非類似度分析に基づく階層的クラスター（n = 44)
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分娩時の膣内細菌叢の組成について
出産直前に採取されたサンプルは合計63個。これらのV2サンプルのうち29個は、入院後2日未満に採取された（V2e）。これらのサンプルは通常、それぞれのV0サンプルと類似しており（50%以上）、4つのV2eだけが入院時に観察されたものとかなり異なる群集組成を持っていた（J07、J35、R04、R13；＜33%の類似性）。その結果、12個のV2eサンプルはL. crispatus（12/29、41％）に支配され、さらに6個のサンプルはL. iners、L. jensenii、L. gasseri（6/29、21％）だった（追加ファイル9：図S2）。
34のV2サンプルは、患者が少なくとも2日間抗生物質を投与された後に採取された。そのうち22名の患者について、V0（入院時）、V1（抗生物質投与2～6日の間）、V2l（抗生物質投与延長後）のサンプリングセットが入手できた（追加ファイル10: 図S3）。V1では4人の患者（R11、R18、J01、J18、V0-V1類似度＞50％）で微生物組成が安定していたが、抗生物質の長期投与により、これらのコミュニティからLactobacillus属が根絶された。唯一安定していた群集（J18、V0-V1、V0-V2類似度＞50％）は、入院時にすでにEscherichia/Shigellaに支配されていた。
興味深いことに、出産時まで抗生物質を投与されていた患者のV2lサンプルは、抗生物質投与の延長（V1サンプルとV2lサンプルの間）によって微生物組成に劇的な変化はなく（類似度43.9±19.5%）、10サンプル中6サンプル（H11、H18、J29、J46、R03、R09）は類似度>50%を保っていた（追加ファイル10：図 S3）。一方，出産2日前までに抗生物質治療を中止した患者（V2r）では，微生物組成がより劇的に変化した（V1-V2，類似度 24.0±22.7%；p = 0.042）（Additional file 10: Fig S3）。しかし、1例（J42）のみ、微生物組成は抗生物質治療前に観察されたものに回復し、V2rはL. crispatusが優勢となった（Additional file 9: Fig.S2）。
新生児期の微生物相の組成
84人の新生児から採取されたサンプルは、配列決定のために処理された。309検体中97検体（31.4%）が増幅産物または十分な数の適格リードを得ることができなかった。合計60個のメコニウム、58個の直腸スワブ、55個の咽頭スワブ、および39個の臍帯血サンプルが品質管理を通過して解析された（Additional file 11: Table S8）。全体として、新生児の微生物叢は、複数の種が高い相対的存在度で存在する不均一な微生物組成を示した（図5）。
図5
新生児サンプルの微生物組成。ヒートマップには、少なくとも1つのサンプルで相対存在量が10％を超える分類群を含む。階層的クラスターは、細菌組成のBray-Curtis非類似度分析に基づくものである。ヒートマップには、メコニウムサンプル（ME、n = 60）、直腸スワブサンプル（RE、n = 58）、咽頭スワブサンプル（PH、n = 55）、および臍帯血サンプル（UC、n = 39）が含まれています。
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出産時の膣内微生物叢とそれぞれの新生児微生物叢のBray-Curtis類似度を比較したところ、具体的には、経膣分娩で生まれた新生児の臍帯血サンプルは、母親のものと非常に類似した群集組成を持つことがわかった。このことは、臍帯血サンプル上の微生物群集が、新生児の血流に含まれる微生物ではなく、臍帯表面からの母親の微生物相の名残りであることを示している。したがって、帝王切開で生まれた新生児の臍帯血から決定された細菌群集は、母親のそれと有意に類似していなかった（p = 0.0184）（図6）。一方、経膣分娩で生まれた新生児のメコニウムサンプルは、サンプリングした他の新生児部位と比較して、V2微生物群集との類似性が低かった。したがって、メコニウムの微生物相は、出産形態に依存した最小限の汚染であり、PPROM後の子宮内細菌コロニー形成の可能性を示す信頼できる微生物相源として考慮する必要がある。
図6
出生時の膣内微生物叢と新生児微生物叢の間の微生物群集構造の類似性。a 自然分娩で出産した新生児のV2サンプルと臍帯血（n = 18）、咽頭スワブ（n = 24）、直腸スワブ（n = 22）、メコニウムサンプル（n = 23）の間の類似性。b V2サンプルと帝王切開による新生児の臍帯血（n=16）、咽頭スワブ（n=23）、直腸スワブ（n=29）、メコニウムサンプル（n=32）の類似性。出自が異なる新生児コミュニティ間のV2サンプルとの類似性の違いをクラスカル・ワリス検定で解析し、一対比較で有意差がある場合はp < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 で示した。
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早産児（V2e、抗生物質投与2日未満）と遅産児（V2m、抗生物質投与2日以上）の膣内細菌叢は実際に有意差があったが（表1）、それぞれの児のメコニウム群集には有意差がなかったことから、母親が投与した抗生物質はメコニウム群集に大きな影響を及ぼさないことがわかった。
表1 早産（48時間未満）と遅産（48時間以上）の母親とその新生児の標準化相対種数データから算出した膣およびメコニウム群集のBray-Curtis類似度によるPERMANOVAの一対結果
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しかし、膣とメコニウムの群集は有意に異なり、母親の抗生物質治療のメコニウム群集への有意な影響は観察されなかったが、新生児H21のメコニウムサンプルにおけるL. crispatusの優位性、あるいは新生児J13とJ18のメコニウムサンプルにおけるそれぞれU. parvumとEscherichia/Shigellaの優位性のように、膣とメコニウムのサンプル間にはいくつかの相関が明らかだった（追加ファイル12：図 S4）。メコニウムサンプルには、母親の膣内細菌叢の他に、Cutibacterium acnesなどの皮膚住民やHelicobacter pyloriなどの典型的な消化器系細菌が観察された（Additional file 12: Figure S4）。
以上、臍帯血サンプルで特徴付けられたコミュニティは、母親の膣サンプルといくつかの類似性を示すことを確認した。臍帯血サンプル、咽頭・直腸スワブコミュニティの間に有意差があるかないかを分析するために、これらを出産時の母親のものと比較した。2ウェイPERMANOVA（追加ファイル13：表S9）の結果、V2コミュニティは、対応する咽頭、直腸、臍帯血サンプルと異なることがわかった。しかし、新生児サンプルの間には統計的に有意な差はなかった。これは、早期分娩と後期分娩の両方のサンプルについて言えることである。メコニウムのコミュニティで観察されたように、早期分娩コミュニティと後期分娩コミュニティの間の有意差は、膣のコミュニティでのみ明らかになったが、新生児のコミュニティでは見られなかった。
細菌群集の違いをより詳細に分析するために、分類群の分布の違いを膣（V2）と新生児サンプル（ME、PH、RE、NB）の間で比較した。明らかにV2が最も明瞭で、様々な細菌種や属が異なる分布をしていた（Additional file 14: Table S10）。
中でも、異なるAnaerococcus種（A. hydrogenalis/senegalensis、A. lactolyticus、A. murdochii、A. obesiensis、A. octavius）、Campylobacter種（C. hominis, C. ureolyticus）、 Dialister種（D. microaerophilus, D. propionifaciens）、Peptoniphilus種（P. coxii, P. gorbachii, P. grossenis、P. hareticas）が、それぞれ異なっていた。grossenis、P. harei、P. lacrimalis）、またはPrevotella種（P. bergensis、P. bivia、P. buccalis、P corporis、P. timonensis）は、新生児コミュニティと比較して膣コミュニティでの存在量が著しく高く、一方C. acnes、Acinetobacter juniiまたはStaphylococcus属は存在量が少なかった。メコニウムサンプルは、このニッチに富む特定の分類群によって特徴づけられ、Bacteroides ovatus、Bifidobacterium longum、Parabacteroides merdae、Phocaeicola vulgatus、Agathobacter rectale、Faecalibacillus、PhascolarctobacteriumおよびRomboutsiaが、他の新生児のコミュニティおよび母親の膣コミュニティと比較して有意に高い存在度でした（Fig 7）．
図7
メコニウム（ME）、臍帯血（UC）、咽頭スワブ（PH）、直腸スワブ（RE）、出生時の膣微生物叢（V2）間で差次的に分布した選択した細菌分類群の存在量。a 新生児サンプルと比較して膣サンプルの存在量が著しく高い分類群、b メコニウムサンプルとその他の試験区画との間で存在量が著しく高い分類群。類似性の差はKruskal-Wallis検定で分析し、一対の比較はDunnsのポストホック検定で行い、*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, and ****p < 0.0001
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自然経膣分娩と帝王切開分娩のPERMANOVAペアワイズ分析では、試験した新生児サンプリンググループのいずれにおいても、新生児の微生物組成に分娩タイプが及ぼす有意な影響は認められなかった。しかし、膣内コミュニティの新生児への移行が明確に観察されるケースもあった。例えば、新生児H06とR07のUC、PH、REサンプルはすべて、出生時の母親の膣内微生物叢と同様にU. parvumが優勢であり、新生児R04のEscherichia/Shigellaと新生児H05のL. crispatusの移入の可能性について同様の観察がなされた。
早期発症の新生児敗血症の予測
16名のPPROM患者が18名の新生児を出産し、EONSを発症した（追加ファイル2：表S2）。母親の膣内コミュニティがEONSの予測因子となり得るかどうかを検討するため、EONSを発症した子供を少なくとも1人出産した母親とEONSを発症していない子供を出産した母親の間でV0、V1、V2コミュニティが種レベルで異なるかを分析した（Table 2）。
表2 EONSに罹患した新生児を1人以上出産した母親とEONSに罹患していない新生児を出産した母親の標準化相対種数データから算出した膣コミュニティのBray-Curtis類似度による一対PERMANOVAの算出結果
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V0とV1のコミュニティを比較した場合、PERMANOVAでは差が出なかったが（それぞれp = 0.837と0.253）、V2サンプルを比較すると、コミュニティ構造全体の差は有意だった（p = 0.044）. この差は、長期間抗生物質を投与された母親のみを考慮した場合（V2l、p = 0.035）、さらに顕著になった。単一分類群レベルでは、Anaerococcus obesiensis、Anaerococcus lactolyticus、Campylobacter ureolyticus、Howardellaは、子供が後にEONSを発症した母親のサンプルに少ない傾向があるのに対し、Escherichia/Shigella、Enterococcus faecalis、Facklamia、Winkia neulii、S．aureus、Eremecoccusは、EONSの母親で過剰発現する傾向が見られた（表3）（追加ファイル15：図S5）。しかし、これらの結果をさらに証明するためには、より多くのサンプル数が必要となる。
表3 EONS症例と非EONS症例の膣内細菌叢で異なる分布を示す細菌分類群
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次に、新生児のメコニウム、咽頭・直腸スワブのコミュニティもEONSと非EONSの間で異なるかどうかを分析した。PERMANOVAでは、EONSと非EONSの新生児のメコニウム群集に有意な差は認められなかったが（p = 0.188）、咽頭（p = 0.006）および直腸（p = 0.033）群集には有意差が観察された。出産形態は群集構造に有意な影響を及ぼさなかった（メコニウム，p = 0.402，咽頭ぬぐい液，p = 0.646，直腸ぬぐい液，p = 0.695）．
EONS新生児と非EONS新生児で異なる分布を示す咽頭ぬぐい液の分類群を分析したところ、非EONS症例で相対存在量が増加している分類群は、S. epidermidisやC. acnesなどの典型的皮膚常在菌だった（表4）。この皮膚生物の相対存在量の増加が、全体的に細菌負荷が低く、したがって皮膚由来の細菌の影響が相対的に高いためかどうかは、まだ確立されていない。直腸スワブでは、明確に異なる分布を示す分類群はなかった。一方、メコニウムサンプルでは、Bifidobacterium longumとAgathobacter rectalisの有病率が高く、推定保護生物であることが示された（表4）。上記のように、これらの結果をさらに証明するためには、より多くのサンプル数が必要である。
表4 EONS症例と非EONS症例の新生児微生物叢で異なる分布を示す細菌分類群
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EONS症例と非EONS症例を識別・予測するバイオマーカーとして、膣とメコニウムのコミュニティを使用する可能性を、3つの異なるモデリング技術（ロジスティック回帰（LR）、線形サポートベクターマシン（SVM）、ランダムフォレスト分類器（RF））でテストしました。膣と咽頭ぬぐい液のコミュニティについてはロジスティック回帰モデリングで、メコニウムのコミュニティについては立方根変換したデータを用いたサポートベクターマシンモデリングで最高の性能を達成した。
受信者動作特性曲線下面積（ROC-AUC）は，V2群集（全検体），V2l群集（抗生物質投与6日以上の膣内群集），メコニウム群集，咽頭スワブ群集でそれぞれ0.675，0.736，0.672，0.685まで達成できた（図8）．5つの特徴を持つ咽頭モデルは、EONS症例の86％を正しく分類することができた。しかし、非EONS症例では58%しか正しく分類できなかった。ここで、100特徴のメコニウムモデルを用いると、EONSの78％、非EONSの84％を正しく分類することができ、最高のパフォーマンスを達成した。また、膣コミュニティは、EONS症例の分類において、64%の真陽性率、69%の真陰性率を示し、妥当な予測力を示した。また、長期の抗生物質治療を受けたコミュニティでは、予測力が若干向上した（真陽性67％、真陰性77％）（Additional file 16: Fig. S6）。
図8
EONSの予測に微生物コミュニティを使用する。膣（aは全V2サンプル、bはV2lサンプル＞抗生物質投与6日）、メコニウム（c）、咽頭スワブ（d）の5-100分類群について学習したロジスティック回帰（a、b、d）およびサポートベクターマシン分類器（d）のROC曲線．使用した分類群の量（Var）、曲線下面積（AUC）、信頼区間（CI）は、挿入図として記載されている
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次に、ハレとロストックの2つの病院から採取したサンプルだけで構成されたトレーニングコホートで、3～4タキソンモデルを評価しました。さらに、3つ目の試験会場であるイエナ病院のサンプルからなる独立したコホートを用いて、モデルの検証を行った。すべてのV2サンプルにおいて、Escherichia/ShigellaおよびFacklamia（リスク分類群）とAnaerococcus obesiensisおよびCampylobacter ureolyticus（保護分類群）からなるモデルのAUCは、それぞれ0.674および0.788であった。V2lサンプルについては、この解析を行うことができるサンプルはわずかであった。しかし、ここでもリスク分類群であるEscherichia/ShigellaとWinkia neuii、保護分類群であるAnaerococcus obesiensisを特徴として用いると、0.975と0.79という高いAUC値を得ることができました。最後に、Bifidobacterium longum、Agathobacter rectale、S. epidermidisという保護分類群を特徴とする新生児メコニウム群集から、EONs症例を妥当な割合で予測することができ、AUCは0.592と0. 一方、咽頭コミュニティ保護分類群であるS. epidermidis、C. acnes、NeisserialesによるEONS予測のAUCは、トレーニングコホートとバリデーションコホートでそれぞれ0.706と0.664となった（追加ファイル17：Fig. S7）。
考察
早産性胎膜破裂（PPROM）は、自然早産全体の3分の1に先行する。乳酸菌が枯渇し、多様性の高い膣内細菌群集は、その後のPPROMの危険因子として報告されている[36]。本研究では、入院時にラクトバチルス種が優勢な膣内細菌叢を保有していた妊婦は全体の約3分の2に過ぎず、PPROMを患った女性に関する過去の報告[4, 36]と同様である。S. agalactiae、Fannyhessea vaginalis、G. vaginalis、U. parvum/urealyticusなどの典型的な膣病原体が頻繁に観察された。その後、子宮腔、胎盤、胎児がこれらの細菌にさらされると、絨毛膜羊膜炎、菌膜炎、新生児のコロニー形成のリスクが高まります。そのため、抗生物質による治療が推奨された[38]。また、抗生物質による治療が妊娠期間の延長や血液培養の陽性回数の減少に関連することが示された臨床試験にも基づいている[39]。しかし、膣内のエリスロマイシン濃度は、ラクトバチルス種には有効でも、ほとんどの膣病原体には有効でないレベルであるため、例えばエリスロマイシンによる治療が上行性感染症を防ぐことはありえないと想定されていた [3, 40]. PPROM後に出産した母子カップルの最近のコホート研究では、胎盤スワブで抗菌薬耐性グラム陰性菌の発生率が増加し、新生児早期発症敗血症の全例がエリスロマイシンを投与された患者で発生しました [41] 。Mercerらが行った臨床試験に基づき、アンピシリンやアモキシシリンとエリスロマイシンの併用が広く行われているが、エリスロマイシンは副作用が少ないことからアジスロマイシンに置き換えられており［42］、最近の研究では［43］、こうした治療中の女性は、エリスロマイシンを処方された女性よりも膜破裂から出産までの潜伏期間の中央値が長かったとされている。しかし、今回実施した微生物相分析では、以前の報告[4]と一致して、抗生物質治療により膣内微生物の多様性が増加し、以前は同属の種が支配していた膣内コミュニティからLactobacillusが排除されたことがわかった。一方、様々なコミュニティがU. parvumによって支配されるようになり、否定的な結果をもたらす可能性があった[44]。一般的に使用されている1gのアジスロマイシンの母体への単回投与は、PPROMの設定において予想される7日間の経過に十分な抗生物質濃度を維持するには最適ではないかもしれない [45]. 興味深いことに、抗生物質の投与が48時間未満であった29件の妊娠のうち、出産後にEONS症例が発生したのは4件（14％）だけであったのに対し、広範囲に投与された妊娠のうち10件（29％）がEONS症例を発生させた。この差は統計的に有意ではありませんが、PPROM後の妊娠延長の中心的な問題であり、成熟のメリットと羊水腔の上昇性細菌汚染にさらされる時間の潜在的なリスクを比較検討しています。また、抗生物質による治療が終了した時点で、14のコミュニティのうち13のコミュニティが異生物のままであり、最初のL. crispatusの優勢に回復したコミュニティは1つだけであったことも注目すべき点である。プロバイオティクスの同時使用[46]や、羊水や膣の微生物叢の分析および標的治療[47]を含む個別管理など、抗生物質治療に代わる方法を評価する必要があるのは明らかである。
子供がEONSに罹患した母親のサンプルでは、Anaerococcus obesiensis、Anaerococcus lactolyticus、Campylobacter ureolyticus、Howardellaが少ない傾向にあり、Escherichia/Shigella、Enterococcus faecalis、Facklamia、Winkia neuii、S. aureus、Eremococcusは多い傾向にあると前出で示した。ウレアプラズマが原因で早産児のEONSと重症気管支肺異形成を引き起こした症例が報告されているが[44]、子供がEONSを発症した母親とそうでない母親の間でウレアプラズマの存在量と有病率に有意差はなかった。実際、早産後の羊水や胎盤に最も多く見られる微生物であるウレアプラズマ種は、以前から絨毛膜羊膜炎や早産と相関しており[48]、特にPPROMの文脈では、早産児にとって有害な病原体と考えなければならない。絨毛膜羊膜炎に関与する典型的な病原体は、ウレアプラズマとガードネレラの他に、フソバクテリアと特に大腸菌である [49] 。これは、出産前に膣内細菌叢で大腸菌が検出されるとEONSの危険因子となる可能性があるためである。EONSに最も頻繁に関与する生物は、Streptococcus agalactiaeとE. coliで、その他の病原体はStaphylococcus aureus、Enterococcus spp.、Haemophilus influenzaeなど[5]で、E. faecalisとS. aureusは、膣内の細菌叢で存在するときにEONSに対するさらなる危険因子であるという識別に従っている。
すでに20年前に、W. neuiiは絨毛膜羊膜炎だけでなく、新生児敗血症を引き起こす病原体として特徴づけられました [50]。それ以来、この種は他のケースでも絨毛膜羊膜炎や新生児敗血症の原因として同定されている[51, 52]。W. neuii（およびE. faecalis）は、細菌性膣炎においてG. vaginalisの病原性を増強することも示されており[53]、従来考えられていたよりも重要な病原体である可能性があります。
Facklamia株（明らかにviridans group Streptococcusと誤認されることが多い）は、新興の病原体として報告されており、敗血症、泌尿器感染症、または創傷感染症などのヒト感染症から分離されている [54]. Facklamia hominisは、絨毛膜羊膜炎や母親の敗血症の原因として報告されており、新生児の敗血症のエピソードの原因となった可能性があります[55]。重要なことは、エリスロマイシンや他の抗生物質に対する耐性がFacklamiaの分離株で広がっているようであり[54,55,56]、絨毛膜羊膜炎や新生児敗血症に対するその重要性は明らかにさらに評価する必要があります。
ヒトの腸の広範なコロニー形成は、分娩後に始まることがよく知られている[57]。さらに、一般に、新生児は無菌状態で生まれ、出産後に初めて細菌が生息すると考えられており[58]、このことは、メコニウムは子宮内では無菌状態であるが、出産後に急速にコロニー化することを意味することになる[59]。しかし、様々な文献から、メコニウムは無菌ではないことが示されている[60]。さらに、メコニウムの微生物叢は、母親の糞便や膣の微生物叢よりも羊水の微生物叢と多くの特徴を共有することが示され、羊水の微生物叢がメコニウムの微生物叢の形成に大きく寄与していることが示唆された [23]。胎児が第2期から第3期にかけて羊水を飲み込むことを考えると、このように微生物相の大部分が共有されることが予想される[21]。今回分析したコホートはPPROM患者のみであり、膜破裂により母体の膣から上行性の細菌コロニー形成の可能性があることを考慮すると、彼らの多くで羊水のコロニー形成が起こっていた可能性もある。したがって、Ureaplasma [49]のような絨毛膜羊膜炎の典型的な病原体は、今回分析した様々なメコニウムサンプルに非常に豊富に含まれており、新生児が後にEONSに苦しんだ1サンプルは、様々な有害な妊娠転帰や新生児敗血症の原因として以前に記述されているFusobacterium nucleatumによって支配されていました［61］。しかし、これらの生物以外にも、メコニウムには大腸菌などのガンマプロテオバクテリアやEnterococcus、Staphylococcus、Streptococcusなどの真菌類、さらにBifidobacteriumやPhocaeicola vulgatus [59, 62] などの生物が一般的に含まれており、これらもメコニウム微生物群の主要メンバーとして同定された生物群です。重要なことは、メコニウムの微生物相は分娩形態に大きく影響されず、分娩時の腸内細菌相を比較すると、帝王切開と経膣分娩の両方の乳児で、BifidobacteriumとBacteroides/Phocaeicolaが顕著に存在していたことである［60］。注目すべきは、メコニウムのサンプルには、母親の便や口腔に由来すると予測される細菌が含まれていることである。このように、メコニウムコミュニティは、消化管から移動した後、膣から垂直に上昇し、胎盤を通る血行性ルート [63, 64] と産後の環境ソースに由来すると考えられる。
メコニウムから検出される細菌の種類が小児期の健康に影響を与える可能性があることは、すでに早くから示唆されており [65]、その例として、新生児黄疸とメコニウムのマイクロバイオームとの関連性が観察されており [66] 、Bifidobacterium pseudolongumの存在度が高いほど、リスクが低くなるとされている。また、生後早期のビフィドバクテリウムのコロニー形成は、壊死性腸炎 [67] や遅発性新生児敗血症 [68] からの保護と関連しています。実際、ビフィズス菌の早期コロニー形成は、人間の健康状態にとって極めて重要であると考えられる。ビフィズス菌は免疫系の形成に重要であり、細胞表面に付着した外多糖類、フィンブリアやピリ、分泌されたセリンプロテアーゼ阻害剤を通じて宿主と相互作用するが、食事由来の糖鎖や宿主が提供する炭水化物の分解を通じて代謝的にも重要である [63]. したがって、ビフィズス菌、特にB. longumがEONSに対する保護因子として同定されたことは驚くにはあたらない。しかし、ビフィズス菌がそれ自体を保護するのではなく、より成熟した腸を示唆するものであると推測されるかもしれない。実際、B. longumが検出された新生児の妊娠年齢は、B. longumが検出されなかった新生児の妊娠年齢よりもわずかに高かった（32.4 ± 2.0 週対 30.9 ± 3.2 週、p = 0.028）B. longumによる影響を明確にするためには、さらに大きなコホートによる調査が必要である。A. rectaleは、おそらく保護効果を持つ第二の生物として示された。B. longumとは対照的に、A. rectaleをメコニウムに保有する新生児と保有しない新生児の妊娠年齢に差はなかった（32.0 ± 2.04 週対 31.4 ± 3.0 週、p = 0.377 ）。
結論
膣内細菌叢の解析により、PPROM患者の複雑な細菌群集が明らかになり、解析ではラクトバチルス属を区別することができます。また、Facklamia属やWinkia neuiiなど、従来の診断法では捉えられないが、PPROMやEONS（または新生児合併症）に関連すると思われる細菌属や種を特定できるため、適切なリスク評価や個別治療に関連します。
PPROM患者に適用される標準的な抗生物質治療は、PPROM後のEONSにおいて、潜在的に保護的な乳酸菌種の喪失に寄与し、コミュニティ多様性の上昇と潜在的な病原体の持続をもたらすため、抗生物質治療に代わる方法を評価する必要があります。
新生児の微生物相は、咽頭・直腸（表面）とメコニウム（加工羊水）の間でサンプリング部位により組成が異なる。培養に基づく従来の診断法では限界があることが多いこの検体において、潜在的に有益または有害な種を同定することは、PPROM後の早産新生児における個々の治療戦略や個々のリスク評価の特定に役立つと考えられます。
EONSの予測に利用できる可能性のあるバイオマーカーは、出生時の膣内微生物叢だけでなく、メコニウムからも同定できる可能性があります。したがって、微生物叢分析は、PPROM後のEONSのリスク評価における貴重な診断ツールとなる可能性があり、臨床の場でさらに評価する必要がある。
データおよび資料の入手方法
配列データは、Sequence Read Archiveにアクセッション番号PRJNA804385 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA804385/) [69]で寄託されている。
略号
ASV。
アンプリコン配列バリアント
EONS（エオンズ）。
早期発症の新生児敗血症
LONS（ロンズ）。
遅発性新生児敗血症（Late-onset neonatal sepsis
LRである。
ロジスティック回帰
MEさん
メコニム
nMDS。
非計量多次元尺度法（Non-metric multidimensional scaling
PERMANOVA:
パーミュテーショナル多変量分散分析
PH:
咽頭スワブ
PPROMのこと。
早産性膜破裂症
RDP
リボソームデータベースプロジェクト
REです。
直腸スワブ
RF:
ランダムフォレスト分類器
ROC-AUC:
受信者動作特性曲線下面積
SVMです。
線形サポートベクターマシン
UCです。
臍帯血（Umbilical cord blood
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参考文献のダウンロード
謝辞
PEONS研究会のメンバーは以下の通りです。Michael Bergner, University Hospital of Obstetrics and Prenatal Medicine Halle (Saale); Roland Haase, Department of Neonatology and Pediatric Intensive Care University Hospital Halle (Saale); Johannes Stubert, Department of Gynecology and Obstetrics, Rostock University Medical Center; Dirk Olbertz, Department of Neonatology and Neonatal Intensive Care, Südstadt Hospital Rostock; Iris Plumeier, Silke Kahl and Ann Kathrin Heroven, Helmholtz Centre for Infection Research Braunschweig, Microbial Interactions and Processs.
資金提供
オープンアクセスの資金提供が可能になり、Projekt DEALによって組織された。PEONSプロジェクトは、ドイツ連邦教育研究省（BMBF）、FKZ 01EO1502 の助成を受けています。
著者情報
著者ノート
Luiz Gustavo dos Anjos Borges, Jana Pastuschek, Dietmar H. Pieper, Janine Zöllkauは、この仕事に等しく貢献した。
著者と所属
ヘルムホルツ感染研究センター微生物相互作用・プロセス研究グループ、Inhoffenstrasse 7、38124、Brunswick、ドイツ
ルイス・グスタボ・ドス・アンジョス・ボルジェス＆ディートマー・H・パイパー
イエナ大学病院産科（Am Klinikum 1, 07747, Jena, Germany
ヤーナ・パストゥシェック、イヴォンヌ・ハイマン、エッケハルト・シュルースナー＆ヤニーネ・ツォルカウ
イエナ大学病院敗血症対策センター（CSCC）、Am Klinikum 1、07747、イエナ、ドイツ
ヤーナ・パストゥシェック、イヴォンヌ・ハイマン、クリスティン・ダウチンスキー、エッケハルト・シュルースナー＆ヤニーン・ツォルカウ
イエナ大学病院小児科、新生児科、Am Klinikum 1, 07747, Jena, Germany
クリスティン・ドウシンスキー
コンソシア
PEONS研究会
マイケル・バーグナー
ローランド・ハーゼ
ヨハネス・シュトゥベール
Dirk Olbertz
, アイリス・プルミエ
シルケ・カール
アン・カトリーヌ・ヘロベン
貢献度
JZ、JP、ESが研究を考案した。JZとJPは臨床データを分析し収集した。LGABとDHPは、バイオインフォマティクス解析を行った。DHP、LGAB、JZは、ESとJPの実質的な支援を得て、原稿を執筆・編集した。JZ、YH、KD、MB、RH、JS、DOは、被験者を募集し、検体を採取した。IP、SK、AHは、サンプルの調製と配列決定を行った。最終原稿は、すべての著者が批判的に検討し、承認した。
コレスポンディングオーサー
ディートマー・H・ピーパーに対応します。
倫理に関する宣言
倫理的承認と参加への同意
本研究は、イエナ大学病院（No.2018-1183）、ハレ/サーレ大学病院（No.2019-012）、ロストック大学病院（No.A 2019-0055）の倫理委員会によって承認されている。本試験への参加を選択した適格な女性は、手順に関する口頭での説明と書面によるインフォームドコンセントを含む、試験登録のための個別の同意プロセスを受けた。参加者は、潜在的なリスクについてカウンセリングを受け、臨床治療に関する不利益を受けることなく、いつでも試験から脱退できることを知らされた。
論文発表の同意
該当事項はありません。
競合する利益
著者は、競合する利害関係がないことを宣言する。
追加情報
出版社ノート
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図や所属機関の管轄権主張に関して、中立を保っています。
補足情報
追加ファイル1：表S1.
母親に投与された抗生物質
追加ファイル2: 表S2.
本研究で対象としたPPROM患者および新生児。
追加ファイル3：表S3.
分娩時に採取した膣サンプルの分類。
追加ファイル4: 表S4.
389サンプルにわたるイルミナベースのアンプリコンディープシーケンスを用いて決定したすべての配列バリアントのヌクレオチド配列、アノテーション、配列数データ。
追加ファイル5：表S5.
キットコントロールサンプル全体でイルミナベースのアンプリコンディープシーケンスを用いて決定した配列バリアントのヌクレオチド配列、アノテーション、相対存在量データ。
追加ファイル6：表S6.
読み取り回数が2000回を超えた378サンプルについて、イルミナベースのアンプリコンディープシーケンスを用いて決定したすべての配列バリアントの相対存在量データ。
追加ファイル7：表S7.
166の膣スワブサンプルにわたるすべての種レベルの分類群の相対存在量データ。
追加ファイル8: 図S1.
抗生物質処理に伴う微生物群集構造の変化。治療時間と、入院時の群集構造のブレイカーチス類似度（単位：％）が示されている。類似度の傾向は、1相減衰に従う線で示されている。
追加ファイル9：図S2.
分娩前のPPROM患者の膣サンプルの微生物組成（V2）。ヒートマップは、少なくとも1つのサンプルで相対存在量＞10％の分類群を含む。単一の分類群が相対存在量＞50％を示すサンプルは、特定のカラーコードで示す（優位グループ）。V2サンプル（n=63）の膣内細菌群集のBray-Curtis類似性分析に基づく階層的クラスター。
追加ファイル10：図S3.
非計量的多次元尺度法（nMDS）で評価した膣サンプルのグローバルな細菌コミュニティ構造の違い。グローバルコミュニティ構造は、標準化された種の存在量データに基づき、3つの異なる時点でのサンプリングが行われたすべての患者について示されている。患者は異なるカラーコードとシンボルで表示されています。0；入院時に採取したサンプル；1；抗生物質治療の2〜6日後に採取したサンプル；2；入院後6日以降に採取したサンプル。
追加ファイル11：表S8.
新生児サンプル212個に渡る種レベルの分類群の相対的存在量データ。
追加ファイル12：図S4.
膣およびメコニウムサンプルの微生物組成。ヒートマップは、少なくとも1つのサンプルで相対存在量＞10％の分類群を含む。単一の分類群が相対存在量＞50％を示すサンプルは、特定のカラーコードで示す（優位グループ）。V2およびMEサンプルの膣内細菌群集のBray-Curtis非類似度分析に基づく階層的クラスター（n=103）。
追加ファイル13：表S9。
標準化相対種存在量データから算出した膣内および新生児コミュニティのBray-Curtis類似度に基づく一対のPERMANOVA。
追加ファイル14: 表S10.
分娩時の膣内微生物叢と新生児微生物叢の間で差次的に分布する分類群。分布の違いは、多重比較のためのBenjamini-Hochberg補正を用いたKruskal-Wallis検定によって検定した。調整後のp値が<0.05である場合、サンプルのグループは有意に異なるとみなされた。この基準を満たした分類群のみを表示した。出生時の膣サンプル（V2）、メコニウム（ME）、臍帯血（UC）、咽頭スワブ（PH）、直腸スワブ（RE）サンプル間で一対比較を行った。 p値はDunn`s testにより補正した。
追加ファイル15：図S5.
標準化された種の存在量データに基づく膣内グローバル細菌群集構造の違い。ノン・メトリック多次元尺度法（nMDS）プロットに、（a）Escherichia/Shigellaまたは（b）Anaerococcus obesiensisの相対存在量（％）を表すバブルを重ねた。赤色はEONS（E）、灰色/黒色は非EONS（N）事例を示す。
追加ファイル16：図S6.
EONSを予測するモデルの性能を要約した混同行列。混同行列の各行は実際のクラスのサンプル数を示し、各列は予測されたクラスのサンプル数を示している。正しく分類されたケースの数を示すタイルは、マゼンタ色（EONS）または緑色（非EONS）に着色されている。aは5つのV2分類群に基づく混同行列、bは5つのV2L分類群に基づく混同行列、cは100のメコニウム分類群に基づく混同行列、dは5の咽頭分類群に基づく混同行列です。
追加ファイル17：図S7.
EONSの微生物予測のためのバイオマーカー候補の同定。トレーニング（CV）および独立した検証コホート（holdout）における3-4分類群ロジスティック回帰サポートベクターマシンSVM分類器の性能を示すROC曲線。a、すべてのV2サンプル、b、V2Lサンプル>6日抗生物質治療、c、メコニウム、d、咽頭スワブ群（d）。
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dos Anjos Borges, L.G., Pastuschek, J., Heimann, Y. et al. 早産性膜破裂および連続性早期発症新生児敗血症の妊婦における膣および新生児微生物叢(Vaginal and neonatal microbiota in pregnant women with premature rupture of membranes and consecutive early onset neonatal sepsis. BMC Med 21, 92 (2023). https://doi.org/10.1186/s12916-023-02805-x
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2022年10月19日受理
2023年2月22日受理
2023年3月13日発行
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メコニウム
早産性膜破裂症
早期発症の新生児敗血症
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