霊長類の腸内細菌叢は宿主代謝の種間差に寄与する

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微生物ゲノミクスロゴ第10巻第12号
霊長類の腸内細菌叢は宿主代謝の種間差に寄与するhttps://www.microbiologyresearch.org/content/journal/mgen/10.1099/mgen.0.001322

オープンアクセス
Elizabeth K．Mallott1,2、Sahana Kuthyar1,3、Won Lee4,5、Derek Reiman6,7、Hongmei Jiang8、Sriram Chitta9、E. Alexandria Waters10、Brian T. Layden11、Ronen Sumagin12、Laura D. Manzanares12、Guan-Yu Yang12、Maria Luisa Savo Sardaro1、Stanton Gray9、Lawrence E. Williams9、Yang Dai6、James P. Curley4、Chad R. Haney10、Emma R. Liechty13、Christopher W. Kuzawa1、Katherine R. Amato1ORCID icon
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公開日：2024年12月2日
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ABSTRACT

大きな脳はエネルギー的に高価であるため、脊椎動物全体のエネルギー利用を促進する代謝形質と関連している。しかし、これらの形質を駆動する生物学的基盤はわかっていない。疾患研究において宿主の代謝を制御する腸内細菌叢の役割を考慮し、我々は、腸内細菌叢が、脳のエネルギー必要量に関連するものを含め、通常の脊椎動物の種を超えた代謝の違いの変動に寄与しているという仮説を立てた。無菌マウスに3種の霊長類（比較的脳の大きい2種と小さい1種）の腸内細菌叢（GM）を接種することで、脳の大きい霊長類のGMは宿主の代謝をエネルギーの使用と生産にシフトさせ、脳の小さい霊長類のGMは脂肪組織へのエネルギー蓄積を刺激することを実証した。この結果は、相対的な脳の大きさに関連する代謝における宿主種間の正常な違いにおける糖鎖の役割を立証し、糖鎖がヒトの進化の過程で脳化を支える代謝変化の重要な促進因子であった可能性を示唆している。

キーワード
脳化、糖新生、生活史、生理学、短鎖脂肪酸（SCFAs）
著者
ノート

†Theseauthors contributed equally to this work
All supporting data, code and protocols have been provided within the article or through supplementary data files.Thirteen supplementary figures and three supplementary tables are available with the online version of this article.
略語
ACN
、アセトニトリル、ALP、アルカリホスファターゼ、ALT、アラニンアミノトランスフェラーゼ、ASVs、アンプリコン配列変異体、BMI、肥満度指数、EQ、脳化係数、GLMMs、一般化線形混合効果モデル、GM、腸内細菌叢、RARE、弛緩促進を伴う迅速獲得、SCFAs、短鎖脂肪酸。

インパクトステートメント

ある宿主種内での代謝の形成における腸内細菌叢（GM）の役割を探る研究は数多くあるが
、宿主種間の代謝の正常な違いに対する腸内微生物の影響を調べる研究は限られている。われわれは無菌マウスモデルを用いて、霊長類の異なる種の腸内細菌叢が宿主の代謝の違いをもたらすことを示した。さらに、比較的脳の大きい霊長類の遺伝子組換えは宿主の代謝をエネルギー生産と利用へとシフトさせ、脳の小さい霊長類の遺伝子組換えは宿主の代謝をエネルギー貯蔵へとシフトさせる。エネルギー生産と利用への代謝シフトは、ヒトのような霊長類の大脳の進化の根底にあると考えられている。その結果、これらのデータはヒトの進化における遺伝子組み換えの役割の予備的証拠となる。

データ概要

ドナーストックおよびマウス糞便サンプルの生の
16S rRNA遺伝子配列、マウス糞便サンプルの生のショットガン配列、マウス肝臓RNA配列は、Sequence Read Archive (PRJNA1003977)で入手可能。解析に使用したコードはすべてhttps://github.com/Kramato-lab/GF_mouse_primate_23、https://github.com/Mallott-Lab/PrimateMicrobiomeandBrainGrowth。

はじめに

脳は、成長や維持に代謝コストのかかる組織である[1-3]。神経細胞のシグナル伝達、シナプス形成、情報処理などの機能を支えるため、体内のほぼすべての臓器よりもグルコース代謝の割合が高い[4]。大脳組織の高い維持費は、体格に比べて脳が大きくなりがちな霊長類において特に顕著である [5]。したがって、脳化指数（EQ）（すなわち、体格に対する脳の大きさ）が高い霊長類は、一般的に空腹時血糖値が高い [6] 。霊長類の中で相対的な脳の大きさが最も大きいヒトは、体の大きさから予想されるよりも1日の総エネルギー消費量が多い [7] 。霊長類の代謝におけるこのような違いを形成するメカニズムや、それらが脳化の違いとどの程度関連しているのかを知ることは、霊長類の脳の発達や生活史、さらには大脳の進化を理解する上で極めて重要である。にもかかわらず、霊長類の代謝生理を種間で比較した系統的なデータは稀であり、代謝が形成されるメカニズムを記述したデータはさらに稀である。いくつかの比較研究では、脳の相対的なサイズが大きい霊長類と小さい霊長類の間で遺伝的・エピジェネティックな違いが検出されているが、同定された経路は全身的な代謝の違いとは明確に結びついていない [8] 。

腸内細菌叢（GM）の変動は、霊長類の代謝が異なる脳のエネルギー要求を促進する可能性のある未解明のメカニズムである。代謝疾患に腸内細菌叢が関与している研究では、特定の微生物の機能と宿主の代謝形質との間に強い関連性があることが示されている [9, 10]。特に、GMが繊維とアミノ酸の発酵から生産する短鎖脂肪酸（SCFA）、酢酸、酪酸、プロピオン酸は、宿主のエネルギー源として機能し、また、SCFA受容体を介したシグナル伝達を通じて、宿主の代謝プロセスに直接的に影響を与える [11]。これらのプロセスには、食欲と満腹感、脂肪生成、コレステロールとトリグリセリド合成、グルコース-インスリン代謝などが含まれる [9, 12, 13]。糖尿病や肥満などの疾患におけるSCFAの役割が最も研究されているが、SCFAとこれらの宿主代謝プロセスとの相互作用は、大脳の高いエネルギー需要を支えるためにグルコース産生を増加させる方向、および／または成長、維持、脂肪沈着などの体性機能を増加させる方向に、全身の代謝をシフトさせる可能性もある。SCFAは、他の微生物代謝産物と同様に、腸と脳の間のコミュニケーションを促進することによって、脳の生理学にも影響を与える可能性があり[14]、脳の進化と関連する生活史のトレードオフをより広く理解するための重要なターゲットとなっている。霊長類の種間で系統的に収集されたSCFAの比較データは限られているが [15]、GM組成と機能は霊長類の種間で著しく異なることが示されている [16, 17]。これらの違いが、代謝や生活史を含む霊長類の生理学における種間変異にどの程度寄与しているかは、現在のところ不明である。我々は、これらの違いが、他の身体システムを維持しながら大きな脳を成長させ維持するために必要な代謝戦略を媒介する上で重要な役割を果たしていると仮定している。

ここでは、マウスモデルを用いて、3種の霊長類におけるGM機能の違いが、脳のエネルギー要求量の種差と一致する形で、宿主の代謝表現型の違いと関連していることを初めて証明した。マカク（Macaca mulatta）、リスザル（Saimiri boliviensis）、ヒト（Homo sapiens）の3種の霊長類のGMを無菌マウスに接種した。ヒトとリスザルは系統的には遠い関係にあるが（一方はアメリカ大陸に生息するカモノハシ科のサル、もう一方はアフリカに生息するサル）、いずれも「脳を優先する」種とみなすことができる。なぜなら、ヒトは生後急速に脳を成長させ、成体になっても比較的脳が発達している（つまり、体格の割に脳が大きい）ため、ライフサイクルを通じて脳を維持するためにより多くのエネルギーを必要とするからである [18, 19]。これとは対照的に、マカク（アフリカに生息するネコ科のサル）は生後の脳の成長速度が遅く、また成体になっても脳化しないため［18, 19］、脳を支えるために必要なエネルギーが少なくて済む。そこで我々は、脳を優先する霊長類のGMは、脳に利用可能なエネルギーを増加させる宿主の代謝表現型の違いを促進するという仮説を検証した。

その結果、我々の仮説全体が支持された。比較的EQの高い遠縁の霊長類2種のGMを持つマウスは、食物の消費と肝臓での糖新生を増加させることにより、宿主のエネルギー消費と産生を増加させる代謝表現型を持っていた。対照的に、脳化度の低い（EQの低い）霊長類の遺伝子組み換えマウスは、体重増加が速く、脂肪組織の沈着が増加したことから、グルコースの利用と脂肪組織の沈着がトレードオフの関係にある可能性が示唆された [20]。これらの違いは、微生物代謝産物濃度、特にSCFAsの違いに関連していた。

霊長類のGMは、相対的な脳化と一致するパターンで、正常な宿主の代謝表現型に因果的な影響を及ぼす
我々は、
離乳期のC57BL/6無菌マウスに、成体マカク（M. mulatta；低EQ）、リスザル（S. boliviensis；高EQ）、およびヒト（H. sapiens；高EQ）のGMを接種し、合計3回の処理を行った。ドナーの糞便サンプル採取方法は、Methodsに記載されているように、ヒトと霊長類以外で若干異なる。マウスは60日間、標準的なチャウ食で自由摂食させ、マウスの生理学とGMの機能に関するデータを複数の時点で収集した（図S1、本論文のオンライン補足資料に掲載）。霊長類のGMはすべてマウスに正常に移行した。3日後および60日後のマウスの糞便サンプルのGM組成は、ドナーストックのGM組成と同様であり、両時点で処理群間のGM組成に明らかな差が見られた（図S2、S3）。最初の時点におけるドナー株とマウスの糞便サンプルは、ヒト、マカク、リスザルについて、それぞれ18.4％、5.9％、6.2％のアンプリコン配列バリアント（ASV）を共有していた。ヒトのドナーストックに存在する微生物属の63％は、最初の時点のマウスの糞便サンプルにも存在した（表S1）。マカク属の37％（表S2）とリスザル属の30％（表S3）が、最初の時点でマウスの糞便サンプル中に存在した。

60日後の評価では、高EQ霊長類GMを接種したマウスと低EQ霊長類GMを接種したマウスの間で、さまざまな代謝形質の違いが検出された（図1）。宿主の脳の大きさには処理による差は見られなかった（F2,23 = 0.2, P = 0.8；図1a）が、これは脳の大きさが動物種間で遺伝的に大きく変化していることから予想されることである[21]。より可塑性が期待される他の臓器では、高EQ霊長類接種マウスで肝臓のサイズ（F2,23 = 1.0, P = 0.4）と膵臓のサイズ（F2,23 = 2.8, P = 0.08）が増加する有意でない傾向が観察された（図1a）。対照的に、高EQ霊長類接種マウスは体脂肪率が有意に低く（無脂肪体重と比較；F2.23 = 3.9, P = 0.03；図1a,b）、その結果、平均摂餌量が多いにもかかわらず（F2,8 = 370.6, P < 0.001；図1a）、体重増加も少なかった（F2,23 = 5.4, P = 0.01；図1a）。各処置群のマウスの一部から採取した糞便組織サンプルの病理学的検査では、異常は認められなかった（図S4）。

図1.
高EQ霊長類のマイクロバイオームを接種したマウスと低EQ霊長類のマイクロバイオームを接種したマウスを区別する生理学的変数。高EQ霊長類マウスと低EQ霊長類マウスでは、体重増加、脂肪率、平均摂餌量（ケージで測定）が異なる（a）。MRIで測定した脂肪率は、高EQ霊長類接種マウスと低EQ霊長類接種マウスで異なる（b）。高EQ霊長類接種マウスと低EQ霊長類接種マウスでは血液化学的性質が異なる（c）。
図1.
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高EQ
霊長類接種マウスはエネルギー産生も亢進しているように見えた。空腹時血糖値が上昇し（F2,23 = 7.5, P = 0.003；図1c）、このパターンはヒトGMを接種したマウスで特に顕著であった。肝臓のグリコーゲン含量には処理による差はなかった（F2,23 = 2.2, P > 0.1;図1b）。しかし、低EQ霊長類接種マウスと比較して、高EQ霊長類接種マウスはALP（F2,23 = 6.1, P = 0.008；図1c）とALT（F2,23 = 7.8, P = 0.003；図1c）の血中濃度が上昇した。後者は糖新生（他の炭水化物、脂質、タンパク質からグルコースを生成すること）に関与する重要な酵素である。高EQ霊長類接種マウスはまた、トリグリセリドを増加させ（F2,23 = 12.4, P = 0.0002；図1c）、コレステロールを減少させた（F2,23 = 4.6, P = 0.02；図1c）。これらの違いを総合すると、高EQ霊長類接種マウスは、より多量のグルコースを産生するが貯蔵はしないように代謝がプログラムされており、低EQ霊長類接種マウスは、グルコースを脂肪として貯蔵するだけでなく、全体としてより少ないグルコースを産生するように代謝がプログラムされていることが示唆される。

高Qと低Qの霊長類接種マウスでは、遺伝子組換えタンパク質の組成と機能的潜在能力が異なる
全体的な
遺伝子組換えタンパク質の組成と機能的潜在能力は、処理群間で異なっていた（図S5とS6）。しかし、GM分類群のほんの一握りだけが処理群間で異なっていた（Fig. 一方、フコースとラムノースの分解、アミノ酸（シトルリン、イノシン、スレオニン）の生合成、ピルビン酸の生合成、ピルビン酸から酢酸と乳酸への発酵、グリコーゲンの分解、ガラクトースの分解、デンプンの分解に関連する遺伝子組み換え経路は、高EQ霊長類接種マウスの方が低EQ霊長類接種マウスよりも多かった（図2a）。一方、ピルビン酸からブタン酸への発酵、グルタミン酸からプロパン酸への発酵、グリコーゲン合成に関連する経路は、低EQ霊長類接種マウスでより多かった（図2a）。さらに、高EQ霊長類接種マウスでは、糞便中の酢酸（F2,21 = 36.9、P < 0.001）、プロピオン酸（F2,21 = 30.4、P < 0.001）、酪酸（F2,21 = 12.0、P = 0.0003）およびバレレート（F1,21 = 20.4、P < 0.001）濃度が増加した（図2b）。

図2.
高EQ霊長類腸内細菌叢と低EQ霊長類腸内細菌叢を接種したマウスのGM間の機能的差異。ヒトとサルの腸内細菌叢を接種したマウス、リスザルとサルの腸内細菌叢を接種したマウスのいずれにおいても、複数の微生物パスウェイの相対的存在量（a）は有意に異なっていたが、ヒトとリスザルの腸内細菌叢を接種したマウスの間では異なっていなかった。SCFAsの糞便中代謝物（b）は、ヒトおよびリスザルの腸内細菌叢を接種したマウスのサンプルでは、マカクの腸内細菌叢を接種したマウスの濃度と比較して高濃度であった。
図2.
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糞便中の
SCFA濃度は、宿主に吸収されないSCFAを定量化したものである。しかし、宿主による様々なSCFAの吸収率に一貫した違いがあることは知られていないため、糞便中SCFA濃度は一般的に腸内でのSCFA産生と吸収に比例すると考えられている[22]。微生物の酢酸産生とプロピオン酸産生の違いは、宿主の代謝に重要な影響を及ぼす可能性が高い。両者とも腸内で吸収され、しばしば肝臓を含む臓器に高濃度で到達する [23-25]。主にマウスを用いた研究から、酢酸は肝臓でコレステロールやトリグリセリドを合成する基質となり、酢酸濃度の上昇は白色脂肪組織での脂肪生成を促進することが知られている [26]。しかし、プロピオン酸濃度が上昇すると、酢酸のこの作用が阻害され、高濃度の酢酸とプロピオン酸の両方が、他の組織と同様に肝臓での糖新生を誘発する [27, 28]。これらの作用は、ノルエピネフリン、グルカゴン、インスリン、グレリン、神経伝達物質、脂肪酸結合タンパク質に対するSCFAの影響を介して媒介される可能性がある［29、30］。したがって、脳を優先する霊長類GMによる酢酸とプロピオン酸の微生物産生の増加は、直接、脂肪生成の低下と糖新生の増加をもたらす可能性がある。この経路で産生されるグルコースは、特に基質要求量がピークに達する生後の成長発育期において、脳の貴重なエネルギー源となる可能性がある [1]。さらに、酪酸は結腸細胞によって優先的にエネルギー源として利用される [31]。腸は脳に次いでエネルギーコストの高い組織であることから [3, 32]、腸が酪酸を利用することで、脳に他の宿主エネルギー源を供給できる可能性がある。最後に、SCFAは血液脳関門を通過することができ [33]、エネルギー源として、あるいは代謝シグナル分子として直接利用される可能性がある。

GMと宿主の代謝の関係を媒介する肝臓の重要な役割を示唆するマウスの生理学とGM機能のパターンを考慮し
、TagSeqを用いて60日間の実験期間終了時のマウス肝臓における遺伝子

発現の差異を評価した。肝臓遺伝子発現におけるドナー種特異的な差異に加えて（図S10）、高EQおよび低EQの霊長類接種マウスが、それぞれ異なる肝臓遺伝子発現パターンを示すことが分かった（図S11）。これらの遺伝子のいくつかは、糖新生、脂肪新生、コレステロール合成、脂肪酸代謝や脂肪細胞発達のさまざまな側面と関連している（Fabp5、Fasn、Elovl6、Mup12など）[34-37]。しかしながら、肝臓の代謝プロセスの制御は、遺伝子発現の変動のみによって駆動されるわけではなく、エネルギーと代謝物のフラックスのパターンとも密接に関連している [38, 39]。また、糖新生の基質となる乳酸やアラニンの利用可能性など、他の重要な制御メカニズムも作用している可能性が高い。これらの基質はどちらも、ピルビン酸分解によってピルビン酸-乳酸から、またピルビン酸とバレレートなどの分岐鎖脂肪酸との相互作用によってアラニンから産生される。我々のGMデータは、高EQ霊長類接種マウスにおいて、ピルビン酸分解が増加し、ピルビン酸生合成が増加し、バレレート濃度が上昇している証拠を示している。

さらに、MiMeNet解析により、87の微生物ASVを用いて、高EQ霊長類接種マウスの肝臓で発現が異なる191の宿主遺伝子を予測できることが示された（図S12）。これらのASVによって予測された遺伝子は、6つの異なるモジュールにクラスタ化され、最も大きな2つのモジュールには、それぞれ脂肪酸代謝とアミノ酸代謝に関連する遺伝子が含まれていた（図S13）。TagSeqデータの機能解析でも、高EQ霊長類接種マウスは肝臓のアミノ酸、脂質、脂肪酸代謝に富み、これらの経路の多くで重要な補因子であるビオチンの代謝と輸送に変化が見られることが示された（図3）。このパターンは、高EQ霊長類遺伝子組み換え作物が、糖新生や脂質シグナル伝達と密接に結びついた他の経路を介したエネルギー産生のために、宿主の代謝をプログラムしていることを示唆するさらなる証拠となる。また、高EQ霊長類に感染したマウスは、臓器障害の徴候がないにもかかわらず、血小板シグナル伝達が亢進し、ある程度フィブリン凝血塊の形成が見られた（図3）。創傷治癒などの免疫的役割に加えて、血小板は、新しいニューロンの形成を含むプロセスを調節することによって、脳を含む中枢神経系における恒常性と可塑性に影響を与える重要なカルシウム依存性シグナル伝達分子として認識されている[40, 41]。従って、この一連の代謝過程は、代謝性疾患以外の場面でも重要な役割を果たし、宿主の代謝を脳を支えるエネルギー産生へとシフトさせる可能性がある。

図3.
マウスの肝臓で治療によって発現が異なる機能的経路。各対種比較で発現上昇した遺伝子を同定した。パスウェイ濃縮はReactomeパスウェイデータベースを用いて、差次的に発現した遺伝子の各セットに対して行った。値および陰影は負の対数調整P値を表し、より有意な濃縮は濃い青で陰影をつけた。SQM = リスザル。
図3.
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ヒトは

高EQリスザルとは異なる

高EQ霊長類マウスと低EQ霊長類マウスの全体的な違いに加え、ヒトGMを接種したマウスは、他のすべてのマウスと比較して、代謝生理と肝臓の遺伝子発現が異なっており、ヒトが霊長類の中で最も高いEQを示すという事実と一致していた。例えば、ヒトGMを接種したマウスは、他のすべてのマウスと比較して、空腹時グルコースが高く（F2,23 = 7.5, P = 0.003;図1c）、120分間糖負荷試験に対するベースライン空腹時グルコースレベルへの戻りが遅かった（F2,23 = 7.53, P = 0.003;図1）。同様に、ヒトを接種したマウスは、トリグリセリドが最も高く（F2,23 = 12.4, P = 0.0002；図1c）、コレステロールが最も低かった（F 2,23 = 4.6, P = 0.02；図1c）。また、研究期間中の体重増加も最も少なかった（F2,23 = 5.4, P = 0.01）。微生物機能に関しては、ヒトを接種したマウスは、プロピオン酸（F2,21 = 30.4, P < 0.001）と酪酸（F2,21 = 12.0, P = 0.0003）の割合が最も高かった。これらのパターンを総合すると、ヒトGMは他の霊長類で観察されたパターンよりもさらに、宿主の代謝を脂肪生成から糖新生へと偏らせる可能性があることが示唆される。このように、我々のデータは、大脳の発達と維持を促進するヒトの代謝適応の形成に、遺伝子組み換えが関与している可能性を示している。

全体として、我々の結果は、霊長類におけるエネルギー使用と生産対貯蔵の代謝表現型を仲介するGMの役割と一致している。我々のデータは、哺乳類の種内でも種を超えても、脳と体の成長の間にトレードオフがあると推定されることを裏付けている[32, 42]。ヒトの場合、脳のエネルギー需要の発達的変化は、乳児期から思春期にかけての成長速度の変化と反比例して変化し、ライフサイクルの中で成長と脂肪蓄積のペースが最も遅いのは、生涯を通じて脳のエネルギー消費がピークに達する幼児期中期と一致する [1, 43]。同様に、大脳の進化には、他の組織におけるエネルギー消費の減少が必要であるという仮説がしばしば唱えられてきた [3, 32, 44]。この進化的トレードオフを裏付けるように、哺乳類の種間における体格に対する脳の大きさのばらつきは、脂肪組織の沈着と逆相関している [20] 。脳が大きい霊長類は空腹時血糖値が高いだけでなく [6]、脂肪率も低い [20]。高EQ霊長類のGMを接種したマウスでは、成長と脂肪率の両方が低下するという所見は、GMが脳と体間のエネルギー配分の分配に寄与していることと一致し、幅広い分類学的範囲にわたって、脳のエネルギーと脂肪率および成長速度の両方との間のトレードオフに関する新たな証拠と広く一致している [1, 20, 45-47]。

重要なことは、ヒトの代謝は幼年期と成年期の両方において他の霊長類とは異なることが知られており [7, 48, 49]、この表現型は他の霊長類よりも比較的大きい脳を支えるための適応であるという仮説が立てられている。例えば、ヒトの成体ではグルコースと脂肪の両方が増加している [50] 。増加したグルコース産生は、リアルタイムで脳に電力を供給するのに役立つ一方で、増加した脂肪率は、利用可能な食料が減少した状況および/またはエネルギー需要が増加した状況において、脳の重要なバックアップエネルギー源として機能する [48]。このような表現型は、他の霊長類と比較して成体ヒトのエネルギー収支が全体的に増加していることと関連していると思われる [7]。このため、代謝のトレードオフが緩和され、他の霊長類と比較してすべての機能に多くのエネルギーを割り当てることができる。われわれのマウスはヒトに典型的な脂肪増加傾向を示さなかったが、これはヒトに比べてマウスのエネルギー予算が制約されている結果であると考えられる。この研究ではすべてのマウスが同じ遺伝的背景を持つことから、ヒトGMを接種したマウスであっても、霊長類に典型的なエネルギートレードオフを必要とする、ヒトとは異なる同様のエネルギー収支を持っていた可能性が高い。また、BMI（体格指数）の低いドナーヒトの単一集団を用いたことが、この結果に影響した可能性もある。しかし、脂肪率が極端に低いヒト集団は、ヒト以外の霊長類よりも依然として脂肪率が高い[7]。

これらのデータを総合すると、霊長類の成体における脳のエネルギー要求量と一致するような形で、霊長類の代謝をプログラムする上で、GMが原因的な役割を果たしていることが示唆される（図4）。特に、高EQ霊長類の遺伝子組み換えは、SCFAs、特に酢酸とプロピオン酸の濃度を増加させ、マウスモデルでは食物消費と糖新生を促進し、脂肪生成を抑制しているようである。このような宿主の代謝の違いは、肝臓の遺伝子発現の変化と関連しており、遺伝子組み換えが宿主の代謝に影響を与えるメカニズムを示している可能性がある。しかし、主要な代謝経路を通るエネルギーや代謝物のフラックスに対する変化など、他のメカニズムも影響している可能性が高い。栄養吸収が行われ、マイクロバイオームコミュニティの組成が異なる小腸における動態を理解することで、興味深い他の経路も明らかになる可能性がある。

図4.
微生物が高EQ霊長類と低EQ霊長類の代謝に及ぼす影響の推定モデル。我々の発見は、微生物が介在する経路を通じて、高EQ霊長類の代謝がエネルギー生産に偏り、低EQ霊長類の代謝がエネルギー貯蔵に偏っていることを示している。
図4.
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この研究にはいくつかの
注意点がある。例えば、ヒトとヒト以外の霊長類の糞便サンプルの採取条件が異なっていたため、データにノイズが混入した可能性がある。しかし、マウスの表現型には方向性があり、ヒトおよびリスザルサンプルを接種したマウスは互いに類似しており、マカクサンプルを接種したマウスとは異なっていたため、交絡バイアスの懸念は軽減された。また、各ドナー種の単一集団を用いたため、一般化可能性が制限される可能性がある。これまでの研究で、霊長目全体で宿主種の影響が宿主の環境／個体群の影響を上回ることが実証されていることから、この制約は考えにくいと思われるが [16]、今後、ドナー種の複数の個体群を組み入れた研究を行うことで、この知見をさらに検証することができる。同様に、本研究ではEQの高い霊長類2種と低い霊長類1種を組み入れた。脳に関連する形質が、他の宿主種に特異的な形質ではなく、観察されたパターンを動かしていることをさらに証明するためには、さらに多くの霊長類種をドナーとして用いた実験が必要である。

本研究の結果は、脳の発達、維持、進化に関連する宿主の代謝プログラミングにおける遺伝子組み換えの役割について、引き続き研究を進めるための重要な基盤となる。より脳が発達した霊長類は、成体期に脳への燃料補給のための代謝的解決策を必要とするが、脳の成長が活発な幼体や、シナプス形成などのプロセスに関連するエネルギーコストが高い幼体 [1, 51, 52] において、このような宿主と微生物の動態を調べることで、さらなる知見が得られるだろう。今後、霊長類の様々な種におけるSCFA産生パターンを系統的に比較し、SCFAが宿主の代謝を変化させる具体的なメカニズムを明らかにするための研究をさらに進める必要がある。また、他の微生物産生化合物が、観察されたパターンにどの程度寄与しているかも調査すべきである。例えば、腸内ではGMとの相互作用により大量のセロトニンが産生され [53]、セロトニンは肝臓での脂肪生成を促進し、脂肪組織での脂肪分解を抑制する [54] 。同様に、微生物と肝臓の相互作用は、脳の発達に関与するトリメチルアミンN-オキシド［55］の産生を介して代謝表現型を媒介することが示されている［56］。これらの経路に関する知識は、遺伝子組換え生物と宿主の代謝との相互作用に関する重要な機構的洞察を提供し、霊長類における脳の成長と発達を促進する近接因子の理解も前進させるであろう。しかし、どのようなメカニズムにせよ、宿主種間における宿主のエネルギー配分パターンの形成にGMが役立っているという我々の発見は、比較的大きな脳の進化を含む生活史における種の違いの足場作りにおいて、微生物が重要な役割を果たしていることを示唆している。

方法

ヒトの便サンプルの収集
ヒトの便サンプルは、米国イリノイ州エバンストンから男女の成人参加者を募集した。BMIが18.5～24.9で、過去6週間以内に抗生物質の使用歴が報告されていない18～35歳の成人が、蓋付きの便器（Fisher Scientific 02-544-208）を用いて自宅でサンプルを採取した。参加者は、検体を採取後24時間以内に研究室に届ける前に涼しい場所に保管した。サンプルは、採取が完了するまで-80℃で数日間保存され、その後、サンプルから糞便物質1gを取り出し、15mlのチューブに入れ、0.1％システイン-HClを含む滅菌1×PBSでチューブを満たすことによって処理された。すべてのヒトサンプルは、実験室到着後、マウス実験に使用するまで-80℃で保存された（<3ヵ月）。被験者の募集およびサンプリング手順は、Northwestern University Institutional Review Board（ID：STU00206091）の承認を得たプロトコールに従った。

マカクについては、鎮静剤を投与するか社会集団から分離した状態で便サンプルを採取した。前者の場合、個体はケタミンまたはテラゾールで麻酔され、手袋をはめた指を直腸に挿入してアカゲザルから少なくとも100gの糞便を採取した。後者の場合、排泄された糞便サンプルは一時的に単独飼育された個体のキャッチパンで採取された。BMIが正常で、過去6週間に抗生物質を使用していない雌雄の成体をサンプルとした。サンプルは、動物ID、採取日時、採取者のイニシャルをラベルした、あらかじめ加重されたチューブに入れられた。サンプルは後述の方法で処理し、実験に使用するまで-80℃で保存した（＜1ヶ月）。アカゲザルの糞便サンプルは、M.D. Anderson IACUC #0000804 -RN03「SPFアカゲザル繁殖および研究プログラムの確立および維持」、および重複するIACUC #00001437 -RN02「アカゲザルにおける慢性腸炎の予備的特徴づけおよび大腸癌の早期発見」の下で収集した。

リスザルの糞便サンプルについては、個体のリスザルを通常の飼育環境から外し、十分な糞便サンプルが得られるまで、2時間から4時間の間、清潔な飼育環境に置いた。糞便は、清潔な検査用手袋および／または木製の舌圧子を用いて、飼育床の数カ所から尿の混入なしに採取した。BMIが正常で、過去6週間に抗生物質を使用していない雌雄の成虫をサンプルとした。サンプルは、動物ID、採取日時、採取者のイニシャルをラベル付けした、あらかじめ加重したチューブに入れた。サンプルは後述の方法で処理し、実験に使用するまで-80℃で保存した（＜1ヶ月）。リスザルサンプルは、M.D. Anderson IACUC #00002148 -RN00「Characterization of the gut microbiome in squirrel monkeys（リスザルにおける腸内細菌叢の特性）」に基づき収集した。

リスザルおよびニホンザルのサンプルは、0.1％システイン-HClを含む滅菌1×PBSをサンプルチューブに充填して処理した。サンプルを最大速度で5分間ボルテックスし、氷上で5分間沈降させた。上部の液体画分（粒子を含まない）をバイオーム画分として回収した。フラクションのアリコートは、Dr. Amatoの研究室に出荷するまで、-80℃でグリセロール（最終濃度10%）に保存した。それらはマウス実験に使用するまで（6-12ヵ月）、Amatoの研究室で-80℃で保存された。

マウスの接種とサンプルの収集
各種5個体（雌雄を含む）の便サンプルのグリセロールストックをホモジナイズし、プールして滅菌PBSで希釈し、経口投与液を作成した。どのサンプルをプールするかは、16S rRNA遺伝子アンプリコン・シークエンスでGM組成に明らかな異常がないことを確認した後、擬似的にランダムに選んだ。それぞれの溶液を10匹の離乳期の無菌C57BL/6NTacマウスに経口投与した。無菌マウスは60日間の試験期間中、フレキシブルフィルムのアイソレーターで維持され、処置は連続して行われた。マウスにはオートクレーブ可能な標準的な餌を与えた（総カロリーのうち、タンパク質は～25％、～17％： ~総カロリー中：タンパク質25％、脂肪17％、炭水化物58％、繊維5％；Envigo Teklad LM-485）を自由摂取させた。マウスはポリスルホン製シューボックスケージに入れられ、Alpha-dri®製寝具とEnviro-Dri®製巣材を用い、ステンレススチール製ワイヤーバーの蓋をした。隔離器は温度72±2°F、相対湿度30～70%、14：10時間の明暗サイクルで維持した。

接種24時間後にマウスの体重を測定して基準体重を設定し、糞便と150μlの顎下血液サンプルを採取した。その後、糞便および血液サンプルを毎週採取し、マウスの体重を毎週測定した。ドナーのGMを確実に維持するため、ギャベージも毎週繰り返した。食餌消費量は、14日ごとに、24時間にわたって供給された食餌量と消費されなかった食餌量を測定することにより、各組について推定した。30日および60日目に、一晩絶食させた後、各マウスに体重1kg-1のブドウ糖2gを与えてブドウ糖負荷試験を行った。血糖値は、0、15、30、60、120分の5時点で、尾穿刺と携帯型グルコメーター（Accu-Check）を用いて測定した。60日後、ノースウェスタン大学先端分子イメージングセンターで、すべてのマウスをMRIでスキャンし、脂肪率を推定した。その後、マウスはケタミン・キシラジンで安楽死させた。臓器を摘出し、体重計で秤量した。消化管は切片（胃、小腸、盲腸、大腸）に分けられた。すべての消化管切片と肝臓は、安楽死後30分以内に-80℃の冷凍庫で凍結した。ノースウェスタン大学の動物飼育・使用プログラムはAAALAC Internationalの認定を受けており、すべての動物実験はNU IACUC #IS00006555の承認を得た 。

MRIデータ作成
各マウスは、3％イソフルランを酸素中で投与する誘導室で麻酔された。麻酔導入後、マウスを専用の動物用ベッドにうつ伏せに寝かせ、呼吸数～40回/分を維持するために必要に応じて1～2％のイソフルランをノーズコーンを通して投与した。呼吸と体温は、枕式圧力センサーと直腸温プローブを用いたSAI Model 1030 MR対応動物モニタリングシステム（Small Animal Instruments Inc. 動物の体温は、動物の腹部の下に温水循環ブランケットを使用して維持した。水と植物油を含む参照標準を動物の脊柱に沿って配置した。

撮像は9.4T Bruker Biospec 9430 (Bruker Corporation, Billerica, MA, USA)を使用し、30cmのボアと12cmのグラジエントインサートを備え、Paravision 6.0.1で行った。高周波コイルは、送受信モードで動作する40mm直交ボリュームコイル（Bruker社製）であった。マウスは2つの物理的視野で撮像された。最初は胸部がコイルの中心にくるようにし、次にスキャナーベッドを取り出し、z軸に沿ってマウスを移動させて腹部がコイルの中心にくるようにし、スキャナーベッドをマグネットの内径に戻した。視野は頭蓋底部から精巣までの解剖学的領域をカバーした。

各視野について、加速スピンエコーシーケンス（T1 Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement、T1-RARE）を軸方向に用いてT1強調画像を取得した。以下のパラメータを使用した： TR/TE=1000ms/6.25ms、RARE factor 4、MTX=256×256、FOV 4×4cm、15スライス、スライス厚1mm、スライスギャップ2mm、2信号平均。各スキャンの撮影時間は1分15秒。3つのインターリーブされたスライスパッケージが取得され、各スライスは前のスライスに対して1mmシフトされ、完全なスライスカバレッジを達成した。各スライス形状について、脂肪抑制スキャンを1回、それ以外は同一の非脂肪抑制スキャンを1回取得した。

画像はスキャナーからDICOM形式でエクスポートされ、Amira 2019ソフトウェア（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）にインポートされた。脂肪抑制画像と非脂肪抑制画像の両方を、水管からの平均信号に正規化した。胴体と腹部のデータセットは、Amiraのマルチプラナーアライメントツールを使用して登録し、重なりを減らすためにトリミングし、全身の脂肪抑制と非脂肪抑制のデータセットを作成するために統合した。結果として得られた2つのデータセットの差を取ることにより、全身の「脂肪マップ」を作成した。マウスの胴体を構成する関心領域を脂肪抑制画像から作成し、脂肪マップに重ね合わせた。脂肪ボクセルは、値が0.25（差し引いた画像の水管の値の平均±2 sd）を超えるものとして同定した。脂肪率は、全身の体積に対する関心脂肪領域の体積の比として算出した。

腸管病理学
エンドポイントにおいて、各動物種の盲腸標本のサブセットを切除し、パラフィン包埋して、病理組織学的スコアリングのために処理した。ヘマトキシリン・エオジン染色した組織切片を、盲検下で認定病理医が検討し、採点した。採点項目には、粘膜損傷（陰窩アポトーシス、びらん、潰瘍化）、リンパ球性炎症（上皮および固有層へのリンパ球浸潤の増加、上皮下膠原線維の肥厚）、好中球浸潤（固有層、陰窩および浮腫性変化における好中球）が含まれた。

16S rRNA遺伝子の塩基配列決定と解析
16S rRNA遺伝子の塩基配列決定を用いて、ドナーの糞便サンプル、ドナーの糞便サンプルを最初に接種した4日後にマウスから採取した糞便サンプル、および実験の最終週にマウスから採取した糞便サンプルからGM組成を評価した。DNA 抽出と 16S rRNA 遺伝子の V4-V5 領域の増幅には、実験室で確立されたプロトコルを用いた[57]。簡単に説明すると、DNAはQiagen DNeasy PowerSoil Kitを用い、メーカーのプロトコルに若干の修正を加えて抽出した。ドナーの糞便サンプルには515 F-806R Earth Microbiome Projectプライマーを、マウスの糞便サンプルには515 F-926R Earth Microbiome Projectプライマーを用いて、2段階のPCR増幅を行った[58]。得られたアンプリコンは、SequalPrepを用いて洗浄した後、PicoGreenを用いて定量した。ヒト、マカクおよびリスザルのドナーサンプルはIllumina MiniSeqプラットフォームでシーケンスし、すべてのマウス糞便サンプルはIllumina MiSeq 2×350 bp V3プラットフォームでシーケンスした。細菌ゲノムのコピー数は、ViiA 7 Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific）を用いた16S rRNA遺伝子のリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）を用いて推定した[59]。アンプリコンの配列決定とqPCRはイリノイ大学シカゴ校のGenome Research Coreが行った。

生のアンプリコン配列はトリミングと品質フィルターを行い、ASVはQIIME2 v.2-2019.10で決定した[60]。分類はGreenGenesデータベース[61]を用いて割り当てた。全サンプル（ストック、最初の時点、最後の時点）のシングルエンド配列、および実験サンプル（最初と最後の時点）のみのペアエンド配列を解析した。ネガティブコントロールはDNA抽出とPCRの両方に使用した。ネガティブコントロールはすべてのケースで実際のサンプルよりも配列数が少なかったため、以降の解析には含めなかった。多様性解析の前に、全サンプルのASV表を10 177配列に希釈し、実験サンプルのみのASV表を6573配列に希釈して全サンプルを保持した。QIIME2では、重み付けなしおよび重み付けありのUniFrac距離、Faithの系統的多様性およびシャノン多様性を計算し、QIIME2内のq2-breakawayライブラリーを使用して、希少化されていないデータからリッチネスを計算した[62]。ドナーGMがマウスにうまく定着したかどうかを評価するために、各ドナー種からの全サンプルと各時点からの全サンプルについて、全ドナー種-時点の組み合わせとコアGM特徴間のペアワイズ距離を計算した。R [63]のveganパッケージ（v2.6.2）を用いて、重み付けしないUniFrac距離と重み付けするUniFrac距離の両方を用いて、分類学的組成に対するドナー種の同一性と実験時点（ストック、最初、最後）の影響を検出するために、パーミュテーショナル分散分析（PERMANOVA）を用いた。負の二項分布を持つ一般化線形混合効果モデル（GLMM）を用いて、希少化されていない実験サンプルの系統、科、属の相対存在量と、最終時点のみの系統、科、属の推定絶対存在量に対するドナー種の同一性の影響を調べた。GLMMはglmmTMB（v1.1.3）およびcar（v3.0.12）Rパッケージ[64, 65]を用いて実行し、科および属レベルのモデルはfdrtool（v1.2.16）Rパッケージ[66]を用いて偽発見率を補正した。すべての解析にRバージョン4.2.1を使用した。

メタゲノムライブラリーの調製、配列決定および解析
ライブラリーは、最終実験時点（上記参照）の DNA 抽出物から、NuGen Celero with Enzymatic Fragmentation キットを用いて、メーカーのプロトコールに従って構築した。ライブラリーをプールし、PippinPrepを用いて400-600 bpにサイズ選択し、Illumina NovaSeq SP 2×150プラットフォームでシーケンスした。シーケンシングはイリノイ大学シカゴ校のGenome Research Coreで行った。

生配列はKneadData (http://huttenhower.sph.harvard.edu/kneaddata)を用いてクオリティフィルターおよびトリミングした。分類学的および機能的プロファイリングにはHUMAnN2処理パイプラインを使用した[67]。得られた遺伝子ファミリーの表はKEGGオルソグループに再グループ化され、100万コピー/百万コピーに正規化され、層化された表と層化されていない表に分割された。パスウェイのアバンダンスの表は、層別化された表と層別化されていない表に分割された。Bray-Curtis および Jaccard 距離行列は、層別化されていない遺伝子ファミリーおよびパスウェイの存在量表から QIIME v.2-2019.10 で計算した。PERMANOVAは、Rのveganパッケージを使用して、Bray-Curtis距離とJaccard距離の両方を用いて、遺伝子ファミリーとパスウェイの組成に対するドナー種の同一性の影響を検出するために使用された。線形混合効果モデルは、遺伝子ファミリーとパスウェイの存在量表に対するドナー種の同一性の影響を調べるために使用され、lme4（v1.1-28）とcarパッケージを使用して実行された[68]。すべての解析に R バージョン 4.2.1 を使用した。

SCFA 代謝物の抽出と解析
SCFA は、最終時点でマウスから採取した糞便サンプルから抽出し、誘導体化した。すべてのサンプルで糞便ペレットを 1 個使用し、SCFA 分析は氷上で行った。サンプルはまず正確に秤量し（ほとんどのサンプルの秤量は20～35mg）、50%アセトニトリル（ACN）で1g：5mlの割合でホモジナイズし、5分間ボルテックスした。その後、サンプルを4000g、4℃で10分間遠心した。SCFA誘導体化には、40μlのサンプル上清を20μlの200mM 3-ニトロフェニルヒドラジン塩酸塩および20μlの120mM 1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩-6％ピリジン溶液と合わせ、サンプルを40℃で30分間反応させた。サンプルは、揮発によるサンプルの損失を防ぐために10% ACNで1mlに希釈し、イリノイ大学シカゴ校質量分析コアで液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS/MS）分析を行うまで-80℃で保存した。酢酸塩、酪酸塩、プロピオン酸塩、バレレート塩の濃度および相対的割合のドナー種グループ間の差は、一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用いて検定した。

肝臓サンプルの RNA 抽出、配列決定、および解析
マウスの肝臓サンプルは、すべてのサンプルについて、肝臓の同じ葉に組織パンチを使用して微小解剖した。解剖したマウス肝サンプルを秤量し、組織ホモジナイザー（Omni）を用いて0.7%β-メルカプトエタノールを含む250μlの溶解バッファー中で15～20秒間ホモジナイズした。溶解液を室温で5分間インキュベートし、KingFisher Flex（5400630 l Thermo Fisher Scientific）でRNA抽出を行い、メーカーのプロトコールに従ってDNaseステップを追加した（Thermo Fisher Scientific, MagMax Total RNA isolation kit, A27828）。RNA 品質は RNA 6000 Nano Assay with BioAnalyzer (Agilent) を用いて決定し、RNA 濃度は Quant-it RNA High Sensitivity assay kit (Thermo Fisher Scientific, Q33140)を用いて決定した。RNAサンプルは100 ng µl-1に正規化し、配列決定に供する前に-80℃で保存した。

抽出されたRNAサンプルは、テキサス大学オースティン校のゲノム配列解析施設（Genome Sequence and Analysis Facility）に提出され、タグベースのRNA配列決定が行われた。この方法は、ポリアデニル化転写産物の存在量を測定するために特別に設計されたコスト効率の高いアプローチであり、十分に注釈付けされたゲノムにおける遺伝子発現の差異解析のための信頼性の高いデータをもたらす[69]。ライブラリーは、Meyerら[70]とLohmanら[69]のプロトコルを改変して構築した（アップデートバージョンはMatz lab Github: https://github.com/z0on/tag-based_RNAseq/blob/master/TagSeq_sample_prep_june2019.docx）。リードはNovaSeq 6000 SR100で最小400万リード、サンプルあたりの目標リードは500万リードでシーケンスした。

Meyerら[70]およびLohmanら[69]に基づいて提供されたTagSeqデータ処理パイプライン（UT AustinのMatz labが保守; https://github.com/z0on/tag-based_RNAseq/blob/master/tagSeq_processing_README.txt）に従って生リードを処理し、遺伝子数データを得た。簡単に説明すると、FASTX-Toolkit（http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit）とCUTADAPT v. 2.8 [71]を利用してカスタマイズしたPerlスクリプトを使用して、'A'≧8塩基のホモポリマーランを持つリードを除去し、最小20塩基のリードを保持し、PCR重複を除去した。処理されたリードは、Bowtie2 [72]を用いてMusculus参照ゲノム（Ensembl release 99）にマッピングされた。

遺伝子発現の差分解析はR v 3.6.2 [73]のDESeq2を用いて行った。偽発見率は5%にコントロールした[74]。調整P値0.05およびlog 2fold change >1.5が、差次的発現遺伝子のカットオフ値として使用された。

MiMeNet解析のために、生の16S rRNAカウントはcentred log-ratio変換を用いて変換し、種間の比較にわたる差次的発現遺伝子の結合はDESeq2の分散安定化変換を用いて変換した。次に、変換されたマイクロバイオームと変換された遺伝子発現を入力としてMiMeNetを実行し、微生物と遺伝子の機能モジュールを得た（https://github.com/YDaiLab/MiMeNet）。RITANパッケージとReactomeパスウェイ[75]を用いて、MiMeNetで同定された各遺伝子モジュールに対して遺伝子セット濃縮解析を行った。MiMeNetはPython 3.7で実行し、遺伝子セット濃縮はRバージョン4.2.1で行った。

機能的遺伝子解析のために、生の遺伝子カウントをフィルタリングし、全サンプルにわたってカウント数が10未満の遺伝子を除去した。次に、DESeq2を用いて、3つの生物種をペアワイズで比較し、調整P値閾値0.05を用いて、差分遺伝子を同定した。遺伝子セット濃縮解析は、RITANパッケージとReactomeパスウェイを使用して、2より大きいか-2より小さいfold-change値を持つ各比較内の差分遺伝子に対して実行された。すべての解析とプロットはRバージョン4.2.1を用いて作成した。

生理学的測定と解析
アルカリホスファターゼ（ALP）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、トリグリセリド、コレステロール、高比重リポ蛋白、低比重リポ蛋白、脂肪血症の血中濃度は、標準的なアッセイを用いてIdexx社により評価された。肝グリコーゲン濃度を定量化するために、肝組織サンプルを、2mm生検パンチ（WP2020F、World Precision Instruments、Sarasota、FL）を用いてクライオスタットで解剖し、1mmジルコニア/シリコンビーズ（11 079 110z、BioSpec）を含む2mlのReinforced Microvials（2007, BioSpec Products, Inc.） 解剖した組織サンプルの重量を測定し [平均重量 (sd) = 16.8 (3.5)] 、ビーズビーター (607, BioSpec) を用いて 1 ml のアッセイバッファー中でホモジナイズした。サンプルを100℃のヒートブロック上で10分間煮沸し、酵素活性を失活させた後、18,000 r.p.m.、4℃で10分間遠心した。上清をアッセイバッファーで40倍に希釈した。希釈したホモジネートは、Glycogen Assay Kitのマニュアル（700 480, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI）に記載されているように処理した。ドナー種に対する各生理学的測定値の差は、分布に応じて、生データまたは変換データのいずれかを用いて一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用いて評価した。

資金提供情報
CIFAR
's 'Humans and the Microbiome' Fellowship（KRA）。サムスン奨学財団（WL）。

謝辞

Anthony PulvinoとYan Zengに感謝する。

著者貢献
概念化
： K.R.A.： K.R.A.、E.K.M.、B.L.、R.S.、G-.Y.Y.、Y.D.、J.P.C.、C.R.H.、E.R.L. 調査： K.R.A.、E.K.M.、S.K.、W.L.、D.R.、H.J.、S.C.、E.A.W.、L.D.M.、G-.Y.Y.、M.L.S.S.、S.G.、L.E.W.、C.R.H.、E.R.L. 可視化： K.R.A.、E.K.M.、D.R.、H.J.、E.A.W.、G-.Y.Y.、C.R.H.、C.W.K. 資金獲得： K.R.A.、R.S.、J.P.C.、C.R.H.およびE.R.L. プロジェクト管理： 監督：K.R.A： K.R.A.、E.K.M.、S.K.、R.S.、M.L.S.S.、S.G.、L.E.W.、Y.D.、J.P.C.、C.R.H.およびE.R.L. 執筆 - 原案： 執筆-校閲・編集：K.R.A.、E.K.M： K.R.A.、E.K.M.、S.K.、W.L.、D.R.、H.J.、S.C.、E.A.W.、B.L.、R.S.、L.D.M.、G-.Y.Y.、M.L.S.S.、S.G.、L.E.W.、Y.D、 J.P.C.、C.R.H.、E.R.L.、C.W.K.、K.R.A.

利益相反

著者らは
競合する利益がないことを宣言する。

倫理的声明

ヒトを対象とした研究プロトコルは、ノースウェスタン大学施設審査委員会（IRBプロトコル#STU00206091）の承認を得た。アカゲザルの糞便サンプルは、M.D. Anderson IACUC # 0000804-RN03「SPFアカゲザル繁殖および研究プログラムの確立と維持」、および重複するIACUC # 00001437-RN02「アカゲザルにおける慢性腸炎の予備的特徴づけおよび大腸がんの早期発見」の下で収集された。リスザルのサンプルはM.D. Anderson IACUC #00002148 -RN00の下で収集された。リスザルの腸内細菌叢の特性化」。すべてのマウス実験はノースウェスタン大学IACUC（#IS00006555）の承認を得た。

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