腎臓の微生物叢の異常は高血圧の発症に寄与する

哉百名

腸内細菌. 2022; 14(1): 2143220. オンライン公開 2022年11月12日 doi: 10.1080/19490976.2022.2143220
PMCID：PMC9662196PMID：36369946
腎臓の微生物叢の異常は高血圧の発症に寄与する
Xin-Yu Liu, a Jing Li, b , c , * Yamei Zhang, d , e , * Luyun Fan, b , * Yanli Xia, d , e , * Yongyang Wu, f , * Junru Chen, g , * Xinyu Zhao, a Qiannan Gao, b Bing Xu, h Chunlai Nie, a Zhengyu Li, i Aiping Tong, a Wenjie Wang, b , and Jun Cai b
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ABSTRACT
腸内細菌叢の異常は代謝症候群（例えば、高血圧）を促進する。しかし、高血圧の病態を促進し、治療介入の標的となり得るパターンは不明である。我々は、腸内細菌が腎臓に移動して高血圧を引き起こす可能性があると仮定した。我々は、腸内細菌が腎臓に移動して高血圧を引き起こすのではないかと考え、その経路を明らかにし、血圧の恒常性を維持する方法を探ることを目的とした。蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）および免疫蛍光染色、電子顕微鏡解析、細菌培養、種の同定、RNAシークエンスに基づくメタトランススクリプトミクスを組み合わせたアプローチにより、まず自然発症の高血圧ラット（SHR）、正常血圧のラット（WKY）、および高血圧患者の腎臓内に細菌が存在することを明らかにしました。移殖された腎臓細菌は、分泌型IgA（sIgA）で被覆されているか、L-フォームで休眠状態にあることが確認された。腸管移植後の無菌（GF）マウスの腎臓にはKlebsiella pneumoniae（K.pn）が確認され、腸内細菌の腎臓への流入が示唆された。腎臓の細菌分類とその機能は、高血圧と関連している。高血圧宿主は腎臓の病理学的細菌の豊富さを示し、その一部は消化管に由来するものであった。また、生きた微生物の移動に細菌性IgAプロテアーゼが不可欠な役割を担っていることも明らかにした。さらに、韃靼そばの食事介入により、血圧が低下し、腎臓の中核的な植物相-宿主生態系がほぼ正常な状態に調整された。腎臓における生菌および休眠菌のユニークなパターンは、非伝染性慢性疾患および循環代謝性疾患（高血圧など）の病態に洞察をもたらし、微生物相を標的とした新しい食事療法につながる可能性がある。

キーワード：腸内細菌叢トランスロケーション、腎臓微生物叢、細胞壁欠損菌、L型菌、sIgA被覆菌、IgAプロテアーゼ、細菌トランスロケーション、高血圧症、食事介入
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はじめに
高血圧は、非伝染性疾患および代謝症候群における管理可能な主要な心代謝性因子であり、公衆衛生上の大きな負担として、世界の成人人口の約30％に影響を与え、世界の死亡者の約19％に寄与しています1、2。重要な内分泌・代謝器官である腎臓は、高血圧障害3、4により深刻な影響を受け、高血圧の発症および持続に極めて重要な役割を演じています5。

高血圧患者における宿主-微生物叢のクロストークについては、動物を含む多くの研究が評価されている。しかし、レニン-アンジオテンシン系関連高血圧は、無菌（GF）動物モデルでは誘導できない7。高血圧患者からGF動物への糞便微生物叢移植は、血圧を上昇させる8。プロバイオティクスまたはプレバイオティクスを介して微生物叢を調節することにより、血圧レベルの上昇および高血圧による臓器の損傷が改善される9、10。腸内細菌叢の乱れは、血圧および腎機能の恒常性に寄与する。11 消化管などのバリア組織に通常生息する微生物に加え、胎盤12、脳13、炎症性サイトカインと関連する脂肪組織など、これまで無菌と考えられていた宿主臓器と組織でも細菌のシグナルが観察されている14。さらに、免疫排除に対する第一線の防御手段であるIgA被覆細菌17は、腸管外自己免疫疾患と関連している18。したがって、ヒトの内臓に生息する病気を引き起こす可能性のある細菌は、高血圧の発症に影響するが、環境汚染による細菌のシグナルは検出時に除外することができない。

腸内細菌は、哺乳類と共生するように適応し、全身的に腎臓の機能に影響を及ぼす。21 しかし、健康な魚の肝臓22および腎臓22,23には、腸内細菌が定着している。Wistar-Kyoto ラット (WKY) から派生した遺伝的素因による高血圧モデルである自然発症高血圧ラット (SHR) では、高血圧になる前の幼若期にも腸管バリア機能不全が現れる24。さらに、感染症を発症したショック患者から検出された微生物の大部分は、通常腸管に存在する一般細菌であり、脳卒中後の感染症における宿主細菌のトランスロケーションを示唆している25。したがって、腸内細菌叢が体内の他の臓器をコロニー化する可能性があり、これは高血圧腎微生物叢をよりよく理解する強い根拠となるものである。抗生物質、宿主の遺伝、環境など、常在微生物および病原性微生物の構成に影響を与える要因に加え26 、食事もヒト27 およびマウスのマイクロバイオームを迅速かつ繰り返し変化させることができる28。したがって、生きた細菌の腎臓への移行が高血圧と関連していると仮定した。厳密な実験処理によりコンタミを排除し、蛍光in situハイブリダイゼーション、免疫蛍光染色、電子顕微鏡、細菌移植、細菌培養、RNA-seqによるメタトランスクリプトームプロファイリングを用いて確認した。臓器や組織に潜在的に生息する可能性のある細菌の状態、分類、機能を特定濃度のL体、IgAコート形状を用いて検討した。さらに、腎臓細菌と宿主内のコロニー区画との相互作用、食事介入に対する反応を、BP調節とともに評価した。

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研究成果
異なる週齢の高血圧ラットおよび正常血圧ラットの腎臓における細菌検出
環境暴露による外因性細菌汚染を避けるため、検体を無菌バイオセーフティキャビネットに無菌的に移し、無菌状態で腎臓を解剖・固定化した。腎臓の解剖および固定は、無菌状態で行った。腎臓組織の解剖および固定の詳細な実験方法を Fig.S1 に示すが、以前の研究と同様である30。滅菌された試薬と同様に、滅菌された環境下での操作手順により、環境や溶媒による外来汚染を排除することができます。また、組織固定液は外来菌による汚染を防いでいます。さらに、細菌培養については、各手順が確立された基準に厳密に従った31。

WKYおよび高血圧モデル動物の腎臓検体中の細菌を可視化するために、免疫蛍光法を併用したユニバーサルプローブ（EUB338）を用いて蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を実施した。SHRとWKYの尿細管内および糸球体内では、細菌はバイオフィルム様の形態として分泌型IgA（sIgA）の分布と個別または同時に共局在した（図1a、S2a、およびS3a）。一方、同じサンプルのアリコートを、プローブnon-Eub338（非特異的結合を制御するためにEub338に相補的）と抗sIgA抗体なし（sIgA非特異的染色を制御するために）で並行して試験したところ、非特異的結合シグナルは認められなかった（図S3b）。菌塊を形成するバイオフィルムが頻繁に観察されるため、糸球体内の腎臓菌の定量は困難であった。そこで、菌塊の観察が少なかった腎臓尿細管内の菌の定量を行った。細菌細胞はWKYよりもSHRで大幅に多く見られた（図S4a）。高血圧患者の腎臓標本において、細菌とsIgAの共局在がFISHにより確認された（図2a,b）。興味深いことに、SHR腸内でもsIgAと局在した細菌が検出され（図S5a）、さらに透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて可視化した（図S5b-d）。これは、IgAで被覆された細菌が腸管バリアに侵入し17、18、病原性を低下させて侵入傾向を高めることによって腸外疾患を誘発するという最近の研究結果と一致している32。sIgAは、「免疫排除17」に対する第一線のファイアウォールとして報告されているが、コーティングされた細菌の病原性を助け、腸管外臓器内への細菌の移動と蓄積を可能にする可能性もある。

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図1.
腎組織内の生存可能な細菌。a, SHR腎尿細管または糸球体のパラフィン切片における細菌（EUB338）およびIgAを標的としたFISHプローブ。画像は、細菌、IgA、DAPIをそれぞれ赤、緑、青で示す。矢印は陽性染色を示す。b-d、SHRとWKYの腎組織のTEMは、間質細胞の細胞質内に細菌が存在することを示す。n = 15/グループ。e-g, 腎臓内の細菌構造のSEM。枠で囲んだ領域を高倍率で選択した。h, 腎臓を無菌的に採取し、ホモジナイズした後、TEMおよびin vitro培養に供した。j, SHR腎臓ホモジネートで4週間培養した寒天培地。n = 15/group. l, SHRとWKYから培養した腎臓菌のTEM。m, SHRとWKYの腎臓組織から培養した細菌の定量。CFU、コロニー形成単位。データは平均値±標準偏差で示した。***p < 0.001. n, 細菌の顕微鏡写真とSEMを示す。左：半固体TSA上での8ヶ月間の微生物培養、中：半固体TSA上での8ヶ月間の微生物培養、中：半固体TSA上での8ヶ月間の微生物培養。L 形態の「目玉焼き」コロニーを光学顕微鏡で観察、右。n = 15。 o, K.pnを経口投与したGFマウス（n = 16）の腎臓におけるK.pnを標的とした免疫電子顕微鏡の画像。両サンプル（左上および右上）は、K.pnを接種したGFレシピエントマウスの腎臓組織から採取したものである。K.pn control」は、K.pnに対する免疫電子顕微鏡用抗体のネガティブコントロールである。左上はK.pn抗体を用いた免疫電子顕微鏡観察、右上はコロイド金の陽性染色が検出されないが、細菌構造は標識されている。下は、ナイーブコントロールとして滅菌PBSバッファーを接種したGFマウスの腎臓組織を免疫電子顕微鏡で観察したもの（n = 19）。矢印はコロイド金、ミトコンドリオン、K.pn.を示す。

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図2.
高血圧患者の腎臓、糞便、血清試料から得られた細菌の形態的特徴。 a, b, 高血圧患者の腎皮質20×倍率（a）と髄質10×倍率（b）のパラフィン包埋切片における細菌（EUB338）とIgAのFISH画像。細菌、IgA、DAPIはそれぞれ赤、緑、青で表示されている。c, d, 高血圧患者の腎皮質（c）と髄質（d）のTEM解析により、細胞質内に細菌の形態が認められる。枠内は拡大表示。e, f, 腎皮質（e）および髄質（f）における細菌構造の代表的なSEM画像。ボックス領域が拡大されている。g, 腎臓組織の代表的なH&E染色．矢印は細菌の形態を示す。i, 高血圧患者から分離・培養した血清サンプルの細菌形態の代表的なTEM画像。矢印はL型細菌と不完全な細胞壁を持つ細菌を示す。スケールバーは大きさを示す。

腎臓の細菌をさらに特徴づけて同定するために、腎臓の標本をTEMおよび走査型電子顕微鏡（SEM）にかけた。SHRとWKYの尿細管と糸球体の間質細胞の細胞質内に細胞壁が損なわれた細菌構造がとらえられた（図1b-d）。観察された細菌の細胞壁は、曖昧、薄い、あるいは完全に欠損していた。細菌の形状や大きさは非常に多様で、一般細菌とはかなり異質であり、L型と呼ばれる細胞壁欠損細菌の可能性が指摘された。SEMにより、コッコイド構造がより鮮明に可視化された（図1e-g）。SHRがWKYと同程度の血圧を示す4週齢では、腎臓内に細菌構造を捕捉することができた。したがって、SHRでは血圧上昇以前から腎臓の細菌が検出可能であり、血圧変化の結果であることはありえない。高血圧患者の腎皮質および髄質における低悪性度炎症でも、細胞質内に同様の細菌形態が確認された（図2c-g）。また、高血圧動物や患者の糞便や血清中にもLフォームに類似した細菌が観察され、腸内細菌が腎臓に移行している可能性が示唆された（図2h、iおよび図S6a、b）。

腎臓内の生存可能なL型細菌
FISH、TEM、SEM解析で観察された細菌は、受動的バイスタンダーを経由して到達した場合は非生存性、腎臓内では生存性の生息と評価された。そこで、腎臓から生菌を培養により分離することを試みた。TEMにより、腎臓ホモジネート中の細菌は細胞壁の破壊を示した（図1h、i）。環境からのほぼすべての細菌は無傷の細胞壁を示したため、外来汚染の可能性は排除された。腎組織溶解液を用いた細菌培養を行い、SHRとWKYの腎組織から生菌を培養した（図1j-m）。一般に、細菌のコロニーは、細菌培養中の48-72時間に確認できる。興味深いことに、腎組織溶解液の細菌培養では、最初の3日間は細菌が検出されず、少なくとも7日かかってようやく小さな細菌のコロニーが出現した。このように増殖速度が極めて遅いことは、L型細菌の特徴と一致する。細菌培養と電子顕微鏡による観察から、腎臓組織内にL型細菌が存在することが判明した。SHRの腎臓組織を微生物培養したところ、有意に多くのコロニーが観察された（図1m）。偏性嫌気性菌や培養不可能な細菌を考慮すると、培養で細菌組成を正確に反映させることは困難であった。そこで、生菌の存在を証明するために、SHRの腎臓組織を代表とする細菌培養物について、サンガーシークエンシングを行った。回収された分離株の分類は、サンガーシークエンスによってStaphylococcus aureus (S.au) と同定されたが（図1k）、これは腎臓組織内の完全な細菌組成を正確に反映したものではない。環境細菌汚染はランダムであった。サンガーシークエンシング（図1k）により、環境からランダムに持ち込まれたとは考えられない特定の細菌が同定されました。したがって、腎臓組織における外因性の細菌汚染は除外された。

S. auの存在は、S. au特異的FISHプローブを用いてさらに確認され、sIgAと共局在化した（図S7a）。4週間培養後、分離した細菌コロニーを可視化すると、典型的なL字型形態として細胞壁の破壊が認められた（図1l）。目玉焼き型」L型コロニーを増殖させた8ヶ月間の長期培養と継代培養の結果、菌体はほぼ球状で、細胞壁を欠き、境界が曖昧であった（図1nおよび図S7b）。L形細菌は、細菌細胞壁を持つ正常な構造に戻ると増殖し、図1nのTEM画像では、細胞壁が損なわれた、不完全な、あるいは無傷の細菌が見られ、L形細菌の回復が進んでいることが示された。

L型細菌は、その不完全な細胞壁のために、有効な免疫応答に対して無害である。したがって、我々は、L型細菌が病原性を誘導する前に、免疫攻撃を活性化せずに腎臓に存在し、宿主と共存できると推測した16,33。L型細菌は、高血圧ラットと患者の両方の血清中からも検出され（図S6bおよび図2i）、常に腸外部位に生存し循環を介してトランスロケーションする可能性を実証した。さらに、これらの細菌構造を確認するために、腎臓内の菌株に特異的な免疫金染色を適用した。K.pnは、通常、肺や腸に寄生して病気を引き起こす日和見病原体です。近年、K.pnを標的としたファージが炎症性腸疾患を予防することが明らかになった34。高血圧患者では、K.pnの腸内細菌が非常に豊富である8。さらに、K.pnによる腸管上皮バリアの完全性の損傷と腸管透過性の向上35により、腸管外部位への漏出が起こる可能性も考えられる。そこで、K. pnを代表種として、腎臓における移行菌について検討した。K. pnをgnotobioticマウスに経口移植したところ、レシピエントマウスの腎臓組織内のK. pneumoniae染色が免疫電子顕微鏡で陽性であることが確認され（図1o）、gnotobioticマウスの腎臓に腸内K. pneumoniaeが流入している可能性も示唆された。K.pnはGFレシピエントマウスにおいて無処置のコントロールよりもはるかに高い収縮期血圧を誘発した36。我々は、腎臓の細菌がこれらの動物の膀胱および尿路に由来する外因性病原体を伴う腎盂腎炎または膀胱炎に関連している可能性を推測している。腎間質細胞内の比較的均一でバイオマスの少ない球状細菌を内在性細菌とし、外来性細菌は存在量や形態がランダムに異なり、細胞質には到達できないことを明らかにした。さらに、糸球体内の球状菌は経尿道感染から除外され、主に腎盂に菌叢が蓄積されることになる。SHRやWKYのような特異的病原体を持たない動物の腎臓内では、腸管が特異的な細菌源とはならない可能性があり、膀胱や尿管に由来する細菌の可能性を否定できなかった。

細菌IgAプロテアーゼの活性化により細菌の移動が促進される
sIgAコーティングは、標的とする微生物の病原性を抑制する37。sIgAは、微生物による虫歯菌の付着やコロニー形成を制限するために不可欠であるが、Escherichia coli（大腸菌）、S. aureus、Porphyromonas gingivalis（P.gingivalis）などの細菌由来の特定のプロテアーゼによって切断されることができる。 38 興味深いことに、高血圧動物の腎臓と腸の両方で大腸菌と黄色ブドウ球菌が検出され（図 3a-d）、SHR 腎臓内の大腸菌、黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌および P. gingivalis のプロファイルを観察した（図 3e-h ）。これらの細菌はIgAプロテアーゼを分泌する可能性があり、高血圧患者の腸内細菌叢から検出され（図3i-l）、PCRで増幅したP. gingivalis由来のIgAプロテアーゼ遺伝子がSHR腎組織でmRNAレベルで配列決定されて確認された（図3m）。このように、マクロファージはヒンジ領域を持たないIgA被覆株を識別できず、免疫反応が緩和される。細菌のIgAプロテアーゼは、宿主のIgAの一部を削除してマクロファージの検出を回避する鍵となり、最終的にIgA被覆細菌は腔を通過して循環系に到達し、宿主の臓器に付着することができる（図3n）。

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図3.
SHRおよびWKY腎組織内のIgA1プロテアーゼを分泌する可能性のある細菌。 a-d, SHRおよびWKYの腸および腎の回腸セグメントにおける大腸菌およびS.auのコロニー形成および分布は、大腸菌またはS.auを標的とする特異的抗体による染色によって決定された。e-h, SHRおよびWKY腎組織内のP. gingivalis, S. pneumoniae, S.au, E. coliの量的存在量。*p < 0.05, +p < 0.01, Wilcoxon rank-sum test. m, SHRの腎組織は、P. gingivalisのprtP加水分解IgAおよびIgGに特異的なプライマー対を用いてRT-PCRにより増幅し、cDNAフラグメントはSanger sequencingにより確認された。n, 大腸菌、S.au、P. gingivalis由来の特異的プロテアーゼで切断されたsIgAは、マクロファージに菌を送り込むことはできなかったが、臓器や組織には菌を移行させた。n = コントロール41、ステージ1高血圧のn = 56、ステージ2高血圧のn = 99。

腎臓における細菌プロファイリングと宿主トランスクリプトームシグネチャー
次に、これらの適応性細菌が選択的に宿主バリアを通過し、高血圧の素因を持つ腎臓で生存しているかどうかを評価した。腎臓に生息する微生物の分類と機能をRNA-seqベースのメタトランススクリプトミクスで解析し、宿主の腎臓遺伝子と微生物の関係の可能性を明らかにした。SHRとWKYの両方の腎臓組織で細菌が読み取られ、腎臓内の細菌の存在が示唆された（図4a-f）。腎臓の細菌遺伝子比率を定量したところ、SHRでは持続的な高血圧とともに有意に増加していた（図4aおよび表S1）。Bray-Curtis距離に基づく主座標分析（PCoA）により、SHRの細菌群集構造は、異なる年齢、特に持続的高血圧状態においてWKYのそれとは異なることが示された（図4b）。組成分析では、SHRとWKYの両方で、Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutesが最も優勢であった（図S8a）；これらの系統は、ヒトにおける優勢な腸内細菌系統でもある39。興味深いことに、腎臓細菌の7.5％以上（起源がわかっている細菌の約55％）が消化管特有の細菌叢に由来しており（図4c、図S9aおよび表S2）、これはK. pnの消化管からの細菌の移動に関する我々の観察（図1o）と一致する。

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図4.
a, 検出された全遺伝子における微生物遺伝子の割合。n = 5/グループ。 b, SHRとWKYのPCoAおよびANOSIM解析による種プロファイルに基づく。n = 5/group. c, 20週齢のSHRとWKYにおける腸または口腔に由来する腎臓微生物の割合。e, KEGGパスウェイ解析により決定された20週齢のSHRとWKYの間の有意に異なるKOのヒートマップ。これらは、ペルオキシソーム、葉酸生合成、クオラムセンシング、および2成分系を含んでいる。g, fの遺伝子とdの細菌の関連性。

さらに、SHRとWKYの腎臓分類群の差異を解析した。Alphaproteobacteriaのような、主に細胞内残留性を特徴とする腎臓種が、SHRとWKYを区別した（図4d、図S9b、c、表S3）。これらのうち、いくつかの細菌は腸に由来するものであった（図4d）。腎臓マイクロバイオームの機能解析は、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) データベースを用いて実施した。SHRとWKYの間で特定のKEGGパスウェイが異なり、膜結合型ペルオキシソーム、葉酸生合成、2成分系が関与しており（図4eおよび表S4）、バイオフィルム形成、食作用に対する耐性、局所環境適応、細菌増殖の可能性を表していた40。これらの特徴は、SHR腎臓の環境が長期持続性の可能性を持つ細菌を選択し、高血圧宿主における細菌病巣の蓄積を引き起こす可能性を示唆している。

腎臓微生物叢に対応する宿主の特徴を評価するために、RNA-seqデータから差次的に発現した腎臓遺伝子についてエンリッチメント解析を実施した。いくつかの宿主遺伝子は、SHRとWKYの間で識別された（図4fおよび図S10a〜c、および表S5）。主要な識別遺伝子は、得られた差分菌と相関していた（図4f,gおよび表S6）。具体的には、アラキドン酸代謝関連チトクロームP450ファミリー8サブファミリーBメンバー1（CYP8B1）などの心代謝疾患関連遺伝子は、SHRに濃縮されていた。さらに、SHRの遺伝子は、抗原処理および提示（例えば、RT1-M2）に関連して枯渇していた（図S10a-c、および表S7）。SHRもWKYも同じ環境と通常のチャウ食で制御されており、WKYとSHRの間で観察された異なる細菌群集構造は、その固有の遺伝的差異によって引き出されたものと考えられた。このように、宿主腎臓内の局所的な構成は、微生物に適応し、疾病に寄与する可能性がある。

食事介入により腎臓のコア微生物叢が回復し、血圧を低下させる
韃靼そば（TBW）は、高血圧の発生率が低いと報告されている中国のイ族集団の伝統的な主食であり41、中国集団の高血圧予防に利用されている42。TBW由来の2-HOBAは、高血圧症のマウスの血圧をほぼ正常に戻すことができ43、臨床試験において栄養補助食品としての安全性が検証されました（ClinicalTrials.gov番号：NCT03555682、NCT03176940、NCT03554096）。近年、TBWはその高品質な栄養成分、他の穀物との併用性、グルテンフリーの特性から注目されている44 。微生物叢に関する研究が急速に蓄積される中、TBWのプロバイオティクス/プレバイオティクス特性および微生物叢への効果が注目されている。したがって、TBWの宿主マイクロバイオームへの影響に関する研究は、動物モデルを用いた新しいものであり、有望である。我々は、SHRの腸内細菌叢45,46および宿主BPホメオスタシス47,48を調節するための候補食として、TBW（50%）とChenopodiumキヌア（50%）を含むTBWFを使用した。我々は、TBWF介入後のSHRの微生物組成とWKY対照のそれとの類似性を探ることを目的とした。腎臓の微生物分類群、機能、および差次的に発現する宿主遺伝子は、TBWF介入後に回復し、BPは調節された（図5a-g）。予想通り、SHRのBPレベルとIgA+細胞の割合の両方が、TBWF投与後に回復した（図5a,b）。Pielou指標の腎細菌α多様性は減少し、Bray-Curtis距離で示されるβ多様性は、SHRとTBWF投与SHRの間で顕著な分離が見られた（図5c）。BP減弱と相互作用するコア腎臓種を探索するために、WKY、SHR、TBWF処理SHRの細菌組成を調べた。WKYとSHRの腎臓マイクロバイオームシーケンスのデータ、およびTBWF食事介入によるマイクロバイオームの変化を統合し、これらの結果を結びつける共通項を見出した。SHRとWKYの間で差のある85種のうち、23種の腎臓細菌がTBWF介入によりSHRで有意に回復した（図5dおよび図S11a、b）。SHRにおけるペルオキシソーム、葉酸生合成、クオラムセンシング、および2成分系に関連する細菌機能も、TBWF食餌介入により修正された（図5eおよび図S11c）。心代謝疾患関連、Gタンパク質共役型受容体関連Olr1326遺伝子、および抗菌防御関連アリール炭化水素受容体経路CYP1A1などの宿主遺伝子の発現は、介入後に逆転した（図5f）。TBWF標的菌叢と遺伝子は、菌-遺伝子ネットワークに基づき有意な相関が見られた（図5g）。SHRとSHR+TBWFの食い違いは、環境、血圧低下、遺伝よりも食事が原因であると考えられた。SHRの血圧はTBWFの介入なしには減弱しないので、血圧の低下が直接微生物のシフトにつながるという考え方は除外した。TBWF食は、SHRの血圧を改善するのではなく、腸内細菌叢を変化させることで腎臓細菌に影響を与えることがわかった。TBWFによる食事介入は、腸内細菌叢の構成に影響を与え、その結果、腎臓組織に転移してくる細菌が少なくなり、腎臓内のコア微生物叢を再構築し、最終的に血圧を下げることが示唆されている。適応菌は宿主臓器に転移して生息し、宿主のトランスクリプトームと相互作用することで、血圧を調節していると考えられる。しかし、高血圧における腎臓の微生物叢の原因メカニズムは不明なままである。

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図5.
TBWF介入後のSHRにおいて腎微生物シグネチャーが一部回復した。 a, 40週におけるTBWF介入下のSHR（TBWF群、緑-黄、n＝5）およびSHRコントロール（赤、n＝5）の収縮期血圧（左）および拡張期血圧（右）の時間経過変化を非侵襲的テールカフにより測定した。+p < 0.01, Wilcoxon rank-sum test. b, 蛍光活性化セルソーティングに基づくTBWFグループとSHRコントロールのIgA+細胞のパーセンテージ. +c, 種レベルでの腎微生物プロファイルに基づくTBWF群とSHR対照群のPielou指数のα多様性とANOSIM分析（Bray-Curtis非類似度）. *d、WKYとは異なるSHRの上位19の腎臓細菌種の相対的存在量は、LEfSe、LDAスコア>2.0によって分析すると、TBWF介入を介して復元された。f、宿主転写プロファイルに基づき、SHRをWKYと区別し、TBWF介入により回復した13の腎臓遺伝子を示すヒートマップ。 n＝5／グループ。 g、dからの19の細菌種とfからの13の宿主遺伝子（黄色）との相関ネットワーク（赤線、正の相関；青線、負の相関）。種の色は細菌門を表す。ノードの色は、SHR（赤）とWKY（青）で濃縮されていることを示す。

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考察
無菌臓器内の細菌が潜在的に生理的および病理学的に促進することを示す証拠が増えつつある14,29,30,49-52 しかし、腸内細菌叢が健常者の肝臓、腎臓、その他の内臓に到達できるかどうかは、特に技術的課題のために、依然として議論の余地がある12,30。実験サンプルの環境への暴露、試薬、PCR、配列決定プロセス、方法論の機器などのさまざまな要因が、偽陽性の微生物シグナルにつながる可能性があります。したがって、私たちの実験では、すべての腎臓サンプルを採取し、無菌状態で固定し、RNA-seqを用いて分析しました。DNAベースのショットガン・メタゲノミクスではなく、RNAベースのメタ・トランススクリプトミクスを実施し、生存可能な微生物群およびその転写プロファイルを特定しました。損傷した細菌、生存していない細菌、または汚染されたDNAの存在を除外した。さらに、種および菌株レベルの配列解像度が達成されましたが、配列解像度の限界は、特に遺伝子転写によって提供される微生物遺伝子発現および相対的な細菌量の損失に関与し、そのため実際の細菌量から部分的に逸脱する可能性があります。さらに、腎臓組織において細胞内細菌をTEMで確認し、外部環境からの汚染の可能性を可能な限り排除した。このような複合的なアプローチにより、高血圧および正常血圧の腎臓、特に4週齢の高血圧予備軍（正常血圧）の自然発症ラットにおける生菌の存在を初めて明らかにし、高血圧に関連するその変化を説明することができました。これらの結果は、腎臓の微生物叢の異常が高血圧の結果ではなく、原因であることを示しています。

注目すべきは、sIgAでコートされた細菌が、バイオフィルム形態であっても、動物と高血圧患者の両方の腎臓組織内に存在することである。sIgAは一般に、侵入する病原体を排除し、粘膜常在菌を維持することによって感染に対するホスト免疫系の第一線の防衛手段である53。重要なことは、選択的にoutgrowingするIgAコーティングされた微生物は、遺伝的にも機能的にも、病原性因子は減少するが、マクロファージにおける接着性または浸潤性、複製能が増加する微生物の病型に類似していることである32。SHRおよびWKY腸内でもsIgAコーティングされた細菌が検出された。このように、sIgAコーティングは、抗体によって強化されたバイオフィルム形成を介して、細菌の臓器への定着や持続を補助する。また、高血圧動物の腎臓では、大腸菌54、S.au55、P. gingivalis38 などの病原性細菌が粘膜感染部位で IgA1 プロテアーゼを分泌することが確認された。通常マクロファージによって貪食されるsIgA被覆細菌とは異なり、我々の研究で高血圧患者に検出されたIgA1プロテアーゼを分泌する細菌は、ヒトIgA1の構造と機能を損傷し、IgA1ヒンジ領域の特定のペプチドを切断することによって、宿主IgA防御を停止させる可能性がある(56)。さらに、感染時のIgA1プロテアーゼやヒトIgA1に対するIgA1プロテアーゼの切断特異性によって示されるように、IgA構造は抗原性の不均一性に寄与する57。したがって、IgA1プロテアーゼは細菌の感染とコロニー形成を誘導する中核的な持続因子として関与していると考えられる。

近年、SHRにおける選択的IgA欠損が腸内細菌叢の異常に関連する宿主因子であることが証明された58。腸内細菌叢が乱れたSHRでは、細菌やウイルスなど多くの抗原を排除し、炎症を誘発せずに体内環境の安定を保つことができる血清IgAが測定された58。血清IgAと分泌型IgAに対する免疫応答は異なっており、分泌型IgAが腸内細菌叢の腸管外への移行に重要な役割を果たすことが知られている18,59。本研究で見出されたIgAプロテアーゼで消化された分泌型IgAの腎への移行と、以前に報告されたSHRにおける血清IgAの選択的欠乏58は、高血圧時に同様の結果をもたらすが、その基礎にあるメカニズムは全く異なる可能性があると推察された。これらの所見と高血圧の病態との相関の可能性については、さらなる調査が必要である。

L型は、環境に適応するために病原性を減弱させた特殊な細胞壁欠損菌の状態で活動し、β-ラクタム系などの壁活性型抗生物質に対する抵抗性を高めるとともに、再び病原性のある壁状態に切り替わる可能性がある33。自然免疫エフェクターであるリゾチーム16と抗生物質の乱用が相まって、L型への菌体転換を誘導し、高塩分や高血糖といった高血圧と同時に起こりうる高張状態60は、L型菌の持続的生存を促進することがある。今回、我々は、高血圧患者の腎臓（本来無菌と考えられている臓器）において、現場での炎症が限定された「休眠」状態のL型細菌をTEM、SEM、細菌培養、染色によって初めて観察し、L型状態が腎臓における細菌の持続性の潜在的要素であることを示している。このように、腸内細菌叢は、宿主防御機構であるIgAを利用して宿主の免疫フィルターを迂回するか、L-formのような適応的な細菌変態を経て腎臓に生息している可能性がある。

最近の研究では、脂肪組織、肝臓、脾臓、膵臓、脳など、かつては無菌と考えられていた臓器に細菌が転移してニッチを確立することが明らかになっている14,49-52,61。我々の知る限り、この研究は、ヒトおよび幼若を含む高血圧の動物モデルの腎臓に生存細菌がいることを初めて証明するものであった。細胞内残留性を特徴とするアルファプロテオバクテリアなどの微生物が、メタトランススクリプトームプロファイリングによって、高血圧動物の腎臓に生息していることが明らかにされた。高血圧が続くと、K. pneumoniaeのような微生物の割合が増え、病原体が蓄積することが観察されるが、これらはバイオフィルムの形成と持続に必要な能力を共有しており62、高BP表現型と相関があることが分かっている。興味深いことに、高血圧モデル動物では、臨床的な表現型に先立って腸壁の透過性の増加が見られ、成体げっ歯類では病理学的な腸の変化が生じる。21 腸-血管障壁は、微生物成分が全身循環に入るのを防ぐと考えられる。K. pnのGF動物への接種と腎臓検体の免疫金染色により、細菌が消化管から腎臓に移行することが確認された。

腸管抗原に特異的に結合するIgA産生細胞は、循環系や動脈硬化プラーク、脳などの腸管外臓器に到達する63,64。例えば、IgAを促進する常在菌は、腸管由来のIgA産生形質細胞を駆動し、神経炎症に対する保護や実験的自己免疫脳脊髄炎に対する抵抗性を引き出す65。一方、多発性硬化症患者の急性再発時に検出されるIgA結合性便中細菌の抑制もヒトでの論証を支持している65。さらに、IgAは粘膜界面の重要な調節因子として、腸内細菌表面抗原に反応し、特定の糞便微生物叢に結合し、多発性硬化症などの中枢神経系自己免疫疾患の活性化において免疫賦活能を発揮する66。本研究では、GF投与マウスの腎臓組織において分泌性IgAとK. pnが共局在化したことから、IgAを保有する腸内細菌が脳内に移行し、中枢神経系に影響を及ぼす可能性が示唆された。今後、K. pnのようなIgA被覆細菌の腸脳軸への影響を直接明らかにする研究が進めば、高血圧の病態をよりよく説明することができるようになると考えられる。

TBWFを介した腎臓細菌への介入により、腎臓の微生物叢の変化が宿主の血圧を調節することが明らかになったが、以下の理由から抗生物質は除外された。i）新生児および小児集団における抗生物質の広範な普及は、微生物の恒常性を乱し、有益な細菌を排除し68、代謝症候群の危険因子となりうる69、ii）抗生物質は、高血圧宿主腎臓における細菌の中心形態である細胞壁障害Lフォームを誘発する場合がある16、33、iii）腎臓の細胞内微生物、例えばアルファプロテオバクテリア菌は抗生物質に耐性となる場合がある、など。逆に、果物、野菜、全粒粉など、より複雑な炭水化物や高繊維質の食材の摂取が特徴的な、高血圧を止めるための食事療法（DASH）や地中海食などの食事処方は、心代謝系疾患の管理に有益である70。高繊維食と酢酸サプリメントは、DOCA食塩 高血圧モデルにおいて、血圧低下作用と心臓・腎臓保護 作用を示した10。したがって、早期の食事介入は、微生物生態系の回復と宿主のBPホメオスタシスの維持に役立つと考えられる。

しかし、DASH食は東洋の集団には適用できないため、本研究では採用しなかった70。その代わりに、中国南西部の四川省に住むイ族のコミュニティで行われているTBW食を用いた。この集団はメタボリックシンドロームの有病率がわずか2.4％である41。イ族は主に、ケルセチン、2-ヒドロキシベンジルアミン43、フラボノイド、オメガ3脂肪酸を豊富に含むTBWを食事で摂取しており、血圧を正常化し、心血管損傷から保護することができる73。ドイツ北部の最近の横断研究でも、フラボノイドを多く含む食品の摂取と収縮期血圧値との間に逆相関があり、この相関の15％以上を微生物因子が説明していた74。したがって、高血圧ラットへの介入としてTBWF栄養補助食品を用いると、血圧値および腎微生物-ホスト生態系の同時調節を行い、健康な対照者の値に近づけることができた。高血圧患者集団におけるTBWFの食事介入に関するさらなる調査が必要である。

本研究にはいくつかの限界がある。第一に、我々は本態性高血圧のSHRからのサンプルしか調べず、IgA被覆細菌またはL-フォームを発見したが、これは本態性高血圧患者からの生検サンプルで確認されたものであった。二次性高血圧のラットモデルでは、酢酸デオキシコルチコステロン（DOCA）-食塩高血圧ラットとDahl食塩感受性（SS）ラット（SSR）が未解明である。SSR は、高塩分食（環境因子）と遺伝因子の相互作用によって引き起こされる二次性高血圧の典型的なモデルである。高塩分食は必然的に消化管内の浸透圧を高くし、L-formsの転位とコロニー形成を助長する。同様に、本態性高血圧症もまた、食事などの環境的危険因子と相互作用する遺伝的要素によって特徴づけられる。遺伝的素因だけでは、現在信じられているほど大きな役割を果たせない可能性がある。腎臓のマイクロバイオームは、宿主の遺伝とは無関係に、両親から受け継がれる因子である可能性があります。第二に、血圧が正常な4週齢のSHRの腎臓から検出された生菌と、血圧を下げるために高血圧性腎臓細菌叢を再構築するTBWF介入に基づくデータは、腎臓の微生物叢異常が高血圧の結果ではなく、原因であることを示唆しています。しかし、高血圧の発生・発症を促進する菌種を確認することはできなかった。

本研究では、まず、高血圧と正常血圧の腎臓組織に生菌がコロニー形成していることを解明しました。これらの細菌は、L型またはIgAでコーティングされた形態を示し、免疫攻撃を受ける可能性は低いものの持続性が向上し、病原性のある状態に切り替わる可能性があるため、病原性が減弱している可能性が高い。腎臓細菌の分類とその機能を解析した結果、一部の腸内細菌は宿主の防御を容易に突破したり迂回したりして、病原性の低い利用可能なニッチに到達できることが明らかになった。マイクロバイオームは多くの生理的・病理的プロセスに影響を及ぼし、食事はこれらの微生物群集の構成と機能に大きく影響する重要な因子である。中国のイ族が伝統的に守ってきた食事であるTBWFによる食事介入は、宿主の血圧恒常性の維持、腸管バリアの保護、血圧および腎微生物生態系の調節を健康な対照群と同様に行うことができる。転座菌の宿主-免疫系のクロストークと腎性高血圧の病態におけるその役割、および高血圧集団の微生物生態系の回復と宿主のホメオスタシスにおけるTBWF食介入法の役割は、さらなる研究に値すると思われる。

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材料と方法
動物および倫理
SHラットおよびWKYラットは、Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd.から購入した。(Beijing, China)から購入し、特定の病原体を含まない条件下で個別に飼育した。SHRとWKYの腎臓と血液のサンプルは、4、20、40週目にバイオセーフティキャビネットで無菌的に採取された。GF C57BL/6 Lマウスは、上海生物科学研究所（SLAC Inc.、上海、中国）から入手し、gnotobiotic施設内で12時間の明暗サイクルの下で飼育した。すべてのマウスに無菌の餌と水を自由摂取させ、細菌汚染は便サンプルの定期的な検査によってモニターした。サンプルサイズは、類似の試験における過去の経験に基づいて決定され、図の凡例に示されている。SHRおよびGF C57BL/6 Lマウスは、必要に応じて異なる群に無作為に割り付けた。四川大学西中国病院動物飼育使用委員会が研究プロトコルを承認し、動物実験が動物倫理委員会のガイドラインに従って行われた。

SHRは正常血圧のWKYラットを繁殖させたもので、一般に高血圧の動物モデルでSHRをコントロールするために使用されている。本研究では、発育期のSHRとWKYラットの双方で腎臓内に生きた細菌を発見した。したがって、他のラット系統はSHRの陽性・陰性対照として不適当であると思われる。

臨床サンプル
本研究では、6匹の高血圧性腎生検が行われた。その人口統計学的特徴を表S8に示す。腎生検検体は、血液および糞便検体とともに病理組織学的分析に使用され、不破病院に入院した高血圧患者から採取されたものである。高血圧の診断は、2010年中国の高血圧管理ガイドラインに基づいて行った。75 過去8週間以内に抗生物質またはプロバイオティクス療法を受けていた人は除外した。倫理的な承認は、不破病院の施設倫理委員会から取得した。症例のデータ収集と分析は、中華人民共和国国家衛生委員会により、継続的な公衆衛生アウトブレイク調査の一部として要求された。参加者全員がインフォームドコンセントを提供した。

腎臓生検は、過去の報告に従って行われた76。腎臓専門医が、自動スプリングロード生検針（16ゲージ、Bard Magnum、Bard Biopsy Systems、米国）を用いて、超音波ガイド下で経皮的腎臓生検を実施した。腎生検は直ちに無菌手術室で採取し，新鮮な組織を分割して0.1 Mリン酸緩衝液中の4％緩衝ホルムアルデヒドおよび3％グルタルアルデヒド＋1％パラホルムアルデヒド中に入れた．ホルムアルデヒド固定した組織をパラフィンに包埋し，切片化し，ヘマトキシリン・エオシン（H&E）で染色した。TEM用組織（3％グルタルアルデヒド＋1％パラホルムアルデヒド、0.1Mリン酸緩衝液）はエポキシ樹脂に埋め込んで60nmの薄切片にし、透過電子顕微鏡（日本電子、北京、中国）で観察した。

生検当日に採取した血液サンプルを30分間遠心分離し、血漿・血清をプラスチックバイアルに入れた。バイアルは-80℃の冷凍庫で保存し、さらなる分析を待つこととした。新鮮な便サンプルを、無菌の糞尿収集器を用いて収集した。中間部分は、無菌の糞便サンプラーを使用して採取した。各便サンプルの約0.2gを滅菌遠心管で秤量し、新しい1.5mlエッペンドルフチューブに分注した。各サンプルは、使用時まで-80℃で20分間保存するために移された。

FISHと免疫蛍光染色の組み合わせ
腎臓内の細菌は、パラホルムアルデヒド固定した組織切片で確認した。SHR の小腸では病理学的変化が検出されているため、腸組織の回腸セグメントは腸の変化を評価するのに適していると考えら れた。パラフィン包埋組織を脱パラフィンし、ユニバーサル細菌プローブ（EUB338：5′-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′）、コントロールプローブ（非EUB838：5′-ACTCCTACGGAGGCAGC-3′）、または配列5′-S. aureus特異プローブにハイブリッド化した。aureusに特異的なプローブであり、配列は5′-GAAGCAAGCTTCTCGTCCG-3′であった。すべてのプローブは、Cy5蛍光体で標識され、Sangon Biotech Co. (中国、上海)から入手した。ハイブリダイゼーションは56℃で一晩行い、その後洗浄し、核色素である2-（4-Amidinophenyl）-6-indolecarbamidine dihydrochloride（DAPI）でカウンター染色を行った。FISHおよび免疫蛍光染色は、まず細菌FISHプローブで染色したスライドで行った。スライドをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄し、1％ウシ血清アルブミンで30分間ブロックし、抗sIgA抗体（Abcam、ab17921）とともに加湿器内で4℃、一晩インキュベートした。スライドはPBSで3回洗浄後、蛍光標識2次抗体と室温で30分間インキュベートした。組織はPBSで3回洗浄し、DAPIで対比染色した。

ヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色と免疫染色
組織は4％パラホルムアルデヒド（PFA）で4℃、一晩固定し、PBSで3回洗浄後、70％エタノールで保存した。組織はルーチンに処理され、パラフィン包埋、切片化され、四川大学の分子病理学コアを用いて染色された。組織は、脱パラフィンしたパラフィン包埋スライドを用いて免疫染色し、電子レンジで加熱したクエン酸バッファー（Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA）中でサンプルをインキュベートすることにより抗原賦活を行った。その後、ブロッキングバッファー（一次抗体の種類に応じて、PBS中の5％正常ヤギまたはマウス血清）中で室温で30分間インキュベートし、次の一次抗体のうちの1つとインキュベートした：抗IgA分泌成分抗体（Abcam、 ab212330）；抗Staphylococcus aureus (Abcam, ab20920). PBSで3回洗浄した後、組織サンプルを蛍光標識二次抗体とインキュベートし、その後DAPI核染色を行った。ビオチン化二次抗体を添加し、アビジン-ビオチン複合体による染色とヘマトキシリンによる対比染色を行った。

画像解析
明視野および蛍光画像は、Leica DM2000正立複合顕微鏡上のOptronics Microfire電荷結合素子カメラを用いて取得した。共焦点画像は、LSM 700（403油浸対物レンズ；Carl Zeiss）またはA1R（603/1.4油浸対物レンズ；Nikon）を用いて実施した。画像はZENソフトウェアまたはFUJI Image Jを用いて解析した。

走査型電子顕微鏡(SEM)
SEM解析のために、SHRおよびWKY腎臓を厳密に無菌状態で採取し（補足資料S1）、10％ホルマリンで24時間以上固定し、濃度の高いエタノール（30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％）中で脱水処理をした。脱水後，97% 1,1,1,3,3,3-hexamethyldisilazane 中 で乾燥するまでインキュベートした。サンプルは粘着テープでスタブにマウントし，金でメタライズした後，20 kVで作動するFEI Inspect顕微鏡（Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA）で分析した。

透過型電子顕微鏡 (TEM)
SHRおよびWKYラットの腎皮質、腎髄質、回腸腸管組織の1cm部分を無菌状態で切り出し（補足資料S1）、直ちに0.1Mカコジル酸ナトリウム三水和物中の3％グルタルアルデヒド、1％パラフォルムアルデヒド、5％スクロースの氷冷溶液で固定した。組織を4℃で1時間前固定し、0.1Mカコジル酸緩衝液中の5%スクロースを含むシャーレに移した。組織をメスで1-2 mm3 ブロックに切断し、細胞外凍結保護剤である10% Ficoll (70 kD, Sigma-Aldrich) を含むカコジル酸バッファーをあらかじめ注入した真鍮製のプランケットに入れた。余分なバッファーはWhatmanフィルターペーパーで除去し、サンプルはタイプBの真鍮製プランシェットで覆われた。サンプルはHPM-010高圧凍結機を用いて超急速凍結し、液体窒素下で直ちに2.5%四酸化オスミウムと0.05%酢酸ウラニルのアセトン中凍結液を含むクライオチューブ（Nunc社）に移された。このチューブを-100℃に予冷したAFS-2凍結置換機（ライカマイクロシステムズ社製）に装填した。固定液を除去し，30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%のアセトン系列で脱水し，100%アセトンで3回洗浄し，最後にエポキシ樹脂に埋没させた。超薄切片は，ウルトラミクロトーム（Leica）上のダイヤモンドナイフ（Diatome）を用いて切断し，酢酸ウランとクエン酸鉛で染色した。電子顕微鏡はJEOL JEM-1400Flash electron microscope (JEOL, Beijing, China) を用いて80 kVで記録した．

本研究では、環境汚染を避けるために厳格な無菌操作が行われ、短い実験期間中に外来菌が腎細胞細胞質内に侵入することができなかったため、腎細胞内細菌は外来菌ではなく内生菌であった。腎細胞の細胞質内の細菌を同定するために、腎細胞の細胞質内に細菌が認識されるまで切片を調査した。細菌細胞は形態に基づいて同定し、1サンプルにつき5つ以上の異なるフィールドを分析した。1匹のラット（SHRとWKYのそれぞれ15匹）あたり、腎皮質と髄質の約1mmをスキャンした。

免疫電子顕微鏡法
免疫電子顕微鏡法では、試料を4%パラホルムアルデヒドと0.5%グルタルアルデヒドで固定し、アセトンで脱水した後、エポキシ樹脂に包埋した。切片を切り出し，金またはニッケルグリッドに貼り付け，抗K. pn抗体（ab20947），次いで15nmの金ビーズに結合した二次抗体で染色し，酢酸ウラニルとクエン酸鉛で後染色を行った。電子顕微鏡写真は、80 kVで作動するJEOL JEM-1400Flash electron microscopeを使用して記録された。

バクテリアの培養と種の同定
31 簡潔に言えば、サンプルを無菌的に採取し、重量を測定し、直ちに Cell Strainer (BD Falcon, Cat 352350) に移して、1 ml の予め還元した（オートクレーブ滅菌、0.22 μm でろ過、真空脱ガスで酸素還元）PBS + 0.1% l-cysteine (Sigma-Aldrich, 168149) で手動ホモジナイザーで処理した。ホモジネート（プレートあたり100μl）をコロンビア血液寒天培地（Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co., Ltd.）にプレーティングし、嫌気的に培養した。好気性培養では、組織ホモジネートをトリプトン胆汁酸寒天培地（TBA）（Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech Co. プレートはパラフィルムで密封し、細菌培養装置で逆さに培養した。2日後（好気性）または5日後（嫌気性）に、2日ごとに細菌コロニーの形成を観察した。恒温恒湿下で最低4週間培養した後、コロニー形成単位（CFU）を定量化した。結果はCFU/g of tissueで表した。

寒天培地上に生育した代表的な細菌コロニーを滅菌ピペットチップで摘出し、さらに分析するまで-80℃で保存した。細菌コロニーを室温で解凍し、6μlの滅菌水に再懸濁し、95℃で10分間加熱して細菌を溶菌した。その後、12000rpmで10分間遠心分離し、2μlの上清を鋳型として、ユニバーサル16S rRNAプライマー（27 F, 5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′ and 1492 R, 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′ ）を用いて以下の反応条件でPCR法により16S rRNA遺伝子を増幅させた。94℃で4分間、次いで94℃で45秒間、55℃で45秒間、72℃で1分間、最後に72℃で10分間のサイクルを30回行った。増幅産物（10μL）を2μLのExoSAP-IT（Thermo Fisher, 78200.200.Ul）と共に37℃で15分間インキュベートし、続いて80℃で15分間2度目のインキュベーションを行った。このアンプリコンをキャピラリーシーケンス（Shanghai Sangon Biotech Co, Ltd.）で配列決定し、得られた配列を16SリボソームRNA配列データベースとBLASTで比較し、種の同定を行った。

K.pnの培養と移植
先行研究8,78では、正常血圧者と比較して高血圧者の腸管にK.pnが濃縮されており、本研究ではSHR腎臓にもK.pnが濃縮されていた。そこで、腸内細菌が腎臓に移行することを確認するために、K. pneumoniaeを移植した。K.pn（ATCCBAA-1144）はMicroBioLogics社（https://www.microbiologics.com）より購入した。K.pnは製造者の指示に従って培養し，滅菌PBSで2回洗浄した後，滅菌生理食塩水に109/mLの濃度で再懸濁し，経口摂取させた．GF C57BL/6 Lマウスは、中国医学科学院実験動物科学研究所および北京ユニオン医科大学比較医学センターのトレクスラー型フレキシブルフィルムアイソレーターで飼育した。GFマウスはKpnとPBSを投与する2群に無作為に分けた。すべてのマウスは、22±1℃、相対湿度50±1％、12/12時間明暗サイクルで飼育し、オートクレーブ滅菌した標準チャウ食を自由摂取させた。GFマウスには、〜109 CFU/mL K.pnを100μLずつ2日おきに経口ガベージで投与した。移植後、レシピエントマウスはgnotobiotic施設に収容し、8週間無菌食と水を与えた。gnotobiotic実験に使用されたすべての食品は、無菌性を確保するためにオートクレーブまたは放射線照射された。すべての動物実験とマウスの安楽死は、北京ユニオン医科大学のInstitutional Animal Careの規則とガイドラインを遵守し、AAALACとIACUCのガイドラインに従って実施された。

P. gingivalisのIgAプロテアーゼ遺伝子prtPの転写解析
高血圧性腎臓における細菌性IgAプロテアーゼ遺伝子のmRNAレベルでの存在を確認するために、以下のプライマーを用いた：prtP, forward 5′- CTACGGTAACGACGCTTCCAAC -3′, reverse 5′- CCTGAGCACGAGTACCACGAATG -3′ Sparing a 108-bp region of the P. Gingivalisporphainase, P. GINGIVALIS, P. GINGIVALIS, P. G. G. G. G. G. G. G.G.G.G.）（以下「GGGGG」）。gingivalisporphypain (prtP) 遺伝子転写物 (RefSeq: U42210.1); およびGAPDH (housekeeping gene), forward 5′-GGTGAAGGTCGAGTCAACGGA-3′ and 5′-GAGGGATCTCGCTCCTGGAAGA-3′ (Sangon Biotech) の3つである。TRIzol試薬（Invitrogen）を用いて腎組織から総RNAを抽出し、Agilent 2100 BioAnalyzerを用いてRNA品質を評価してから、製造者の指示書に従ってMaxima H Minus Mastermixを用いてcDNAに逆転写した（Thermo Fisher Scientific）。RNA（1μg）を、高容量cDNA逆転写キット（カタログ番号#4368814）を用いて、製造者の指示に従って一本鎖cDNAを合成するために使用した。この断片を逆転写PCR（RT-PCR）を用いて増幅した。PCR産物をアガロースゲル上で実行してアンプリコン発現を可視化し、QIAquick PCR精製キットを用いて精製し、その後、産物の定量とサンガーシークエンシングを行った。

患者におけるP. gingivalis, Streptococcus pneumoniae, S.au, E. coliの相対的存在量
私たちの以前の研究では、健常対照者 41 名、ステージ 1 高血圧患者 56 名、ステージ 2 高血圧患者 99 名のメタゲノム解析により糞便 DNA サンプルを配列決定し、注釈付き分類群の存在量を決定した8。

sIgA+ セルソーティング
SHRおよびTBWF処理SHRから得たIgA+形質細胞を、sIgAに特異的な一次抗体（ab 17921, Abcam, 1：100希釈）で4℃、30分間染色し、洗浄後Alexa Fluor 488（A-21206、Invitrogen、1：100希釈）と結合した抗マウス抗体と4℃、30分間インキュベートし、FACSCanto II（BD Biosciences）で収集した。データはFACSDivaソフトウェア（v.9.0）を用いて取り込み、FlowJoソフトウェア（v.10.7.1）を用いて解析した。

TBWF食餌介入
79 SHRの高血圧は、当初は明らかな器質的病変がなく、主に末梢血管抵抗の増加による血行動態の変化を伴って発症する。本態性高血圧に有用な降圧剤は、SHRでも有効である79。したがって、ヒトの本態性高血圧を研究し、降圧剤をスクリーニングするための理想的な動物モデルであると言える。本研究では、標準的な実験用チャウ食（Lab Diet 5012）と、TBW（50％）とChenopodium quinoa（50％）を含むTBWF食の2種類の食餌を使用した。11週齢のSHRを特定病原体不検出施設で1週間、標準的な実験用チャウ食に馴化させ、標準チャウ食群と食事介入群の2群に無作為に分けた。その後、実験群の食餌をTBWF食に変更し、対照群には通常のチャウ食を与えた。特に断りのない限り、すべての食餌は28週間にわたってアドリビタムを提供した。血圧は非侵襲的テールカフシステム（SoftronBP-98A; Softron, Tokyo, Japan）を用いて測定した。すべてのSHRs実験は、同じTBWFで少なくとも2回繰り返した。

RNAの分離
RNA単離は、Donaldsonによって以前に記述されたように行った。59 腎臓は、作業台上で厳密に無菌状態で新鮮に採取し（補足資料S1）、500μl緩衝液（0.2M NaClおよび20mM EDTA）、210μl 20％SDS、500μlフェノール、クロロホルムおよびイソアミルアルコール（Ambion AM9720）の混合液で直ちにビーズビートにより溶解させた。水相を遠心分離で分離し、新しいチューブに移し、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールで2回目の抽出を行った。その後、50μlの3M酢酸ナトリウムと500μlの冷エタノールを水性画分に混合し、20分間氷上に置いた。RNAをペレット化し、冷えた70%エタノールで1回洗浄し、100μlの水に再懸濁した。RNAはQiagen RNeasy Mini Kitを用い、製造者の説明書に従ってさらに精製した。DNAは、オンカラムのQiagen RNase-free DNase消化を含む2回目のQiagen RNeasyカラムにかける前に、37℃で1時間Turbo DNase (Ambion AM2238)を用いて除去した。

RNA配列決定（RNA-Seq）
腎臓組織を入手し、DNaseを含むRNeasyキット（Qiagen）を使用して全RNAを抽出した。RNAの分解、混入、DNAの混入は1.5%アガロースゲルでモニターした。RNA の濃度と純度は、NanoDrop 2000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) を用いて測定した。RNA の完全性は、Agilent Bioanalyzer 2100 System (Agilent Technologies, CA, USA) 上の RNA Nano 6000 Assay Kit を用いて評価した。RNA (サンプルあたり 1.5 μg) は、Ribo-Zero rRNA Removal Kit (Epicenter, Madison, WI, USA) を用いて rRNA を除去するための入力材料として使用された。NEBNextRUltraTM Directional RNA Library Prep Kit for IlluminaR (NEB, USA) を用いて、製造元の推奨に従ってシーケンスライブラリを作成し、インデックスコードを付加して各サンプルに配列を帰属させた。インデックスコードを付与されたサンプルは、TruSeq PE Cluster Kitv3-cBot-HS (Illumina) を用いて、acBot Cluster Generation System上でメーカーの指示に従ってクラスター化された。クラスタ生成後、ライブラリーをIllumina HiSeqプラットフォームで配列決定し、ペアエンドリードを生成した。

RNA-seq解析
Trimmomaticを用いた品質管理後、CLC Genomics Workbench（version 12.0.3, CLC Bio, Aarhus, Denmark）を用いて、高品質リードをラットゲノム（Rnor6.0）に対してマッピングし、RNA-Seq統計解析を実施した。RNA-Seq解析は、ラットゲノムを用いて、length fraction = 0.8, similarity fraction = 0.8, mismatch cost = 2, insertion cost = 3, and deletion cost = 3というパラメータで実施した。発現量はTranscripts per million (TPM)とした。遺伝子発現レベルを比較し、Log2 fold change (FC) の絶対値>2、FDR p-values<0.05 のカットオフで差次的発現遺伝子 (DEG) を同定するために差次的発現解析テストを使用した。DEGの機能的濃縮解析は、Rのcluster Profilerパッケージ（バージョン3.16.1）を用いて実施した。

RNA-seqデータにおけるバクテリアの検出
次世代シーケンサーのマッピングされていないリードは通常無視されるが、生物学的に関連する情報が含まれている。80 ヒトリードの計算による減算を行うアルゴリズム（例えば PathSeq81）を開発し、次にヒト参照ゲノム／トランスクリプトームおよび微生物参照ゲノム（細菌、ウイルス、古細菌、真菌の配列を含む）に残留リードのアライメントを行っている。これらのアラインメントにより、RNA-seqデータ中のリードを細菌、ウイルス、古細菌、真菌の配列に分類しました。さらに、SortMeRNA (Version 2.1b)85 を用いて、SILVA (Version 119)86 および Rfam (Version 14)87 rRNA データベースに対して small RNA を予測・除去しました。

分類学上の分類では、残りのリードを推定バクテリアmRNAリードとみなし、NCBI nrデータベースから構築したバクテリア、古細菌、ウイルス、真菌、微生物真核生物のタンパク質配列を含む「nr_euk」データセットに対してMEMモードでKaiju (Version 1.7.3)88 を使用してバクテリア存在量を予測するために使用された。種プロファイルに基づき、線形判別分析効果量（LEfSe）（バージョン1.0）89 を用いて、グループ間で有意に異なる種を同定した。ラット以外のDNAシーケンシングリードの分類に続き、90%以上の配列同一性と90%以上のクエリーカバレッジでマッピングされたリードを用いて、各細菌生物の相対存在量値を算出した。分類はドメイン、門、属、種の各レベルで行い、一意のアラインメントを必要としました（すなわち、複数の分類群に対して同等のE値を持つリードは解析から除外されました）。各生物の種レベルの相対存在度（RA）は、以下のように計算した：サンプル中の与えられた生物の相対存在度＝（ゲノム全体のユニークアラインメント位置の数×1,000,000）/（総アラインメント細菌リードの数×細菌ゲノムサイズ）。その後、各サンプルの相対的存在度の合計が1になるようにRA値を正規化した（相対的存在度の割合が100％の場合は100％）。

機能アノテーションのために、MEGAHIT (version 1.1.1-2-g02102e1)90 を用いて、既定のパラメータで細菌のリードをコンティグにde novoアセンブルした。遺伝子量を決定するために、リードを SOAP2 を用いて non-redundant gene catalog に再整列した。2本以上のリードがマップされている遺伝子のみをサンプルに存在するとみなした。遺伝子の存在量は、リードの数をカウントし、遺伝子長で正規化することで算出した。遺伝子の KEGG オルソログ (KO) は Ghost KOALA (Version 2.2) を用いてアノテーションした93 。KO abundance は同じフィーチャーにアノテーションされた遺伝子の abundance を合計して計算した。KOの存在量の差は、R（バージョン4.0.0）のWilcoxon rank-sum検定を用いて検定された。P値はBenjamini-Hochberg法を用いて多重検定で補正した。

統計解析
R (version 4.0.0, package "vegan") を用いて、種プロファイルからα-Diversity (標本内多様性) を推定した。グループ間のα-diversityの差の比較にはWilcoxon rank-sum検定を用いた。β多様性（標本間多様性）は、R（Version 4.0.0, package "vegan"）を用い、Bray-Curtis距離によって種プロファイルをもとに推定された。グループ間のβ多様性の差は、ANOSIM解析を用いて求めた。主座標分析（PCoA）はRパッケージ "vegan "を用いて行った。結果の可視化には、Rパッケージ "ggplot2 "を用いた。群間差の比較にはWilcoxon rank-sum testを用いた。参照ゲノムの分類情報は、NCBI分類学データベースから取得した。系統情報および種のプロファイルに基づき、種の出所を定義し、異なるグループの比率を算出した。CFUは、平均値±標準偏差で表した。統計解析は、GraphPad Prism version 8の独立t-testを使用して実施した。

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補足資料
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謝辞
TEMおよびSEM作業にご協力いただいた四川大学分析試験センターのQin Zou氏、Guiping Yuan氏、四川大学西中国基礎医学・法医学院のGuo Yang氏に感謝する。また、四川大学西中国病院のBingwen Zou教授のご支援に感謝いたします。

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資金提供の声明
本研究は、中国国家自然科学基金（Cai Jに81630014と81825002）、北京優秀青年科学者プログラム（Cai JにBJWZYJH01201910023029）、四川科学技術プログラム（Zhou Bに2017SZ0057、Liu XYに2020YFH0095）、西昌大学四川重点研究所開放資金（Liu XYにSZKF2104）による一部支援を得たものである。

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ディスクロージャーステートメント
著者による潜在的な利益相反は報告されていない。

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寄稿者
X.Y.L.がコンセプトとデザインを担当した。J.C.はこのコンセプトを開発した。X.Y.L.とJ.C.が本研究を監修した。X.Y.L.、Y.M.Z.、Y.L.X.、X.Y.Z.、B.X.、C.L.N、Z.Y.L、W.J.W、Y.Y.W、 Q.N.G. および A.P.T. は実験にあたった。J.L.、L.Y.F.、Y.Y.W.は臨床試料を採取した。J.R.C., J.L., L.Y.F., J.C., X.Y.L. がデータを解析し解釈した。J.C.、J.L.、L.Y.F.、X.Y.L.は、原稿を執筆した。すべての著者は原稿を検討し、その内容に同意している。

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データの利用可能性に関する声明
本研究のRNA-seqデータは、BioProject Accession Code PRJEB42560 [http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB42560]の下、European Nucleotide Archive (ENA) に寄託されています。

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補足資料
本論文の補足資料は、https://doi.org/10.1080/19490976.2022.2143220 からオンラインでアクセスできます。

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  29. このような場合、「臓器移植は、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行う前に、臓器移植を行ってください。Cell. 2022;185(8):1356-72 e26. doi: 10.1016/j.cell.2022.02.027. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

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