マウスの行動と免疫反応におけるストレス誘発性の変化と腸内ビロームの関連性

2024年2月6日 10:00

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出版：2024年2月5日
マウスの行動と免疫反応におけるストレス誘発性の変化と腸内ビロームの関連性

https://www.nature.com/articles/s41564-023-01564-y

ナサニエル・L・リッツ, ロレイン・A・ドレイパー, ...ジョン・F・クライアン著者一覧を見る
Nature Microbiology (2024)この記事を引用する

指標詳細

概要
微生物叢-腸-脳軸はストレス応答において重要な役割を果たすことが示されているが、これまでの研究では主にバクテリオームの役割に焦点が当てられてきた。腸内ビロームはマイクロバイオームの大部分を構成しており、バクテリオファージはバクテリオームの構造や活性をリモデリングする可能性がある。ここでは、慢性的な社会的ストレスのモデルマウスを用い、糞便中の16S rRNAおよび全メタゲノム配列決定法を用いて、ビロームがストレスによってどのように調節され、ストレスの影響にどのように寄与するかを明らかにする。その結果、慢性ストレスがマウスの行動、免疫、およびバクテリオームの変化を引き起こし、バクテリオファージクラスCaudoviricetesおよび未同定のウイルス分類群の変化と関連していることがわかった。これらの変化がストレスに関連した行動や生理学的結果と因果関係があるかどうかを調べるため、我々はストレス前のマウスから糞便ビロームの移植を行い、それを慢性的な社会的ストレスを受けているマウスに自家移植した。糞便ビロームの移植は、ストレスに関連した行動の後遺症を予防し、選択的な循環免疫細胞集団、サイトカイン放出、バクテリオームの変化、扁桃体における遺伝子発現におけるストレス誘発性の変化を回復させた。これらのデータは、ビロームがストレス時の微生物叢-腸-脳軸の調節に関与していることを示す証拠であり、将来、微生物叢指向の治療法をデザインする際には、これらのウイルス集団を考慮すべきであることを示している。

主な疾患
うつ病や不安障害などのストレス関連精神疾患は、世界中で生涯有病率が最も高い疾患のひとつであり、社会的負担が大きい1,2,3。したがって、慢性ストレスの生物学的影響を理解することは、ストレス関連疾患に対する新たな戦略を開発する上で重要な道である。脳と腸の相互作用がストレスに対する反応を制御している可能性を示唆する証拠が増えている4。同時に、腸内細菌叢（腸内に生息する細菌、ウイルス、古細菌、原生動物、真菌などの微生物群集）は、微生物叢-腸-脳軸を通じて、免疫系と神経系の発達と機能に影響を及ぼすことが示されている2,5。細菌は腸内の細胞微生物の大部分と代謝能力を占めており、ストレス応答を調節することが示されている6。あまり研究されていないが、バクテリオファージ（またはファージ）を主成分とする腸内ウイルスは細菌に感染し、増殖して溶菌したり、宿主ゲノムに組み込まれて細菌と一緒に複製したりする7,8。これらのファージは、微生物叢の構造と機能を調節し、微生物叢の多様性、安定性、回復力にコミュニティレベルで貢献することができる9。糞便濾過液から調製された糞便ビローム移植（FVT）は、大部分がウイルス（主にファージ）粒子で構成され、細胞性微生物を含まない。クロストリジウム・ディフィシル（Clostridioides difficile）感染症の臨床症状や、2型糖尿病、抗生物質誘発性微生物叢擾乱、壊死性腸炎、小腸細菌過剰増殖の前臨床モデルを改善するために、微生物叢に基づく治療法として用いられてきた10,11,12,13,14。

数多くのストレス関連疾患は、腸内細菌叢の変化と関連している15,16,17,18。また、大うつ病や全般性不安障害の患者からげっ歯類に細菌叢を移植すると、その表現型に関連した症状が移行するという証拠がある19,20,21。ビロームはバクテリオームの構成と密接に関連しているため9、宿主の環境や心理状態に応じて変化する18,22,23,24。最近では、Caudoviricetes属のファージが、種を超えて宿主の実行機能と関連していることから、微生物叢のウイルスが宿主の行動に影響を与えるという説が支持されている25。腸内細菌叢が注目され、現在研究が盛んに行われている一方で、ビロームが宿主細菌とどのように相互作用し、両者がどのように関連してストレスに関連した健康状態や疾病状態に影響を及ぼすのかという動的な関与については、ほとんど未解明である。ここでは、ストレスがビロームに与える影響を評価し、自家由来の（つまり、土着由来の）ビロームの移入が、マウスにおけるストレスに関連した行動、免疫、神経生物学的変化の発現を防ぐことができることを実証する。

結果
ビロームがストレスによってどのように調節されるのか、またビロームを活用してどのようにストレスの影響を防ぐことができるのか、ワークフローの概要をExtended Data Fig.

ビロームと腸脳軸はストレスによって調節される
まず、マウスに慢性的な社会的ストレス（慢性的な心理社会的敗北ストレス；すなわち、予測できない慢性的な社会的敗北と、過密状態の期間を含む単独飼育）を与え、対照マウスは同様に扱い、群飼いした。その後、ストレス対処行動、免疫調節、マイクロバイオーム組成を試験した（図1a）。慢性的な社会的ストレスがビロームとバクテリオーム構成に及ぼす影響を評価するため、ストレス負荷前（pre）と負荷後（post）の糞便ペレットについて、ウイルスメタゲノム配列決定と16S細菌リボソーム（r）RNA遺伝子配列決定を組み合わせた。糞便細菌叢のAitchison β多様性はストレスによって有意に変化した（図1b）。定性的には、ストレスはβダイバーシティレベルのビローム構成に顕著な影響を与えたが、プール群を用いたため、視覚的には明確に分離していたにもかかわらず、群間の傾向しか示さなかった（図1c）。ビローム解析では、十分な核酸含量を確保するため、n=10と9のグループ（それぞれCtrとストレス）をプールした。細菌とウイルスのα多様性指標はストレスの影響を受けなかった（図1d, e）。しかし、12種類のファージがストレスによって発現量が変化し、そのうち5種類はCaudoviricetesと同定された（図1f）。

図1：慢性的な心理社会的ストレスは、マイクロバイオーム、行動、生理、免疫に変化をもたらす。
図1
a,慢性的な心理社会的ストレスの実験タイムライン。 b,PERMANOVAで評価したところ、糞便細菌叢のアイチソンβ多様性はストレス（Stress）群とコントロール（Ctr）群で有意差があった（R2 = 0.1693、P < 0.01；Ctr n = 10、Stress n = 9）。c, PERMANOVAで評価したところ、プールされた糞便ビロームのAitchison β多様性には、ストレス群と対照群の間で差がある傾向がみられた（R2 = 0.3011, P = 0.1; Ctr n = 10 3検体プール, Stress n = 10 3検体プール）。d,e, バクテリオーム(d)(Ctr n = 9, Stress n = 9)またはビローム(e)のα多様性指標に差は見られなかった(Ctr n = 10, Stress n = 10, 3検体プール)。 f, クラス分類学的レベルで同定された対照群と比較したストレス群のファージ量の差; データは平均値±β推定値の95%信頼区間として示した(Ctr n = 10, Stress n = 10, 3検体プール)。g, 社会的相互作用試験(SIT)において、ストレスはCD1マウスとの相互作用ゾーンにいる時間の割合をCD1マウスのいない相互作用ゾーンにいる時間で割った値として、社会的相互作用を有意に減少させた(t(18) = 3.317, P < 0.01; Ctr n = 10, Stress n = 10)。h,FST試験において、動かずに過ごした時間で測定したストレス対処行動は、ストレスによって有意に増加した（t(18) = -4.946、P < 0.001；Ctrのn = 10、ストレスのn = 10）。 i,ストレスは、FSTの前に尾の傾き（TT）で採取した基礎血漿コルチコステロンを有意に増加させた（t(15. 68) = -2.224、P < 0.01；Ctrのn = 10、ストレスのn = 10）。 j, FST後45分に測定したコルチコステロンは、ストレス群で増加する傾向があった（t(18) = -2.077, P = 0.052; Ctr n = 10, Stress n = 10）。k,l,IL-6(k)とIL-10(l)の24時間試験管外ConA脾細胞刺激後の上清から採取した炎症性サイトカインの分析では、コントロールと比較してストレス群で有意な増加が認められた(それぞれt(18)=-2.316, P < 0.05; t(18)=-2.257, P < 0.05; Ctr n = 10, Stress n = 10)。d-lのデータは独立標本両側t検定を用いて比較した（*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001）。箱ひげ図として示されたデータは、最小値、第1四分位値、中央値、第3四分位値、最大値を示す。

フルサイズ画像
慢性的な社会的ストレスは、これまでのマウス研究26,27,28と同様に行動と免疫反応に影響を与えた。ストレス後、社会的相互作用行動は明らかに減少した（図1g）。ストレス受容群では、強制水泳試験（FST）における不動時間と、それに対応して基礎コルチコステロン濃度が増加し、FST後のコルチコステロン増加傾向も見られた（図1h-j）。さらに、コンカナバリンA（ConA）で刺激した脾臓細胞からの炎症性サイトカイン放出（IL-6とIL-10）が増加した（図1k,l）。これは、マウスの慢性社会的ストレス後によく見られる現象である（Extended Data Table 1a）29,30。ストレス後の脾臓細胞培養からの炎症性サイトカイン放出の増加は、以前から不安様行動29と関連しており、ConAによる刺激は、炎症を引き起こす可能性のある体液性免疫活性化を示している。

ストレス行動は糞便ビローム移植によって抑制される
慢性的な社会的ストレスが行動を変化させ、バクテリオームとビロームの集団構造を変化させるという観察結果を受け、次にビロームの介入によって微生物叢を調節し、ストレスに関連した行動の後遺症を改善できるかどうかを調べた。そのために、健康な非ストレスマウスから糞便を採取し、ウイルス画分を精製し、経口投与できるように調製した。次に、同じマウスを慢性的な社会的敗北ストレス（単独飼育時）に、自己糞便ビローム移植（FVT）の有無にかかわらずかけた。FVTの特異性は、微生物叢のクロスオーバーが起こると阻害されるため、共食いを防ぐためにストレスモデルの過密飼育期間を取り除いた。10日間のストレスおよび治療後、動物を行動検査に供し、社会的行動（社会的相互作用検査（SIT））、不安様行動（高架式十字迷路（EPM）検査）、ストレス対処行動（FST検査）を評価した。対照マウス（緩衝液経口投与）でもストレス行動表現型を確認し、さらに、運動行動（図2d）および不安様行動（図2e,f）の有意な改善に加えて、ストレスおよびFVT投与によるストレス誘発性社会調査欠損の回復効果（図2b,c）を見出した。強制水泳試験中の不動時間（ストレス対処行動の指標；図2g）には、ストレス効果は観察されなかった。これは、ストレス効果を処理するために、ストレスのない対照群に緩衝液を経口投与したためである。しかし、ストレス群では、基礎レベルとストレス後90分で、循環ストレスホルモン・コルチコステロンの増加が観察され、強制水泳試験ストレス因子に対する曲線下面積データで回復効果が見られた（図2h,i）。

図2：糞便ビローム移植はストレス関連行動を抑制する。
図2
a, 実験タイムライン。 b, SITテストにおいて、ストレスはCtrストレス群で社会的相互作用比を有意に減少させた（それぞれP < 0.05, q = 0.050, t(27) = 9.395, P < 0.01, P = 0.427、各群n = 10）。c, コーナーレシオはストレスにより有意に増加した（P < 0.05, q = 0.040, t(27) = 6.067, P < 0.05, P = 0.111；各群n = 10）。 d, 試験の馴化期における移動距離はストレスにより有意に減少し、FVT群では回復した（P < 0. 001, q = 0.023, t(27) = 17.761, P < 0.01, P < 0.01; n = 10/群). e, EPMテストにおいて、ストレスは開肘で過ごす時間の割合を有意に増加させ、FVTはこの効果を回復させた（P < 0. 01, q = 0.038, t(23) = 4.818, P < 0.05, P < 0.05; Ctr n = 10, Ctr Stress n = 7, FVT Stress n = 9). f, EPMオープンアームへの進入はストレス群で減少し、その後FVTによって回復する傾向がみられた（P < 0. 05, q = 0.050, t(23) = 7.254, P < 0.05, P = 0.071; Ctr n = 10, Ctr Stress n = 7, FVT Stress n = 9). g, FSTでは、影響は記録されなかった。 h, TTにより採取された血漿コルチコステロンは、FST開始から-5分（基礎）、+15分、+45分、+90分で測定され、データは平均値±sで示された。直交対比の後、Tukeyの両側一対事後検定で評価したところ、Ctrストレス群ではCtr群と比較して、FST開始後-5分および90分の時点でコルチコステロンが増加していた（P < 0. 05、t(16) = 2.673、P < 0.05、t(16) = 2.386、P < 0.05、それぞれ；Ctr n = 8、Ctr Stress n = 10、FVT Stress n = 9）。i, コルチコステロンの曲線下面積（AUC）は、ストレス群で増加し、次いでFVTによって減少する傾向がみられた（P < 0.05, q = 0.085, t(26) = 26.703, P < 0.05, P = 0.058; Ctr n = 8, Ctr Stress n = 10, FVT Stress n = 9）。b-gおよびiでは、計画直交対比に続いてTukeyのpost hoc検定（Ctr-Ctr StressおよびCtr Stress-FVT Stressの両側一対比較）およびBH-FDR調整を用いて回復効果を測定した。データは以下の順序で示した： P = 直交対比で測定した回復効果; q = BH-FDR調整P値; P = Tukeyのpost hoc検定。Ctr-CtrストレスおよびCtrストレス-FVTストレスについては、Tukeyの一対ごとのpost hoc P値を算出した。有意な効果は以下のように示される： *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, †q < 0.2。箱ひげ図として示されたデータは、最小値、第1四分位値、中央値、第3四分位値、最大値を示す。

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FVT植菌とビロームの特性解析
FVTは、ファージを主成分とする遊離ウイルス粒子を、その他の微生物叢や粒子状物質から抽出する技術である。ファージを使ってバクテリオームを標的にすることで、この治療は微生物叢-腸-脳軸を特異的に標的とし、生きた細胞微生物を除去するため、同等の糞便微生物叢移植よりも安全である。FVTは以前にも、別の供給源から得たファージでネズミのバクテリオームを特異的に標的にするために使われたことがある11,12,13,14。細菌宿主へのファージ感染は、ほとんどの場合、株レベルの精度に支配され、高度に特異的なターゲティングで構成されている。このことが、ファージオームの個体間変動性を高めている22,31,32,33。ファージ-宿主ペア間の適合性が高いため、理論的にバクテリオームメンバーの活性ファージ感染の確率が最も高くなることから、我々は自家FVTモデルを使用した。

FVTサンプルの画像を撮影し、FVT接種片に大きな微生物がいないことを確認した（図3aに代表的な画像を示す）。FVT溶液中で、1mlあたり約2.2×108個のウイルス様粒子を数えた（図3b）。さらに、FVT溶液をビロームシークエンシング（絶対量を計算するために、既知濃度の乳酸球菌ファージQ33をスパイクした）で特徴付け、約3.5×107個/mlのプラーク形成単位のウイルスを計数した。シークエンシングに基づくリード定量は、ウイルスコンティグを既知のウイルス遺伝子に一致させるという次世代シークエンシングライブラリー調製法の要件によって制限されるのに対し、エピ蛍光顕微鏡法は、核酸が結合すると蛍光を発するFVT接種サンプルのSYBR染色によって機能するため、検出方法によって不一致が説明できる。しかし、より大きな細胞性微生物の存在は、いずれのFVT接種試料の特性評価法でも検出されなかった。

図3：糞便ビローム移植のウイルス特性解析とレシピエントのマイクロバイオームへの影響。
図3
a, SYBR Goldで染色したFVT接種片からのウイルス様粒子の代表的な蛍光顕微鏡像（100倍）。この方法では他の微生物は観察されず、各FVT接種片についてウイルス数を評価した（FVTストレス n = 9）。定量化のために、スライドのあらかじめ定義された四分画でサンプルごとに4枚の代表画像を撮影し、平均カウントを用いてサンプルごとのウイルス様粒子の総数を算出した。 b, Q33乳酸球菌ファージスパイクを用いたエピ蛍光顕微鏡法（黒）とシークエンシングリード（灰色）を用いて算出したウイルス様粒子の絶対カウント（FVTストレス n = 9）。d, 線形混合効果モデル（Ctr n = 10, Ctr Stress n = 8, FVT Stress n = 9）で評価した、ストレスによって影響を受け、FVT試験によって回復した細菌種の差の縦断的測定。e,試験終了時に分析されたFVTストレス群のFVT接種液中に存在する予測されるファージ-宿主ペアと糞便細菌叢（FVTストレス n = 9）。

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FVT調製物には様々なファージが存在し、ほとんどの場合、CaudoviricetesクラスとMicroviridaeファミリーのメンバーで占められていたが、ウイルス集団の大部分は現在未同定である（図3c）。ストレスによって変化したが、FVTを実施すると回復した細菌種が20種あった。15種の細菌がストレスによって減少し、FVTによって保護され、5種の細菌がストレスによって増加し、FVTによって減少した（図3dおよびExtended Data図3a）。バクテリオームでは個々の細菌種に違いがみられたが、バクテリオームやビロームではα-およびβ-多様性の指標に変化はみられなかった（Extended Data Fig.

FVT経口ガベージ製剤はビロームの配列決定を受け、ウイルスインプットの特徴が明らかになった。現在利用可能なバクテリオファージコミュニティーを網羅するウイルスデータベースの包括的なコレクションを用いて、ウイルス宿主ペアを予測した。しかし、これらのツールは、バクテリオファージビロームの膨大な未知の部分によってまだ制限されている31。したがって、我々のバクテリオファージ配列決定データには、予測宿主を持つファージコンティグのごく一部が含まれている。FVT接種菌の予測宿主は、門、目、科レベルで報告されている（Extended Data Fig.） Deferribacterota門とBacteroidota門（以前はBacteroidetes門）を標的とするファージが最も多く、Bacillota門（以前はFirmicutes門）がそれに続き、Pseudomonadota門（以前はProteobacteria門）とHalobacteriota門はそれほど多くなかった。最も一般的なファージは、Deferribacterales目、Bacteroidales目、Lachnospirales目、Lactobacillales目、Oscillospirales目を対象としていました。最後に、最も一般的なファージは、ムキスピリル科、バクテロイド科、エリプシペロトリッチ科、ラクナ科、ムリバキュラ科、OLB10科、ストレプトコッカス科を対象としていた。しかし、ネズミのマイクロバイオームにおけるファージ-宿主ペアの大部分は未知である。

次に、FVT調製物から得られたファージホスト対を、ストレスによって影響を受け、FVTによって回復した、（糞便バクテリオーム配列決定データから得られた）異常に豊富な分類群と相互参照した。異常に豊富な細菌種と重なる同定されたウイルス分類群は、門レベルで予測されるファージ宿主とともに描かれた（図3e）。門レベルでは、予測されたファージ宿主ペアには、20種の異なる細菌種のうち18種が含まれていた。シュードモナドータ（Pseudomonadota）6組、バシロータ（Bacillota）6組、バクテロイーダ（Bacteroidota）3組、そしてベルーコミクロビオータ（Verrucomicrobiota）、アクチノバクテリオータ（Actinobacteria）、シアノバクテリア（Cyanobacteria）各1組であった。目レベルでは、Burkholderialesが2組、Erysipelotrichalesが1組、Bacteroidalesが1組あった。科レベルでは、LachnospiraceaeとErysipelotrichaeceaeのペアが1組あった。この証拠から、FVTによるバクテリオーム調節が、ファージによるストレス治療の回復効果を助けたことが裏付けられた。腸内におけるファージ感染は圧倒的に温和であることから、ファージ-宿主ペアの結合は、環境条件によって溶菌性または溶原性である可能性があり、その結果、宿主細菌の増殖に直接的および／または間接的な影響を及ぼす可能性がある9,34。ファージ-細菌の連鎖的相互作用は、相関ファージ-宿主ネットワークプロットとして示されている（Extended Data Fig.5）。描かれたすべてのファージ-細菌相関は有意な関連を示し（q < 0.1）、特にCaudoviricetes 48-Geofilum rubicundum、未同定クラス38-Kriegella aquimaris、未同定クラス38-Odoribacter splanchnicusは、ストレスおよびFVT処理後に有意な回復効果を示した（P < 0.05）。

発現量の異なる Pseudomonadota 分類群全体で、個々の種はストレスと比較して FVT 後に発現量が増加し（Advenella mimigardefordensis、αプロテオバクテリウム AAP38、Archangium gephyra、Nitrosomonas aestuarii、Paraburkholderia kururiensis、Sinorhizobium medicae）、FVT が正の調節因子であることを示した。5つのBacillota分類群が存在量の増加を示した（Bacillus aurantiacus、Bacillus campisalis、Butyrivibrio sp. WCD3002、Cohnella laeviribosiおよびErysipelotrichaeceae菌NK3D112）。逆に、Bacteroidota属の1種（Paludibacter sp.47-17、Pontibacter akesuensis、Thermonema rossianum）はFVT後に存在量が減少し、Bacillota属の1種（Paenibacillus sp.1-49）および藍藻類の1種（Oscillatoria sp. PCC 10802）も減少したことから、これらのケースではFVTが負の調節因子であることが示された。これらの変化は、ストレス調節とFVT処理による保護または軽減に起因している。このデータは、ファージ-宿主ペアが存在し、我々の実験パラメーター内でストレス対処行動の減衰に潜在的に関与していることを示す証拠となる。

異なる処理後のFVT接種株とバクテリオームの機能的可能性を評価するために、腸-脳モジュール（GBM）と腸-代謝モジュール（GMM）を特徴付けた35,36。FVT inoculaのウイルスリードでは、3つのGBMと10のGMMが同定された（Extended Data Fig.）興味深いことに、S-アデノシルメチオニン合成能は各FVT接種菌で認められ、ストレスおよびFVT後にバクテリオームGBMで有意に回復した。S-アデノシルメチオニンは、モノアミン神経伝達物質37,38,39,40の合成や代謝など、微生物叢内でもさまざまな組織全体でも、多数の生化学的経路で役割を果たしている。また、バクテリオームにおけるFVTによるGBMとGMMの存在量の回復も評価したが、偽発見率調整後に統計的に有意なモジュールは見つからなかった（拡張データ表2および3）。

ストレス誘発性の炎症と免疫はFVTによって保護される
ストレスによって誘発された免疫細胞集団と炎症性サイトカインの変化から、ストレス対処行動が長時間の免疫活性化によって影響を受けたという証拠が得られた。末梢免疫細胞やサイトカインは、ストレスや炎症によって変化することが知られており、これはマウスモデルにおける不安様行動の増加と関連している41,42,43。さらに、ストレスとコルチコステロンの両方が免疫細胞の再分布を誘導し、骨髄系細胞がリザーバー（骨髄、脾臓など）から移動して、脳のような免疫優位組織の監視と保護を促進する44,45,46。末梢血の免疫表現型を特徴付けると、炎症性単球と好中球の集団はストレスによって減少し、FVTによって改善することがわかった（図4a,b）。興味深いことに、FVTを受けた群に存在する単球はCD62リガンドを強く発現していた（図4c）。血漿中で測定されたケモカイン（IP-10）および脾臓細胞培養における一連の炎症性サイトカイン（TNF-α、IL-6、IL-12）は、ストレスによって上昇し、FVTによって減少したことから、治療の回復効果が示された（図4d-fおよび拡張データ表1b,c）。

図4：免疫活性化と炎症に対するFVTの効果。
図4
a, ストレスによって減少し、FVTによって回復した相対的LY6Chi単球の回復効果があった（回復効果P < 0.01, BH-FDR調整P値 q = 0.030, t(26) = -2. 867, Tukeyの一対比較 P < 0.05, P = 0.106, それぞれ; Ctr n = 10, Ctr Stress n = 10, FVT Stress n = 9). b, ストレスによって減少し、FVTによって改善した相対好中球の回復効果があった（P < 0.01, q = 0.030, t(25) = -2.788, P < 0. 05, P = 0.231; Ctr n = 10, Ctr Stress n = 9, FVT Stress n = 9). c, CD62-リガンドを持つLY6Chi単球の回復効果があり、ストレスでは影響を受けなかったが、FVTでは強く増加した（P < 0.05, q = 0.030, t(26) = -3.18, P = 0.845, P < 0. 001; Ctr n = 10, Ctr Stress n = 10, FVT Stress n = 9)。d, 血漿中の炎症性サイトカインを測定したところ、血漿中のIP-10はストレスによって増加し、FVTによって減少するという回復効果が見られた（P < 0.05, q = 0.075, t(23) = 2.828, P = 0.054, P = 0.070; Ctr n = 9, Ctr Stress n = 10, FVT Stress n = 7)。炎症性サイトカインは、未刺激の脾臓細胞培養上清およびConAまたはLPSで刺激した培養液でも測定した。e,f, TNF-α（P＜0.05、q＝0.075、t(23)＝2.68、P＝0.086、P＝0.056；Ctr n＝9、Ctr Stress n＝8、FVT Stress n＝9）、IL-12/IL-23p40（P＜0. 05, q = 0.075, t(24) = 2.634, P = 0.079, P = 0.068; Ctr n = 10, Ctr Stress n = 8, FVT Stress n = 9）、IL-6（P < 0.05, q = 0.010, t(22) = 2.328, P = 0.162, P = 0. 091; Ctr n = 9, Ctr Stress n = 6, FVT Stress n = 9）（e）；および脾細胞のIL-6 ConA刺激（f）（P < 0.05, q = 0.076, t(24) = 2.517, P = 0.24, P < 0.05; Ctr n = 10, Ctr Stress n = 8, FVT Stress n = 9）。a-fにおいて、復元効果は、計画的直交対比の後、Tukeyのpost hoc検定（Ctr-Ctr StressおよびCtr Stress-FVT Stressの両側一対比較）とBH-FDR調整を用いて測定した。データは以下の順序で示した： P = 直交対比で測定した回復効果; q = BH-FDR調整P値; P = Tukeyのpost hoc検定。Tukey's pairwise post hoc P values were calculated for Ctr-Ctr Stress and Ctr Stress-FVT Stress. 箱ひげ図として示されたデータは、最小値、第1四分位値、中央値、第3四分位値、最大値を示す。有意な影響は以下のように示される： *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, †q < 0.2。

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FVTは海馬と扁桃体の遺伝子発現を回復させる
最後に、FVTが不安とストレス対処を支える脳回路にも影響を与える可能性があることを確認するため、全動物の海馬と扁桃体でディープRNAシークエンシングを行った。これらのストレスに敏感な脳領域は、これらの領域がストレスに弱く、微生物叢48,49,50による調節に反応することを示した先行研究に基づいて選択した。ストレスによって影響を受け、FVTによって回復した遺伝子から、特にストレス、社会的行動、ビローム、微生物叢-腸-脳軸に直接関与する機能をターゲットとして、上位に濃縮されたジーンオントロジー（GO）51項を選択した。これらのGO用語は、恐怖反応、免疫系プロセス、神経伝達物質レベル調節、シナプス後神経伝達物質受容体機能、ストレス反応、社会的行動、ウイルスプロセスに関連する遺伝子で構成されている。

海馬では免疫系プロセスが有意に増加し、扁桃体ではすべてのGO用語が有意に増加した（図5a）。この所見は、ストレスやFVT治療によって観察された行動の変化と一致し、脳内の領域反応に差があることを示す証拠となる。興味深いことに、ストレスによって影響を受け、FVTによって回復した扁桃体遺伝子（4,852個）は、ダウンレギュレーション（19個）よりもむしろアップレギュレーション（4,833個）が多かった（図5b,d）。海馬の遺伝子は、ストレスによって正に調節された遺伝子と負に調節された遺伝子がほぼ同数（441個）存在し、233個の遺伝子がアップレギュレートされ、208個の遺伝子がダウンレギュレートされた（図5c,e）。このことは、ストレスとFVT治療が神経遺伝子発現に影響を与えるメカニズムが、扁桃体において特に敏感であることを示している。

図5：扁桃体と海馬のトランスクリプトーム標的遺伝子オントロジー。
図5
扁桃体と海馬の脳領域は、ストレスによって変化し、FVTによって回復した遺伝子（回復効果）のディープ・トランスクリプトーム解析のために選択された。a, 海馬（紫）と扁桃体（緑）で回復した遺伝子における機能濃縮のストレス、社会的行動、微生物叢-腸-脳軸標的遺伝子オントロジー（Ctr n = 10, Ctr Stress n = 8, FVT Stress n = 9; 有意効果は*P < 0.001で示す）。 b,cは、扁桃体（b）（4,852遺伝子；4,833個が発現上昇、19個が発現下降）および海馬（c）（441遺伝子；223個が発現上昇、208個が発現下降）において、ストレスによって最も有意に影響を受け、FVTによって回復した遺伝子を示すボルケーノプロット（Ctr n = 10, Ctr Stress n = 8, FVT Stress n = 9）。d,eは、扁桃体（d）と海馬（e）で最も有意に回復した遺伝子を示すヒートプロット。差次発現遺伝子オントロジークラスターと個々の遺伝子は、線形モデルに続いてStoreyのFDRで評価した。

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考察
消化管ビロームは、細菌群集の構造や機能を調節する可能性のある、ほとんどが分類されていないバクテリオファージの膨大かつ多様な集団から構成されている9,31。我々の研究は、ストレスがビロームの構成に及ぼす寛容な影響を示しており、バクテリオームを標的とすることでストレス関連の後遺症を軽減できる可能性がある。まず、慢性的な社会的ストレスが腸内細菌叢とウイルス叢の両方に影響を及ぼし、さらにマウスのストレス対処行動と免疫機能の障害を誘発することが示された。これらの知見は、以前に報告されたストレス行動の表現型と一致する6。興味深いことに、ストレスは糞便サンプル中のバクテリオームとビロームのβ多様性の対照からの距離を増加させた。これらのデータは、ストレスに関連した行動と腸内細菌叢およびウイルス叢との間に潜在的な関連があることを浮き彫りにした。このことから、もしビロームがストレスの影響に対して寛容であれば、ビロームを標的にしてストレスの影響を軽減できるはずだという仮説を追求することになった。

私たちは、微生物叢を介したメカニズムにより、自己由来のFVTがストレス対処行動に対する防御効果を引き出せることを発見した。慢性的な社会的ストレスの後、FVTを投与すると、社会的相互作用試験における社会的尺度が改善し、ストレスを受けた動物で観察される運動機能障害が完全に予防された。高架式プラス迷路の滞在時間とオープンアームへの進入回数で測定される不安様行動も同様に、ストレスの影響と比較してFVTによって抑制された。さらに、急性ストレスに対する慢性ストレスおよびFVT治療後の循環コルチコステロンのストレス誘発性上昇の回復効果が見られた。これらの所見から、強制水泳試験で測定された不動時間に差は観察されなかったにもかかわらず、慢性的な社会的ストレスによる過去の報告と同様に、測定可能なストレス行動反応があったことが示された28,29。以上のことから、FVTを投与した動物では、ストレス後に不安様行動の減少、探索行動の改善、ストレス対処の減弱が認められた。

バクテリオームとビロームに対するFVTの影響は、メタゲノム解析とビローム解析を組み合わせて評価した。これらの関連細菌分類群は、これまで慢性的な社会的ストレスや微生物叢-腸-脳軸の観点から、種レベルで記述されていなかった。しかし、16S rRNA遺伝子の塩基配列決定によってより一般的に特徴付けられている共有属は、いくつかの興味深い背景を提供している。バチルス属のメンバーは、社会的攻撃性の防止、神経細胞死の緩和、健康増進に関連している52,53,54。さらに、バチルス属の1種は、高脂肪食誘発性の社会性障害、不安様行動、海馬の酸化ストレス、炎症を抑制することがわかった55。ブチリビブリオ属は、微生物叢-腸-脳軸にわたって多様な役割を果たす重要な短鎖脂肪酸産物である酪酸の一般的な生産者である56,57。エリシペロトリカス科は、評価された全てのレベルでファージ-宿主ペアが確認され、ストレスやFVTの後に存在量が異なることが判明し、炎症性腸疾患、代謝障害、経腸栄養に関連している58。このファミリーはクローン病59,60の再発性または炎症性疾患の患者で減少していることが示されており、胆汁酸塩代謝に関与する重要な分類群である61。しかし、うどんこ病菌が感染時に炎症を引き起こすという証拠もある62,63。ニトロソモナス属とニトロスピラ属は、腸内の窒素循環に関与し、アンモニアの酸化を助ける。アンモニアが高濃度になると、成長低下や免疫機能障害64,65と関連し、海馬のシナプス伝達を阻害する66。興味深いことに、パエニバチルスは様々な抗菌剤や殺虫剤を生産する。この微生物はストレス後に増加したことから、他の微生物叢のメンバーを抑制する可能性があるという点で、日和見的かつ間接的な病原行動を示しているのかもしれない67。Paraburkholderia属の微生物は、ストレス後に枯渇するという証拠がある68,69。ポンティバクター（Pontibacter）もまた、ストレスによって枯渇し、FVTによって回復するが、以前はうつ病様の表現型と関連していた70。特定の細菌分類群におけるこうした変化に加えて、FVT処理には微生物叢の動的活性を特異的に変化させる能力がある。FVT接種株には、キノリン酸分解、S-アデノシルメチオニン合成、ドーパミン合成を含む3つの腸脳モジュール35が含まれていることが判明した。さらに、FVT接種株には、アラビノキシラン分解、ホモ酢酸生成、メチオニン分解I、ムチン分解、ペクチン分解I、デンプン分解、硫酸還元（異化）など、10の異なる腸代謝モジュール36も含まれていた。これらの知見は、ストレス時に自家投与される糞便ビロームには、神経活性と代謝の両方の可能性を持つ要素が含まれており、微生物叢の機能的出力に役割を果たしうることを示している。

FVT溶液から予測されたファージ-宿主ペアは、ストレスとFVTに応答して異常に豊富な細菌種の90％と、門分類学レベルでクロスリファレンスされた細菌種とオーバーラップした。しかし、科レベル（LachnospiraceaeとErysipelotrichaceae）では10％しか重複していなかった。これは、腸内ビロームの大部分がまだ未確定であることと、ウイルス解析ツールがネズミのデータセットではなくヒトのデータセットに重点を置いていることを考慮したものである71,72。現在、バクテリオファージのデータベースは限られている。というのも、ファージの宿主範囲を決定する正確な遺伝子は、非常に特異的であると同時に、移動性エレメントの影響を受けやすいからである。例えば、尾部繊維のわずかなアミノ酸の変化によって、細菌の莢膜構造のレセプター結合ドメインが変化し、それによってファージの宿主向性も変化する73,74。しかし、前述の分類と感度の限界のため、微生物群集における宿主と餌食のペアの本当の割合を推測することはできない。ファージ-宿主ペア数が比較的少なく、FVT処理による種間の存在量差に大きな効果が見られなかった理由として、2つの可能性が考えられる。第一に、腸内におけるファージ-宿主相互作用は主に温和で、溶原性（lysogeny）に傾いており、これは群集全体の変化をもたらさず、現在の腸内バクテリオファージモデル9,34,75に適合する。第二に、FVTが相互作用を通じて微生物群集を制御する力を発揮している可能性がある。これは、ストレスに反応して影響を受けやすい種の増殖を制御し、捕食から身を守る要素を含む種を選択することによって起こる可能性がある9,76。ファージは細菌に特異的に感染するよう制限されているため、哺乳類の細胞には影響を与えないというのが古典的な認識である。しかし、ファージチャレンジ後に免疫活性化が起こりうるという証拠がある77,78。従って、我々のモデルで見られる効果は、FVTを介したものであり、おそらくファージによる微生物叢の調節が最初に起こり、次に腸脳軸が起こると考えられるが、ファージの直接的な影響も起こりうる。さらに、ファージが感受性の高い細菌を捕食することで、細菌間の相互作用を通じて、他の種にも連鎖的な影響が及ぶという証拠もある79。我々のデータセットのファージ-宿主ネットワーク相関分析は、このダイナミックなカスケードを支持している。さらに、いくつかのファージ-細菌間の関連は、グループ間で異なっており、ストレスの予防と回復に役割を果たしている可能性がある。

短期モデル44とは対照的に、われわれの慢性社会的ストレスモデルでは、末梢の炎症性単球と好中球が減少し、炎症性サイトカインレベルが上昇した。興味深いことに、FVT後、循環中のCD62L+単球が劇的に増加した。この細胞表面分子は、ストレス下で単球を再配分し、炎症組織への移動を誘導する上で重要な役割を果たしており、末梢単球が積極的にリクルートされていることを示唆している45。血漿IP-10は、ストレスによる上昇とFVTによる減少の後、有意な回復効果を示した。このサイトカインはCXCケモカインファミリーに属し、TLR-9刺激によって誘導され、単球、T細胞遊走、その他の免疫細胞を刺激してウイルスクリアランスを促進することが示されている77,81,82。脾臓は免疫細胞の貯蔵庫であり、脾臓細胞を培養することで、単球、マクロファージ、Tリンパ球、Bリンパ球、樹状細胞を含む免疫細胞集団のサイトカイン産生を評価するex vivo試験が可能になる46。炎症性サイトカインTNF-α、IL-6、IL-12の無刺激脾臓細胞産生においても、ストレスとFVT後の同様の回復効果が見られた。IL-6 は、Con A 脾臓細胞刺激後に FVT によって減少した唯一のサイトカインであり、FVT 処理がストレス後の抗原性亢進反応を軽減できることをさらに示していた。ここで、我々のサイトカインデータを総合すると、FVTストレス群では免疫活性化、ウイルス検出、活発な感染の徴候は見られなかったことが示唆される。免疫細胞シグナル伝達は、腸内細菌叢がストレス時を含め脳に影響を与える重要なメカニズムであり41、ストレス反応を緩和するFVTの能力が免疫介在経路を介して駆動されていることはもっともらしいが83。

脳の海馬領域と扁桃体領域のトランスクリプトーム解析から、ストレスやFVTに感受性を示す遺伝子が多数発見された。扁桃体と海馬はともに、ストレス反応の調整に大きく関与する脳領域であり、腸に対して感受性が高い48,84,85。扁桃体は、不安、社会的行動、微生物叢の相互作用に特に敏感であることが、我々のグループによって以前に示されている84,86。私たちは、扁桃体遺伝子の大部分（99.6％）の発現がストレスによって低下し、FVTによって回復することを観察したが、海馬では、遺伝子発現レベルはより均等に分布していた（52.8％がストレスおよびFVT後にアップレギュレートされた）。海馬と扁桃体では、GO免疫用語が回復した。扁桃体では、内因性ウイルスプロセスに関連する遺伝子がさらに増加した。これらのウイルスプロセスには、宿主細胞感染、ウイルスゲノムの複製、および/またはウイルス粒子の子孫のアセンブリーのような、ウイルスの複数生物間相互作用が含まれる。脳は微生物感染から守られた免疫特権臓器であるため、ウイルス過程はおそらく、宿主のゲノムに歴史的に組み込まれた内因性のレトロウイルス集合体であろう。他の文脈では、レトロウイルス由来のこれらの配列は、微生物叢によって促進される恒常性維持反応や炎症反応と関連している87。さらに、社会行動、ストレス行動、恐怖行動に関連する遺伝子を表示する扁桃体GO行動用語が復元された。最後に、神経伝達物質とシナプス後膜の神経伝達物質受容体レベルも扁桃体で回復した。

現在のファージ研究が直面している課題のひとつは、ファージ配列データベースが主に工業的に関連性のある、病原体に関連した、あるいは培養可能なファージで構成されていることである。我々の研究で配列決定されたサンプルの大半が未知のネズミファージであることを考えると、発見されたすべてのウイルス配列を分類する能力には限界がある。もう一つの限界は、一本鎖（ss）DNAやRNAウイルスはシーケンス解析で捕捉されないことが多いことである。これを考慮し、我々は逆転写のステップを使ってssDNA/RNAを相補的な(c)DNAに変換した。最初のビローム配列決定（Ctrとストレスの比較）では、RNAゲノムを持つウイルス分類群に属すると分類学的に同定されたウイルスはなかった。しかし、2回目のビローム解析（FVT研究）では、RNAゲノムを持つ分類群に属すると推定されるシグナル（例えば、ssRNAウイルスのアストロウイルス科とフィアウイルス科（旧レビウイルス科））が、DNAゲノムを持つウイルスのシグナルに比べて非常に低いレベルではあるが観察された。ssDNAウイルス分類群に対応する推定シグナルもFVTビロームで同定された（例えば、サーコウイルス科、ジェノモウイルス科、マイクロウイルス科、パルボウイルス科）。また、両データセットに含まれる相当数のウイルスコンティグが、既知のウイルス分類群に属すると分類できなかった（つまり、「未割り当て」）ことにも注目すべきである。これは、これらが追加的なRNA/ssDNAウイルスであることを意味するものではないが、その可能性を排除するものでもない。

落射蛍光顕微鏡とショットガンシークエンシングを用いてFVT接種菌の特徴を明らかにすることにより、精製されたFVT接種菌がウイルス様粒子とウイルスリードから構成されていることが示されたが、我々は主にサイズに基づいてファージを選択したため、生命の極限にある最小の細菌も移入された可能性があることは理解できる。しかし、ここで用いた精製ステップでは、遠心分離、広範なろ過、透析を用いて、100 kDa（約3.05 nm）から45 µmの間のウイルスを特異的に分離・濃縮した。次に考えられるのは、温帯性ライフサイクルである。温帯性ライフサイクルは、環境条件に応じて溶菌経路と溶原性経路の両方を誘発する能力を持ち、腸内で優勢なファージのライフサイクルタイプである9。このため、ファージが細菌宿主に直接的な溶菌作用によって影響を与えているのか、それとも溶菌という多様なオプションによって影響を与えているのかを確認するのは困難である。FVTは排泄された糞便から得られたものであるため、ファージは主に温和なものであったと推測できる。さらに、組み込まれたプラスミドや溶解したウイルス核酸モチーフは、サンプル調製では容易に収集されないため、FVTは遊離ウイルス画分に偏ることになる。このことは、移植されないオリジナルのドナーのビロームの要素が存在することを意味する。最後に、経口ガベージによるFVTの投与は、本質的にストレスの多い手法であり、対照群にも緩衝液をガベージすることでバランスをとったが、これはストレスに関連した追加措置として、結果に影響を与える可能性がある。

技術としてのFVTはまだ発展途上にあるが、疾患モデルにおける有効性を支持するデータが増えつつあり11,14,89,90,91、微生物叢に基づく代替治療法91,92,93として急成長している。最近のエビデンスでは、FVTの異なる層を不活性化することが可能であることが示唆されている90。このようなアプローチを用いることで、ファージ-細菌-宿主の相互作用の原動力となっているのはどのようなグループなのかをさらに解明することができる。さらに、完全に不活性化されたFVTが微生物叢や哺乳類宿主にどのような影響を及ぼすかを評価することも必要である。あるいは、特定の微生物分類群の役割と機能が明らかになれば、病原体を標的とするファージカクテルを組み立て、関連する病気を改善するために投与することもできる。本研究の目的は、腸内ビロームがストレス関連行動を予防する治療効果を引き出せるかどうかを明らかにすること、そしてその効果を微生物叢-腸-脳軸の文脈で説明するために、深い表現型解析を行うことであった。本研究の特定の条件下で、我々はストレスに対する自己恒常性FVTの保護効果を観察した。しかし、これらの効果を促進する特定の薬剤や、それらが相互作用する標的はまだ不明であり、この微妙な相互作用を解明するためには今後の研究が必要である。不活性化されたFVTが効果を引き出せるかどうか、宿主微生物叢の代わりにFVTが宿主にどのような影響を与えるか（無菌モデルやgnotobioticモデルなど）、ストレスを受けた動物のFVTがストレス表現型を引き出せるかどうか、特定のファージが抗ストレス能を持ちうるかどうかなど、今後の研究には多くの興味深い可能性と方向性がある。

結論として、ビロームがストレスに対する微生物叢-腸-脳軸反応に寛容な役割を果たしていることが示された。この応答は、ビローム（すなわちFVT）を通して、宿主に対するストレスの影響を様々なレベルで改善するための標的とすることができる。バクテリオファージ治療は、微生物叢-腸-脳軸内の個々の層を利用してストレスから保護する有用性を示している。腸内ファージの研究が進むにつれて、微生物叢におけるファージと宿主のダイナミックな相互作用の特徴が明らかになり、腸と脳の健康を促進する可能性がさらに高まるだろう。

研究方法
動物実験
最初の研究では、雄性C57Bl/6Jマウス20匹（各群n = 10）および雄性CD1非実験用常駐攻撃マウス20匹を使用し、2番目の研究では、雄性C57Bl/6Jマウス30匹（各群n = 10）および雄性CD1マウス50匹を使用し、University College CorkのBiological Services Unitで飼育した。マウスはEnvigo社（英国）から8週齢で譲り受け、無作為に群に割り付けた。動物は1週間馴化され、その後「ストレス」群は単独飼育となり、対照群は群飼育のままとなった。試験期間中、餌と水は自由摂取とした。飼育室は12時間の明暗サイクル（明サイクルは07:00から）で、温度21±1℃、湿度55±10％であった。体重は週2回モニターした。変化を検出するのに十分なサンプルサイズを提供するため、G*Power（v.3.1）というソフトウェアを用いて、検出力80％（1βエラー）、αエラー0.05を考慮した事前検出力分析を行った。治験責任医師は実験割り付け時に盲検化されていなかったが、解析は実験責任医師と盲検化された方法で行われた。すべての手順は、欧州指令2010/63/EUの勧告に従い、コーク大学の動物実験倫理委員会（AEEC）および医薬品規制庁（HPRA）の承認を得て実施された。

実験スケジュールと行動試験
最初の実験では、慢性的な社会的ストレスがバクテリオームとビロームを変化させるかどうかを調べるため、ストレス群とCtr群の2群を用いた。ストレス群の動物（無作為に割り付けられた）は、20日間にわたり、社会的敗北と過密状態のストレス要因を半無作為に連続させた慢性的な心理社会的敗北ストレスを受けた（図1a参照）。行動テストは9時から12時の間に以下のように行った： (1) 21日目、社会的相互作用試験 (2) 22日目、強制水泳試験。試験終了後、動物は23日目に断頭により安楽死させ、その後の分析のために組織を採取した。

動物は2回目の実験で使用する3つのグループのいずれかに無作為に割り付けられた： Ctr群、Ctrストレス群、FVTストレス群である。Ctr群とCtrストレス群にはビヒクルの生理食塩水マグネシウム（SM）緩衝液（50 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、8.5 mM MgSO4、pH 7.5）を、FVTストレス群にはストレス前の糞便から精製した自己糞便ビロームを投与した。ストレス」群の動物は22日間にわたり19回の慢性社会的敗北ストレスを受けた（3回の行動試験日には動物はストレスを受けなかった）。対照動物はストレスを受けなかったが、同時に研究者によって均等に扱われた。行動テストは9:00～12:00の間に以下のように行った： (1）11日目、社会的相互作用試験、（2）15日目、高架式十字迷路、（3）19日目、強制水泳試験（図2a参照）。試験終了後、動物は23日目に断頭により安楽死させ、その後の解析のために組織を採取した。

糞便ビロームの精製
糞便サンプルはPBS-グリセロール（20％）溶液で回収し、凍結保存（-80℃）した後、FVT経口投与に使用するファージリッチ材料を作製するために使用した。約2.5gの糞便ペレットを10mlのフィルター滅菌SM緩衝液と2mlの1M NaHCO3（胃酸を減らすため）に懸濁した。糞便スラリーを激しくボルテックスし、5,000 gで20分間遠心した。上清はフィルター滅菌（0.45μmフィルター）後、一晩透析した（SpectraPor Float-A-Lyzer Dialysis Device G2、100kDa、Repligen）。

慢性心理社会的ストレス
最初の実験では、マウスは社会的敗北ストレスおよび/または過密状態からなる慢性心理社会的ストレスを20日間受けた（実験のタイムラインは図1a参照）26。実験マウスは、予測不可能な社会的敗北／過密スケジュールで20日間連続してストレスを受けた。社会的敗北セッション（後述）では、攻撃的なCD1マウスと接触し、攻撃または服従姿勢をとった。過密飼育では、標準飼育ケージに24時間同居させ、1ケージあたりn = 10とした。

慢性社会的敗北ストレス
2番目の実験では、慢性社会的敗北ストレスを19日間連続で毎日行った（行動試験日を除く；実験タイムラインは図2a参照）94。慢性社会的敗北ストレスは、慢性心理社会的ストレスパラダイムの過密状態で起こりうる共食現象を排除し、FVT 投与の効果を混乱させる可能性を排除するために選択された。CD1マウスは社会的敗北セッションの2日前に攻撃性についてスクリーニングされた。攻撃潜時が最も短いCD1マウスを、その後の社会的敗北で使用する攻撃者として選択した。各社会的敗北セッションでは、実験マウスにとって新規のCD1マウスが用いられた。このセッションでは、共食いを減らすため、清潔なケージに新鮮な寝具を敷き、CD1マウスに最初に接触させた。セッションは最初の攻撃、実験マウスによる服従姿勢の発現、または5分経過するまで続いた。攻撃または服従までの潜伏時間を記録した。2時間後、セパレーターを取り外し、2回目のディフィートセッションを行った後、マウスをホームケージに戻した。社会的敗北セッションは午後の明るい時間帯に行われた。コントロールマウスは、社会的敗北の代わりに毎日同量のハンドリングを行った。

社会的相互作用試験
研究1では、動物は20日間の慢性心理社会的ストレスの後に社会的相互作用試験95を受けた。研究2では、動物は連続10日間の慢性社会的敗北ストレスの後に試験を受けた。実験動物は空の金網ケージ（9.5×7.5cm2）を入れた長方形のプラスチックボックス（31×39cm2）に入れられ、2.5分間自由に探索させた後、マウスを取り出してホームケージに1分間入れ、その間に新しいCD1マウスを金網ケージに入れた。その後、実験動物を社会的相互作用ボックスに戻し、CD1マウスが金網ケージに入っている間、2.5分間自由に探索させた。試験終了後、マウスをホームケージに戻し、箱と金網ケージを70％エタノールで洗浄した。試行は天井に取り付けたカメラで記録し、Ethovision 11.5（Noldus）を用いて評価した。社会的相互作用およびコーナー比率は、CD1が存在するときと馴化の間に相互作用ゾーン（メッシュケージ周辺）またはコーナー（メッシュケージから最も遠い2点）で過ごした時間の比率をとることで算出した。

高架式十字迷路試験
高架式十字迷路試験は不安様行動の評価に用い、文献28に従って実施した。迷路装置は地上1mの高さにあり、灰色のプラス（＋）型迷路で、2つの対向するオープンアームとクローズドアーム（アームの長さ50×5cm、クローズドウォールの高さ15cm、オープンウォールの高さ1cm）がある。実験と馴化は赤色光（5ルクス）で行った。マウスは試験の1時間前から部屋に慣れさせ、その後5分間迷路を探索させた。迷路は各試行後に70%エタノールで洗浄した。実験は天井に取り付けたカメラで録画し、ビデオはオープンアームでの滞在時間とオープンアームへの進入（進入とはすべての前足がアームに入ること）についてブラインドで採点した。

強制水泳試験
強制水泳試験は抑うつ様ストレス対処行動を評価するために用い、文献28に従って実施した。ガラスシリンダー（直径21cm）に24±1℃の水を15cmの高さまで入れた。実験動物は天井に取り付けたカメラで記録されながら、6分間水中に置かれた。各試験後、動物はタオルでやさしく水分を拭き取り、ホームケージに戻した。6分間のテストのうち最後の4分間は、実験群を盲検化した研究者が録画したビデオから不動行動を手動で採点するために使用した。マウスは、頭を水面上に保つのに必要な動きしかしない場合、不動と判定された。

ストレスおよび免疫測定のための反復採血
強制水泳試験の5分前、および試験開始から15分後、45分後、90分後に、各動物の血漿を尾の先端から採取した。尾をしっかりと固定し、尾の先端から約1～2mmのところを斜めに切開した。タイムポイントごとに約40μlの全血をEDTAライニングキャピラリーチューブ（Fisher Scientific、749311）に採取した。サンプルをエッペンドルフに入れ、4℃で3,500g、10分間遠心した。血漿を採取し、後のコルチコステロンの定量用に-80℃で保存した。残りの血球は免疫フローサイトメトリー分析に用いた。

コルチコステロンのストレス応答タイムライン
サンプルあたり10μlの血漿を用いて、1回のアッセイでサンプルを二重に分析した。検出の閾値は<32 pg ml-1で、変動係数は20％、濃度単位はng ml-1であった。吸光度はマルチモードプレートリーダー（Synergy HT, BioTek Instruments）を用いて405 nmで読み取った。

フローサイトメトリー
フローサイトメトリーは、強制水泳試験の前と45分後に採取した血液サンプルを用いて行い、サンプルは同日に処理した。染色、ゲーティング、解析は以下の方法94に従って行い、ゲーティング戦略はExtended Data Fig.7に示した。血液を10 mlの赤血球溶解バッファーに3分間懸濁した（15.5 mM NH4Cl、1.2 mM NaHCO3、0.01 mM EDTA四ナトリウム、脱イオン水で希釈）。次にサンプルを遠心分離し（1,500 g、5分間）、45 μlの染色バッファー（autoMACS rinsing solution, Miltenyi 130-091-222, supplemented with MACS BSA stock solution, Miltenyi 130-091-376）に再懸濁した。次に、5μlのFcRブロッキング試薬（Miltenyi 130-092-575）を各サンプルに添加した。次に、サンプルを2： 71 希釈（CD11b+ Miltenyi, 130-113-234; LY6G Miltenyi, 130-117-500; LY6C Miltenyi, 130-111-917; CD62L BioLegend, 104418; MHC-II Biolegend, 107632; CD4 Biolegend, 100548; CD44 BD Biosciences, 563736; CD69 Miltenyi, 130-115-575）を加え、氷上で30分間インキュベートした。その後、サンプルを4％パラホルムアルデヒド（PFA）中、氷上で30分間固定した。固定したサンプルは染色バッファーに再懸濁し、翌日、FACSCelestaフローサイトメーター（BD Biosciences）を用い、FACSDiva（v.8.0、BD Biosciences）およびCellQuest Pro（v.5.2、BD Biosciences）を用いて解析した。データはFlowJo（v.10）を用いて解析した。細胞はFSC-heightとSSC-heightに基づいてゲーティングされ、その後、LY6Chi単球（CD11b+、LY6Chi）、好中球（CD11b+、LY6C+、LY6G+）、Tヘルパー細胞（CD11b-、LY6G-、CD4+）が選択された。次に、CD62LまたはMHC-IIを含むLY6Chi単球と好中球の割合を、それぞれの親集団と比較して評価した。次に、CD69+またはCD44hiのいずれかを持つTヘルパー細胞の割合も同様に、全親細胞集団に対する相対値で評価した。

脾臓細胞刺激
脾臓は組織採取の際に採取し、脂肪を取り除き、RPMI培地（R8758、10％ウシ胎児血清（F7524、Sigma）および1％ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン100倍（10378-016、Biosciences）添加）に入れた。その後、赤血球溶解バッファー（R7757、Sigma）で処理し、70μmのフィルターを通した後、新鮮なRPMI培地に再懸濁した。次に、4mlの脾臓細胞を6ウェルプレートに、1ウェル当たり16×106細胞の濃度で播種した。2.5時間の休息後、細胞をリポ多糖（2μg ml-1, tlrl-eblps, Invivogen）とコンカナバリンA（2.5μg ml-1, C5275, Sigma）で24時間刺激し、天井抗原性を誘導した。その後、上清を回収し、炎症性サイトカイン分析に用いた。

炎症性サイトカイン分析
血漿および脾臓細胞上清サンプルからのサイトカインレベルを安楽死中に採取し、V-PLEX Proinflammatory Panel 1 mouse kit (MSD, K15048D)を用いて定量し、MESO QuickPlex SQ 120 SECTOR Imager 2400 (MSD)でIFN-y、IL-6、IL-12/IL-23p40、TNF-aおよびIP-10を測定した。サイトカインの定量は、製造業者のガイドラインに従って行った。各アッセイの検出限界以下のサンプルは除外された。

糞便バクテリオームの収集と配列決定
最初の実験では、QIAamp DNA stool mini kit（Qiagen社製）を使用し、メーカーのハンドブック（2012年第2版）「Isolation of DNA from Stool for Pathogen Detection」を用いて細菌DNAを抽出した。サンプルは、Nextera XT DNA library prep kit（Illumina）を用いて、Illumina 16Sライブラリー調製ワークフローに記載されているように、16Sシーケンス用に調製した。16S細菌rRNA遺伝子は、V3-V4超可変領域を標的とするプライマーを用いて増幅した（フォワード：5′TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG；リバース：5′TCGTCGCAGCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG）： 5′GTCTCGTGGCTCGGAGATGTGTATAAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC）（Sigma Aldrich）。イルミナV3-V4プライマーは、シークエンシングに必要なアンプリコンサイズを維持しながら、高いカバレッジ（94.5%菌）を持つものを選択した96。16S rRNAアンプリコンはIllumina MiSeqプラットフォーム（Teagasc, Moorepark, Ireland）でシーケンスした。

2番目の実験では、QIAamp Fast DNA stool mini kit（Qiagen）を用いて糞便ペレットからDNAを抽出した。これはメーカーのガイドラインに従って行った。ただし、抽出の前に、絶対量の算出を助けるために、ZymobIOMICs spike-in control 1（Zymo Research社製）を20μl加えた。その後、Qubit High Sensitivity assay（Thermo Fisher Scientific）を用いてDNA濃度を測定し、Nextera XTライブラリー調製（Illumina）用に0.2 ng μl-1に調整した。高感度D1000 ScreenTapeアッセイ（Agilent Technologies）を用いて4200 Agilent Tapestation（Agilent Technologies）でライブラリーの質を評価した後、2×150 ntペアエンドケミストリー（Genewiz）を用いてIllumina Novaseqプラットフォームで全メタゲノムシーケンスを行った。

糞便ビロームの収集と配列決定
初回実験の糞便ビロームは、検証済みのプロトコル34,97を用いて処理した。簡単に説明すると、コントロール群とストレス群のサンプルをプールし（プールあたりn = 3-4）、1-2 gの糞便サンプルを作成した。プールしたサンプルを10 mlのSM緩衝液に再懸濁し、5分間ボルテックスし、氷上で5分間冷却した後、4℃で10分間5,000 gで遠心分離し、大きな粒子および細菌細胞を除去し、上清を新しいチューブに移し、遠心分離を繰り返した。上清は0.45μm孔のセラミックフィルターで2回濾過した。さらに精製し、プロテイナーゼKとファージ溶解バッファーで処理した後、フェノール-クロロホルム法でサンプルDNAを抽出した。DNA抽出後、サンプルはNextera XT DNA library prep kit（イルミナ社製）を用いてショットガンメタゲノムシーケンス用に処理した。イルミナMiSeqプラットフォーム（Teagasc, Moorepark, Ireland）を用いてウイルスメタゲノムシークエンシングを行った。

2回目の実験では、ref. 98に記載されている最新のプロトコルを用いた。FVT経口摂取サンプルについては400 µlを処理し、サンプル間のウイルス量の比較を可能にするため、各サンプルに乳酸球菌ファージQ33のプラーク形成単位108個/mlを10 µl添加した。糞便サンプルについては、各マウスの糞便サンプル1匹をグループごとに650μlのSM緩衝液にプールした。新鮮な0.5 Mジチオスレイトールを1 mlのSMバッファーで調製した。最終濃度が12mMになるように16μlのジチオスレイトールストックをサンプルに加え、サンプルを37℃で30分間インキュベートした。4,000g、30分間、室温で遠心し、残渣と細菌細胞をペレット化した。その後、400μlの液体を除去し、40μlのDNase/RNaseバッファー（50mM MgCl2、10mM CaCl2）、12μl（24U）のTurbo DNase（Thermo Fisher）、4μl（40U）のFermentas RNase I（Fisher Scientific）で37℃、1時間処理した。遊離核酸を除去したウイルス様粒子（VLP）を、QIAgen血液・組織キットを用いて、製造業者のガイドラインに従って溶解した。ただし、得られた核酸の最終濃度を高めるために、30 µl の Qiagen AE 溶出バッファー（10 mM Tris-HCl、0.5 mM EDTA、pH 9.0）を溶出量として使用した。

SuperScript IV First Strand Synthesis System（Invitrogen/Thermo Fisher Scientific）を用い、11μlの精製VLP核酸サンプルとランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドを用いて、製造元のプロトコールに従って逆転写反応を行った。DNeasy blood and tissue kit（Qiagen）を用いて精製したDNAの濃度は、Qubit dsDNA HS kitとQubit 3 fluorometer（Invitrogen/Thermo Fisher Scientific）を用いて測定した。DNA/cDNA収量は0.05～29 ng µl-1の間で変動し、検出限界以下のサンプルもあった。ライブラリー調製の前に、各サンプル22 µlをSuperscript IVキット（Invitrogen/Thermo Fisher Scientific）を用いて、製造元のプロトコールに従って逆転写を行い、RNAウイルスを解析に含めた。

その後、低EDTA TEバッファーで容量を52.5 µlに調整した後、サンプルを超音波処理した。未増幅DNA/cDNA混合物の剪断は、M220 Focused-Ultrasonicator（Covaris社製）を用い、ピークパワー50W、デューティーファクター20%、1バーストあたり200サイクル、総時間35秒の設定で行った。その後、Genomic DNA Clean and Concentrator-10 kit（Zymo Research社製）を用いてサンプルを濃縮し、16μlのアリコートで溶出した。ライブラリー調製は、Accel-NGS 1S Plus kit（Swift Biosciences）を用い、メーカーの指示に従って行った。ただし、DNA/AMPureビーズv/v比0.8のビーズクリーンアップステップを最終的に追加した。フラグメント長分布と定量を決定するためのライブラリーQCは、4200 Agilent Tapestation（Agilent Technologies）を用いて、High Sensitivity D1000 ScreenTape assay（Agilent Technologies）とInvitrogen Qubitを用いて行った。正規化されたプールライブラリーは、GenewizのIllumina HiSeqプラットフォームで2×150 ntペアエンドシーケンスケミストリーを用いてシーケンスされた。

バクテリオームシーケンスデータの解析
品質スコア30を閾値として、FastQCプログラムを用いてすべての糞便サンプルの生配列の品質チェックを行った。その後、ショットガンメタゲノムシーケンスデータをクリーニングし、宿主ゲノム配列はBowtie2を用いてKneaddata wrapperプログラムにより以下のパラメータでフィルタリングした： ILLUMINACLIP:/NexteraPE-PE.fa:2:30:10, SLIDINGWINDOW:5:25, MINLEN:60, LEADING:3, TRAILING:3。Bowtie2を用いてWeb of Lifeデータベースにアライメントし、Woltkaを用いて微生物群集の分類学的および機能的プロファイリングを行った。次に、uniref90ベースの遺伝子存在量マトリックスを、Woltkaに備わっている'woltka tools collapse'機能を使って、KEGG Orthology (KO)タームマッピングを用いてさらに折りたたんだ。Woltka の SOP はオンラインで入手可能である（https://github.com/qiyunzhu/woltka/blob/master/doc/wolsop.sh）。GBMs35およびGMMs36は、RバージョンのGomixerツールを用いて計算した。

経口ビロームシークエンスデータの解析
fastp（v.0.23.2）99を用い、'-length_required 60-detect_adapter_for_pe -cut_front -cut_tail -cut_window_size 4 -cut_mean_quality 20-trim_front1 10'のフラグで、アダプターの除去、低品質塩基のトリミング、品質と長さのフィルター処理を行った。その後、Kraken (v.2.1.2)100を用いて、MusculusとHomo sapiensのゲノム(それぞれGCF_000001635.27_GRCm39とGCF_009914755.1_T2T-CHM13v2.0)にリードをマッピングし、真核生物のリードを同定・除去した。各ステップで、FastQC（v.0.11.9）101を用いてリードの質を評価した。

トリミングとフィルタリングのステップを通過したリードは、MEGAHIT（v.1.2.9）102を用いて、デフォルトのパラメータでサンプルごとにアセンブルされた。全サンプルから得られたコンティグをプールし、長さ3Kbp以上のコンティグのみを保持するようにフィルターをかけた。冗長なコンティグは、all-vs-all BLASTn (v.2.12.0+)比較（e-value cut-off of ≤1×10-20）に従って除去され、コンティグの最短の長さの90%以上で90%以上の同一性を共有するコンティグについて、ヒットのすべてのペアについて最短コンティグが除去された。

まず、コンティグをNational Center for Biotechnology Information (NCBI) RefSeqデータベースリリース211、Gut Virome Database103、Joint Genome Institute (JGI) IMG/VR v.3 (リリース#5; 12-10-2020)104、およびBLASTn(v.2.12.0+)を用いて、e-value cut-offを≤1×10-10として、社内のcrAss-likeバクテリオファージゲノムデータベースを用いた。これらのヌクレオチド比較では、これらのデータベース内の配列と少なくとも50％の同一性を持つヒットの組み合わせによって、その長さの85％以上がカバーされていることが判明したコンティグは、潜在的なウイルス配列とみなされた。ファージはマイクロバイオーム間で特に不均一に分布しているため、サンプルの約半数でその特徴がない（または観察されない）場合、その後の解析に含めると偽の関連付けのリスクが非常に高くなる105。ウイルスのコンティグ候補は、タンパク質の相同性に基づいても同定された。このために、各コンティグ内のオープンリーディングフレーム（ORF）をProdigal（v.2.6.3）106で「-meta」オプションを使って呼び出し、得られたORFをBLASTp（v.2.12.0+；e-value cut-off of ≤1×10-10）を使ってNCBI RefSeq viral protein database（リリース211）と比較した。また、hmmscan (HMMER v.3.3.2; e-value cut-off of ≤1 × 10-5)を用いて、Prokaryotic virus Remote Homologous Groups (PHROGs; release v.3)データベース107およびJGIのinovirus protein families (iPFs)データベース108の隠れマルコフモデル(HMM)とORFを比較した。コンティグが少なくとも2つのORFをコードし、そのORFがコンティグのORF数の合計の少なくとも50%を占め、タンパク質比較のいずれかの組み合わせでヒットした場合、コンティグはタンパク質比較の結果からウイルスの可能性があると示された。VirSorter2（v.2.2.3）109（'-include-groupsDNAphage,RNA,ssDNA'付き）とDeepVirFinder（v.1.0）110（デフォルトパラメータ付き）である。最後に、ViRal and Circular content from metAgenomes tool (VRCA; https://github.com/alexcritschristoph/VRCA)によって同定された円形コンティグも、ウイルスの可能性があるコンティグのリストに含めた。

これらのウイルス同定基準のいずれかを満たしたコンティグを、デフォルトパラメーターでbarrnap v.0.9（https://github.com/tseemann/barrnap）を用いてrRNA遺伝子の有無を調べ、rRNAヒットが見つかったコンティグは、ウイルスコンティグの可能性があるリストから削除した。最後に、CheckV v.1.0.1とその配列データベース(v.1.2)111を使用して、潜在的なウイルスコンティグの質を調べた。CheckVによってコンティグがプロウイルスと同定された場合、そのコンティグの配列は、CheckVによって示唆されたウイルスの開始位置と終了位置の範囲内に修正された。この精密化によって、ウイルスコンティグの長さがいくつか変化したため、コンティグを再度フィルタリングし、長さが3Kbp以下のコンティグを除去した。

ウイルスコンティグのリストから、内部ウイルス標準として使用した乳酸球菌ファージQ33に対応するアセンブルコンティグをファージQ33ゲノムのBLASTnで同定し（GenBank accession: JX564242.1）、対応するコンティグをQ33の参照ゲノム配列に置き換えた。次に、vCon- TACT2（v.0.11.1）112 を用いて、「-rel-mode Diamond -db ProkaryoticViralRefSeq207-Merged-pcs-mode MCL -vcs-mode ClusterONE」オプションでウイルスコンティグをウイルスクラスターにクラスタリングした。ウイルスファミリー情報もDemovir (https://github.com/feargalr/Demovir)を用いてコンティグに割り当てた。vContact2がウイルスコンティグを既知のウイルスとクラスタリングできた場合は、既知のウイルスの分類群情報をコンティグに割り当て、そうでない場合はDemovirからの情報を使用した。BACPHLIP（v.0.9.6）113を用いて、各ウイルスコンティグのライフスタイル（すなわち、強毒性か温帯性か）を予測した。BACPHLIPが0.95以上の信頼値でライフスタイルを割り当てた場合、そのライフスタイルがコンティグに割り当てられ、そうでない場合、コンティグのライフスタイルは「未割り当て」と表記された。iPHoP（v.1.1.0）72を用い、宿主データベース「Sept_2021_pub」とデフォルトの「predict」パラメータを用いて、各コンティグに対する宿主推定細菌の割り当てを行った。

糞便ビロームの定量的解析は、まずBowtie（v.2.4.5）114を「-end-to-end」モードで使用し、トリミングとフィルタリングを通過したサンプルごとのリードを推定ウイルスコンティグの最終データベースにマッピングすることで達成した。その後、SAMTools（v.1.15.1）を用いてリードカバレッジとマッピングカウントを収集した115。ウイルスコンティグへのスプリアスリードマッピングカウントは、長さの75%未満で1xカバレッジが見つかったウイルスコンティグのマッピングリードカウントを0に設定することで、カウントデータから除外した。推定ウイルスコンティグは、CheckVによって50%以上の完全性を有すると判定され、CheckVによって同定されたウイルス遺伝子の数が1以上であり、CheckVによって「ウイルス性」と分類された遺伝子の数が全遺伝子数の10%以上である場合にのみ、定量分析に含まれた。全サンプルについて、コンティグにマッピングされたリード数をコンティグの長さで正規化し、その後、「Total-Sum Scaling」116（つまり、長さで正規化したリード数/サンプルのマッピングに使用されたリードの総数）を用いてライブラリーのサイズを正規化することで、サンプル中の各ウイルスコンティグの存在量を推定した。絶対ウイルス数は、正規化されたリードカウントの相対的な存在量を、スパイクされた乳酸球菌ファージQ33コンティグのそれと比較することによって計算された。GBM と GMM は、まず eggNOG-mapper v.2.1.11 を用いてウイルス遺伝子に注釈を付け、次に出力された KO を GBM データベースと検索することで、アセンブルされたビローム配列内でスクリーニングされた。

バルクメタゲノムシーケンスデータ内の全ウイルス配列の解析
バルクメタゲノムシーケンスデータ内の全ウイルス配列情報の定量的解析は、ウイルスガベージサンプルの解析で使用した同様のプロセスに従った。すなわち、各サンプルについてfastpによるトリミングとフィルタリングを通過したリードを、上述のように経口摂取サンプルから得られた推定ウイルスコンティグのデータベースにマッピングした。マッピング結果は、上記のように総和スケールリードカウントに変換された。ここでも、前述のCheckVフィルタリング条件をパスしたウイルスコンティグのみがリードカウント表に含まれた。

マイクロバイオームデータのバイオインフォマティクスと統計解析
RstudioのGUI（v.2022.7.2.576）を用いて、R（v.4.2.2）でマイクロバイオーム測定データの取り扱いを行った。

プレート間バイアスはR117のMetacalパッケージを用いて再較正した。したがって、最小カウントが5未満の分類群は細菌解析から除外され、有病率が50％未満の分類群はファージ解析から除外された。これは、比率がサブセット化に不変であり、本研究が組成データ解析技術を採用しているため118,119。ファージはマイクロバイオーム間で不均一に分布しており、サンプルの約半数で特徴がない（または観察されない）場合、後続の分析に含めると偽の関連性のリスクが大幅に高まるため、このアプローチが用いられた105。主成分分析は、中心対数比変換（clr）値に対して行った。ゼロは文献120に記載されている'const'アプローチで置換した。120. β多様性は、clr変換データ間のAitchison距離またはユークリッド距離で計算し、veganパッケージを用いた並べ替え多変量分散分析（PERMANOVA）で評価した。α多様性はiNEXTライブラリ121を用いて計算した。

微生物量の差は、lme4フレームワークを用いた一般化線形混合効果モデルを用いて評価した122。カスタム関数とスクリプトは https://github.com/thomazbastiaanssen/Tjazi からオンラインで入手できる。必要に応じて、P値0.05の閾値と0.2のBenjamini-Hochberg調整q値カットオフによる直交復元比較のP値に加え、0.05のP値カットオフによる片側Tukeyの手順を用いて、post hoc一対比較を行った。

微生物分類群の回復度は、一般化線形混合効果モデルにおける直交対比を用いて評価し、「Ctrストレス」群に対する「Ctrストレス」群および「FVTストレス」群の重み付けを行った。図はRのggplot2、ggforce、patchworkを用いて作成した。

ファージ蛍光定量
FVT溶液中のVLPをSYBR goldで染色した。簡単に説明すると、FVT溶液を希釈し、全面ガラス製の真空フィルターを通してAnodisc（直径25mm、孔径0.02μm；Whatman社製）に60秒間通した後、AnodiscをSYBR goldで20分間染色し、退色防止剤を添加し、暗所で乾燥させた。画像を蛍光正立顕微鏡（Olympus BX53 Upright Research Microscope）で100倍の倍率で撮影し、画像中のVLPをPythonスクリプト（https://zenodo.org/records/10460215）で定量した。

トランスクリプトーム解析
海馬と扁桃体のRNAはmirVANA kit（Qiagen）を用いて抽出した。メッセンジャーRNAの配列決定は、Source Bioscience社がIllumina NovaSeq 6000（S4フローセル、150bpペアエンドレーン、25億リードペア）を用いて行った。得られた配列の参照ゲノムを参照アノテーションを用いて作成した： Mus musculus（生物）、GRCm38、UCSC、ゲノムブラウザ（GRCm38.p6）、Ensemble124。デフォルトのパラメータを使用して、fastqcでリードの質を評価し、フィルターをかけた。遺伝子のアノテーションとカウントはkallisto125でデフォルトパラメータを用いて行った。

遺伝子発現の差およびGO用語の濃縮解析
トランスクリプトームデータのさらなる処理は、Rstudio GUI（v.2022.7.2.576）を用いてR（v.4.2.2）で行った。主成分分析はclr変換した値に対して行った。ゼロはref. 120. 全体的な遺伝子発現の差をAitchison距離（clr変換データ間のユークリッド距離）で計算し、veganパッケージを用いたPERMANOVAで評価した。

遺伝子発現の差は、ベースとなるR stats lmフレームワークを用いた一般化線形モデルを用いて評価した。カスタム関数とスクリプトは、https://github.com/thomazbastiaanssen/Tjazi refs. 126,127. 統計的検定の前に、海馬の遺伝子転写産物はR128のgenefilterライブラリを用いて分散によってフィルターされ、0.5がカットオフとして設定された。遺伝子発現の回復は、海馬と扁桃体それぞれについて「Ctrストレス」群に対して「Ctrストレス」群と「FVTストレス」群を重み付けした一般化線形モデルの直交対比を用いて評価した。

遺伝子のサブセットがストレスによって変化し、FVT後にコントロールレベルに回復したかどうかを評価するために、GOデータベース130上でEnrichRフレームワーク129を採用した。並行して、遺伝子オントロジーデータベースから、研究デザインの目的に対応する7つの用語を同定した。これらの7つの用語はさらに、超幾何学的検定の基本R stats phyper実装を使用して濃縮について評価した。図はRのggplot2とpatchworkを用いて作成した。

統計解析
16S rRNA、メタゲノム、トランスクリプトームデータはRを用いて解析し、その他の統計解析はSPSS v.28を用いて行った。測定は別々のサンプルから行い、繰り返し測定は行わなかった。複数のテクニカルレプリケートが実施された出力（コルチコステロンや炎症性サイトカイン分析など）では、個体ごとの平均値を用いた。ストレスによって変化した特徴のFVTによる回復は、計画的直交対比（P）、次いで算出されたP値（q）のBenjamini-Hochbergの調整済み偽発見率（BH-FDR）、およびTukeyのpost hoc検定（P；Ctr-Ctr Stressの一対比較、次いでCtr Stress-FVT Stressの比較）によって解析した。ファージ-宿主ネットワーク（Extended Data Fig.5）については、Anansiパッケージ131を用い、線形モデルを用いてデータを比較し、BH-FDRとピアソンの相関係数を用いてファージ-宿主ペアをプロットした。特に断りのない限り、有意な効果は次のように示される： P < 0.05、***P < 0.01、***P < 0.001、†q < 0.2。統計解析の前に技術的異常値を除去した（例えば、試験を完了しなかった動物、アッセイに利用できなかったサンプル、検出限界外の値など）。平均値から2.5標準偏差の値を統計的外れ値とみなし、関連する解析から除外した（1試験あたり最大2統計的外れ値）。データの分布は正規分布と仮定したが、正式な検定は行わなかった。解析は実験者と盲検化された方法で行われた。

報告概要
研究デザインの詳細については、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの利用可能性
16S rRNAシーケンスデータは、European Nucleotide Archive (ENA)のアクセッションPRJEB69687に掲載されている。メタゲノムシーケンスデータはNCBIのSequence Read Archive (SRA)のBioProject accession PRJNA970614に掲載されている。トランスクリプトームシーケンスデータは、ENAのaccession PRJEB67706にある。本研究の結果を裏付けるソースデータは、補足データとして入手可能である。

コードの利用可能性
16S rRNA、メタゲノム、トランスクリプトームシーケンスデータセットの処理と生成に使用したスクリプトは、Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.10144096)に掲載されている。本研究で使用したマイクロバイオームの概念的バイオインフォマティックアプローチに関する追加資料は、refs. 126,127.

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参考文献のダウンロード

謝辞
K. J. O'Riordan、A. Lavelle、P. Zizka、M. Schverer、O. W. Bayfield、A. Golubeva、S. Stockdale、A. Clooney、R. Cabrera-Rubioの研究技術協力、P. Fitzgerald、C. Manley、J. Riley、APC Microbiome Ireland (a research centre funded by Science Foundation Ireland (SFI) through the Irish Government's National Development Plan) (grant no. 12/RC/2273_P2) for the use of the APC Microbiome Ireland Flow Cytometry Platform. A.N.S.は、Wellcome Trust Research Career Development Fellowship（220646/Z/20/Z）、および欧州連合（EU）のHorizon 2020研究・革新プログラム（助成金協定番号101001684）に基づく欧州研究会議（ERC）の支援を受けた。

著者情報
著者情報
マルセル・ファン・デ・ウー

現住所カナダ、カルガリー、カルガリー大学小児科

キャサリン・E・グゼッタ

現住所スイス、バーゼル、チューリッヒ工科大学、バイオシステム科学・工学部

アウレリウス・ブロカス

現住所現住所：リトアニア、ヴィリニュス大学、生命科学センター、生化学研究所、生物モデル学科

マリオン・ダルマッソ

現職ノルマンディー大学、UNICAEN、UNIROUEN、ABTE、14000、Caen、フランス

これらの著者の貢献は同等である： Lorraine A. Draper, Thomaz F. S. Bastiaanssen.

著者と所属
APCマイクロバイオーム・アイルランド、コーク大学、コーク、アイルランド

Nathaniel L. Ritz, Lorraine A. Draper, Thomaz F. S. Bastiaanssen, Christopher J. R. Turkington, Veronica L. Peterson, Marcel van de Wouw, Klara Vlckova, Christine Fülling, Katherine E. Guzzetta, Aurelijus Burokas, Hugh Harris, Marion Dalmasso, Fiona Crispie, Paul D. Cotter, Andrey N. Shkoporov, Gerard M. Moloney, Timothy G. Dinan, Colin Hill & John F. Cryan

アイルランド、コーク、コーク大学解剖学・神経科学科

ナサニエル・L・リッツ、トマズ・F・S・バスティアンスセン、ヴェロニカ・L・ピーターソン、マルセル・ファン・デ・ウー、キャサリン・E・グゼッタ、ジェラルド・M・モロニー、ジョン・F・クライアン

アイルランド、コーク、コーク大学微生物学部

ロレイン・A・ドレイパー、クリストファー・J・R・ターキントン、マリオン・ダルマッソ、アンドレイ・N・シュコポロフ、コリン・ヒル

アイルランド、ファーモイ、ムーアパーク、ティーガス食品研究センター、食品バイオサイエンス部門

フィオナ・クリスピー & ポール・D・コッター

アイルランド、コーク、コーク大学精神医学・神経行動科学科

ティモシー・G・ディナン

貢献
N.L.R.、L.A.D.、V.L.P.、A.N.S.、G.M.M.、T.G.D.、C.H.およびJ.F.C.が研究を計画した。N.L.R.とV.L.P.が動物を用いた実験を行った。N.L.R.、L.A.D.、V.L.P.、M.v.d.W.、K.V.、C.F.、K.E.G.、A.B.およびM.D.がアッセイ、試料採取および処理を行った。T.F.S.B.、L.A.D.、C.J.R.T.、V.L.P.、H.H.、M.D.、F.C.およびP.D.C.がメタゲノム解析およびビロームシークエンシングを実施した。T.F.S.B.とG.M.M.はトランスクリプトーム解析を行った。N.L.R.とT.F.S.B.はデータを解析した。N.L.R.とJ.F.C.は、全著者の貢献により論文を執筆した。イラストはBioRender.com (YW260Q7D5T)とInkscape Project (http://www.inkscape.org/)で作成したグラフィックを一部使用した。

筆者
John F. Cryan宛。

倫理宣言
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。

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Nature Microbiology誌は、Dennis Nielsen氏、Caroline Menard氏、Kenny Chan氏、および本著作の査読に貢献した匿名査読者に感謝する。

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拡張データ
Extended Data 図1 研究のワークフローの概要。
(a) まず、腸内ビロームがストレスの影響を受けるかどうかを明らかにするために、慢性的な心理社会的ストレス後の行動、生理、マイクロバイオームの変化を評価した。(b)次に、ストレスを予防するためにビロームを利用できるかどうかを調べるため、ストレスを受けたマウスに自己糞便ビローム移植（FVT）治療を行ったところ、FVTが行動、生理、マイクロバイオーム、脳のトランスクリプトームに対するストレスの影響を抑制することがわかった。

Extended Data 図2 慢性的な心理社会的ストレス前後のマイクロバイオーム比較。
(a)慢性心理社会的ストレス前（Pre）と後（Post）のBacteriome Aitchison β多様性測定では、Preでは差は見られなかったが、PostではPERMANOVA（R2 = 0.1693、p < 0.01）により評価したところ有意な変化が見られた（n = 10 Ctr、Pre時点では3人でプール、n = 9 Stress）。(b)慢性的な心理社会的ストレスの前（Pre）と後（Post）で、Virome Aitchison β多様性を測定したところ、Preでは差異は認められなかったが、PostではPERMANOVA（R2 = 0.3011、p = 0.1）で評価したところ、変化の傾向が認められた（n = 10 Ctr、3人でプール；n = 10 Stress、3人でプール）。(c)バクテリオームのα多様性指標（Chao1、Shannon Entropy、Simpson Index）、独立標本両側T検定による評価では、前後で有意差は認められなかった（n = 10 Ctr、Preタイムポイントでは3つにプール、n = 9 Stress）。(d)ウイルス体アルファ多様性測定（Chao1、Shannon Entropy、Simpson Index）、独立標本両側T検定により評価したところ、前後で有意差は認められなかった（n = 10 Ctr、3人ずつプール、n = 10 Stress、3人ずつプール）。箱ひげ図として示したデータは、最小値、第1四分位値、中央値、第3四分位値、最大値を示している。

Extended Data 図3 ストレスによって変化し、FVTによって回復した細菌種と、FVT植菌の予測宿主分類群。
(a)ストレスによって影響を受け、FVTによって回復した細菌種の差分量（試験前（Pre）と試験後（Post））を線形混合効果モデルで比較した。StoreyのFDR検定（Ctr n = 10, Ctr Stress n = 8, FVT Stress n = 9）。(b-d)FVT接種ファージ宿主の系統レベル(b)、目レベル(c)、科レベル(d)での予測(FVTストレス n = 9)。箱ひげ図として示したデータは、最小値、第1四分位値、中央値、第3四分位値、最大値。

Extended Data 図4 慢性ストレスとFVT後の多様性と群集マイクロバイオームの測定値。
(a, b) バクテリオーム(a)とビローム(b)のAitchison β多様性距離、シャノンエントロピー、シンプソン指数（Ctr n = 10, Ctr Stress n = 8, FVT Stress n = 9）。(c, d)糞便中バクテリオーム(c)とFVT接種菌群と糞便中ビローム(d)の群集プロフィール（Ctr n = 10, Ctr Stress n = 8, FVT Stress n = 9）。箱ひげ図として示したデータは、最小値、第1四分位値、中央値、第3四分位値、最大値を示している。

Extended Data 図5 ファージ-宿主ネットワーク。
バクテリオファージと細菌量の有意な関連（q < 0.1）。有意な復元効果を持つファージ-宿主ペアの関連は完全に不透明である（P < 0.05）。データは両側線形モデルを用いて比較し、Benjamini & HochbergのFDRとPearson′s相関係数を用いてファージ-宿主ペアをプロットした。

図6 FVT接種による腸-脳および腸-代謝モジュール。
糞便ウイルソーム移植（FVT）接種株について、腸-脳モジュール（GBM）と腸-代謝モジュール（GMM）の機能的キャリッジを評価した。(a)FVT接種株で見つかったGBMは、ドーパミン合成、キノリン酸分解、S-アデノシルメチオニン（SAM）合成であった。(b)FVT株接種株で見つかったGMMは、アラビノキシラン分解、ホモアセト生成、メチオニン分解I、ムチン分解、ペクチン分解I、デンプン分解、硫酸還元（異化作用）であった。

Extended Data 図7 免疫細胞フローサイトメトリーのゲーティング戦略。
全血マーカーのパネルを用いて、FACSCelesta上で循環免疫細胞集団を評価した。このアプローチにより、最初に単一細胞をゲーティングし、次に末梢血単核球と生細胞（FVS780を使用）を選択した。好中球はLY6G+（PerCP-Vio700標識）とCD11b+（FITC標識）に基づいて選択された。単球は、LY6G-、CD11b+、LY6Chi（APC標識）で選別され、その後CD62L+細胞（Pe-Cy7標識）が定量された。

拡張データ表1 炎症性サイトカインと循環免疫細胞集団のデータ
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拡張データ表2 FVT腸脳モジュール
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拡張データ表3 FVT腸-代謝モジュール
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補足ソースデータ
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この記事の引用
リッツ、N.L.、ドレイパー、L.A.、バスティアンスセン、T.F.S.ら. 腸内ビロームは、マウスの行動と免疫応答におけるストレス誘発性の変化と関連している。Nat Microbiol (2024). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01564-y

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受領
2023年03月09日

受理
2023年11月17日

発行
2024年02月05日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41564-023-01564-y

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テーマ
バクテリオファージ
マイクロバイオーム
神経科学
Nature Microbiology (Nat Microbiol) ISSN 2058-5276 (オンライン)

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