青いうんち：新規マーカーを用いた腸管通過時間が腸内細菌叢に与える影響

2023年8月31日 10:44

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腸内細菌叢
オリジナル研究
青いうんち：新規マーカーを用いた腸管通過時間が腸内細菌叢に与える影響

https://gut.bmj.com/content/70/9/1665.long

Francesco Asnicar1、http://orcid.org/0000-0002-0531-4901Emily R Leeming2、Eirini Dimidi3、Mohsen Mazidi2、Paul W Franks4、Haya Al Khatib3,5、Ana M Valdes6、http://orcid.org/0000-0003-2050-3994Richard Davies5、Elco Bakker5、Lucy Francis5、Andrew Chan7、Rachel Gibson3、George Hadjigeorgiou5、Jonathan Wolf5、Timothy D Spector8、Nicola Segata9、Sarah E Berry3
Dr Sarah E Berry, Diabetes and Nutritional Sciences Division, King's College London, London WC2R 2LS, UK; sarah.e.berry@kcl.ac.uk。
要旨
背景と目的腸管通過時間は宿主とマイクロバイオームとの相互作用の重要な調節因子であるが、信頼できる方法が一般的に高価であったり負担が大きかったりすることもあり、見過ごされがちである。この単群単盲検介入研究の目的は、（1）腸管通過時間とヒト腸内細菌叢との関係、および（2）通過時間を測定するための安価で拡張可能な手法としての「青色色素」法の有用性を評価することである。

方法 PREDICT 1研究に参加した863名の健常人を対象に、腸内細菌叢の分類学的・機能的可能性プロファイル（ショットガンメタゲノムシークエンシングによるプロファイリング）、腸管通過時間（blue dye法による測定）、心代謝系の健康状態、食事との相互作用を評価した。

結果我々は、腸内細菌叢の分類学的組成が腸管通過時間のクラス間を正確に識別できること（受信者動作特性曲線下面積0.82）、より長い腸管通過時間がAkkermansia muciniphila、Bacteroides spp、Alistipes sppなどの特定の微生物種と関連していることを見出した（偽発見率調整p値<0.01）。青色色素を用いた腸管通過時間の測定は、便の硬さや回数といった典型的な通過時間プロキシよりも腸内細菌叢と最も強い関連を示した。

結論青色色素法で測定した腸管通過時間は、便の一貫性や頻度といった従来の指標よりも、腸内細菌叢の機能の指標として有益である。青色色素法は、食事-微生物-健康研究を推進するための大規模疫学研究に応用できる。臨床試験登録ウェブサイトhttps://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03479866、試験番号NCT03479866。

データ入手に関する声明
データは合理的な要求があれば入手可能である。メタゲノムはEBI ENAにアクセッション番号PRJEB39223で登録されている。本研究で解析に使用されたメタゲノム以外のデータは、キングス・カレッジ・ロンドンのDepartment of Twin Researchが保有しており、匿名化とGDPR基準の遵守を可能にするため、https://twinsuk.ac.uk/resources-for-researchers/access-our-data/。

https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
この記事は、Creative Commons Attribution 4.0 Unported (CC BY 4.0)ライセンスに従って配布されたオープンアクセス記事である。このライセンスは、原著作物が適切に引用され、ライセンスへのリンクが示され、変更が加えられたかどうかが示されていることを条件に、他の人がこの著作物をコピーし、再配布し、リミックスし、変形し、いかなる目的にもこの著作物を基に構築することを許可するものである。参照：https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2020-323877

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この研究の意義
このテーマについて既に知られていることは何か？
マイクロバイオーム研究において、腸管通過時間が共変量として考慮されることはほとんどない。

腸管通過時間を測定する現在の有効な方法には、コストが高い、参加者や研究者の負担が大きいなど、いくつかの限界がある。

新しい知見は何か？
青色色素法で測定される腸管通過時間は、従来の便の硬さや回数を測定する方法よりも、腸内マイクロバイオーム機能の指標として有益である。

腸内細菌叢の組成は腸管通過時間のクラスを予測し、腸管通過時間の長さはAkkermansia muciniphila、Bacteroides属、Alistipes属の相対量と関連している。

腸管通過時間は内臓脂肪量および食後測定値と独立して関連している。

予見可能な将来、臨床診療にどのような影響を与えるだろうか？
青色色素を用いた腸管通過時間の測定法は、大規模な疫学研究に応用でき、食事-微生物-健康研究を推進することができる。

はじめに
腸の健康」という用語には、栄養素の効果的な消化・吸収、免疫・内分泌系の正常な機能、腸内細菌叢と代謝、腸管運動が含まれる。腸管の正常な「運動性」は、腸の健康を維持する上で重要な要素である。腸管の正常な「運動性」は、腸管の健康を維持するための重要な因子である。腸管の運動性は、腸管収縮活動、腸壁の生体力学的機能（例えば、緊張やコンプライアンス）、管腔内内容物を推進する管腔内流動および通過など、測定可能ないくつかの現象から構成される。腸管通過時間の評価は、消化管に沿った管腔内容物の通過を意味し、腸管運動性および機能のマーカーとして一般的に用いられている2 3。腸管通過時間の測定は、宿主および微生物の代謝との関連性から健康に関連する。

腸管通過時間の測定には、シンチグラフィー、ワイヤレス運動性カプセル、放射線不透過性マーカー、呼気試験など、有効性が確認されている方法がいくつか存在する。専門的な機器とスタッフを必要とし、少なくとも1回は直接訪問する必要があるため、手間がかかり、不便で高価な手法となっている。このような制約があるため、腸管通過時間を評価するための、入手しやすく安価な技術の必要性が強調されている。実際、別の方法として、参加者の負担が少なく、より安価な腸管通過時間の代用マーカー、例えば便の硬さ4が使用されており、より大規模に適用できる可能性がある。カルミンレッド色素や青色色素法など、他の代替マーカーも使用されている。青色色素法はこれまでその妥当性が評価されておらず、生成された腸管通過時間データが宿主および微生物の代謝に及ぼす影響も調査されていない。

腸管通過時間と腸内細菌叢との間に関連性がある可能性は、腸の運動性と栄養の利用可能性に対する微生物の適応度の違いによって説明できるかもしれない。小規模および大規模な研究により、腸内細菌叢と通過時間との関連性が示されている4。さらに、慢性便秘の女性と健常対照者を対象とした研究では、有効なシンチグラフィー法で測定したところ、腸管通過時間の速さと腸管内細菌叢の多さに相関があることが明らかになった8。さらに、特定の微生物叢の種や機能と宿主の健康との関連を理解することは、微生物叢が健康に影響を及ぼす可能性のある機序を裏付けるだけでなく、症例／対照研究における通過時間の違いによる交絡の可能性のある変動から、疾患に関連する微生物叢の関連を切り離すためにも極めて重要である。

健常人の腸管通過時間と腸内細菌叢との関連を理解することは、腸内細菌叢が宿主の生理機能や健常状態と疾患状態との移行に影響を及ぼす可能性があることから、重要である10。腸管通過時間は、心代謝系の健康を含む宿主の代謝や健康だけでなく、食事との関連も示唆されている。例えば、腸管通過は栄養吸収や微生物組成を調節することにより、食後の血糖値や脂肪血症に影響を及ぼす可能性が提唱されている11。

この解析の目的は、新規で安価な腸管通過時間のマーカーを評価し、腸管通過時間と（1）便の一貫性と頻度、（2）腸内細菌叢の組成と機能、（3）心代謝系の健康と食事との関連を調べることである。これらの解析はPREDICT 1臨床試験（NCT03479866）において行われ、英国および米国の双子および血縁関係のない成人において、腸管通過時間、マイクロバイオーム、代謝、食事組成、および食事コンテキストの転帰を評価した。

材料と方法
PREDICT 1試験
PREDICT 1臨床試験（NCT03479866）は、標準化された食事に対する個人の代謝反応を定量化することを目的とした単群単盲検介入試験（2018年6月～2019年5月）である。本研究は、英国（n=1002、男性279人、女性723人、平均年齢45.58歳、標準偏差11.88歳）と米国（n=100、男性32人、女性68人、平均年齢41.33歳、標準偏差12.82歳）の双生児および血縁関係のない成人のデータを統合し、食事に対する個人の反応の予測因子を区別するために、遺伝子、代謝、マイクロバイオーム組成、食事組成および食事コンテキストのデータを探索する。完全なプロトコールと適格基準については、Berry et al.13を参照のこと。研究手順は、各参加者から書面によるインフォームド・コンセントを得た後に実施された。すべての著者が研究データにアクセスし、最終原稿を確認・承認した。

通過時間データ：青色色素法
参加者は、臨床受診の前日まで標準化された食事および生活習慣の指示に従った13。参加者は絶食状態で診療所に到着し、10分以内に「青色」マフィン2個（84.5g×2、Sugarflair Colours「ロイヤルブルー」食用色素ペーストをそれぞれ0.75g添加）をチョコレートミルク飲料とともに摂取した（食事の栄養組成については補足資料の臨床研究プロトコル13を参照）。青色色素はカルミンレッド色素より選択されたが、その理由は、第一に、ベジタリアン由来であること、第二に、同色または類似色の他の染色食品（例えば、ビーツ）による便中の視覚化を参加者が誤って報告するのを防ぐためである。参加者は、ZOE Global社が開発したAndroidおよびiOSデバイス用の特別な携帯電話アプリケーションを使用して、「青いうんち」の最初の出現を記録するよう求められた。マフィンを食べてから便に青色色素が初めて確認されるまでの時間を、青色色素法を用いて測定した。青色の出現日時（時間、分）は、参加者が関連するボタンをクリックした後、モバイルアプリケーション内に自動的に記録された。収集された腸管通過時間のデータは、以前に報告された値に基づいて3つのグループに分けられた14。しかし、正常な腸管通過時間を表す真ん中のグループは二峰性の分布を示したため、結果に記載されているように、さらに2つのクラスに分けられた。

Bristol Stool Formスケールと排便回数
参加者は、受診前または受診中に、便の硬さと排便回数に関する質問を含む質問票に記入した。(1)「過去7日間に何回排便がありましたか」（なし/1/2～3/4/6～7/7回以上）、(2)「以下の便表を使って、過去3ヵ月間の平均的な便の硬さをお答えください」（タイプ1/タイプ2/タイプ3/タイプ4/タイプ5/タイプ6/タイプ7）。Bristol Stool Form（BSF）スケール15の画像が、後者の質問とともに、説明文とともに表示された。

マイクロバイオームデータ
PREDICT 1参加者合計1098人（英国n=1001、米国n=97）について、最初の通過時間測定前の24時間以内に採取された便サンプルのショットガンメタゲノム配列決定が行われた。計算解析は、bioBakeryツール群16を用い、MetaPhlAn V.3.017で微生物種レベルの存在量を、HUMAnN V.2.0で遺伝子ファミリーおよびパスウェイの機能的ポテンシャルプロファイリングを行った18。本研究では、参加者がPREDICT 1研究に提供したベースライン時の便サンプルのマイクロバイオームプロファイルを使用し、青色で現れた最初の便サンプルのプロファイルは使用しなかった19。

食事データ
習慣的な食事データは、EPICを修正した食物摂取頻度調査票（FFQ）20を用いて収集した。PREDICT 1試験における食事指標（Plant-based Diet Index21 (PDI)、Animal Score、22-31 Alternative Mediterranean Diet Index32 (aMED)、Healthy Eating Index 201033 (HEI)、Healthy Food Diversity Index34(HFD)）の収集、処理およびFFQへの適用については、以前に詳述されている35。

ヘルスマーカーデータ
グルコース、トリグリセリド（TG）、インスリン、Cペプチド（インスリンの代用として）、インターロイキン（IL）-6、メタボロミクス（NMR）の血清濃度を測定するために、空腹時および食後（0～6時間の9つのタイムポイント）の静脈血を採取した。

機械学習
機械学習（ML）分析は、「scikit-learn」Pythonパッケージ（V.0.22.2）を用いて行った。トレーニングセットとテストセットを80/20にランダムに分割し、100回のブートストラップ反復を繰り返すクロスバリデーション法を採用した。我々のデータセットに特有なオーバーフィッティングを避けるため、双子のペアがテストセットに存在する場合は、トレーニングセットから双子を取り除いた。MetaPhlAn 3.0によって推定された種レベルの分類学的相対存在量と、arcsin-sqrt変換を使用して正規化された組成データ、およびHUMAnN2によって提供された単一微生物遺伝子ファミリーの相対存在量推定値とパスウェイレベルの相対存在量の機能ポテンシャルプロファイルについて、ランダムフォレスト（RF）分類を使用しました。RF分類タスクでは、RandomForestClassifier関数を "n_estimators=1000, max_features='sqrt'"パラメータで使用した。回帰タスクでは、RF回帰器を訓練した（RandomForestRegressor関数、パラメータは "n_estimators=1000, max_feature=sqrt"）：「n_estimators=1000,criterion='mse',max_features='sqrt'"）と、出力値の範囲を較正するための線形回帰器（LinearRegression関数、デフォルト・パラメータ）を学習した。

統計解析
異なる腸管通過時間クラス、ブリストル便のタイプ、便通のカテゴリー間の統計的有意性は、Mann-Whitney U検定（'scipy' Pythonパッケージの'mannwhitneyu'関数、V.1.3.2）を用いて検定した。マイクロバイオームベータ多様性に関する4つの腸管通過時間クラス間の差異を推定するパーマノバ解析は、Rパッケージ'vegan' (V.2.5-6)の'anosim'関数と'adonis2'関数を用いて行った。

構造方程式モデリング分析
各曝露（食事、マイクロバイオーム、腸管通過時間）とアウトカム（血圧（平均収縮期および拡張期）、炎症（平均空腹時GlycAおよびIL-6）、食後反応（平均ピークグルコースおよびトリグリセリド濃度）、内臓脂肪）との関係を示すために、構造方程式モデリング（SEM）を用いた。マイクロバイオームデータを1つの特徴量として表現するために、微生物種の相対量について学習させたML回帰タスクの結果を用いて、腸管通過時間を予測した。モデルは共分散行列を用いた最尤フレームワークの下で適合させた。相対的なモデルの適合度は、比較適合度指数（CFI）（0（適合なし）～1（完全適合））を用いて評価した36。絶対的な適合度は、近似の二乗平均平方根誤差を用いて評価した。値は標準化され、複合データ（血圧、炎症、グルコースとトリグリセリドのピーク濃度）の平均値が用いられた。

データの利用可能性
メタゲノムはEBI ENAにアクセッション番号PRJEB39223で登録されている。本研究で解析に使用したメタゲノム以外のデータは、キングス・カレッジ・ロンドンのDepartment of Twin Researchが保有しており、匿名化と一般データ保護規則（GDPR）基準の遵守を可能にするため、https://twinsuk.ac.uk/resources-for-researchers/access-our-data/。

結果と考察
PREDICT 1試験では、分類学的および機能的プロファイルを特徴付けるために便サンプルのショットガンメタゲノムシークエンシングを用いて、腸内マイクロバイオーム、心代謝系の健康、および食事（n=1102）の相互作用を、心代謝系の健康の血液測定、標準化された食事に対する食後反応、および習慣的な食事データとともに評価した37。われわれは以前、マイクロバイオームの個々の構成要素と、食事-代謝-健康の共有微生物シグネチャーの両方を同定し、好ましい分類群と好ましくない分類群を、食事摂取と心代謝系健康の両方の複数の指標と分離した35。ここでは、PREDICT 1コホートにおいて新規の青色色素法を用いて評価した腸管通過時間の測定値を報告する（「材料と方法」のセクションを参照）。計866人（英国778人、米国88人）のデータが得られた（オンライン補足表1）。青いマフィンのプロトコールへの導入が遅れたこと（n=171）、およびトランジットタイムを報告しなかった参加者が多数いたこと（n=61）のため、全参加者のデータは入手できなかった。トランジットタイムのデータがない参加者は、（年齢、肥満度、シャノン指数、BSFスケールにおいて）他のコホートと差がなかった。

補足資料
[gutjnl-2020-323877supp001.xlsx]
大規模集団における腸管通過時間の安価な推定：青色色素法
腸管通過時間は、標準化されたマフィンに含まれる青色色素を摂取してから、便の中に目に見える青色を伴って最初に排泄されるまでの時間として測定された（図1Aおよび材料と方法のセクション）13。

図1
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図1
PREDICT 1コホートにおける腸通過時間の推定。(A) 腸管通過時間に焦点を当てたPREDICT 1試験デザイン（Biorender.comで作成）。(B）腸通過時間分布のヒストグラム。オレンジ色の縦線が4つのクラス（C1：速い腸通過時間、C2とC3：通常の腸通過時間、C4：遅い腸通過時間）の境界を示している。(C）C1、C2、C3、C4について、それぞれ平均0.38日、1.02日、2.01日、4.21日を示す4つの腸管通過時間クラスのバイオリンプロット。半対数スケールを用いた別の可視化はオンライン補足図1Aに掲載されている。(D)ブリストル便のタイプ、(E)PREDICT 1試験開始前1週間の排便回数に関する腸通過時間の分布。アスタリスクは、p値＜0.01のMann-Whitney U検定による統計的に有意な差を示し、10サンプル未満のカテゴリーでは有意性の検定は行わなかった。

補足資料
[gutjnl-2020-323877supp002.pdf]
腸通過時間の3群は、以前に報告された腸通過時間の標準値14に基づいて割り当てられた：（G1）＜14時間-速い腸通過時間；（G2）14～58時間-普通の腸通過時間；（G3）≧59時間-遅い腸通過時間。G2における正常な腸通過時間の分布が二峰性であったため、さらに14～38時間と38～58時間の2つのクラスに分割され（図1B）、合計4つの異なる腸通過時間クラスとなり、C1ではn=79であった（平均0. 38日、SD 0.14日）、C2-正常（平均1.02日、SD 0.19日）、C3-正常（平均2.01日、SD 0.16日）、C4-低速（平均4.21日、SD 1.45日）であった（図1C、オンライン補足図1A）。

腸管通過時間と便の形態および回数との関連
BSFスケールスコアが低いほど腸管通過時間が長く（タイプ1で中央値5日以上）、BSFスケールスコアが高いほど腸管通過時間が短い（タイプ6で中央値1日、図1D）。

便通イベントの頻度は、PREDICT 1試験開始前の1週間に報告された（「材料と方法」の項を参照）。参加者は、排便回数が1～3回（32.8％）または7回以上（67.2％）と報告した。排便回数が4～6回と報告した参加者はいなかった。これまでの研究で、硬い小便は排出が困難であることが示されている一方、排便は24時間ごとにまとまって起こるようである38 39。したがって、排便頻度の低い人が排便を促すのに十分な大きさの便意を生じるには、排便の間に最低24時間必要である可能性がある。排便頻度と腸管通過時間を比較すると、統計的に有意に腸管通過時間が長いほど、1週間の排便回数が少ないことと関連していた（p値=1.2e-8、図1E）。要約すると、青色色素法で測定した腸管通過時間は、便の硬さと負の相関があり、便の回数と正の相関があることが大規模研究で確認された。

腸内細菌叢と腸通過時間の間には非常に強い関連性が存在する
われわれは、微生物の分類学的および機能的プロファイルを考慮しながら、腸内通過時間と腸内マイクロバイオームとの潜在的な関連性を調査した。動物実験では、腸管通過時間が腸内細菌叢の組成と機能に影響を及ぼすこと、また薬剤による腸管通過時間の変化が遠位腸の微生物組成に影響を及ぼすことが確認されている40。しかし、青色色素法で前向きに測定した腸管通過時間が腸内細菌叢に及ぼす影響は、ヒトを対象とした大規模な研究では確認されていない。このギャップを解決するために、我々はまず、1つのマイクロバイオームサンプルがどれだけ多様であるかを反映するα多様性を、豊かさの指標（すなわち、検出された種の数、図2A）と、均等性と存在量の両方を考慮するシャノン指数（オンライン補足図1B）を用いて調べた。α多様性（豊富度とシャノン指数の両方、それぞれp値=1.7e-4と7.1e-6）と腸管通過時間（図2A、オンライン補足図1B）において有意な正の傾向が観察され、先行研究と一致した4。さらに、腸管通過時間が長くなると、管腔内の基質時間が長くなり、大腸微生物叢による炭水化物（CHO）とタンパク質の利用・発酵が促進され、微生物の多様性が高まる可能性がある。易発酵性基質（すなわちCHO）の枯渇は、タンパク質分解性発酵：糖質分解性発酵の比率を高め、増殖の遅い種の増殖を助けることが示されている4 42。タンパク質分解性発酵のアップレギュレーションは、短鎖脂肪酸（SCFA）を犠牲にして分岐鎖脂肪酸の生産を高め、宿主の健康に対するSCFAの有益な影響の一部を減少させると考えられている43-45。

図2
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図2
マイクロバイオーム組成は、Bristol Stool Form（BSF）スケールや排便回数よりも優れた腸通過時間の予測因子である。(A）4つの腸通過時間クラスのシャノンアルファ多様性分布（統計的に有意な差、p値＜0.01、強調表示。） (B）腸管通過時間クラスによって色分けされたマイクロバイオームサンプルのBray-Curtisペアワイズ距離のPCoAプロット（オンライン補足表2参照）。(C）機械学習（ML）分類器による2つの極端な腸通過時間クラスの予測能力を示す受信者動作特性（ROC）曲線： C1対C4（曲線下面積（AUC）=0.82）、および2つの中間クラスを考慮した場合： C1およびC2対C3およびC4（AUC=0.73）。比較のために、BSFタイプ1、2、3対タイプ4、5、6の予測におけるROC曲線も示した（AUC=0.65）。(D) 種の相対存在量と機能パスウェイ情報（機能的遺伝子ファミリーはオンライン補足図2Aで報告）を用いた場合の腸管通過時間クラスのML分類マトリックス。(E)シャノン指数とブリストル便のタイプで測定したアルファ多様性（リッチネスとして測定したアルファ多様性についてはオンライン補足図1Cを参照）。(F)シャノンアルファ多様性腸の動き（リッチネスとして測定されたアルファ多様性についてはオンライン補足図1Dを参照）。(G)便通のML分類マトリックスについて、生物種と機能パスウェイの相対量（オンライン補足図2Bおよびオンライン補足図2C-Dで報告された機能遺伝子ファミリー）を用いたブリストル便タイプのML分類マトリックス。

補足資料
[gutjnl-2020-323877supp003.xlsx]
補足資料
[gutjnl-2020-323877supp004.pdf]
次に、異なる腸通過時間クラス内の参加者の微生物組成が有意に異なるかどうかを検証した（Permutational Multivariate Analysis of Variance（PERMANOVA）分析に基づく）。その結果、C1-fast対C4-slowは、β多様性（Bray-Curtis非類似度）の分散の17.1％を説明し、11.5％を説明するBSFタイプよりも強い効果を示した（図2Bおよびオンライン補足表2）。PERMANOVA分析によると、C1-fast対C2-normalを除くすべての腸通過時間クラスが有意（p値＜0.01）であった（オンライン補足表2）。

腸管通過時間と腸内細菌叢とαおよびβ多様性との関連性を考慮し、腸内細菌組成と機能プロファイルが4つの腸管通過時間クラスを予測するかどうかを検討した（図2C-D）。ML分類タスク（先行研究35および「材料と方法」のセクションを参照）を用いて、まず2つの極端な腸内通過時間クラスを区別した。これらのクラスは、β多様性解析によると微生物組成に高い差異を示したからである（図2B）。MetaPhlAn17（V.3.0、材料と方法のセクションを参照）で推定されたC1-fastとC4-slowの種相対量のみを使用すると、分類曲線下面積（AUC）は0.82となった（図2C）。これは2つの極端なクラスを比較した影響ではないことを確認するため、C1-fastとC2-normalの両方を1つのクラスとして、C3-normalとC4-slowの両方をもう1つのクラスとして考慮したところ、ML分類タスクのAUCは0.72となり（図2C）、腸管通過時間と腸内細菌組成の間に直接的な関係があることが示唆された。この結果は、腸管通過時間の代用として便の一貫性のみを用いた以前の大規模研究と一致しており、腸管通過時間は、評価した69の共変量のうちマイクロバイオーム組成に寄与する共変量のトップであることが明らかになった7。さらに、HUMAnN2によって推定されたパスウェイ（図2D）および遺伝子ファミリー（オンライン補足図2A）の相対的存在量と同様に、種の相対的存在量もモデル内に含めることで、これらの関連性を調査した18。マイクロバイオームは、種の相対的存在量（図2D、上部の三角形）および機能的パスウェイの相対的存在量（図2D、下部の三角形）に依存する場合の両方で、腸管通過時間クラスの各一対比較における差異をうまくモデル化した。興味深いことに、C1-fastとC2-normalの比較が最も明確でなかったのに対し、新たに定義された正常な腸管通過時間の2つのサブクラス（すなわち、C2-normalとC3-normal）は、およそ1日と2日に相当し、より明確なマイクロバイオーム構成を示した。

先に示したマイクロバイオームとトランジットタイムの関連を検証するため、研究調査において腸内トランジットタイムの代用として一般的に使用されているBSFスケールと排便回数が同様の結果をもたらすかどうかを調べた4 15。いくつかの比較では統計的に有意な結果が得られたが（p値＜0.01）、腸内細菌叢とBSFスケールおよび排便頻度との間の関連は、青色色素法による腸内細菌叢と腸管通過時間との間に観察された関連と比較して、MLを用いた場合には弱かった（図2Gおよびオンライン補足図2B-D）。特に、2つの極端な腸通過時間クラス（253人）は、2つの極端なブリストル便タイプ2と6（117人）よりも代表的であると考えられる。同様に、C1-fastおよびC2-normal対C3-normalおよびC4-slowの腸通過時間について得られたAUC0.72（図2C）と、タイプ1、2および3対タイプ4、5および6を考慮してBSFスケールについて同様の比較を行うと、AUC0.65が得られた（図2C）。要約すると、腸内細菌叢は腸管通過時間と強く関連しており、この関連性は便の回数や一貫性よりも強いようであることがわかった。

マイクロバイオームとトランジットタイムの関連性の明確なドライバーとなる細菌群
腸管通過時間とマイクロバイオームとの間に同定された関連性を考慮し、腸管通過時間が短いか長いかに関連する可能性のある単一菌種を同定することを目的とした。まず、2つの極端な腸通過時間クラスC1-fastとC4-slowの相対存在比が少なくとも2倍以上の種を検討し（図3A）、次に平均相対存在比が1％を超える有意な種を検討し、4つの腸通過時間クラスにおける分布を示した（図3Bおよびオンライン補足表3）。すべての生物種は腸管通過時間が長いほど相対存在量が増加したが、Eubacterium rectaleは腸管通過時間が長いほど相対存在量が減少した。E. rectaleは糖分解菌46 47であるため、タンパク質分解代謝に切り替わる腸通過時間が長くなると、その存在量が減少する可能性がある。Akkermansiaムチニフィラ（Akkermansia muciniphila）48 49やバクテロイデス（Bacteroides）属、アリスティペス（Alistipes）属は、バクテロイデス門に属し、腸管通過時間が長いほど多く、先行研究と同様であった4 50。A.ムチニフィラ（A. municiphila）も以前、健康な女性53人の小規模コホートにおいて、腸管通過時間と正の相関があることが示されている4。注目すべきことに、本研究で腸管通過時間が長いほど高いことが示されたRuthenibacterium lactatiformansは、同じPREDICT 1コホートにおいて、より悪い心代謝系健康のマーカーと関連している35。

補足資料
[gutjnl-2020-323877supp005.xlsx]
図3
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図3
腸内通過時間に関連する腸内細菌叢の種と機能的経路。(A）少なくとも2倍のエフェクトサイズを持つ12種の差分有意種（偽発見率（FDR）補正後のp値＜0.01）のC1およびC4腸通過時間クラスにわたる存在量。(B)有意なバイオマーカー種のうち、PREDICT 1における相対存在量の少なくとも1%の平均値で同定されたバイオマーカー種の、4つの腸管通過時間クラスにおける相対存在量。 (C)有意（FDR補正後p値<0.01）で、少なくとも2倍のエフェクトサイズを持つ機能パスウェイの相対存在量。(D）腸管通過時間（32）とBristol Stool Form（BSF）スケール（11）について同定されたFDR補正後の有意な種（うち10種は共有）。

次に、パスウェイと遺伝子ファミリーの機能データを用いて同様の解析を行ったところ、腸管通過グループ間ではパスウェイの違いが生物種の違いよりも顕著であることが示された。我々は、少なくとも2倍のエフェクトサイズ（パスウェイ存在量の中央値の比）を持つ有意なパスウェイ（FDR調整p値<0.01）を考慮し、4つの腸通過時間クラスに従ってそれらの分布をプロットした（図3Cおよびオンライン補足表3）。腸管通過時間が長いほど、ピルビン酸からプロパン酸への発酵が高いことが示された。注目すべきは、H2とCO2からのメタン生成の増加も腸通過時間が長いほど見られたことで、便秘の人に観察されたメタン生成の増加51や、腸通過時間が長いほど観察されたMethanobrevibacter属の増加4と一致している。しかし、以前の症例対照研究では、呼気メタン生成は腸通過時間ではなく糞便微生物叢組成と関連することが示唆された8。この微生物シグネチャーが腸通過時間に特異的であるかどうかを理解するために、BSFスケールの両極端（タイプ1と2対タイプ5と6）を特徴づける有意な種（FDR調整p値<0.01）を同定したところ、腸通過時間と共有されたのはわずか10種であった（図3D）。

まとめると、ショットガンメタゲノムシーケンスにより、微生物群と通過時間の関連性の明確なドライバーが明らかになった。より具体的には、ピルビン酸発酵とメタン生成に関連する経路は、トランジットタイムが長いほど増加し、A. muciniphilaもトランジットタイムの長さと関連していた。これらの知見は、腸内細菌叢が健康な集団において宿主の生理機能や機能に影響を与えるメカニズムについて理解を深める可能性がある。

腸管通過時間と食事および心代謝指標との直接的な関連は限定的
食事とマイクロバイオームの関係は、食事とマイクロバイオームの両方が宿主の健康に及ぼす影響とともに、十分に特徴づけられている。腸管通過時間の測定値と予測値の相関を評価した。比較のために、食事と心代謝マーカーを予測するために種の相対存在量で訓練したML回帰タスクの性能を報告し、腸通過時間がマイクロバイオーム組成と関連する変数の上位にあることを示した（図4）。

図4
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図4
健康マーカーと食事の予測におけるマイクロバイオーム・プロファイルと腸管通過時間。マイクロバイオーム。健康マーカー、食事パターン、栄養素（エネルギー摂取量で調整したものとそうでないもの）、食品群、単一食品について、腸管通過時間（100倍表示）および各マーカーの中央値を予測するための機械学習（ML）回帰タスクの学習に使用したマイクロバイオーム種の相対存在量の箱ひげ図。腸管通過時間は、マイクロバイオーム種プロファイルを用いた予測可能な結果としては、健康マーカーや食事よりも優れているようである。腸管通過時間。腸管通過時間とマイクロバイオーム関連マーカーおよび食事関連マーカーとの相関の箱ひげ図。腸管通過時間とマイクロバイオーム関連マーカーには、2つのアルファ多様性指標（リッチネスとシャノン）、および平均相対存在量に基づく上位5つの系統ごとの最も豊富な10種までが含まれる。腸管通過時間および食事関連マーカーには、単一栄養素およびエネルギー調整栄養素、単一食品およびPlant-based Dietary Indexに従って食品群に分類された食品、食事指標、および微生物心代謝健康シグネチャーを定義するために以前の研究35で使用された19の健康マーカーが含まれる。10ポイント未満のマーカーについては箱ひげ図を削除した。

腸管通過時間とマイクロバイオームおよび食事関連マーカーとの関連を調べるために、2つのアルファ多様性指標、リッチネスとシャノン指数、および上位5つのフィラの上位10種の相対存在量（平均相対存在量が高い）を考慮した。食事関連マーカー（FFQから推定）については、栄養素とエネルギー調整栄養素、単一食品項目、食品群、食事指標を考慮した。検討した心代謝系健康マーカーは、健康の微生物シグネチャーを定義するために以前35に使用されたマーカーである。これらの結果は、微生物ベースの特徴よりも全体的に低い相関値を示している（図4およびオンライン補足表4）。注目すべきは、これらの知見に従って、19の心代謝系健康マーカーを予測するML分類タスクに、腸通過時間を追加特徴として考慮したことである。その結果、19個のマーカーに対して17個のマーカーでは平均0.78％のAUCの低下、19個のマーカーに対して2個のマーカーでは平均0.44％のAUCの上昇を示した（オンライン補足表5）。このことは、腸管通過時間が習慣的な食事と直接関連しないこと、あるいはマイクロバイオームの寄与に関しては関連性が冗長であることを示唆しているのかもしれない。栄養学的介入は動物実験でもヒト試験でも腸通過時間に影響を及ぼすことが示されているので、これは驚くべきことである。さらに、短期間の食事介入において以前に報告されているように、食事は腸通過時間に一過性の影響を及ぼす可能性がある54-56。したがって、FFQによる習慣的な食事情報は、腸通過時間に対する食事の影響を決定する上で、短期間の食事暴露を捕捉する詳細な前向き食事記録ほど洞察に富まない可能性がある。さらに、FFQには、測定誤差、摂取可能な食品の限定リスト、推定ポーションサイズの不正確さなど、いくつかの限界がある。さらに、腸の運動性に影響を及ぼす神経筋機能が、食事や腸内細菌叢とは無関係である可能性もある。例えば、中枢神経系や腸神経系、免疫系や内分泌系も腸の運動性に影響を与えることが示されている51。

補足資料
[gutjnl-2020-323877supp006.xlsx]
補足資料
[gutjnl-2020-323877supp007.xlsx]
腸管通過時間、マイクロバイオーム、食事、健康の相互関係モデル
食事、マイクロバイオーム、腸管通過時間がその後の健康影響に及ぼす相互関係は複雑であるため、SEMを用いてそれらの相対的影響を調査した。SEM（曝露とアウトカムの詳細は「材料と方法」の項を参照）は良好な適合を示した（χ2：20.2、CFI：0.98、二乗平均平方根誤差： 0.98、二乗平均平方根近似誤差：効果の推定値は図5とオンライン補足表6に示されている。腸通過時間とマイクロバイオームは互いに強く関連していた（β=0.98）。腸管通過時間は内臓脂肪（β=0.83）および食後反応（β=0.69）と独立した正の相関を示した；腸管通過時間が長いほど内臓脂肪が多く、食後反応が高いことが予測された（いずれも心血管疾患の独立した危険因子）。逆に、マイクロバイオームは内臓脂肪（β=-0.87）および食後反応（β=-0.68）と独立して負の相関を示した。興味深いことに、腸管通過時間とマイクロバイオームはともに血圧や炎症とは関連がなかった。予想通り、食事の質（HEIで測定）はすべての健康指標と独立して負の相関を示した。しかし、食事の質と腸管通過時間との関連は認められず、ML回帰課題分析から得られた知見と一致した。

補足資料
[gutjnl-2020-323877supp008.xlsx]
図5
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図5
マイクロバイオーム、腸管通過時間、食事と健康指標との関係を決定する構造方程式モデル。血圧（収縮期および拡張期の平均値）、炎症（空腹時GlycAおよびIL-6の平均値）、食後反応（グルコースおよびトリグリセリド濃度のピーク値の平均値）、内臓脂肪。モデルの定義。ボックスは顕在ノードを表し、矢印は回帰の結果を指す回帰係数を示す（標準化ベータ値は、暴露間の関連を除く有意な関連（p値＜0.05）についてのみ各矢印に記載）（Biorender.comにより作成）。

結論
ここで我々は、新規かつ安価で拡張可能な腸管通過時間の評価法を開発・評価し、健常人における腸管通過時間と（1）便の一貫性および頻度、（2）腸内細菌叢の組成および機能、（3）習慣的な食事および心代謝系の健康との関連を検討した。青色色素法は、専門スタッフや診療所への訪問を必要とせず、被験者はスーパーマーケットで普通に手に入る材料を用いて遠隔で評価を行うことができるため、この方法は、腸管通過時間と機能を評価するための大規模な疫学研究に使用される可能性がある。我々は初めて、青色色素法を用いて測定した腸管通過時間が、便の粘性や回数、微生物のアルファ多様性や腸内マイクロバイオーム組成と強い相関があることを観察した。後者は、青色色素で分類された異なる腸管通過クラスター間で、特に腸管通過が速いクラスターと遅いクラスター間で区別することができ、いくつかの細菌種が微生物群と通過時間の関連性の明確なドライバーであることが示された。注目すべきことに、腸管通過時間は、便の一貫性や便の回数よりも、相対的存在量とアルファ多様性の両面で、腸内細菌叢のばらつきをより多く説明した。このことは、青色色素法で測定した腸管通過時間が、便の一貫性や回数よりも、健康な人の大規模コホートにおける腸機能の指標としてより有益である可能性を示している。さらに、青色色素法は、健康状態の重要な指標である健康な人の食後の脂質およびグルコース反応と内臓脂肪の予測も可能であった。したがって、青色色素法の利用は、精密医療を進歩させるパズルのもう一つのピースを提供する可能性がある。したがって、今後の研究では、腸管通過時間が目標とするアウトカムに与える影響を評価・検討するだけでなく、腸管通過時間の評価に標準化されたアプローチを採用することを目指すべきである。

本研究は、腸管通過時間の新規で安価なマーカーを評価し、健康な集団における腸管通過時間と腸内細菌叢との関連を検討した初の大規模研究であるが、多くの限界があることを認識すべきである。第一に、青色色素法は、放射線不透過性マーカー法やシンチグラフィーのような他の腸管通過時間測定法に対して検証されていない。しかしながら、我々はこの方法を腸管通過時間の代用であることが確認されている便の一貫性と比較した15。それにもかかわらず、便の一貫性は過去3ヶ月間の想起に基づいて評価されたため、便の一貫性を想起することに関して以前から指摘されている問題点を考慮すると、不正確なデータが得られた可能性がある57。今後の調査においては、先行サンプルではなく、青色便をシーケンスすることが推奨されるであろう。さらに、その後の便における青色色素の出現期間を記録すれば、さらなる知見が得られたかもしれないが、本研究では記録されなかった。

結論として、今回の結果から、青色色素法は新規かつ安価で拡張可能な腸管通過性評価法であり、腸の健康と代謝に関する貴重な知見が得られることが示された。研究および臨床の場で広く使用されることで、腸の機能とその決定因子、ならびに腸の生理機能と健康転帰との間の複雑な相互作用に関する理解が促進される可能性がある。

データ入手に関する声明
データは合理的な要求があれば入手可能である。メタゲノムはEBI ENAにアクセッション番号PRJEB39223で登録されている。本研究で解析に使用したメタゲノム以外のデータは、キングス・カレッジ・ロンドンのDepartment of Twin Researchが保有しており、匿名化とGDPR基準の遵守を可能にするため、https://twinsuk.ac.uk/resources-for-researchers/access-our-data/。

倫理声明
公表に関する患者の同意
不要

倫理承認
本試験は、英国ではResearch Ethics CommitteeおよびIntegrated Research Application System（IRAS 236407）により、米国ではPartners Healthcare Institutional Review Board（IRB 2018P002078）により承認された。本試験はヘルシンキ宣言およびGood Clinical Practiceに従って実施された。

謝辞
PREDICT 1試験の参加者に感謝する。ZOE Global Ltd、Department of Twin Research、Massachusetts General Hospitalのスタッフ、Berry研究室、Segata研究室、Spector研究室のメンバーの皆さんには、試験運営、データ収集、データ処理に多大な貢献をしていただきました。

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このWebのみのファイルは、著者から提供された電子ファイルからBMJ Publishing Groupが作成したものであり、内容の編集は行っていない。

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脚注
TDS、NS、SEBは共同上席著者。

Twitter @EmilyLeemingRD、@EiriniDimidi、@nsegata、@saraheeberry。

FA、ERL、EDは同等に貢献した。

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貢献者構想： SB、AV、JW、GH、HAK、RD、NS、PF、TDS。データキュレーション： SB、NS、FA、TDS、RD。形式分析： FA、SB、NS、ERL、ED、MM、LF。資金獲得： JW、GH、TDS。調査： SB、GH、HAK、ERL、NS、FA。方法論： SB、AV、JW、GH、HAK、RD、NS、PF、TDS、FA、ERL。プロジェクト管理： SB、NS、ERL、TDS、FA、GH、JW、ED。リソース TDS、NS、JW、GH。ソフトウェア： NS、FA、RD、EB。監督： SB、NS、PF、ERL。バリデーション： FA、NS、RD。視覚化： NS、SB、ED、FA、MM、ERL。原案作成： NS、FA、SB、ED、ERL、MM、TDS、PF。執筆-レビューと編集： NS、FA、SB、ED、ERL、MM、RG、AC、TDS、PWF、AV、JW、GH、HAK、RD、EB、LF。

資金提供この研究は、Zoe Global Ltdおよび欧州研究評議会（ERC-STGプロジェクトMetaPG）からNSに、MIUR 'Futuro in Ricerca'（助成金No. RBFR13EWWI_001）からNSへ、欧州H2020プログラム（ONCOBIOME-825410プロジェクトおよびMASTER-818368プロジェクト）からNSへ、米国国立衛生研究所がん研究所（1U01CA230551）からNSへ、Premio Internazionale Lombardia e Ricerca 2019からNSへ。AMVはNIHRノッティンガムBRCの支援を受けた。TwinsUKは、ウェルカム・トラスト、医学研究評議会、欧州連合、慢性疾患研究基金（CDRF）、ゾーイ・グローバル社、およびキングス・カレッジ・ロンドンと提携し、ガイズ・アンド・セント・トーマスNHS財団トラストに拠点を置く国立保健研究所（NIHR）の資金提供によるバイオリソース、臨床研究施設、生物医学研究センターから資金提供を受けている。

競合利益 TDS、SB、FA、PF、AV、AC、ERLおよびNSは、ゾーイ・グローバル社（以下「ゾーイ社」）のコンサルタントである。JW、GH、RD、HAK、LF、EBはゾーイの従業員、または過去に従業員であった。その他の著者は利害の対立はない。本試験のスポンサー（Zoe Global Ltd；JWおよびGH）は、PREDICT 1試験の科学諮問委員会の一員として、試験デザインと収集に貢献した。EDはAlpro社から教育助成を受け、英国栄養士会、カリフォルニア州アーモンド協会、国際ナッツ・ドライフルーツ協会、Nestec Ltdから研究助成を受け、Puratos社のコンサルタントを務めている。SBはカリフォルニア・アーモンド委員会およびマレーシア・パーム油委員会から研究助成を受けている。

証明と査読委託ではなく、外部査読。

補足資料本コンテンツは著者から提供されたものである。BMJ Publishing Group Limited（BMJ）の審査を受けておらず、査読を受けていない可能性がある。また、査読を受けていない可能性もある。議論されている意見や推奨事項はすべて著者のものであり、BMJが承認したものではない。BMJは、本コンテンツに依拠することから生じるすべての責任および義務を否認します。コンテンツに翻訳されたものが含まれる場合、BMJは翻訳の正確性および信頼性（現地の規制、臨床ガイドライン、用語、薬剤名、薬剤投与量を含むが、これらに限定されない）を保証せず、翻訳および翻案その他から生じる誤りおよび／または脱落について責任を負わない。

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オンライン ISSN: 1468-3288プリント ISSN: 0017-5749
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