ヒト腸内における微生物の相互摂食相互作用の疾患特異的消失
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出版：2023年10月20日
ヒト腸内における微生物の相互摂食相互作用の疾患特異的消失
https://www.nature.com/articles/s41467-023-42112-w
ヴァネッサ・R・マルセリーノ、ケイトリン・ウェルシュ、...サミュエル・C・フォースター 著者一覧を見る
ネイチャーコミュニケーションズ14巻、論文番号：6546（2023） この記事を引用する
メトリクス詳細
要旨
ヒトの健康にとって重要な腸内微生物の多くは、生存のために互いが生産する栄養素に依存している。しかし、このような相互摂食の相互作用を定量化することは依然として困難であり、その特性は十分に明らかにされていない。しかし、このような相互摂食相互作用の定量化は未だ困難であり、その特性は十分に明らかにされていない。ここでは、このような相互作用を定量化するためのMetabolite Exchange Score（MES）を紹介する。1600個体以上の原核生物メタゲノム集合ゲノムの代謝モデルを用いて、MESは、11疾患中10疾患において、相互摂食パートナーの喪失によって顕著な影響を受ける代謝相互作用を同定し、ランク付けすることを可能にした。クローン病の症例対照研究に適用したところ、我々のアプローチは、硫化水素を消費する能力を持つ生物種の欠如を、疾患におけるマイクロバイオームの主な特徴として同定した。我々の概念的枠組みは、詳細な分析、実験、臨床ターゲットの優先順位付けに役立ち、微生物の相互摂食相互作用の回復を標的とすることは、健康な腸内生態系を再構築するためのメカニズムに基づいた有望な戦略であることを提案する。
はじめに
ヒトの腸内には数百種の微生物が存在し、複雑で相互依存的な代謝ネットワークを形成している。腸内微生物が消費する代謝産物の半分以上は、微生物代謝の副産物1であり、ある種の廃棄物が他の種の栄養素となっている2,3,4。種の相互依存は、ニッチを埋める代替種が存在しない限り、パートナーが失われた場合5、微生物が局所的な絶滅の危機にさらされる可能性がある。この文脈では、同じ栄養素を生産または消費する能力を持つ、機能的に冗長な種が存在することは、宿主にとって有益である。機能的な冗長性が高いことが、回復力のあるヒト腸内細菌叢の特徴であることは一般に認められているが6,7,8、代謝相互作用における冗長性がヒトの健康に及ぼす影響については、まだほとんど解明されていない。相互摂食微生物の多様性を回復させることは、バランスの悪い腸内細菌叢に関連する様々な疾患と闘うための論理的な手段であるが、まだほとんど解明されていない。
微生物の代謝をインシリコでシミュレートするメカニズムモデルは、微生物の代謝相互作用に関する知識のギャップを埋める可能性を秘めている4,9。ゲノムスケール代謝モデル（GEM）は、遺伝子を生化学的・生理学的プロセスに関連付ける、ますます包括的なデータベースに基づいている10,11。これらのモデルは、10年以上前から細菌種のペア間の代謝交換を推定するために使用されている12,13。GEMの再構築の自動化14や、何千もの腸内微生物15,16について手作業でキュレーションされたGEMの利用が可能になったことで、複雑な微生物群集の代謝モデルを構築する道が開かれた。方法論の進歩により、現在では複数の生物種間の相互作用をモデル化できるようになり17,18、Zorrillaら19が最近開発したワークフローでは、大規模なメタゲノムデータセットから代謝モデルを直接再構築できるようになった。コミュニティ全体の代謝モデルを用いた研究では、2型糖尿病19や炎症性腸疾患20に関連する腸内細菌叢において、健常対照群と比較して数十から数百の有意に異なる代謝交換が発見されている。生態学に基づく枠組みに従ってこれらの代謝相互作用をランク付けする方法は、腸内細菌叢と疾患との間のメカニズム的関連性の基礎となる、的を絞った仮説を生み出す機会を提供する。
ここでは、メタゲノムスケールの代謝モデルから導き出した代謝物交換スコアリングシステムを紹介し、疾患において最も影響を受ける潜在的な微生物の相互摂食相互作用を同定するように設計した。この概念的枠組みを、15の国と11の疾患表現型を網羅する、一般に公開されている1661の便メタゲノムからなる統合データセットに適用した。大腸がんと微生物によるエタノール代謝との関連、関節リウマチと微生物由来のリボシルニコチンアミドとの関連、クローン病と硫化水素を代謝する特定の細菌との関連など、既知および新規の微生物と疾患との関連性が明らかになった。このスコアリングシステムは、微生物相互作用の文脈依存的な破壊を定量化し、特定するのに役立つ。
研究結果
相互摂食の可能性の定量化
交差摂食相互作用と疾患との関連を理解するために、我々は代謝産物交換スコア（Metabolite Exchange Score：MES）を設計した。MESは、ある代謝物を消費すると予測される分類群と生産すると予測される分類群の多様性の積を、関与する分類群の総数で正規化したものである（図1aおよび方法）。MAGを再構築できる各マイクロバイオームメンバーによる代謝物の潜在的生産、消費、交換は、代謝モデリングによって推定される。ネットワークの中心性尺度と同様に、最も接続の多いノードを定義すると、MESが高い代謝産物は微生物の食物連鎖における重要な構成要素である可能性が高い。一方、MESがゼロの代謝物は、コミュニティのどのメンバーによっても生産されないか、または消費されません。健康なマイクロバイオームと病気のマイクロバイオームで各代謝物のMESを比較することで、相互摂食パートナーの喪失によって最も影響を受ける代謝物をランク付けし、特定することができます（図1b）。MESで代謝物の優先順位が付けられたら、次に分類群の存在量と代謝フラックスの推定値を統合して、対象となる代謝物の主な生産者または消費者として機能する生物種のコンソーシアムを検索することができる。我々はこのアプローチを、新たな発見、標的実験、臨床試験を導くための仮説生成戦略として提案する。
図1: Metabolite Exchange Score (MES) の計算と応用の概要。
図1
a MESは、メタゲノム情報に基づく代謝モデルから推定される潜在的な生産者（P）と消費者（C）の数の調和平均である。 b 健常コホートと疾患コホートのMESを比較解析することで、相互摂食相互作用の回復に必要な生物種と代謝物を特定することができ、マイクロバイオーム治療の有望なターゲットとなりうる。
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1661のマイクロバイオームのメタ解析から、健康および疾患における腸内微生物間の主要な代謝的相互作用が明らかになった
クロスフィーディング相互作用とさまざまな疾患との関連を概観するために、我々は、33の発表された研究、15の国、11の疾患表現型に由来する871人の健常者と790人の疾患患者を含む、1661の高品質で詳細な塩基配列を決定した腸内メタゲノムサンプルの大規模解析を行った（補足データ1）。研究および国を統合することで、多様な腸内微生物のMetagenome-Assembled Genomes（MAG）のアセンブリが可能となり、健常集団のベースラインMESの特徴づけが可能となった。私たちの健康なコホートは、BMI（Body Mass Index）が18.5～24.9で、疾患が報告されていない男女で構成されていた。この情報が不明確なサンプル（例えば、健康状態やBMIが報告されていない疾患対照）はデータセットに含まれていない（詳細はMethodsを参照）。サンプル内配列アセンブリー21、メタゲノム共ビン化22、および品質管理23の結果、完全度90％以上、コンタミネーション0.05％未満の高品質MAG 24,369個を含む55,345ビンが得られた。平均ヌクレオチド同一性（ANI）95％で定義された、1種につき1つの代表的なMAGを選択した結果、949の細菌種と6つの古細菌種が得られ、腸内で見られるすべての優勢な微生物門が網羅された（図2a、補足データ2）。これらの種の存在と存在量は、955のMAGに対して配列リードをマッピングすることによって決定された。40の細菌種と1つの古細菌種が疾患個体でのみ検出され（補足データ3a）、一方、健常個体では59の細菌種と1つの古細菌種が検出されたが、いずれの疾患個体でも観察されなかった（補足データ3b）。メタゲノムサンプル中の菌種を同定することは依然として困難であり、MAGに基づくアプローチでは、コビニングに使用した大規模なデータセットにもかかわらず、腸内細菌叢の希少な構成要素を見逃している可能性が高い。微生物間の代謝交換を推測するために、955個のMAGについてゲノムスケールモデル（GEM）14を再構築し、MICOM18を用いて種レベルの存在量に基づいて各個体についてコミュニティスケールの代謝モデルを構築し、カスタムスクリプト24を用いてMESを計算した。モデル化された群集には、平均138種（最小＝34種、最大＝236種）が含まれた。
図2：グローバル解析により、健常な腸内微生物の間で最も一般的な代謝交換と、疾患特異的な交差摂食パートナーの喪失が明らかになった。
図2
a 全サンプルにわたる種レベルのMAGの有病率。 b 健常個体でMESが最も高い上位15代謝物。これは、健全な微生物群集構造を維持する上で中心的な役割を果たすと予想される。 c 健常グループと比較した場合、疾患マイクロバイオームでMESが有意に低下した代謝物（片側Kruskal-Wallisのp < 0.05/各疾患カテゴリー内の比較数）。これは、これらの代謝物について、微生物の相互摂食パートナーが有意に失われていることを示唆している。ここに示した代謝物パネルには、各疾患の健常群と疾患群の間でMESの差が最も大きかった上位5代謝物が含まれています（疾患マイクロバイオームでMESが増加した代謝物は含まれていません）。統合失調症患者（n = 87）では、多重比較を考慮してもMESに有意差は認められなかった。サンプルサイズとボンフェローニ補正p値閾値： IBD炎症性腸疾患（n=63、p<1.27×10-4）、肝硬変（n=54、p<1.30×10-4）、強直性脊椎炎（n=72、p<1.32×10-4）、NAFLD非アルコール性脂肪性肝疾患（n=71、p<1.25×10-4）、ベーチェット病（n=18、p<2. 21 × 10-4）、ME/CSF筋痛性脳脊髄炎/慢性疲労症候群（n = 17、p < 2.99 × 10-4）、T2D2型糖尿病（n = 32、p < 1. 37 × 10-4）、アテローム性動脈硬化症（n = 98、p < 1.18 × 10-4）、CRC大腸がん（n = 143、p < 1.17 × 10-4）、関節炎リウマチ（n = 135、p < 1.18 × 10-4）。b, cの色はHuman Metabolome Databaseによる代謝物Sub Classesを表す。
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まず、健常人グループ全体の各代謝物のMESを分析することで、健常人マイクロバイオームにおけるクロスフィードパートナーの多様性が最も高い代謝交換を同定しようとした。代謝物のMESは個人間で大きなばらつきを示した（図2b、図S1）。平均MESが最も高かった代謝物には、ウラシル（MES平均値およびsd=60.5±17.6）やチミン（41.8±21.8）などの核酸塩基、リン酸（59.9±17.0）や鉄（40.3±36.9）などの必須栄養素、グルコース（52.6±22.1）やガラクトース（52.3±21.3）などの糖類が含まれた。
疾患時の相互摂食パートナーの喪失によって最も影響を受ける代謝物を同定するため、健常群と11の疾患表現型とのMESを比較した。この解析により、統合失調症を除くすべての疾患群において、特定の代謝物についてクロスフィードパートナーの有意な喪失が確認された（図2c、図S2）。ビタミンB1（チアミン）25や短鎖脂肪酸の前駆体（リンゴ酸、グルコース、ガラクトースなど）26など、健常人でMESが高く、ヒトの健康に重要であることが知られている代謝物は、複数の疾患表現型において有意に影響を受けていた（Kruskal-Wallisのp＜0.05/多重比較補正のための検定数）。チアミンは、肝硬変と強直性脊椎炎における健常微生物群と疾患微生物群のMESの差が最も大きい代謝産物であり、炎症性腸疾患（IBD）では第2位であった（図2c）。チアミン欠乏と肝硬変およびIBDとの関連は、これまでに報告されている27,28,29。同様に、微生物由来のリボシルニコチンアミドと関節リウマチとの関連性を示したのも今回が初めてである（図2c）。この結果は、大腸がん30におけるエタノールやIBD31,32における硫化水素など、これまでに報告された微生物が介在する疾患と代謝物との関連も確認するものであり、妥当な関係を同定するための我々の新規アプローチの可能性を補強するものであった。
次に、SMETANA17を用いて腸内の微生物代謝交換を定量化し、それらを耐糖能異常や2型糖尿病（T2D）と関連付けたZorrillaらの研究19と我々の結果を比較した。彼らの研究では、硫化水素（H2S）およびD-ガラクトースを含む22の代謝産物について、有意に異なる交換が同定された。これらの代謝産物は、健康なマイクロバイオームと比較して、T2D関連マイクロバイオームで有意に高いMESを有することが我々の解析でも同定された（補足データ4）。また、腸内細菌間で最も頻繁に交換されていると同定された代謝物に関しては、Zorrillaら（文献19のFig.
種の多様性は、交換代謝産物の生産者および消費者と明確な関係がある
腸内コミュニティ内の微生物種の多様性は、一般的に健康状態のマーカーと考えられている。5つの疾患に関連するマイクロバイオームでは、指標（シャノン指数と種の豊富さ）全体にわたってα多様性が有意かつ一貫して減少していたが、2型糖尿病患者のマイクロバイオームでは、健康なグループと比較してα多様性が有意に高かった（図S3）。種の多様性が低い疾患（例：炎症性腸疾患）は、MESの差の大きさが最も大きかった（図2c）。これは、代謝産物を交換する微生物種の数が、当然ながらコミュニティ内の種の数と相関することを考えれば予想されることである。
多様性と代謝産物交換の関係をさらに理解するために、生産者と消費者が種の多様性から同じように影響を受けるという帰無仮説を検証した。具体的には、各代謝物の生産者種数または消費者種数を種の豊富さと相関させ、代謝物の生産と消費に関するこれらの相関の傾きの統計的差異を調べた。帰無仮説（傾きに統計的な差がない）は、種の豊かさが増加するにつれて、生産者種と消費者種の数が同じ割合で増加することを意味する。このような結果は、交雑摂食相互作用が群集に存在する種の数のみに依存することを意味する。この帰無仮説は腸内細菌叢で交換された代謝産物の79%で棄却され（図3a、補足データ5）、相関の傾きは消費者（代謝産物の55%）または生産者（代謝産物の24%）で有意に急だった。MESが最も高い代謝物の中から、グリセロールの生産者と消費者のみが、種の豊かさに対する反応に有意な差を示さなかった（図3b-p）。
図3：ほとんどの代謝物において、生産者から消費者への動態は種の豊かさに影響される。
図3
a 大部分の代謝物において、種の豊かさ対生産者または消費者の相関の傾きに有意差が認められ、代謝物の24%において生産者の方が傾きが急であり、分析した代謝物の55%において消費者の方が傾きが急であった。 b-p 健康なマイクロバイオームにおいてMESが最も高い上位15代謝物について、種の多様性対生産者または消費者の相関を表したもの。解析は、我々のデータセット（n = 1661、健常コホートと疾患コホートを含む）の全サンプルと、少なくとも50マイクロバイオーム内で交換された代謝物のみを対象とした。各サブプロットには、生産者（茶色の円）と消費者（青色の三角形）の多様性を表すために、各サンプルについて2つのポイントが含まれている。アスタリスクは、ボンフェローニ補正後の線形回帰モデル（両側）に関連するt検定の有意なp値を示す（すなわち、p < 0.00011）。
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クローン病の潜在的治療戦略としての微生物食物網の修復
MESと我々のモデリングフレームワークの適用が、有望な治療標的の同定にどのように役立つかを調べるために、我々はIBDの一種であるクローン病（CD）に焦点を当てた。バッチ効果を最小化するため、品質管理されたデータセットの中から、健常人と疾患患者からのサンプル数が最も多い単一の症例対照研究33を選択した。世界的な解析と同様に、H2S-以前からCDやIBDの症状に関与しているガス31,32,34-は、交差摂食微生物のパートナーの喪失によって最も影響を受ける代謝物であることがわかった（2倍減少、補足データ6）。腸内細菌叢によるH2S産生はいくつかの研究対象になっているが（例えば文献35,36）、このガスの消費についてはあまり特徴付けられておらず、我々のモデリング結果は、細菌によって消費されたH2Sはシステインなどの含硫アミノ酸に取り込まれる可能性があることを示している（図S4）。
H2Sに注目すると、健康な人のマイクロバイオームには、H2Sを産生する可能性のある種が多く、H2Sを消費する可能性のある種も、CDに関連するマイクロバイオームよりも多いことがわかった（図4a）。興味深いことに、CD患者では、H2S産生菌の多様性（32％減少）よりも、H2S消費菌の多様性（平均56％減少、補足データ7）の方がより影響を受けており、その結果、CD患者ではH2S産生菌と消費菌の比率が有意に高くなっていた（図4c）。微生物間のH2Sのフラックスを調べたところ、同様の結果が得られた。疾患状態におけるマイクロバイオームのH2S消費能力の総推定値は74％減少したが、総生産量は有意な影響を受けず、その結果、CDではH2S生産／消費比がより高くなった（図4b、d、補足データ7）。H2Sの過剰（すなわち、培地に輸出されると予測されるH2S）は、健常者と疾患被験者との間に有意差はなかった（Kruskal-Wallis χ2(1) = 0.0356, p = 0.8503）。微生物間で交換されるH2Sのフラックスに有意差は認められなかったが（補足データ8）、種の多様性の交絡効果を補正した後でも、CDではH2S消費者の方がH2S生産者よりも影響を受けるという示唆が成り立つ。
図4：クローン病に伴う硫化水素生産-消費平衡の変化。
図4
a H2Sを産生または消費する可能性のある種の数は、健常対照群と比較して、クローン病に関連するマイクロバイオームでは有意に減少している。 b H2Sの推定消費量の合計は、CDでは枯渇しているが、産生には有意な影響はない（フラックスは乾燥重量1グラム当たり1時間当たりミリモルで推定）。CDに関連するマイクロバイオームでは、H2S生産者数と消費者数の比（c）、およびH2S生産量と消費量の比（d）が有意に増加している。 e CDで最も変化しているH2Sの交換に関与する種であり、マイクロバイオーム治療の有望なターゲットとなる可能性がある。このネットワークは、健常対照群と比較して、CDではH2S産生が増加しているH2S産生種（茶色）と、H2S消費が減少しているH2S消費種（青色）を示している。H2S産生または消費に最も寄与している10種が強調表示されている。ノードとエッジの太さは、消費者または生産者カテゴリー内のH2Sの種の加重フラックス合計に比例している。a-dの統計検定は片側Kruskal-Wallis検定で行い、自由度=1、p < 0.05を有意とみなした。a-dの箱ひげ図要素：中央線＝中央値、箱限界＝上下四分位数、ひげ＝1.5×四分位範囲、点＝サンプル（n = 84生物学的に独立したサンプル）。
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代謝モデリングの結果の遺伝的基盤をよりよく理解するために、CD症例対照研究に存在するMAGにおいて、H2S循環36に関与することが知られている46遺伝子の分布を調べた。その結果、各MAGに1個から23個の遺伝子が見つかった（補足データ9）。H2S循環に関与する5つの遺伝子は、健常人に関連するマイクロバイオームで有意に多く見られた（補足データ10）：cysK、dcm、Fuso_cyst、metH、metK（線形モデル、交絡変数として種の多様性を用い、有意性を評価するために二元配置t検定、多重比較を考慮したp＜0.0012）。また、asrA、asrB、asrC、dsrA、dsrC（p < 0.0012）の5つの遺伝子がCD関連マイクロバイオームでより一般的であり、最初の4つの遺伝子は種の多様性を考慮すると有意に濃縮された（補足データ10）。
CDにおけるH2S不均衡に関連する主要な生物種を同定するために、健常人とCDのコホートにおけるH2Sの総生産量または消費量に対する各生物種の寄与を比較した。各生物種について、H2Sフラックス（相対的存在量による重み付け）を推定し、健常個体とCD個体におけるH2S総重量フラックスの差を計算した。CD患者においてH2S産生が最も増加した菌種は、Clostridia属、Bacteroidia属、Bacilli属であった（図4e、補足データ11）。Enterocloster clostridioformis（Clostridia）とEnterococcus_B faecium（Bacilli）はCDコホートでのみ観察された。多くの種（症例対照研究からのMAGの45％）が、モデルに従ってH2Sを生産・消費する能力を示し、その役割は群集の状況に依存していた。Phocaeicola dorei（バクテロイデス門）は、両コホートで一般的であるにもかかわらず、健常者とCDの間で予測されたH2S産生量に最も高い差を示した種であった。この種ではH2S代謝に関連する遺伝子が複数見つかった（cysK、bsh、dcm、Fuso cyst、luxS、metK、sufS、malYとmetH遺伝子の2コピー）。CDマイクロバイオームにおいてH2S消費量が最も減少したのはClostridiaクラスのメンバーで、Roseburia intestinalis、Blautia_A obeum、Faecalibacteriumの2種（F. prausnitzii_JとF. sp900758465）が含まれた（図4e、補足データ11）。上位5種の消費菌は、H2S代謝に関与する他の様々な遺伝子に加えて、システイン脱硫酵素（iscS）遺伝子を2～4コピー持っていた（補足データ9および11）。
次に、我々の代謝モデリング・アプローチから得られた結果を、従来のマイクロバイオーム組成分析と比較した。主成分分析を用いて群集のベータ多様性を可視化したところ、CDに関連するマイクロバイオームが明確なクラスターを形成していることがわかった（図S5a）。これらの差異に最も寄与している種を特定するために、ランダムフォレスト（RF）分類器を用いた（70％のデータをトレーニングに、30％をテストに使用）。トレーニング用データセットのバッグ外エラー率は9.52%で、テスト用データセットの精度は100%であった。健康なマイクロバイオームとCD関連マイクロバイオームの違いに最も寄与している生物種は、重要度スコアによって同定された（図S5b）。RF解析で同定された種のいくつかは、H2S消費菌のRoseburia intestinalis、Escherichia coli、Anaerostipes hadrus、H2S生産菌のClostridium_Q symbiosumなど、代謝モデリングアプローチでも同定された。CD（図4e）のH2S産生／消費比のアンバランスに最も寄与しているとして我々のモデリングアプローチで同定された20種のうち16種は、この組成ベースの分析で選択された上位30種の中には含まれていなかった。
考察
本研究では、新しいMESベースの概念的枠組みを導入し、15カ国と11の疾患表現型を網羅する1661の公開便メタゲノムから955の腸内細菌種の代謝モデルの統合データセットに適用した。このアプローチにより、10の疾患と関連するマイクロバイオームにおける潜在的な相互摂食相互作用の著しい減少が明らかになり、症例対照クローン病研究において有望な治療標的が同定された。
我々の分析フレームワークは、既知および新規の微生物と疾患との関連性を同定し、実験の優先順位付けや臨床試験の指針として、コスト効率に優れ、メカニズムに基づいた戦略を提供することを示す。一例として、関節リウマチとリボシルニコチンアミド（ニコチンアミドリボシドまたはNRとしても知られる）との関連が挙げられる。この代謝産物はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）の主要な前駆体の一つであり、関節リウマチ患者ではNAD+が著しく減少していることが報告されている37。NRや他のNAD+前駆体の投与は、関節リウマチ患者37や他の炎症性疾患、神経変性疾患、心血管疾患38の臨床転帰を改善する。我々の知る限り、これは関節リウマチにおける微生物NR代謝の役割について報告された最初の証拠である。我々はまた、大腸癌（CRC）患者において、交差摂食の喪失によって最も影響を受ける代謝物としてエタノールを同定した。中程度から大量のアルコール摂取は、腸内細菌がエタノールを代謝して発がん性のアセトアルデヒドを産生することから、少なくとも部分的にはマイクロバイオームが介在するプロセスを介して、CRC39の発症リスクが1.17～1.44高くなることと関連している40。メタゲノムデータのみを用いて、このような代謝物と疾患との関連を同定できたことは、我々のアプローチの有効性と有用性をさらに証明するものである。Roseburia intestinalisとCDの関連性など、本研究で観察されたいくつかの関連性は、マイクロバイオームの組成のみに基づいた解析でも見つけることができたが、ほとんどの関連性（Phocaeicola doreiなど）はできなかった。また、我々のMESアプローチと、SMETANAスコアに基づく以前に提案された手法との間の相補性も観察された。T2D進行のマーカーとして同定された代謝物19は、健常集団でMESが最も高い代謝物の中に含まれており、これらの代謝物の交換が健康なマイクロバイオームの重要な特徴であるという考えを裏付けている。
微生物が相互摂食に依存するのは、腸内環境における代謝産物の利用可能性に影響されると予想される。健康時と疾患時でMESに有意差がある代謝産物のいくつかは食品に含まれており（ビタミンや糖など）、腸内細菌叢におけるクロスフィーディングを理解する上で食事の重要性が浮き彫りになった。興味深いことに、多くの代謝産物（リン酸、グルコース、ガラクトース、コリンなど）について、種の多様性が低いときには生産者の割合が高いが、種の豊かさが増すにつれて消費者の割合が生産者を追い越すことが観察された（図3）。種の多様性が低いと、消費に利用できる代謝産物が不足し、これらの代謝産物を自給自足で生産する種が有利になると推測される。一方、種の多様性が高いと、群集による代謝産物の純生産量が多くなり、消費種が繁栄する機会が増えると考えられる。この仮説は、IBDに関連するマイクロバイオーム（通常、種の多様性が低い）では、必須アミノ酸やビタミン（チアミンを含む）の合成・代謝経路を完全にコードするゲノムを持つ細菌が豊富である一方、健常人のマイクロバイオームでは、必須代謝産物を相互摂食に依存すると予想される細菌が豊富であることを示す最近の2件の研究と一致している41,42。これらの研究と我々の結果を合わせると、健康で多様なマイクロバイオームでは、クロスフィーディングに大きく依存していることが示唆される。
CDをケーススタディとして用いることで、モデリングフレームワークが、目標とする実験や臨床的検証のために、メカニズムに基づいた仮説を定義するのに役立つことを示した。その結果、CD患者には健全なH2Sバランスを支える微生物群集のメンバーが欠けていることが示唆された。このガスは、少量であれば腸を保護する効果が期待できるが、大量に存在すると粘液層を破壊し、炎症を引き起こす可能性がある43,44,45,46。この結果は、IBD患者のマイクロバイオームでは硫黄を含む代謝産物の分泌が特に不足していることを示唆する最近の知見を裏付けるものであり20、さらにCDではH2Sの消費種が不均衡に失われていることを示している。微生物によるH2Sの交換は、内腔pH32の調節などのメカニズムを通じて直接的に、あるいはマイクロバイオーム構成へのカスケード効果を通じて間接的に、宿主に影響を及ぼす可能性がある。
自動化されたゲノム・スケールの代謝再構築は、手作業でキュレーションされたモデルに近い表現型を表現するが14、生物固有の形質や二次代謝をすべて予測することは当然できない。自動化されたゲノムスケールモデルは、トップダウンアプローチの機会を提供し、ここで行われたような大規模な解析は、理想的には実験的検証と組み合わせて、より洗練された仮説駆動型の様々な研究を導くことができる。今後、より小規模なデータセットを扱う研究では、手作業によるモデルのキュレーション、追加的なオミックスデータの統合（例えば文献47）、および他の証拠（例えば文献47）により、さらなる改良を加えることができる。47や他のエビデンス（例えば、組成データで訓練された機械学習法）を統合したり、宿主の食事や代謝に関する個別化データを統合したりすることで48。また、高品質なMAGが再構築されたマイクロバイオームの原核生物分画のみをモデルに含めることができたこと、そして我々の解析は種レベル（95％ANI）で行われたため、代謝における菌株レベルの違いを見逃している可能性があることに注意することも重要である。菌株レベルの組成情報と組み合わせてMESアプローチを適用する今後の研究は、健康状態のバイオマーカーを同定し、これらの複雑な腸内コミュニティの生態系をよりよく理解するために、非常に有益であろう。
メタゲノム情報に基づく代謝モデルは、微生物の相互摂食相互作用の評価と相まって、マイクロバイオーム療法の開発における主な障壁のひとつである、どの生物種や代謝物を標的とするかの優先順位付けを軽減するのに役立つと期待される。腸内生態系の重要な側面の回復に焦点を当てることで、ヒトの腸内マイクロバイオームにより効果的で長期的な変化をもたらすことができるかもしれない。
研究方法
腸内メタゲノムの世界的調査と品質管理
ヒト便メタゲノムと関連するメタデータが公開されている査読付き研究の文献検索を行った。これらには、腸内メタゲノムの大規模なメタアナリシスやメタデータの編集49,50が含まれる。食事介入、投薬、運動、小児（10歳未満）に焦点を当てた研究は除外した。縦断的研究については、1人当たり1サンプルのみを解析の対象とした。シーケンス技術の影響を最小限にするため、イルミナのHiSeqまたはNovaSeqプラットフォームを用いたペアエンドシーケンスを報告した研究のみを対象とした。
健常コホートには、明らかな疾患や有害症状がないと報告された人を含めた50。疾患対照に分類され、健康状態が判断できないサンプルは除外した。健康状態/疾患状態が曖昧になるのを避けるため、大腸腺腫（非がん性腫瘍）および耐糖能障害（糖尿病前症）のある人のサンプルは除外し、BMI（Body Mass Index）が18.5～24.9の人のみを健常者コホートに含めた。シーケンス深度の影響を最小化するため、品質管理後のPEリード数が15 M未満のサンプルは除外した。バッチ効果を最小化し、データセットを計算可能なサイズに縮小するため、各研究から疾患カテゴリーごとに最大100サンプルを使用した。
生配列リードはNCBIからダウンロードし、TrimGalore v.0.6.6 (Krueger F. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/)を用いて、長さのしきい値を80 bp、Phredスコアを25以上として品質管理を行った。ヒト配列リードによる汚染の可能性は、Bowtie v.2.3.551でメタゲノム配列をヒトゲノムにマッピングすることで除去した。配列深度の影響を最小化するため、サンプルはseqtk v.1.3 (https://github.com/lh3/seqtk)を用いて15 Mフラグメント（30 M PEリード）に希釈した。品質管理されたデータセットには1697サンプルが含まれ、Supplementary Data 1にメタデータとともに掲載されている。
メタゲノム解析とビニング
個々のメタゲノムについて、Megahit v.1.2.921を用いてアセンブルを行った。複数のサンプルを共ビン化することで、より多くの高品質なMAGが得られることが示されているが、共存在情報を使用するには多大な計算リソースが必要である52。そこで、1697サンプルを2つのバッチに分け（Supplementary Data 1に記載）、それぞれのバッチについて、VAMB v.3.0.222ワークフローで推奨されている手順に従った。つまり、quality-filtered sequenced readsを、そのバッチ内でアセンブルされたすべてのコンティグに対してminimap253でマッピングし、VAMBを使用してメタゲノムビンを同定した。これらのステップのsnakemakeワークフロー（VAMB githubからの流用）は、Zenodoリポジトリ24で公開されている。メタゲノムビンの完全性と汚染レベルはCheckM23で評価した。完全性90%以上、汚染度0.05%未満のビンを24,369個取得した。これらのビンをdrep v.3.0.054を用いて95%Aniでデリプリケートし、複数の品質指標（完全性、コンタミネーション、株の不均一性、N50、中心性）に基づいて「最良」の代表ゲノムを選択した。デ・リプリケーションの結果、955の高品質で種レベル（95% ANI）のメタゲノム集合ゲノムが得られた。これらのMAGをGTDBtk v.1.5.155で分類学的に分類し、KMA v.1.3.1356で配列リードをMAGにマッピングすることで、サンプル全体の種の存在率を算出した。全サンプルにわたるMAGの有病率は、GTDBtk55で構築したツリーに沿って可視化し、iTOL57で可視化した。
ゲノムおよびメタゲノムスケールの代謝モデリング
ゲノムスケール代謝モデル（GEM）は、CarveMe v1.514を用いて各生物種レベルのMAGについて再構築した。GEMは、古細菌とバクテリアのドメイン固有のテンプレート、ギャップ充填のための媒体としてヨーロッパの平均的な食事58、およびIBM Cplexソルバーを用いて作成した。
マイクロバイオームのコミュニティメンバー間の代謝交換は、MICOM v.0.2618を用いて計算した。MICOM は、マイクロバイオームのメンバー間の存在量の差を考慮しながら、成長と代謝交換をシミュレートし、現実的な成長率を推定することが示されている。さらに、MICOMは多様な微生物群集（すなわち、数十から数百の種）をシミュレートする際に計算が容易である。MICOMの増殖ワークフローを用い、トレードオフパラメータを0.5、培地としてヨーロッパの平均的な食事を用い、最適な増殖速度と代謝フラックスを特定するためにパーシモニアスフラックスバランス解析（pFBA）を用いて代謝交換を推定した。基礎となる CarveMe モデルには炭素源が比較的少ないため、成長率が低く、その結果数値が不安定になる。そのため、培地項目のフラックスを600倍して代謝交換を計算し、最終結果で補正した。すべてのサンプルについて、MICOM を用いて推定されたバクテリア増殖率を検証したところ、予想される範囲内であった（図 S6）ことから、この増殖ステップが非現実的な増殖を誘導していないことが示唆された。36サンプルで最適解が見つからず、解析から除外され（補足データ1で特定）、最終的に1661サンプルのデータセットが得られた。再現性のために、snakemakeワークフローがZenodoリポジトリで提供されています24。
代謝物交換スコア
代謝産物交換スコア（Metabolite Exchange Score：MES）を定義する基本的な根拠は、代謝産物がマイクロバイオームの複数のメンバーによって産生および消費される個体は、これらの代謝産物がより少ない種によって産生および消費される個体よりも機能的な冗長性が高いということです。ホモジナイズされた便由来のメタゲノムでは、腸内に見られる微生物の集合体のパッチ性を捉えることができないため、機能的冗長性が高いと、ほとんどのマイクロニッチに少なくとも1つの種が生息している可能性が高くなる。MESは、与えられたマイクロバイオームサンプルにおいて、与えられた代謝物を消費・生産する微生物種の数を重み付けしたものである。MESは各代謝物について、潜在的な消費者と生産者の調和平均として定義しました（式1）：
MES}=2times \frac{Ptimes C}{P+C}$.
(1)
ここで、Pは潜在的な生産者の数、Cはある代謝物の潜在的な消費者の数です。代謝物が生産されるだけ、あるいは消費されるだけで、微生物間で交換されない場合、MESは0になることに注意してください。
クロスフィーディングパートナーが有意に失われた特定の代謝物は、病気の表現型を健常集団と比較するKruskal-Wallis検定で同定した。多重検定を考慮するためにBonferroni法を用い（0.05を目標αとして検定数で割る）、少なくとも15人の罹患者を含む少なくとも50人の個体に存在する代謝物のみを分析に含めた。水と酸素は解析から除外した。簡略化したグラフ表示（図 2c）では、交差摂食のパートナー数の有意な減少を示し、どの疾患でも MES の差が最も大きい代謝物の上位 5 つに含まれる代謝物を選択して表示した。棒グラフは、ggplot2 Rパッケージ60を使用して、Human Metabolome Database59で定義されている代謝物Sub Classに従って作成し、色分けした。また、wordcloud Rパッケージ61を使用して、健常者と疾患患者でMESに有意差がある代謝物を最大100個含むワードクラウドを作成しました。
種の多様性効果
分類学的多様性を推定するために、メタゲノムリードをKMA v.1.3.1356で955の種レベルのMAGにマッピングした。アルファ多様性の定量化には、Shannon indexとspecies richness（リードマッピング結果による各サンプル中の種の総数）を用い、Wilcoxon検定（多重比較を考慮したホルム法）を用いて健常マイクロバイオームと疾患マイクロバイオーム間で比較した。その後、種の豊富さを種の多様性の指標として用い、下流の解析を行った。
種の多様性と消費者または生産者の相関の傾きの差は、データセット全体（健常マイクロバイオームと疾患マイクロバイオームを含む）について、Rで線形モデル（lm）を当てはめ、生産者と消費者の数とそれらのカテゴリー（生産者または消費者）の間の相互作用を考慮して評価した。傾き間の差の統計的有意性は、ボンフェローニ法を用いて多重比較の補正を行った。
クローン病に関連するマイクロバイオームにおける栄養学的相互作用
我々は、有望な治療標的を同定するために我々のフレームワークをどのように適用できるかを示す詳細な分析のために、症例対照研究を選択した。メタゲノムで組み立てられたゲノムの完全性は、大規模なデータセットを共ビニングすることで最適化されることを考慮し22、我々は、コミュニティ全体の代謝をモデル化するために使用される高品質のMAGを多数利用するために、品質管理されたデータセットから症例対照研究を選択することを選択した。Heらの研究33は、我々のデータセットの中で最大のCD研究であり、クローン病患者46人と健常対照者38人を含む合計84サンプルが品質管理を通過し、解析に含まれた。クロスフィードパートナーが失われた特定の代謝物は、サンプルの半分以上で観察された代謝物のみを使用し、Bonferroni補正で多重検定を調整したKruskal-Wallis検定で同定した。
H2Sのフラックスは、乾燥重量1g当たり1時間当たりミリモル単位で推定し、微生物間で交換されたH2Sの生産と消費の合計を得るために、種の存在量を乗じた。フラックスは統計検定とグラフ表示のために対数変換した。H2S生産者と消費者の多様性、生産者と消費者の比率、およびそれらのフラックス間の差は、Kruskal-Wallis検定で評価した。培地に排出されると予測されるH2Sは、マイクロバイオームによる過剰なH2S産生の推定に用いられた。
生産者／消費者の数またはフラックスと疾患の状態との関連に及ぼす種の多様性の交絡効果を考慮するため、入れ子線形モデルを用いた。99種未満（健常者コホートの最小種数）のサンプルはこの解析から除外され（n = 58サンプルが残った）、種の多様性とH2S消費者数または生産者数の間の線形関係が保証された。
CD症例対照研究内で観察されたMAGにおけるH2S産生と消費の遺伝的基盤をよりよく理解するために、H2Sサイクリング36に関与する74遺伝子の隠れマルコフモデル（HMM）調査をHMMer v.3.3.262を用いて行い、相同性を確実にするために信頼できるカットオフスコアを用いた。これらの遺伝子が健常者とCD患者で異なって分布しているかどうかを調べるために、少なくとも100種以上のサンプルと、少なくとも10サンプルで観察された遺伝子のみを用いて、線形モデルを用いた。解析は、MAGsの存在量（遺伝子数に属菌の存在量を乗じることによって）と有病率（種の存在／非存在を使用、比較的まれな分類群がH2Sの生産と消費の大部分を担っている場合に、より有益となる）の両方を考慮して行った。データは対数変換時に無限大にならないように0.1でオフセットされ、種の多様性は交絡変数として使用され、多重比較を説明するためにボンフェローニ補正が使用された。
CDにおけるマイクロバイオーム治療の有望なターゲットとなりうる菌種を同定するため、CDおよび健常者コホートにおけるH2Sのフラックスと相対的な存在量に重み付けを行った。具体的には、各微生物種のH2Sフラックスに相対存在量を乗じることで、H2Sフラックスの重み付けを推定した。H2Sフラックスの加重合計は、健常コホートまたは疾患コホート内のすべての加重フラックスの合計として計算された。健常コホートとクローン病コホート間のH2Sの加重総和の違いから、クローン病に関連する主要なH2Sの生産者と消費者が特定された。クローン病コホートには健常者コホートよりも多くの個体が含まれていたため、健常者と疾患コホートの個体数（38）が同じになるように、8つのランダムサンプルを除外した。主要なH2S消費源の1つであるRoseburia intestinalisの代謝モデルは、Fluxer63を用いて最良のk-最短経路で可視化し、H2S摂取と細胞増殖の間の経路を可視化した。
このモデリングフレームワークが、より伝統的な組成に基づく解析とどのように比較されるかをよりよく理解するために、Heと同僚33による上述のバランスのとれたデータセットを用いて、mixOmics64でCLR正規化された種の存在量のPCAプロットを用いて、コミュニティのベータ多様性を可視化した。次にランダムフォレスト分析65を行い、サンプルの70%をモデルのトレーニング用にランダムに選択し、残りの30%を分類器のテストに使用した。特徴の重要度（ジニの平均減少率）を用いて、健常時とCD関連時のマイクロバイオーム間の変動を最も説明する生物種をランク付けした。
統計と再現性
ここで適用した統計検定は、Rを用いて上記の関連セクションで説明されている。再現性のために、Zenodoリポジトリ24でRスクリプトを提供している。データの除外は、メタゲノムの品質／配列決定深度とメタデータの完全性に基づいて行った（「腸内メタゲノムのグローバル調査と品質管理セクション」参照）。サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は用いなかった。
報告概要
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。
データの利用可能性
本研究で使用したデータは、European Nucleotide Archive (ENA)で公開されている。本研究で再構築された全てのアセンブリーおよびMAGは、PRJEB63093プロジェクトの下、ENAに寄託されている。生配列データのBioSample IDおよび本研究で実施したアセンブリーのアセンブリーIDは、補足データ1に記載されている。本研究で再構築された全メタゲノムビンのENAサンプルアクセシオンは補足データ12に、955種レベルのMAGのENA解析IDは補足データ2に記載されている。すべての高品質MAGはZenodo24 [https://zenodo.org/record/8223163]でも入手可能である。代謝物クラスはHuman Metabolome Database HMDB 4.0 [https://hmdb.ca]から推定した。
コードの利用可能性
代謝モデリング解析の実行、統計検定の実行、ここで紹介するグラフの作成のために開発されたコードは、解析ワークフローのステップバイステップの説明とともに、Zenodo24: https://zenodo.org/record/8223163 (repository v.1.2.2)、およびGitHub: https://github.com/vrmarcelino/MetaModels で入手できる。
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謝辞
本研究は、Australian Research Council (DP190101504) および Australian National Health and Medical Research Council (APP1181105 and APP1186371)の支援を受けた。V.R.M.はAustralian Research Council DECRA Fellowship (DE220100965)、C.G.はNational Health & Medical Research Council EL2 Fellowship (APP1178715)、S.C.F.はCSL Centenary Fellowshipの支援を受けている。S.M.G.とC.D.は米国国立衛生研究所糖尿病・消化器・腎臓病研究所（R01DK133468）の支援を受けている。著者らは、モナシュeリサーチセンターによる計算資源と専門知識の利用、およびビクトリア州政府の運営基盤支援プログラムの支援に感謝する。Paul Harrison博士とJamie Gearing博士には統計学とバイオインフォマティクスの助言を、Lucas Schiffer博士にはcuratedMetagenomicDataの助力をいただいた。また、メタデータを公開してくださった便提供者と研究者、建設的なフィードバックをくださった本原稿の査読者にも感謝する。オープンアクセス料はハドソン医学研究所の助成によるものである。
著者情報
著者および所属
モナシュ大学分子・トランスレーショナルサイエンス学部、クレイトン、VIC、3168、オーストラリア
ヴァネッサ・R・マルセリーノ、エミリー・L・ガリバー、エミリー・L・ラッテン、レミー・B・ヤング、サミュエル・C・フォースター
自然免疫・感染症センター、ハドソン医学研究所、クレイトン、VIC、3168、オーストラリア
ヴァネッサ・R・マルセリーノ、エミリー・L・ガリバー、エミリー・L・ラッテン、レミー・B・ヤング、エドワード・M・ジャイルズ、サミュエル・C・フォースター
メルボルン統合ゲノミクス、メルボルン大学バイオサイエンス学部、パークビル、VIC、3010、オーストラリア
ヴァネッサ・R・マルセリーノ
メルボルン大学感染・免疫研究所微生物学・免疫学部門、パークビル、VIC、3010、オーストラリア
ヴァネッサ・R・マルセリーノ
バイオメディシン・ディスカバリー・インスティテュート微生物学科、クレイトン、VIC、3800、オーストラリア
ケイトリン・ウェルシュ & クリス・グリーニング
システム生物学研究所、シアトル、WA、98109、USA
クリスチャン・ディエナー＆ショーン・M・ギボンズ
モナシュ大学小児科、クレイトン、VIC、3168、オーストラリア
エドワード・M・ジャイルズ
ワシントン大学バイオエンジニアリング学部、シアトル、WA、98195、USA
ショーン・M・ギボンズ
ゲノム科学科、ワシントン大学、シアトル、WA、98195、USA
ショーン・M・ギボンズ
eサイエンス研究所、ワシントン大学、シアトル、WA、98195、USA
ショーン・M・ギボンズ
貢献
V.R.M.とS.C.F.が研究を計画した。V.R.M.とR.B.Y.はサンプルの同定とメタデータのキュレーションを行った。V.R.M.は代謝モデリング解析を行った。C.D.とS.M.G.はデータ解析と解釈を手伝った。C.W.とC.G.はH2S遺伝子の調査を行った。E.L.G.、E.L.R.、R.B.Y.は細菌微生物学の専門知識で、E.M.G.はIBDの臨床的専門知識で貢献した。すべての著者が結果の解釈と原稿執筆に貢献した。
対応する著者
Vanessa R. MarcelinoまたはSamuel C. Forsterまで。
倫理申告
競合利益
S.C.F.は特許の発明者であり、BiomeBankおよびMicrobioticaのアドバイザーを務めている。R.B.Y.はBiomeBankのアドバイザーを務めている。その他の著者は、競合する利害関係はない。
査読
査読情報
Nature Communications誌は、Francisco Zorrilla氏と他の匿名の査読者に感謝する。査読ファイルはこちら。
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補足情報
補足情報
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補足データ1-12
権利と許可
オープンアクセス 本論文はクリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされている。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられた場合にはその旨を示す限り、いかなる媒体または形式においても、使用、共有、翻案、配布、複製を許可するものである。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表記に別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。この記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれていない素材で、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
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この記事の引用
Marcelino, V.R., Welsh, C., Diener, C. et al. ヒト腸内における微生物相互摂食相互作用の疾患特異的損失. Nat Commun 14, 6546 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-42112-w
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受領
2023年2月14日
受理
2023年9月27日
掲載
2023年10月20日
DOI
https://doi.org/10.1038/s41467-023-42112-w
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ネイチャー・コミュニケーションズ（Nat Commun） ISSN 2041-1723（オンライン）
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