学童期の亜鉛欠乏に伴う腸内細菌叢の変化
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ジャーナル Nutrients 第14巻 第14号 10.3390/nu14142895
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オープンアクセス論文
学童期の亜鉛欠乏に伴う腸内細菌叢の変化
https://www.mdpi.com/2072-6643/14/14/2895
陳暁輝1,姜宇1,王朔2,陳用海1ORCID,唐世華1,王秀悦3,蘇莉1,黄暁丹1ORCID,龍丹峰1,王亮4,郭偉5,*,張英1,*ORCIDによる
1
蘭州大学公衆衛生学院、蘭州730000、中国
2
陝西省人民医院科学研究室、西安710000、中国
3
北京大学公衆衛生学院、北京100000、中国
4
ベイラー大学ロビンズ保健人間科学部公衆衛生学科（米国テキサス州ウェーコ、76798
5
中国貴州大学教育部高原山地動物遺伝育種繁殖重点実験室 550000貴陽市
*
著者宛先
Nutrients 2022, 14(14), 2895; https://doi.org/10.3390/nu14142895
受理：2022年6月7日 受理：2022年6月7日 / 改訂：2022年7月1日 / 受理：2022年7月11日 / 掲載：2022年7月14日 受理：2022年6月7日 / 改訂：2022年7月1日 / 掲載：2022年7月14日
(この論文は、特集「小児の微量栄養素栄養失調、感染症、免疫」に属しています。）
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要旨
亜鉛の欠乏は、動物の腸内微生物の組成や機能に動的な変化をもたらす可能性がある。しかし、学童期の小児において亜鉛欠乏が腸内細菌叢にどのような影響を及ぼすかは不明である。本研究の目的は、亜鉛欠乏症の学童の腸内細菌叢の動的な変化をプロファイリングし、そのような変化が食事摂取と関連しているかどうかを明らかにすることである。学童期児童177人を対象に、食事調査、身体計測、血清検査を行い、その中から67人を選んで、アンプリコンシークエンシングを用いて腸内微生物群集を探索した。学童期の子どもたちは、食事の多様性が乏しく、食品と栄養素の摂取が不十分であり、32％が亜鉛欠乏であった。亜鉛欠乏（ZD）群では、対照（CK）群に比べて炎症性サイトカインが有意に増加した（p＜0.05）。β多様性には差がなかったが、シャノン指数はZD群ではるかに高かった（p < 0.05）。属レベルでは、Coprobacter、Acetivibrio、Paraprevotella、Clostridium_XIがZD群で多かった（p < 0.05）。機能予測分析の結果、ZD群ではシトクロムP450による有害物質の代謝が有意に低下していた（p < 0.05）。結論として、腸内微生物の多様性は亜鉛欠乏症に影響され、亜鉛欠乏症の臨床診断のためのバイオマーカーとして利用できる可能性のある特定の細菌がZD群で強調された。
キーワード：亜鉛欠乏症、腸内細菌叢、食事、シトクロムP450、学童期児童
図解要旨
はじめに
人体の重要な消化器官である消化管には、大規模かつ多様な微生物集団が存在する [1]。腸内細菌叢がヒト宿主の健康に寄与している可能性は、数多くの研究によって実証されている [2]。腸内細菌叢には、病原体からの防御、免疫系の強化、代謝の促進、必須アミノ酸やビタミンの生合成など、様々な重要な機能がある [3,4,5] 。腸内細菌叢のディスバイオーシスは、肥満、炎症性腸疾患、非アルコール性肝疾患、2型糖尿病など、数多くのヒト疾患と関連している [6,7,8,9]。したがって、腸内細菌叢は宿主の健康維持に重要な役割を果たしている。ヒトの腸内の優勢な分類群は類似しているが、特定の微生物集団の相対的な存在量や菌株の種類は個人によって大きく異なる [10] 。さらに、腸内細菌叢の多様性は、環境、年齢、抗生物質、宿主の生理的状態など、多くの要因によって影響を受ける可能性がある [11,12] 。これらの因子の中でも、最も容易に変更または制御可能な因子である食事は、腸内細菌叢の安定性を制御する上で重要な役割を果たすと考えられる [13] 。近年、様々な食事成分が微生物組成の変化をもたらす可能性があることが、多くの研究で報告されている [14,15,16,17] 。なかでも、食事から摂取される微量栄養素は、人体、特に腸内微生物の常在集団にとって非常に重要である [18]。先行研究では、腸内細菌叢に対する微量栄養素の影響を調べるために、いくつかのモデルが用いられた [19]。例えば、鉄欠乏食は、無菌ラットにおいてビロフィラ属、コプロコッカス属、E. halliiの減少を引き起こした [20]。in vitroの大腸発酵試験では、鉄欠乏は潜在的病原性腸内細菌の増殖を減少させた [21]。さらに、食事から銅を補給すると、コリネバクテリウム、リケネラ、ジョトガイルコッカス、スタフィロコッカスなど、いくつかの分類群の存在量が変化した [22]。従って、微量栄養素の摂取バランスが崩れると、微生物構造が変化するという仮説を立てた。
亜鉛のホメオスタシスは、主に腸管吸収によって調節されている [23]。ある研究では、亜鉛摂取量の20％近くが腸内細菌叢によって利用されることが明らかにされている［24］。人体に不可欠な微量栄養素として、亜鉛は数多くの生理反応に関与している [25]。例えば、亜鉛はRNAやDNAの合成、免疫系、酵素反応において重要な役割を果たすだけでなく [26,27]、COVID-19の予防や治療においても潜在的な価値を示している [28]。さらに、Reedらは、亜鉛欠乏がブロイラー鶏の腸内の微生物多様性を減少させる一方で、腸球菌科（Enterococcus）とルミノコッカス科（Ruminococcaceae）の存在量を有意に増加させ、クロストリジウム科（Clostridiales）とペプトストレプトコッカス科（Peptostreptococcaceae）の存在量を減少させることを見出した[29]。妊娠中のマウスでは、急性亜鉛欠乏が動物門レベルで明らかな変化を引き起こし、腸透過性と炎症反応を増加させることが判明した [30]。さらに、マレーシア人を対象とした研究では、血清亜鉛レベルはClostridialesに属する分類群と正の相関があり、Bacteroidalesに属する分類群とは負の相関があることがわかった[31]。以上の結果から、亜鉛は腸内微生物群集を制御する可能性が示唆された。
世界人口の約17％が亜鉛欠乏症に苦しんでいる [32]。中国では、約10億人が亜鉛欠乏の高リスクにあった [33]。亜鉛の摂取不足は発育不全を引き起こし、感染症や下痢のリスクを高めることが実証されている [26]。さらに、いくつかの動物モデルでは、亜鉛欠乏が胃腸の健康状態の低下やマイクロバイオームの変化と関連していることが示された [29,30,34]が、亜鉛欠乏に関連するヒトの腸内細菌叢のシフトはまだ研究されていない。そこで本研究では、学齢期の小児を対象に、亜鉛欠乏が腸内細菌叢の組成と機能に及ぼす影響（アンプリコンシークエンシング）を調べることを目的とし、亜鉛欠乏に対処する潜在的な方法を提供し、その結果、罹患者の健康と栄養状態を改善する道を開く可能性がある。材料と方法
2.1. サンプル集団の募集
本研究の参加者は、2020年11月に甘粛省定西市安鼎区陸家口鎮陸家口中央小学校（東経104度34分、北緯35度50分）で募集した。詳細な情報を含む質問票を補足文に示す。
合計177人の学齢児童が登録され、67人の児童（亜鉛欠乏症の参加者26人と対照の参加者41人）が、以下を含む選択基準[35]に従って、アンプリコンシークエンシングを用いて腸内微生物群集を探索するために選ばれた： (1)急性または慢性の病気（がん、悪性腫瘍、腎臓病、心臓病、糖尿病、肝臓病など）の既往歴がない、(2)過去3ヵ月間に消化器症状（便秘、下痢など）がなく、慢性の消化器疾患（消化器腫瘍など）の既往歴がない。 3）その他の慢性疾患がない、（4）感染症（AIDS、b型肝炎、c型肝炎、梅毒など）がない、（5）過去3ヵ月間に抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、鎮痛薬の摂取歴がない、（6）過去3ヵ月間に発熱症状がない、（7）過去3ヵ月間に栄養補助食品（亜鉛、カルシウム、ビタミンなど）の摂取歴がない。本研究に登録された学齢児童の保護者からインフォームドコンセントを得ている。登録番号（ChiCTR2200056909）はChinese Clinical Trial Registry（http://www.chictr.org.cn/index.aspx）から取得した（2022年5月1日アクセス）。
2.2. サンプルサイズの算出と検証
以前に発表された文献によると、中国の小児における亜鉛欠乏症の有病率は38.2％であった[36]。サンプルサイズの推定式は以下の通りである：
�
=
�
/
2
2
×
�
×
(
1
�
)
�
2
(1)ここで、α = 0.05、信頼水準 = 1 - α = 95%、Zα/2 = 1.96、p = 0.382、δは許容誤差で、δ = 0.2 × p = 0.0764。したがって、最小サンプル数は155と推定された。
さらに、本研究で作成されたデータが十分な統計的検出力を有するかどうかを検証するために、検出力分析[37]を実施し、その結果、検出力値が0.8（検出力0.8が望まれることが多い）、有意水準（α）が0.05の場合、推定標本サイズは1群あたり25.52となり、本研究の最小標本サイズ（ZD群26）よりも小さかった。このことは、本研究のサンプルサイズは、この分析には十分であることを示唆している。
2.3. 食事調査と身体測定
訓練されたインタビュアーによる食事情報の収集には、3回連続の24時間食事リコールが用いられた。学童食堂の調理師と主な養育者の双方に、学童期の子どもが学校と家庭で摂取した食品を思い出してもらい、総食事情報を得た。食事データの入力と計算は、ソフトウェアNutrition（V.2.7.8.8、北京博苑石順科技有限公司・中国疾病予防管理センター栄養食品安全研究所、中国北京市）を用いて行った。食事多様性スコア（DDS）を得るために、中国住民のための食事ガイドライン（2016）[38]に従って9つの食品群を選択した。研究対象の栄養適正を評価するために、栄養適正比率（NAR）および平均適正比率（MAR）を算出した。関連する計算方法は、以前に報告された方法 [39] に従った。
身長と体重の測定は、訓練を受けた面接官による標準的な手順に従った。HAZ（height for age Z-score）、BMI（body mass index）、WAZ（weight for age Z-score）、BMIZ（BMI for age Z-score）は、WHO Anthroplusソフトウェア（V.1.0.4、Department of Nutrition, World Health Organization, Geneva, Switzerland）を用いて算出した。
2.4. 血液サンプルの採取と測定
全血を絶食状態の小児から採取した。血清は、3000×gで5分間遠心分離した後、-80℃で保存した。すべての手順は、国際亜鉛栄養協議会（IZiNCG） [40]の提案するプロトコールに従って実施した。
室温で解凍後、炎原子吸光分析装置（Analytik Jena, ZEEnit 700P, Jena, Germany）を用いて血清亜鉛を検出した。血清中の炎症性サイトカインIL-6、IL-1β、およびTNF-αのレベルを検出するために、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）キット（Elabscience、武漢、中国）を使用した。
2.5. 便サンプルの採取とDNA抽出
1人当たり約300mgの糞便を採取し、採取後24時間以内にドライアイスで実験室に移し、-80℃で保存した。メーカーのプロトコールに従い、DNA抽出にはQIAamp DNA stool mini kit（QIAGEN、Hilden、Germany）を使用した。NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）と Qubit3.0 Fluorometer（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を用いてゲノム DNA の濃度と純度を測定した。ゲノムDNAの完全性は、1%アガロースゲル電気泳動で検出した。
2.6. ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）と塩基配列決定
ポリメラーゼ連鎖反応は、TopTaq DNAポリメラーゼキット（Transgen, Beijing, China）を用いて行い、細菌16S rDNA遺伝子のV3-V4領域は、ユニバーサルプライマーセット341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）と805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）を用いて増幅した[41]。製造元のプロトコールに従い、最終PCR産物をAgencourt AMPureXPPCR Purification Beads (Beckman Coulter, Grants Pass, OR, USA)とAgilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)で精製・定量した。シーケンシングは、Genesky Biotechnologies社（中国、上海）のIllumina NovaSeq 6000プラットフォーム（2×250 bp）で行った。アンプリコンシークエンシングとは、16S rDNA、18S rDNA、ITSなど特定の遺伝子セグメントのPCR産物のハイスループット塩基配列決定である[42]。なかでも、本研究で使用した16S rDNAシーケンシングは、微生物群集の構造、微生物の分類学、群集の多様性に関する情報を得るための重要かつ広く使用されているツールである[43]。
2.7. バイオインフォマティクス解析
生データはQIIME2 [44]で処理した。Cutadaptプラグインを使用してアダプター配列とプライマー配列をトリミングした。品質管理とキメラ除去はDADA2プラグイン[45]で行った。配列はアンプリコン配列バリアント（ASV）にクラスタリングされた。ASVの割り当てはRibosomal Database Project (V.11.5) [46]で学習させたNaive Bayes分類器を用いて行った。α多様性指標はRソフトウェア（Vegan package, V.4.0.5, R Core Team, Vienna, Austria）[47]で計算した。Rソフトウェア（V.4.0.5）を用いて、Bray-Curtis距離（β-多様性）に基づく非計量的多次元尺度法（NMDS）を実施し、微生物群集が亜鉛レベルの影響を受けているかどうかを評価した。2つのグループ間で有意に異なる分類群は、線形判別分析効果量(Linear discriminate analysis effect size: LEfSe)[48]によって決定された。棒グラフはOrigin 2021で門と属レベルで作成した。Rソフトウェア（V.4.0.5）を用いてピアソン相関分析を行い、腸内微生物と食事成分の潜在的な関係を示した。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)機能予測分析は、PICRUSt2ソフトウェア(V.2.3.0, The Huttenhower Lab, Cambridge, MA, USA)によって行われた[49]。
2.8. 統計解析
データ入力と文書化は EpiData 3.1（EpiData Association, Odense, Denmark）を用いて行った。DDS、食物摂取量、エネルギーおよび栄養素の摂取量、NAR、MAR、α多様性指標、血液指標は、平均値および平均値の標準誤差（SEM）として表示し、ZD群とCK群の有意差を調べるためにStudentのt検定を使用した。Zスコアは中央値で示し、2群間でMann-Whitney U検定を行った。統計解析にはGraphPad Prism 8.0を用いた。低DDS群、中DDS群、高DDS群については、一元配置分散分析（ANOVA）とボンフェローニ検定を行い、NARとMARの差を検討した。NARとDDSの間にはピアソン相関分析を用いた。STAMP ソフトウェア（V.2.5.3, Robert Beiko & Christian Blouin, Halifax, NS, Canada）を用いて、2群間のパスウェイと機能遺伝子の相対量を比較するために、Welch の t 検定を用いた。* p < 0.05、** p ≤ 0.01、*** p ≤ 0.001は、図と表において統計的に有意な差を示した。
3. 結果
3.1. 研究集団の特徴
血清亜鉛の結果、177人の参加者がZD群とCK群に分けられ、それぞれ57人の亜鉛欠乏群と120人の亜鉛正常群が含まれた（血清亜鉛濃度の具体的な下限カットオフ値は以下の通りである[40]：10歳未満の小児は65μg/dL、10歳以上の女性は70μg/dL、10歳以上の男性は74μg/dL）。参加者の詳細情報（zスコア、血液指標）を表1に示す。ZD群には女性30名、男性27名（8.35±0.15歳、平均±SEM）、CK群には女性63名、男性57名（8.88±0.18歳、平均±SEM）が登録された。ZD群では、IL-6、TNF-α、IL-1βが非常に高かった（p < 0.05）。
表1. 亜鉛欠乏児と対照児の特徴（n = 177）。
表
3.2. 学童期の栄養プロファイル
穀類とイモ類、次いで牛乳と乳製品、野菜、果物、卵の5つが最も多く消費される食品であった。一方、水産物、大豆、ナッツ類は摂取が少なかった。9つの食品群のうち、野菜、果物、家畜・家禽肉、水産物、牛乳・乳製品、大豆・ナッツ類、油の摂取量は推奨摂取量を大きく下回っていた（補足表S1）。ZD群とCK群の1日の栄養素と食品の摂取量に関するデータを補足表S2に示す。ZD群では大豆とナッツ類の摂取量のみがCK群と比較して有意に増加した（p < 0.05）。NARとMARは両群間で有意差はなかった（補足表S3）。
DDSは三分位値によって低、中、高群に分けられた（低または高のカットオフ：DDS＜5.6またはDDS＞6、表2）。DDSが低い場合に比べ、ナトリウムとビタミンEを除くほとんどのNARは中・高DDSで有意に高く（p＜0.05）、MARについても同様の傾向がみられた。DDSはすべてのNARおよびMARと正の相関を示した（r > 0、p < 0.05）。
表2. DDS低、中、高群（n = 177）の参加者におけるNARとMAR。
表
3.3. 微生物分類群の構成はグループによって異なる
品質管理後、合計4,503,833の高品質リードが得られ、サンプルあたり平均67,211±421（平均±SEM）の高品質リードが得られ、サンプルあたり平均234±6 ASVの4210 ASVが得られた。両グループのカバレッジインデックスは1に近く、シーケンス深度が微生物群集をカバーするのに十分であることが示唆された（表3）。
表3. 亜鉛欠乏群と対照群のα多様性指標。
表
Bray-Curtis距離に基づくNMDSでは、ZD群とCK群の間で細菌群集組成に差が観察されないことが示された（p = 0.926、PERMANOVA；図1A）。ZD群では、シャノン指数がはるかに高かった（p < 0.01、表3）。
栄養素 14 02895 g001 550図1. ZD群とCK群における微生物群集の多様性と差異のある分類群。(A) NMDSはBray-Curtis距離を用いてβ-多様性を示した。各ドットは1つのサンプルを表し、2つの色はそれぞれ2つのグループを表す。(B）ZD群とCK群の群集組成の違いを有意に説明する分類群を特定したLEfSe。
門レベルでは、バクテロイデス門（44.43％）、ファーミキューテス門（43.70％）、放線菌門（7.44％）、プロテオバクテリア門（3.64％）の4門が最も多く、全サンプルのASV全体の99.21％を占めた（図2A）。属レベルでは、Bacteroides属（28.33％）、Faecalibacterium属（9.48％）、Prevotella属（6.91％）、Bifidobacterium属（6.39％）がサンプル間で共通で、全リードの50.11％を占めた（図2B）。ベン図によると、954のASVがZDグループとCKグループで共有され、1327と1929のASVがそれぞれZDグループとCKグループに固有であった（補足図S1）。
栄養素 14 02895 g002 550図2. ZD群とCK群間の細菌組成。(A)門レベルの微生物組成、(B)属レベルの微生物組成。
図1Bに示すように、LEfSeは、Ruminococcaceae、Acetivibrio、Paraprevotella、Coprobacter、Clostridium_XI、およびPapillibacterがZD群でより豊富であること（LDA > 2、すべてp < 0.05）を明らかにした一方、SolobacteriumはCK群でより豊富であった（LDA = 2.404、p < 0.05）。有意差分析はASVレベルで行った。
3.4. 微生物分類群と栄養摂取量との関係
食事からの摂取量と微生物分類群（属レベル）との関係をピアソン相関分析により算出し、相関係数＞0.30または＜-0.30を図に示した。図3に示すように、穀類とジャガイモの摂取量は、ZD参加者ではバクテロイデスと正の相関が見られたが（r = 0.04、p < 0.05）、CK参加者では負の相関が見られた（r = -0.38、p < 0.05）。
栄養素 14 02895 g003 550図3. (A)ZD群および(B)CK群における属レベルの細菌分類群と食事組成の関係。相対存在量が0.05％を超える属のみを示す。2色はそれぞれ正の相関と負の相関を意味する。
栄養素の摂取量もまた、いくつかの属レベルの微生物叢と関連を示した（補足図S2）。CK群では、各栄養素が微生物と有意な関連を示した。Barnesiellaの相対量は11種類の栄養素の摂取量と正の相関があった（0.31 < r < 0.48, p < 0.05）。Bilophila（0.31＜r＜0.54、p＜0.05）とDorea（0.31＜r＜0.48、p＜0.05）の相対的存在量は、それぞれ9種類と8種類の栄養素の摂取量と正の相関があった。ZD群では、9つの栄養素のみが微生物叢と有意な関連を示した。
3.5. 亜鉛欠乏群と対照群の微生物機能の変化
腸内微生物の機能的変化を調べるために、PICRUSt2ソフトウェア（V.2.3.0、The Huttenhower Lab、Cambridge、MA、USA）を用いて機能予測解析を行った。合計166のKEGG代謝パスウェイ（レベル3）が得られた。両グループで優勢なパスウェイは、アンサマイシンの生合成、他の形態の糖鎖分解、バンコマイシン群抗生物質の生合成であった。代謝経路に関しては、チトクロームP450による異種抗生物質の代謝は、ZD群で有意に減少していた（図4B、p < 0.05）。合計40のKEGGオルソロジー（KO）がZD群で有意に増加した（p < 0.05）のに対し、72のKOがZD群で有意に減少した（p < 0.05）。これらのKOのほとんどは、「多様な環境における微生物代謝」と「代謝経路」に分類された。さらに、「チトクロームP450による異種物質の代謝」経路に関与する2つの酵素が観察された（図4A）。グルタチオンS-トランスフェラーゼ（K00799）とミクロソームエポキシドヒドロラーゼ（K01253）は、統計学的有意性は認められなかったが、ZD群で減少していた（図4B）。
栄養素 14 02895 g004 550図4. 亜鉛欠乏は腸内細菌叢の明確な機能的シフトを促進する。(A）シトクロムP450と関連するKOによる異種生物代謝の図解。(B）CK群とZD群における経路とKOの変化。KOとパスウェイの数はすべてKEGGデータベースから得た。
4. 考察
近年、微量栄養素と腸内細菌叢との相互作用に大きな関心が寄せられている [50] 。微生物が微量栄養素の利用可能性や微量栄養素のレベルに影響を与え、それが腸内細菌叢に影響を与える可能性があることが示されている [50]。例えば、ラクトバチルス・プランタラムは、非ヘム食における鉄の吸収率を高めるだけでなく [51]、マグネシウムとカルシウムの生物学的利用能も高める [52]。マウスを用いた研究では、マグネシウム欠乏食は腸内細菌の多様性を著しく減少させることが示された [53]。マウスモデルでは、マンガン補給により、ファーミキューテス属の細菌数が有意に増加し、バクテロイデス属の細菌数は減少した。本研究では、学童期の腸内細菌叢に対する亜鉛欠乏の影響を調べ、微生物の多様性とマイクロバイオーム機能の変化を観察した。
重要な微量元素である亜鉛は、尿中および糞便中の亜鉛損失を補うために食事から摂取した [55]。子どもたちの亜鉛の状態は、摂取した食物の亜鉛含有量に影響されるだけでなく、その生物学的利用能にも左右された [56]。植物には亜鉛の吸収を阻害する主な物質（フィチン酸）が含まれているため、菜食主義者は亜鉛欠乏症にかかりやすい [57] 。フィチン酸の加水分解を触媒するフィターゼは、食品加工中に活性化される可能性がある [58]。そのため、精製されていない穀物食では亜鉛の生物学的利用能が低かった [40]。対照的に、亜鉛吸収阻害物質のない動物性食品は、亜鉛の優れた供給源である [32]。本研究の対象者は、中国の主要なジャガイモ栽培地域である定西の出身であり、そこでは人口の大部分が自家消費のためにジャガイモや穀類を栽培している。本研究の被験者にとって、最も頻繁に消費される食品群は穀類とジャガイモであり、水産物や肉の消費は少なかった。従って、精製されていない植物性食品の摂取が多く、動物性食品の摂取が少ないことが、今回の研究で亜鉛欠乏率が高かった理由の一つかもしれない。さらに、食事の多様性が乏しいことも、本研究で観察された亜鉛欠乏のもう一つの原因かもしれない。DDSはNARsと正の相関を示し、これは先行研究 [39,59] と一致した。微量栄養素の欠乏を評価するための有効な指標として、DDSが6を下回ると微量栄養素欠乏のリスクが高いことが示された [59]。したがって、バランスのとれた食事は亜鉛欠乏症の予防に役立つであろう。
腸内細菌叢と食事成分との関係については、ZD群では穀類とジャガイモの摂取量がバクテロイデスと正の相関を示したが、CK群では逆の傾向を示した。バクテロイデスは、ヒトの大腸でエネルギーを得て宿主に栄養素を供給するいくつかの重要な代謝活動に関与している [60]。一般に、脂肪とタンパク質が豊富な欧米食を摂取するとバクテロイデス属菌が増加し [61]、食物繊維が豊富なベジタリアン食を摂取するとバクテロイデス属菌が減少する [62]。しかし、低亜鉛状態では「糖質代謝」、「糖鎖生合成および代謝」、「ヌクレオチド代謝」に関する代謝経路が枯渇しており [63]、エネルギーや栄養素の産生が低下している可能性がある。一方、バクテロイデスは様々なメカニズムによって動的な環境に適応できると報告されている［64］。したがってバクテロイデスは、宿主が亜鉛欠乏に苦しんでいる間、ヒトが摂取した穀類やジャガイモを積極的に利用して炭水化物発酵やデンプン分解を行い、自らの生存のためにエネルギーや栄養素を生産している可能性があり [60,65] 、これは潜在的な代償機構を表している。
ZD群では腸内細菌叢の著しい変化が観察された。今回の研究では、微生物の多様性はZD群で有意に増加した。しかし、Zn制限飼料は離乳豚やブロイラー鶏の微生物多様性を有意に減少させた[29,66]。微生物多様性の低さは、喘息[67]、自閉症[68]、アレルギー[69]など、最近の研究では通常さまざまな疾患と関連していた。微生物の多様性の低下は、亜鉛の摂取不足を示す重要な指標ではあるが、非特異的な指標である可能性が高いと報告されている[29]。多様性に関するこの食い違いの原因として、被験者の違いが考えられる。したがって、亜鉛欠乏症のヒトにおける腸内細菌叢に関するさらなる研究が必要である。別の理由として、微量栄養素の欠乏が微生物生態学的バランスを乱し、特定の病原菌の繁殖やコロニー形成を促進することが考えられる [70] 。さらに、最近の知見では、亜鉛欠乏と神経疾患との潜在的な関係に焦点が当てられている [71]。例えば、ヒトにおける亜鉛欠乏と自閉症スペクトラム障害（ASD）との関連性を指摘する研究報告が増えつつあり [72,73]、腸内微生物のディスバイオーシスはASDの小児に共通して認められた [74]。同様の所見は先行研究でも報告されており、自閉症児ではClostridium、Prevotella、Ruminococcaceaeの相対量が増加していた [75,76,77]。一方、亜鉛は腸の完全性に好影響を与える重要な食事成分であり [78] 、亜鉛の欠乏は胃腸の発達に影響を与え、腸の透過性を増加させた [30,34] 。腸管バリアが変化すると、血液中にエンドトキシンが大量に流入し、炎症反応が活性化され、炎症性サイトカインのレベルが上昇した [30,34,79] 。従って、亜鉛欠乏は神経発達と腸管バリア機能の両方に影響を及ぼし、微生物組成の変化と炎症状態を引き起こすという仮説は妥当である。
今回の研究では、ルミノコッカス科、アセチビブリオ属、クロストリジウム_XI、パピリバクター属がZD群で多かった。この知見は、低亜鉛状態でClostridium、Ruminococcus、Ruminococcaceaeの存在量が増加したことを報告した先行研究と一致している[29,34]。これらの分類群の中には、宿主と微生物間の亜鉛の奪い合いに関与しているものもあった。例えば、Ruminococcaceaeに属するRuminococcaceae Bacterium CPB6には、ABCトランスポーターをコードする遺伝子がいくつか含まれており[80]、その中でもZnuABCトランスポーターは亜鉛イオンの膜貫通輸送に関連していた[81]。ZnuABCトランスポーターは、ある種の分類群では亜鉛制限条件下で誘導されることが判明している[82,83]。従って、ZnuABCトランスポーターは、細菌が宿主から内腔の食餌性亜鉛を略奪するのを助け、それが亜鉛欠乏症の発生を直接引き起こし、さらにその状態を悪化させたと推測された。さらに、Ruminococcaceae、Acetivibrio、Clostridium_XI、Papillibacterを含むファーミキューテス門は、低亜鉛環境において亜鉛の需要を減らすか、より効率的な摂取機構を持つことで生存上の利点を得ている可能性がある[30]。さらに、短鎖脂肪酸（SCFA）は管腔pHを低下させ、亜鉛の生物学的利用能 を高める [84]。SCFA生産者として、増加したルミノコッカス科とクロストリジウムは、腸細胞による亜鉛の吸収に間接的に寄与する可能性があり、これは亜鉛のホメオスタシスを維持するための一種の潜在的な調節機構である可能性がある。しかし、これらの分類群と亜鉛欠乏症との関連を完全に説明するには、利用可能な証拠が不十分である。内部メカニズムを明らかにするためには、さらなる研究が必要である。
KEGG機能予測の結果によると、ZD群ではチトクロームP450による異種物質の代謝が有意に低下していた。酵素のスーパーファミリーとして、チトクロームP450（CYP）は、薬物や異種物質の代謝[85]やステロイドホルモンの生合成[86]など、哺乳類における様々な生理過程に関与している。ラットを用いた以前の研究では、亜鉛が欠乏すると、異種物質の代謝に関与する肝遺伝子CYP4b1、CYP4A3、CYP2C23の発現がダウンレギュレートされることが判明した [87]。これまでの動物実験や臨床研究において、亜鉛の補給がチトクロームP450による異種生物代謝を促進し、異種生物代謝を改善することが報告されている [88,89] 。しかし、別の研究 [90] では、酸化ストレスがチトクロームP450レベルのダウンレギュレーションを引き起こすことがわかった。動物モデルでは、亜鉛欠乏がフリーラジカルの発生とともに肝臓の酸化ストレスを引き起こすことが実証されている [91,92]。フリーラジカルは肝ミクロソームP450の構造的・機能的障害を引き起こし、最終的には酵素活性と代謝能力の低下を引き起こす可能性がある [93]。さらに、ミクロソームのエポキシドヒドロラーゼとグルタチオンS-トランスフェラーゼは、「チトクロームP450による異種物質の代謝」経路において、様々な化合物の代謝過程に関与している。Beloucifらは、食餌性亜鉛欠乏症のラットにおいて、グルタチオンS-トランスフェラーゼが顕著に減少していることに気づいた [94]。抗酸化システムの一部として、この酵素は亜鉛欠乏によって引き起こされる活性酸素種を除去するために自己消費する [95]。Draperらは、ラットとヒトにおいて、ミクロソームのエポキシドヒドロラーゼがZn2+によって阻害されることを発見した [96]。しかし、炎症時には血清亜鉛濃度が低下する一方で、肝臓の亜鉛濃度は上昇し [97]、肝臓のCYP酵素活性のダウンレギュレーションにつながる可能性がある。以上の結果から、亜鉛の欠乏はCYP酵素活性に悪影響を及ぼし、その結果ゼノバイオティクスの解毒に影響を及ぼす可能性があるという証拠が得られた。
5. 結論
本研究では、血清炎症性サイトカインおよび食事調査と腸内細菌群集を関連付け、亜鉛欠乏が腸内細菌群集の構成に及ぼす影響を検討した。さらに、本研究の結果は、亜鉛欠乏が腸内細菌叢の変化とその機能的能力を引き起こすことを示唆した。しかし、本研究の結果は、食事調査に登録された被験者の保護者または世話人による自己申告に基づいており、食事摂取量を推定する際に想起バイアスの影響を受けやすい可能性がある。したがって、本研究の結果は、亜鉛欠乏と腸内細菌叢の多様性および機能とのカジュアルな関連を解明するためにさらなる研究が必要である。
補足資料
以下はhttps://www.mdpi.com/article/10.3390/nu14142895/s1。補足テキスト 表S1：9つの食品群の平均摂取量と推奨摂取量；表S2：ZD群とCK群の1日当たりの食品群および栄養素の摂取量；表S3．図S1：ZD群とCK群における固有のASV（アンプリコン配列変異体）と共有ASV（アンプリコン配列変異体）のベン図；図S2：（A）ZD群と（B）CK群における属レベルの細菌分類群と栄養プロファイルの関係。相対存在量が0.05％を超える属のみを示す。2色はそれぞれ正の相関と負の相関を意味する。
著者貢献
執筆、原案作成、X.C.；査読・編集、X.C.、W.G.、Y.Z.、Y.J.；形式分析、X.C.、W.G.、S.W.；方法論、X.C.、Y.J.、Z.W、 L.S.、X.H.、D.L.、L.W.およびY.Z.；データキュレーション、X.C.、Y.J.、Z.W.、Y.C.およびS.T. 著者全員が原稿に貢献し、提出されたバージョンを承認した。すべての著者は掲載された原稿を読み、同意した。
資金提供
本研究は、中国国家自然科学基金会（プロジェクト番号：82173497）、中国栄養学会（CNS）栄養科学基金会-ZD地志・健康基金（プロジェクト番号：CNS-ZD2009008）、中央大学基礎研究基金（プロジェクト番号：uzujbky-2021-ct20）の助成を受けた。
施設審査委員会声明
本研究はヘルシンキ宣言に従って実施され、中国蘭州大学公衆衛生学院医療倫理委員会の承認を得た（プロトコルコード：GW-20200915-1）。
インフォームド・コンセント
本研究に参加したすべての被験者からインフォームド・コンセントを得た。
データ利用声明
生のシーケンスリードはEuropean Nucleotide Archive (https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home)にアップロードされており、プロジェクト番号はPRJEB51060である。(2022年3月20日にアクセス）。
謝辞
本研究に参加したすべての児童とその保護者、そして力強いサポートをしてくれた陸家口中央小学校のスタッフに感謝する。また、試料採取と検出をサポートしてくれた蘭州大学第二病院の沈明慧氏と蘭州大学公衆衛生学院の張柯氏に感謝したい。さらに、上海のGenesky Biotechnology Inc.のWanpeng Qi氏の技術協力にも感謝する。
利益相反
著者らは利益相反はないと宣言している。
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AMAスタイル
陳X、江Y、王Z、陳Y、唐S、王S、蘇L、黄X、ロングD、王L、ら学齢児童における亜鉛欠乏に関連する腸内細菌叢の変化。Nutrients. 2022; 14(14):2895. https://doi.org/10.3390/nu14142895
シカゴ/チュラビア式
Chen, Xiaohui, Yu Jiang, Zhuo Wang, Youhai Chen, Shihua Tang, Shuyue Wang, Li Su, Xiaodan Huang, Danfeng Long, Liang Wang, and al. "Alteration in Gut Microbiota Associated with Zinc Deficiency in School-Age Children" Nutrients 14, no. 14: 2895. https://doi.org/10.3390/nu14142895
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