シャム魚（Betta splendens Regan）の腸内細菌叢と年齢および性別の関連性

2022年11月28日 13:56

オープンアクセス論文
シャム魚（Betta splendens Regan）の腸内細菌叢と年齢および性別の関連性
by Lucsame Gruneck 1,†ORCID,Vasana Jinatham 1,2,†ORCID,Phatthanaphong Therdtatha 3,†ORCID andSiam Popluechai 1,2,*ORCID
1
メー・ファー・ルアン大学（タイ、チェンライ、ムアン、57100）腸内マイクロバイオーム研究グループ
2
メー・ファー・ルアン大学理学部、ムアン、チェンライ、57100、タイ
3
チェンマイ大学農学部バイオテクノロジー学科、チェンマイ、50100、タイ
*
著者への連絡先
†
これらの著者はこの仕事に等しく貢献した。
Fishes 2022, 7(6), 347; https://doi.org/10.3390/fishes7060347 (DOI登録中)
Received: 2022年11月4日 / 改訂：2022年11月20日 / 受理：2022年11月23日 / 発行：2022年11月25日
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概要
シャム格闘魚（Betta splendens Regan）は、タイで人気のある観賞魚である。魚の健康は腸内細菌叢に影響されることを示唆する研究が増えている。今回、我々は初めて16S rRNA遺伝子配列解析により、シャム格闘魚の幼魚（8週齢）および成魚（16週齢と24週齢）のライフステージにおける健康な腸内細菌叢プロファイルの差異を調査した。魚は水質管理された環境で飼育され、餌はMoina macrocopaを与えた。腸内細菌群集のプロファイリングにより、シャム闘魚の若魚と成魚の間で細菌全体のプロフィールに有意差があることが明らかになった。24週齢の成魚では、細菌の多様性が減少した。ベタ科魚類の腸内細菌群集は、プロテオバクテリアが最も優勢であり、その構成員の多さは年齢によって異なっていた。24週齢の雄魚ではPlesiomonasが、8週齢の魚ではPseudomonasが腸内で優勢であった。さらに、これらのProteobacteriaの予測される機能が幼魚と成魚で異なることから、魚の成長を改善するための重要なターゲットになる可能性があります。これらの知見は、腸内細菌叢の役割や宿主因子との関連について理解を深めるものである。
キーワードシャム闘魚、腸内細菌叢、16S rRNAシーケンス、ベタ魚

グラフの概要

はじめに
シャム格闘魚（Betta splendens Regan）は、経済的価値の高い観賞魚として人気がある。この淡水魚はOsphronemidae科に属し，東南アジアで記録された55種のBettaを含む[1]．このうち、タイでは通常10種の野生型が見つかっており、B. splendens Reganが最も一般的である[1]。また、タイでは最も重要な輸出観賞魚の1種とされており、アメリカ、日本、ヨーロッパ（特にドイツ、フランス、イギリス）が主な市場となっている[2]。タイは最近，年間2300万匹以上のベタを輸出し，公定価格で415万米ドルに達しており，輸出は増加傾向にある[3]．しかし，この種は水域環境の変化に弱く，自然界では生存が危ぶまれる可能性がある[4]．しかし，この魚は水域環境の変化に弱く，自然界では生存が危ぶまれている[4]．また，高品質な大量輸出のための養殖は，病気との遭遇や魚の健康維持のために，管理されたシステムであっても困難である．
水生動物の腸内細菌叢として知られる消化管内の微生物群集は複雑で、複数の好気性および嫌気性微生物で構成されています。細菌を中心とした微生物相は、幼生期から魚類の腸内に定着し始め、成体ではより複雑になり、500種類以上の微生物細胞で108個を占める[5,6]。水環境は、養殖魚の成長に不可欠です。また、水環境は微生物の増殖に理想的な媒体であり、陸上動物の腸内より密に魚の腸内にコロニーを形成します[7]。微生物相には，魚類の腸内に定着する自家性微生物と，一過性の自由生活微生物である同種性微生物がある[8]．淡水魚の腸内では，Actinobacter，Aeromonas，Flavobacterium，Lactococcus，Pseudomonas，Bacteroides，Clostridium，Fusobacterium，Enterobacteriaceaeのメンバーなどの通性嫌気性菌が主に優勢である [9]．これらの微生物は、宿主が発育しやすい環境を提供する一方で、魚との関係によって宿主の機能（代謝、免疫系など）に影響を与える可能性があります[10]。
先行研究[1,11]によれば，ベタ魚のステージと発生は，幼生（24-48時間），幼体（2-3週間），若体（7-10週間），成体（3-5ヶ月後）の4段階に分けることができる．成魚のオスとメスは、色模様と体の大きさで形態学的に区別できる。宿主の特性（年齢、性別、性的発達など）が魚類の腸内細菌叢の構成に影響を与え、これらの要因によって若魚と成魚の細菌プロファイルが区別されることが示されています[12,13]。例えば、ゼブラフィッシュでは、その発生を通じて微生物プロファイルが変化し、宿主の年齢が上がるにつれて変動が大きくなることが以前に証明されています[14]。このことは、腸内細菌叢の形成に宿主の因子が重要な役割を担っていることを明確に示しています。しかし、ベタ魚の腸内細菌叢に対する年齢と性別の影響を探るような研究は行われていないことに留意する必要があります。このことから、ベタ魚の発育がマイクロバイオータのコロニー形成に与える影響を理解することは、このギャップを埋めることに貢献し、将来の種の保存と魚の健康増進のための基盤となることが示唆される。
本研究では、16S rRNA遺伝子のハイスループットシーケンスを用いて、年齢と性別の異なるタイのベタ魚の腸内細菌叢の特徴を明らかにしました。B. splendens Reganは、タイでよく知られ、広く普及しているベタ種であるため、ベタ魚の代表として選択された。我々は、B. splendens Regan（以下、シャム闘魚）の腸内細菌叢の群集プロファイルと機能的関与を確立することを目的とした。これは、この経済的に重要な魚種を養殖する際に、腸内細菌を操作して生存率を改善するなどの将来の研究のためのベースラインデータとなる可能性がある。
材料と方法
2.1. ベタ魚のサンプリングと微生物 DNA 抽出および生理的パラメータの測定
タイ国チェンライ市（20°2′29.795″ N, 99°53′0.57″ E）のベタ養殖場から16週齢の雌雄シャム闘魚を入手した。この魚は、シャム格闘魚の専門家の指導のもと、適切に管理された。その後、交配を行い、稚魚を作出した。60cm×30cm×30cmのガラス水槽に移し、フロースルー方式で水中飼育を行った（図S1）。水質は，溶存酸素（DO）6.5 〜 8.0 mg/L，水温（Tm）23 〜 25 ℃，pH 6 〜 7 を維持した．上記のすべてのパラメータは，魚類の成長に許容される範囲内であった [15,16]。稚魚はすべて水槽に一緒に入れ，Moina macrocopaを含む飼料を1日1回，体重（BW）の3%で与えた．雌雄の個体は16週齢から個々の水槽で別々に飼育し、24週齢まで成長させた。宿主であるシャム系闘魚の基本的な特徴を表1に示す。各試験の最終日である8週齢、16週齢、24週齢の個体について、標準的な体長および／または体幅の測定（cm）のためにサンプリングした。また、各魚の標準重量（グラム）を決定するために、精密計量器を使用した。既報[1,11,17]の通り、ベタ魚の年齢および性別の判定には、魚鰭（胸鰭および腹鰭）を使用した。
表1．本研究で使用したシャム闘魚の基本的特徴
表
2.2. 微生物ゲノムDNAの抽出
8週目、16週目、24週目に腸内細菌叢のプロファイリングのために合計45個のサンプルを採取し、年齢と性別に基づいて以下の5群に分けた。(1) 8週齢群（B8W、n = 9）、(2) 16週齢男性群（BM16W、n = 9）、16週齢女性群（BF16W、n = 9）、 (4) 24週齢男性群（BM24W、n = 9）、24週齢女性群（BF24W、n = 9）。8 週齢の魚は、形態がまだ発展途上であるため、幼若管を代表するサンプルとして選択した[1,2]。その後、個々の魚がランダムに選択され、その後の分析のために3つのサブグループにプールされた（B8W1-B8W3, BM16W1-BM16W3, BF16W1-BF16W3, BM24W1-BM24W3, およびBF24W1-BF24W3）。本試験の魚はいずれも病気の外見的徴候を示さなかった。細菌ゲノム DNA は，Qiagen DNA stool mini kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて，製造者の指示に従い，魚の全消化管（GI）200-400 mg から抽出した（以下の修正を加えた）：腸組織は 0.5 mm ジルコニアビーズを用いて均質化した．抽出した DNA は、さらなる分子解析まで -80 ℃で保存した。
2.3. 16S rRNA 遺伝子アンプリコンシークエンス
16S rRNA遺伝子のV3-V4超可変領域は、プライマー341F（5′-CCTAYGGRBGCASCAG-3′）および806R（5′-GGACTACNNGGTATCTAAT-3′）を用いてバーコードと共に増幅させた。PCR反応はPhusion® High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs)を用いて行った。PCR産物は2%アガロースゲルで解析し、Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Germany)で精製した。その後、NEBNext® Ultra™ IIDNA Library Prep Kit (Cat No. E7645)を用いてシーケンスライブラリーを作製した。ライブラリーの品質は、Qubit@ 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific) と Agilent Bioanalyzer 2100 システムで確認した。250 bp ペアエンドリードを Illumina NovaSeq platform (Illumina, San Diego, CA, USA) で Novogene (Hong Kong) にて取得した。
2.4. バイオインフォマティクスと統計解析
2.4.1. アンプリコンシークエンスバリアント（ASV）の分類学的アノテーション
プライマーおよびバーコードでトリミングしたペアエンドリードをFLASH (version 1.2.11, http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/, accessed on 8 June 2022) [18] を用いてマージした。高品質なクリーンタグの生成には、fastp (version 0.20.0) ソフトウェアを使用した。Vsearch (version 2.15.0) を用いてクリーンタグを SILVA データベースと比較することによりキメラ配列を検出し、フィルタリングして有効タグを得た[19]。配列はQIIME2ソフトウェア（バージョンQIIME2-202006）を用いて解析した。アンプリコン配列バリアント（ASV）は、DADA2パイプラインを使用して組み立てた[20]。5個以下のASVはデータセットから削除された[21]。代表的な配列は、SILVAデータベースに対して分類されました。宿主（コンタミネーション）配列（ミトコンドリアなど）もアノテーションリードから削除した。これまでBacteroidetes, Fusobacteriota, Verrucomicrobiota, Spirochaetota, Actinobacteriota, Acidobacteriotaと認識されていた原核生物に、それぞれ新しい名称を付与した。本研究で得られたシャム闘魚腸内細菌群の16S rRNA遺伝子の有効リードは、Bioproject accession number PRJNA873232としてNCBI SRAデータベースに寄託されている（BioSample accession number SAMN30492725-SAMN30492739 ）。
2.4.2. アルファおよびベータ多様性解析
サンプルは、1サンプルあたり最小79,055リードに希釈した。アルファおよびベータ多様性解析は、QIIME2ソフトウェアで実施した。主座標分析（PCoA）はR ade4パッケージで作成した。プロットは、R バージョン 2.15.3 の R ggplot2 パッケージを用いて可視化した。3群の優占種の違いに関する3元プロット解析は、R vcdパッケージを使用して行った。群間における加重および非加重のUnifrac距離行列に基づく群集構造および組成の変動は、QIIME2ソフトウェアのadonis関数を用いて評価した。グループ間の組成の差は、Rソフトウェア（バージョン3.5.3）に組み込まれたT-test分析を用いて決定された。差次的に豊富な腸内細菌叢は、LEfSe（線形判別分析（LDA）Effect Size）分析[22]を用いて分析した。
2.4.3. ネットワーク解析
共起ネットワーク解析では、微生物相互作用ネットワークを調査するために、すべてのサンプルにわたって平均相対存在度が0.1％を超えるASVを選択した。ネットワークの構築には、Cytoscape バージョン 3.9.1 の CoNet アンサンブルアプリを使用した[23]。プログラムによって推奨されているように、すべてのサンプルで最小行出現率は1に設定された。細菌の関連は，0.8の閾値でSpearman相関を使用して同定された．Edgesは1000回の並べ替えで検証されました。Edgesは1000回の並べ替えで検証された。Benjamini-Hochberg 補正後、0.05 より小さい p 値（q 値）を持つエッジは、R パッケージ igraph バージョン 1.2.6 [24] を使用して可視化された。
2.4.4. 腸内細菌叢の機能予測
さらに、KEGG Orthology (KO) に従って、PICRUSt2 ソフトウェア (バージョン 2.1.2-b) を用いて微生物群集の機能プロフィールを予測した。各注釈付き遺伝子はK番号（K）で表した。Rバージョン4.0.3のR ComplexHeatmapパッケージ（バージョン2.5.4）［25］を用いて、レベル2および3における予測されるシャム闘魚の腸内細菌叢の機能のヒートマップをプロットした［26］。Dunnの検定（有意なKruskal-Wallis検定に続く）、Wilcoxon順位和検定、またはt検定を使用して、注釈付き遺伝子機能の平均相対存在度のグループ間の差異を評価した。予測遺伝子の相対的存在量（Ks）と腸内細菌叢の属レベルでの有意な関連は、Python（バージョン3.8.13）の階層的全反対関連（HAIIA）［27］によって同定された。
結果
3.1. シャム魚の腸管内細菌の多様性
腸内細菌叢の多様性を探るために、5つの異なるサンプルからの細菌16S rRNA遺伝子のディープシークエンシングを用いた。ASVの数は96,403から264,371であった（Supplementary File S1）。多様性の評価には、5つの指標を使用した。Chao1、観察種、Shannonの5つの指標を用いた（図1a）。解析の結果、グループ間の多様性に差は見られなかった。しかし、上記 3 つの指標から、BM24W と BF24W 群では減少する傾向が見られた。
魚類 07 00347 g001 550Figure 1. シャム闘魚の年齢群および性別群における腸内細菌叢の多様性。(a)年齢と性別のグループ間でのシャム戦闘魚の腸内細菌叢のα多様性の箱ひげ図。α多様性指数は、Chao1、観察種、Shannon指数に基づいて算出した。(b)年齢および性別グループ間でのシャム魚の腸内細菌群集の構造と構成。重み付けされていないUniFrac距離と重み付けされたUniFrac距離のそれぞれのPCoAプロット。グループ間の微生物群集の差はPERMANOVAによって決定された。重み付けされていないUniFrac距離と重み付けされたUniFrac距離に基づく腸内細菌叢のNMDSプロット（各々）。ストレス値が0に近いほど、元のデータ点が縮小された次元でよりよく表現されていることを意味する。サンプルポイント間の距離は、それらのマイクロバイオームの非類似度を表している。B8W：8週齢のシャム格闘魚、BM16W：16週齢のシャム格闘魚（オス）、BF16W：16週齢のシャム格闘魚（メス）、BM24W：24週齢のシャム格闘魚（オス）、BF24W：24週齢のシャム格闘魚（メス）を示す。
次に、腸内細菌叢全体の構造と構成を明らかにするために、重み付けなしのUniFrac距離行列と重み付けしたUniFrac距離行列を用いてβ多様性を検討した。UnifracのPCoA（図1b）は、グループ間の微生物群集のばらつきを示したが、weighted UnifracのPCoAは、シャム成魚のクラスター間の距離が近いことを示した。PERMANOVAでも、腸内細菌叢の構造（unweighted Unifrac, p = 0.031）と組成（weighted Unifrac, p = 0.026）に有意差があることが示された。さらに、weighted Unifracに基づく非計量多次元尺度法（NMDS）プロットでは、成体群の腸内細菌叢組成は強くクラスター化しており（ストレス値<0.0001）、8週齢の群は分散していた（図1b）。これらの結果を総合すると、年齢や性別の異なるシャム闘魚の腸内細菌叢は、組成よりも構造が多様であることが示唆された。
3.2. シャム格闘魚の幼魚と成魚の腸内細菌叢の組成
シャム魚の腸内細菌叢は、Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidota、Fusobacteriota、Verrucomicrobiota、Campylobacterota、Spirochaetota、Actinobacteriota、SyngistotaおよびAcidobacteriotaが上位10位に含まれる（図2a）。宿主の年齢や性別にかかわらず、すべてのサンプルでプロテオバクテリアが最も多く（全ASVの80％以上）検出された。他の門では、グループ間で差が見られた。BM24W群に比べ、若年者サンプルの腸内ではバクテロイーダが有意に優勢であった（p = 0.04）。16週齢の雌の腸内では、24週齢の雌に比べてフソバクテリオがより豊富であった（p = 0.03）。酸菌はBF24WではB8W（p = 0.03）およびBM24W（p = 0.01）よりも少ない量であった。しかし、多重検定補正後も有意差は保たれなかった。
魚類 07 00347 g002 550図2. シャム闘魚の年齢および性別グループ間での上位の豊富な腸内細菌叢。(a,b) 上位 10 の門と科の平均相対存在度の棒グラフ。(c)上位20属の平均相対存在度の棒グラフ。その他は上位分類群以外のASVの相対存在度が低い。B8W：8週齢のシャム格闘魚、BM16W：16週齢のシャム格闘魚オス、BF16W：16週齢のシャム格闘魚メス、BM24W：24週齢のシャム格闘魚オス、BF24W：24週齢のシャム格闘魚メス。
科別では，すべての試料で腸内細菌科が最も多く（ASV全体の9～76％を占める），次いでAeromonadaceae，Comamonadaceaeであった（図2b）。BM24Wサンプルでは、腸内細菌科のレベルもB8Wグループより高かった（p = 0.01）。24週齢の雄（p = 0.02）および雌（p = 0.03）と比較して、若いシャム戦闘魚の腸内では、Pseudomonadaceaeが優勢であった（図3a）。興味深いことに、BF24WのサンプルにはHolophagaceaeはほとんど含まれていなかった。しかし、多重検定補正を行った結果、門や科のレベルでは有意な差は保たれなかった。
魚類 07 00347 g003 550図3. シャム闘魚の年齢および性別グループ間での上位35の細菌科（a）および属（b）の階層的クラスタリングのヒートマップ。左の注釈は、門レベルでの腸内細菌叢を表す。勾配のブロック（高い値と低い値）は、グループ間で腸内細菌叢が濃縮されていることを表している。B8W：8週齢のシャム格闘魚、BM16W：16週齢のシャム格闘魚オス、BF16W：16週齢のシャム格闘魚メス、BM24W：24週齢のシャム格闘魚オス、BF24W：24週齢のシャム格闘魚メス。
属レベルでは、すべてのグループでPlesiomonasとAeromonasが最も多く見られた（図2c）。前者はBM24WでB8Wより有意に多かった（q = 0.02）。PseudomonasはBM24Wで最も少なく（1%未満）、B8Wのそれよりも有意に低かった（q = 0.02）。Comamonasは24週齢の男女で減少し（平均1%未満）、若いグループよりも少なかった（B8W vs. BF24W、q < 0.01）。Aquabacteriumも同様のパターンを示し、その存在量は24週齢の成人ではB8Wグループよりも低かった（B8W vs. BM24W, q < 0.01）。さらに、LEfSe解析により、上記の属は同じ性別でも異なる年齢層に顕著に関連していることが明らかになった。Pseudomonasは、若い年齢のシャム闘魚の腸内で有意に濃縮されていた（図4b,c）。この属はComamonasとともに、24週齢の雄魚よりも16週齢の雄魚でより多く見られた（図4e）。後者の属とAquabacteriumは、16週齢の雌成魚で24週齢の雌成魚よりも多く見られた（図4f）。これらの結果から、シャム闘魚の幼魚から成魚までの発育段階が腸内細菌叢の構成に影響を与え、宿主が成熟するにつれて性別が決定要因になることが明らかになった。
Fishes 07 00347 g004 550図4. シャム闘魚の腸内細菌叢の年齢および性別群間の相対存在度のLEfSe解析。同性の成魚グループは、若齢グループ（B8W）と比較した。(a-g) LDAスコア>4.0のグループ間で差次的に豊富な分類群。LEfSe解析では、B8W、BM16W、BF16Fに濃縮された細菌タクサはなかった。B8W：8週齢のシャム格闘魚；BM16W：16週齢のシャム格闘魚オス；BF16W：16週齢のシャム格闘魚メス；BM24W：24週齢のシャム格闘魚オス；BF24W：24週齢のシャム格闘魚メス。
3.3. 性別はシャム魚の微生物群集ネットワークの構造に有意な影響を与えた
共起する微生物ネットワークによると、腸内細菌叢の属レベルでの有意な関連性がシャム系闘魚のグループ間で観察された（q < 0.0001）。微生物群集のメンバーは、宿主の年齢や性別に関係なく、主に相互排他的な関係を形成しており（補足ファイルS2）、近隣との強い結びつきは見られなかった（表S1）。注目すべきは、Proteobacteriaが全ネットワーク接続の大きな割合を占めていることである。若年男性群と成人男性群では、同様の微生物関連パターンが観察された。例えば、B8W、BM16W、BM24Wのコミュニティでは、PlesiomonasがDuganellaおよびRurimicrobiumと強い負の関連性を示した（rho = -1, q < 0.0001）（図5、図S2、S3）。男性試料（BM16WおよびBM24W）では、PlesiomonasはComamonasおよびRalstoniaと負の相関を示した（rho = -1, q < 0.000）。女性群は，EnterobacterがProteobacteriaに属するAquabacterium，Paucibacter，Pelomonasなど複数の細菌と負の関係パターンを共有した（rho = -1，q < 0.000）。さらに，Plesiomonasは雄ネットワークで最も活発な細菌であり，その程度はBM24Wサンプルで最も高かった（負の程度＝32，間隙＝1015.75）が，その関係は若魚や雌でもわずかに観察された。このことから、Plesiomonasはシャム闘魚のオスの相互排除ネットワークに大きな役割を果たしている可能性が示唆された。
Fishes 07 00347 g005 550Figure 5. 24週齢のシャム格闘魚における属レベルでの微生物相共起ネットワークグラフ。腸内細菌叢間のネットワーク相互作用の算出には、スピアマン相関係数を使用した。有意な相関のカットオフは0.8（q < 0.05、Benjamini-Hochberg法による多重検定補正）であった。赤いエッジの存在は、相互排除（負の相関）を示す。ノードの色は、門レベルを表す。各モジュールの色付けにはグレーの濃淡を使用した。細菌属はノードIDで表す。最小行出現数は 1 に設定した（CoNet アプリが提案）。BM24W：24週齢のシャム系闘魚のオス、BF24W：24週齢のシャム系闘魚のメス。
3.4. シャム魚の腸内細菌叢と予測される機能との関連性
KEGG Orthology（KO）に基づくシャム魚腸内細菌叢の機能予測では、合計7870個のKEGG遺伝子が同定され、51個のKEGGレベル2パスウェイおよび442個のKEGGレベル3パスウェイに対応した（補足ファイルS3）。レベル2およびレベル3のパスウェイで最も多かったのはタンパク質ファミリー：代謝と酵素で、予測されたパスウェイ全体のそれぞれ31%と25%を占めた（図S4）。
同定されたKEGG遺伝子に基づく細菌遺伝子の比較では、これらのKEGG遺伝子の相対的な存在量にのみ、若いグループと24週齢、および24週齢のシャム闘魚のオスとメスの間で有意差が認められた（q < 0.05）（補足ファイル S4）。8週齢と16週齢の群を比較すると、差は見られなかった。次に、すべてのKEGG遺伝子の機能的オルソログを、KEGGパスウェイのレベルに基づいて分類した。上位30パスウェイについては、グループ間で同様の分布パターンが見られ、シャム闘魚の腸内細菌叢における細菌遺伝子機能を表すレベル3では、酵素とトランスポーターが最も濃縮されたパスウェイであった(図6)。すべてのグループ、性別、年齢を考慮した場合、レベル2における上位30パスウェイの平均相対存在度をグループ間で比較すると、B8WグループとBM24Wグループの間で有意差のみが検出された（q < 0.05）。B8W群ではエキソソームがより濃縮されていたが、他の8つのパスウェイ（酵素、プリン代謝、ピリミジン代謝、リボソーム生合成、転移RNA生合成、ペプチドグリカン生合成および分解タンパク質、染色体および関連タンパク質、アミノ糖およびヌクレオチド糖代謝に関連）はBM24W群で有意に高い値であった。これらのパスウェイはレベル 1 の代謝、遺伝子、タンパク質パスウェイと関連していた。
魚類 07 00347 g006 550図6. Bray-Curtis非類似度に基づく年齢および性別グループ間での予測されるシャム闘魚の腸内細菌叢機能の階層的クラスタリング。ヒートマップは、KEGGレベル3パスウェイで同定された微生物遺伝子機能の相対的な存在量を表している。行は、同定されたKEGGレベル2パスウェイに従って分割されている。ヒートマップの構築では、「Pathway or Brite」に含まれないオルソログ、モジュール、ネットワークに関連する1047個のKEGG遺伝子を除外していることに留意する必要があります。アスタリスク（*）は、グループ間の有意差を示す（p < 0.05）。上位のアノテーションは、シャム闘魚の年齢と性別に言及している。KEGGデータベースの分類。P, パスウェイマップ; B, Brite階層と表。B8W、8週齢のシャム格闘魚；BM16W、16週齢のシャム格闘魚オス；BF16W、16週齢のシャム格闘魚メス；BM24W、24週齢のシャム格闘魚オス；BF24W、24週齢のシャム格闘魚メスを示す。
さらに、予測される機能とシャム系闘魚の腸内細菌叢との関連を階層的全対象関連（HAIIA）を用いて明らかにし、両者の関係をより深く理解することを試みた。解析の結果、属レベルの腸内細菌叢は、全グループの上位50個のKEGG遺伝子と強い相関（-1または1、スペアマン、q < 0.0001）を示した（補遺ファイルS5）。さらに、Plesiomonas、Comamonas、PseudomonasといったProteobacteria門に属する3属に注目したところ、興味深いパターンが観察された。シャム格闘魚の成熟ステージに基づくと、固有の関連性の数が共有の関連性よりも多くなった（図S5a〜S7a、図7a）。若齢群（B8W）では、Plesiomonasは28のパスウェイ（タンパク質ファミリー-シグナル伝達と細胞プロセス、タンパク質ファミリー-代謝、糖質代謝、脂質代謝など）に関与する33のKEGG遺伝子と明確な負の相関を示し、一方ComamonasとPseudomonaは9のKEGG遺伝子パスウェイと正の相関を示し、それらの大部分はシグナル伝達と細胞プロセスに関わるタンパク質ファミリーと定足数感知関連遺伝子に関与していることが示された。成人では、BM16W、BF16W、BM24Wの各グループで観察されたように、プレシオモナスのKEGG遺伝子との関連は、コマモナスやシュードモナスと一貫して対照的だった（図7c-e、図S5d、S6d-e、図S7d）。例えば、BM16W群では Plesiomonas は K00059 (3-oxoacyl-[acyl-carrier protein] reductase) と負の相関を示し、一方 Comamonas は脂質代謝を含むいくつかの経路に関与するこの KEGG 遺伝子と正の相関を示しました。16週齢のシャム系闘魚の腸内では、Pseudomonasはグルタチオン代謝に関与するK00799（グルタチオンS-トランスフェラーゼ）と正の相関を示したが、Plesiomonasはこの遺伝子と負の相関を示した。さらに、BM24W群では、Pseudomonas（-）とPlesiomonas（＋）がK02003（ABC transport system ATP-binding protein）およびK02004（ABC transport system permease protein）と対比相関を示し、Comamonasはクオラムセンシング関連遺伝子（K02034）と負の相関を示した。また、Pseudomonasは、シャム幼魚ではK01992（ABC-2型輸送系透過酵素タンパク質）およびK01091（ホスホグリコール酸ホスファターゼ）と正の関係を示したが、雄成魚（BM16WおよびBM24W）では、タンパク質ファミリー-シグナリングと細胞プロセスおよび糖質代謝に関連するKEGG遺伝子とそれぞれ負の関係を示した（図7c-e）。後者のKEGG遺伝子K01091は、BM24WではB8Wよりも有意に低かった（q < 0.01）。また、シャム闘魚で2番目に多いAeromonas属は、B8Wでは、タンパク質ファミリー-シグナル伝達と細胞プロセス、タンパク質ファミリー-代謝、糖質代謝などの機能遺伝子と負の相関しか持たなかった。しかし、KEGG遺伝子との関連は宿主の年齢とともに減少し、24週齢の雌魚で最も低かった（負の関連は3つだけ）。意外なことに、AquabacteriumはAeromonasとは異なるプロファイルを示し、KEGG遺伝子（タンパク質ファミリー-シグナル伝達と細胞プロセス、タンパク質ファミリー-代謝、細胞コミュニティなど）との関連度は成魚で正の方向にシフトし、24週齢のシャム闘魚で最も高くなった。宿主の発達に伴い、腸内細菌叢の機能が入れ替わり、互いの活動を補い合っている可能性が推測された。その結果、年齢と性別がシャム系闘魚の腸内細菌叢の機能プロファイルに影響を与えることが示唆された。
Fishes 07 00347 g007 550Figure 7. シャム系闘魚の腸内細菌叢と予測される機能との関連性。(a) 若いサンプルと雄の成体サンプルの間で共有される関連とユニークな関連の数は、階層的全対全関連（HAIIA）により同定された。(b) グループ間の上位10属の三項プロット。円の大きさは相対的な存在量に比例する。円が頂点に近いほど、ある属がより多くサンプルに含まれていることを意味する。(c-e) B8W、BM16W、BM24Wの各グループにおいて、優占するシャム闘魚の腸内細菌叢と相対的存在度の上位50 K数との間に有意な関係があることを表すヒートマップ（q < 0.0001 ）。B8W、8週齢のシャム系闘魚；BM16W、16週齢のシャム系闘魚オス；BM24W、24週齢のシャム系闘魚オスの順。
4.考察
本研究では、魚の年齢と性別に関連する腸内細菌叢の特徴を調べるために、細菌の16s rRNA配列決定を実施した。アルファ多様性指標は、性別に関係なく、加齢に伴い腸内細菌叢が顕著に減少する傾向を示したが、グループ間の差は有意ではなかった。このことは、シャム系闘魚の加齢に伴い、細菌の多様性が低下することを示唆している可能性がある。我々の結果は、宿主が成熟するにつれて微生物の多様性が増加することを見出したミナミナマズ（Silurus meridionalis）の先行研究とは対照的であったが、どちらの研究も宿主の年齢によって群集組成が変化することに同意していた[28]。これらの知見は、魚類の腸内細菌多様性は年齢によって形成されることを示唆した[10,29,30]が、これは魚種によって異なる可能性がある。
PERMANOVAとNMDSを用いて、β多様性解析を行った。これらの結果、細菌群集は、組成よりも構造の面で有意に異なることが明らかになった。Proteobacteriaは、すべてのグループで最も一般的な門であった。淡水魚を対象とした過去の調査でも同様の結果が得られている。この門は魚類に見られる主要な細菌群であり [31,32]，その相対的な存在量の違いは，水生生息地に関連するProteobacteriaの膨大な多様性の一部投影または宿主自身によって説明できる [33]．さらに、この門のほとんどのメンバーは、特に肉食魚のタンパク質を消化することができるプロテアーゼの生産者として知られている[34]。したがって，シャム闘魚のプロテオバクテリアが多いのは，モイナのように高タンパク源食であることに起因するのかもしれない．また，幼魚ではBacteroidotaが2番目に多く，成魚，特に雄では有意に減少した。また，草食性魚類では，Bacteroidota が支配的であることが報告されている[35]．一方，ベタは肉食性で，昆虫や昆虫の幼虫を自然に摂取している[1]．また，ベタ科魚類の腸内細菌叢は，食餌によって決定されるため[33]，本研究でモイナ（甲殻類）を摂取したシャム科闘魚の栄養状態に応じて存在量が減少する生来の細菌である可能性が考えられる．ただし、プロテオバクテリアの過剰発現メンバー（ビブリオ、アエロモナス、シェワネラなど）は、他の魚に病気を引き起こす可能性があり［36］、さらにはヒトにも病気を引き起こす可能性があり［37］、懸念される［38］。これらの微生物が食物連鎖を通じて拡散することができるかどうかは、まだ調査されていない。
環境は魚の腸内細菌組成を規定する [33,39]。淡水で育つシャム闘魚、特に成魚は、主にGammaproteobacteria、Plesiomonas、Aeromonasのメンバーを保有していた。この知見は，これらの細菌が淡水魚の腸内で一般的なコロニー形成者であると報告している他の研究とも一致する[40,41]．特に、Aeromonas属はセルラーゼとアミラーゼの生産者として知られている[7,42,43]。これらの細菌は、シャム戦闘魚の成長を促進する炭水化物代謝に関与する重要な分類群である可能性がある。しかし，日和見感染を引き起こすことが知られている Plesiomonas や Aeromonas などの上記の優占菌の割合が幼魚で低いこと [41,44] は，宿主の免疫系の影響もあるのかもしれない．稚魚は免疫系が十分に発達していない可能性があるため，この細菌群は宿主の免疫反応によって制御されている可能性がある．
シャム格闘魚では，相互排除は保存されているように見えたが，宿主の発達に伴い，個々のメンバー間の対の関連は変化し，プロテオバクテリアがすべてのネットワークを支配していた．この細菌群はシクリッド魚類と最も多くの関連を持っていた[45]．著者らによると，宿主の腸内環境は，魚類の腸内コミュニティの生態的関係（例えば，生理や免疫系）を形成している可能性がある．
年齢や成熟段階を含むいくつかの要因は、魚類の腸内細菌群集に影響を与え、その結果、細菌が腸内でどのように機能するかに影響を与える可能性がある[10]。本研究では，宿主の年齢と性別が，シャム系闘魚の腸内群集機能の形成に支配的な役割を果たすと思われた．PICRUSt2の結果、腸内細菌群の予測される機能遺伝子にばらつきがあることが明らかになりました。代謝に関連する腸内細菌パスウェイは、8週齢のサンプルよりも24週齢の雄でより濃縮されていた。このことは、宿主の年齢が上がるにつれて腸の代謝活動が活発になることを示唆している。また，腸内細菌叢は宿主の健康に影響を与える消化に重要な貢献をしていることから，雄成魚で糖質代謝に関わる細菌遺伝子がより豊富であることは，宿主魚に多くのエネルギーが供給され，それによって成長が促進されることを示しているのかもしれない [46]．また，成魚のオスは攻撃行動に必要な大きさと強さがあるため，この現象に関与している可能性もある。さらに，若いシャム闘魚の優勢な腸内細菌叢は，機能遺伝子と明確な関連を示した．Plesiomonasは負の、ComamonasとPseudomonasは正の相関を示し、代謝、シグナル伝達、細胞プロセスに関連する多くの遺伝子と関連することから、これらの細菌は幼魚の腸内で宿主の健康維持に異なる役割を果たすことを示唆しているかもしれない。後者2つの細菌は，健康なナマズ（Heteropneustes fossilis）の皮膚粘液において，病気のナマズよりも濃縮されていることが判明した[47]．したがって，これらの微生物は養殖におけるプロバイオティクスとなる可能性が示唆された．しかし，Pseudomonas属は健康な宿主と病気の宿主の両方に関連するため，菌株によって病原性が異なる可能性がある[48]．
腸内細菌叢とABCトランスポーター（K02003およびK02004）およびクオラムセンシング（K02034およびK02035）に関連するKEGG遺伝子との関連パターンは、宿主が発達するにつれてシフトしていた。細菌のABCトランスポーターは，栄養の取り込みから細菌の病原性まで様々な役割を担っており，その全てが生存に必要である[49]．また、Quorum sensing（QS）は、宿主の腸内で細菌の病原性を低下させるだけでなく、群集のバランスをとるのに役立つ、細菌のコミュニケーションに不可欠なプロセスである[50]。我々は、前述の遺伝子とComamonasまたはPseudomonasとの間に、シャム闘魚の幼魚では正の関係を観察したが、成魚の試料では負の関係を観察した。宿主体の生理状態が十分に発達していないため、これらは腸内細菌叢がこれらの機能的プロセスを通じて生存能力を強化している可能性が示唆された。さらに、8週齢魚の腸内ではPseudomonasの存在量が濃縮されており、この属とシグナル伝達や細胞プロセス、糖質代謝に関連する機能遺伝子との正の相関は、シャム戦闘魚の幼魚の成長を支えている可能性を示唆するものであった。淡水魚（Aplodinotus grunniens）を対象に行った最近の研究では、飼料の家畜化によりPseudomonasの存在量が増加し、摂取量と成長性能が向上することが明らかになった[32]。今後、シャム系闘魚の成長と発達を媒介するプロテオバクテリアの生物学的機能に関する研究が必要であり、持続可能な養殖のための腸内細菌叢の操作につながる可能性がある。
本研究には限界があり、以下のように指摘されている。倫理的配慮から使用動物数が制限された。プール法では群内のばらつきが大きく、個体の腸内細菌叢が不明瞭になる可能性がある。この点、腸内サンプルを独立して分析することで、各サンプルの腸内細菌叢プロファイルのばらつきを明らかにし、評価するのに役立つ可能性がある。また、各時点で魚を犠牲にする必要があるため、腸内細菌叢と魚の成長速度（8週から24週まで）の関連性を検討することはできなかった。今後の研究で水サンプルからの細菌をプロファイリングすることで、魚の腸内細菌叢とその水中環境との関係をより深く理解することができるかもしれない。さらに、今回のサンプルはB. splendens Reganに限定されている。今後の研究では、ベタ類の宿主の生理・行動と腸内細菌叢との関連性を把握するために、ベタ類全体のマイクロバイオームの特徴を明らかにする予定である。これらの側面を知ることで、宿主とマイクロバイオームの関係について有用な情報が得られ、魚の健康増進に役立つ可能性がある。
5.結論
本研究では、シャム系闘魚の年齢と性別が腸内細菌叢に与える影響を明らかにした。24週齢の成魚では、細菌の多様性が低下していることが確認された。ベタ魚の腸内細菌はプロテオバクテリアが優勢であり、PlesiomonasとAeromonasが最も一般的なコミュニティメンバーであった。共起ネットワーク解析の結果、すべてのグループにおいて腸内細菌群集のメンバー間に相互排他的な関係が認められた。24週齢の雄魚の微生物相互作用ネットワークでは、Plesiomonasが中心的な位置を占め、成魚サンプルではPseudomonasまたはComamonasの機能遺伝子と明確な関連パターンを示した。また、幼魚と成魚の間でProteobacteriaのメンバーの機能プロファイルが変化していることから、腸内細菌叢は宿主の発生過程で異なる機能を果たす可能性があることが示唆された。本結果は、今後、ショットガン・メタゲノム法を用いて微生物ゲノム全体をプロファイリングし、このような複雑な相互作用がシャム系闘魚の健康に及ぼす影響を徹底的に理解するために、Proteobacteriaの役割について調査することが必要であることを示唆している。
補足資料
以下の補足資料は、https://www.mdpi.com/article/10.3390/fishes7060347/s1、図S1：研究デザインとサンプル収集、図S2：8週齢のシャム戦闘魚における属レベルでの微生物相共起ネットワークグラフ。腸内細菌叢間のネットワーク相互作用の算出には、スピアマン相関係数を使用した。有意な相関のカットオフは0.8（q < 0.05、Benjamini-Hochberg法による多重検定補正）であった。赤いエッジの存在は、相互排除（負の相関）を示す。ノードの色は、門レベルを表す。各モジュールの色付けにはグレーの濃淡を使用した。細菌属はノードIDで表す。最小行出現数は 1 に設定した（CoNet アプリが提案）。B8W、8週齢のシャム闘魚、図S3: 16週齢のシャム格闘魚における属レベルでの微生物相共起ネットワークグラフ。腸内細菌叢間のネットワーク相互作用の算出には、スピアマン相関係数を使用した。有意な相関のカットオフは0.8（q < 0.05、Benjamini-Hochberg法による多重検定補正）であった。赤いエッジの存在は、相互排除（負の相関）を示す。ノードの色は、門レベルを表す。各モジュールの色付けにはグレーの濃淡を使用した。細菌属はノードIDで表す。最小行出現数は 1 に設定した（CoNet アプリが提案）。BM16W、16週齢のシャム闘魚のオス、BF16W、16週齢のシャム闘魚のメス、図S4: 棒グラフは、レベル2（a）およびレベル3（b）におけるシャム闘魚の腸内細菌叢の予測KEGGパスウェイ上位10の割合を表す、図S5：シャム闘魚の腸内細菌叢と予測される機能の間の関連性。(a) 若いサンプルと雌の成体サンプルの間で共有される関連と固有の関連の数は、階層的全対全関連（HAIIA）により同定された。(b) グループ間の上位10属の三項プロット。円の大きさは相対的な存在量に比例する。円が頂点に近いほど、ある属がより多くサンプルに含まれることを意味する。(c-e) B8W、BF16W、BF24Wの各グループにおいて、優占するシャム闘魚の腸内細菌叢と相対的存在度の上位50K数の間に有意な関係があることを表すヒートマップ（q < 0.0001 ）。B8W、8週齢のシャム闘魚；BF16W、16週齢のシャム闘魚メス；BF24W、24週齢のシャム闘魚メス図S6．シャム系闘魚の腸内細菌叢と予測される機能との関連性。(a) 若いサンプルと16週齢のサンプルの間で共有される関連とユニークな関連の数は、階層的全対全関連（HAIIA）により同定された。(b) グループ間の上位10属の三分割プロット。円の大きさは相対的な存在量に比例する。円が頂点に近いほど、ある属がより多くサンプルに含まれていることを意味する。(c-e) B8W、BF16W、BF24Wの各グループにおいて、優占するシャム闘魚の腸内細菌叢と相対的存在度の上位50K数の間に有意な関係（q < 0.0001）を表すヒートマップ（それぞれ）。B8W、8週齢のシャム闘魚；BF16W、BM16W、16週齢のシャム闘魚オス；16週齢のシャム闘魚メス図S7: シャム系闘魚の腸内細菌叢と予測される機能との関連性。(a) 若いサンプルと24週齢のサンプルの間で共有される関連とユニークな関連の数は、階層的全対全関連（HAIIA）により同定された。(b) グループ間の上位10属の三分割プロット。円の大きさは相対的な存在量に比例する。円が頂点に近いほど、ある属がより多くサンプルに含まれていることを意味する。(c-e) B8W、BF16W、BF24Wの各グループにおいて、優占するシャム闘魚の腸内細菌叢と相対的存在度の上位50K数の間に有意な関係（q < 0.0001）を表すヒートマップ（それぞれ）。B8W：8週齢のシャム戦闘魚、BM24W：24週齢のシャム戦闘魚オス、BF24W：24週齢のシャム戦闘魚メス、表S1：シャム戦闘魚における微生物関連ネットワークのグローバルネットワークトポロジー、補足ファイルS1：データ処理の統計結果、ASVsアノテーション結果、各試料の特徴量表。補足ファイルS2：シャム科闘魚の腸内細菌叢の共起ネットワーク解析、補足ファイルS3：シャム科闘魚の腸内細菌叢の共起ネットワーク解析。補足ファイルS3：KEGG Orthology（KO）によるシャム科闘魚腸内細菌叢の機能プロファイル、補足ファイルS4：KEGG Orthology（KO）によるシャム科闘魚腸内細菌叢の機能プロファイル、補足ファイルS5．KEGG Orthology (KO)による予測機能の平均相対存在度のグループ間比較の統計結果、補足ファイルS5：階層的全反対関連（HAIIA）により特定された予測遺伝子の相対存在度（Ks）と属レベルの腸内細菌叢との有意な関連性。
著者による貢献
概念化、方法論、S.P.、調査、V.J.およびS.P.、正式解析、L.G.、可視化、L.G.、執筆-原案作成、L.G.、V.J.、P.T、S.P.、執筆-審査および編集、L.G.、V.J.、P.T、S.P.、監督、S.P.、資金獲得、S.P。すべての著者が原稿に目を通して合意した出版版です。
資金提供
本研究は、タイ科学研究イノベーション（TSRI）（助成金番号：652A01021）およびメー・ファー・ルアン大学から資金的な支援を受けたものである。
施設審査委員会声明
本研究における動物を用いた方法は、メー・ファー・ルアン大学の動物倫理委員会により登録番号の下で承認された。AR05/63。この国の仏教道徳を遵守するため、動物の使用は制限された。
データの利用可能性に関する声明
データの利用可能性については、以下の情報を提供した。シャム闘魚の腸内細菌叢の16S rRNA遺伝子の配列は、BioSampleで入手可能である。SAMN30492725-SAMN30492739 (BioProject: PRJNA873232)で公開されている。対応する配列（Fastq 形式）は、https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA873232 で公開されている。
謝辞
Channarong Wanthanjaiの技術協力、Elleni Gentekakiの建設的な批評に感謝します。
利益相反
著者らは利益相反を宣言しない。資金提供者は研究デザイン、データ収集、分析、出版決定、原稿作成に関与していない。
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このような場合、「ゲノムアセンブリー」「ゲノムアセンブリー」「ゲノムアセンブリー」「ゲノムアセンブリー」「ゲノムアセンブリー」「ゲノムアセンブリー」「ゲノムアセンブリー」「ゲノムアセンブリー」「ゲノムアセンブリー」「ゲノムアセンブリー」「ゲノムアセンブリー」「ゲノムアセンブリー」「ゲノムアセンブリー」「ゲノムアセンブリー」「ゲノムアナライザー」「ゲノムアナライザー」「ゲノムアナライザー」「ゲノムアナライザー」「ゲノムアナライザー」「ゲノムアナライザー」「ゲノムアナライザー」「ゲノムアナライザー」を用いて、「16S rRNAキメラ配列」の生成とその検出を行うことができます。Genome Res. 2011, 21, 494-504. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
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共有と引用

MDPIおよびACSスタイル
Gruneck, L.; Jinatham, V.; Therdtatha, P.; Popluechai, S. Siamese Fighting Fish (Betta splendens Regan) Gut Microbiota Associated with Age and Gender（シャム格闘魚（Betta splendens Regan）腸内細菌叢と年齢および性別の関連）. Fishes 2022, 7, 347. https://doi.org/10.3390/fishes7060347

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Gruneck L, Jinatham V, Therdtatha P, Popluechai S.（グルネック・L、ジナサムV、ザードタタP、ポプルーチャイS. Siamese Fighting Fish (Betta splendens Regan) Gut Microbiota Associated with Age and Gender（シャム魚の腸内細菌叢と年齢および性別の関連）。Fishes. 2022; 7(6):347。https://doi.org/10.3390/fishes7060347。

シカゴ／トゥラビアンスタイル
Gruneck, Lucsame, Vasana Jinatham, Phatthanaphong Therdtatha, and Siam Popluechai. 2022. "Siamese Fighting Fish (Betta splendens Regan) Gut Microbiota Associated with Age and Gender" Fishes 7, no.6: 347. https://doi.org/10.3390/fishes7060347.

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