過敏性腸症候群における糞便メタボロームプロファイルの時間的安定性

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神経消化器病学＆運動性早見表e14741
原著論文
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過敏性腸症候群における糞便メタボロームプロファイルの時間的安定性

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nmo.14741

Cristina Iribarren、Otto Savolainen、Maria Sapnara、Hans Törnblom、Magnus Simrén、Maria K. Magnusson、Lena Öhman
初版発行：2024年1月19日
https://doi.org/10.1111/nmo.14741
Maria K. MagnussonとLena Öhmanがシニアオーサーシップを分担した。
論文の保証人： LÖとMKM。
記事について
セクション

要旨
背景
過敏性腸症候群（IBS）のバイオマーカーとしての糞便メタボロームの可能性は、その経時的安定性に依存する。そこで本研究では、IBS患者および健常者における糞便メタボロームの経時的動態、および便の硬さとの関係の可能性を明らかにすることを目的とした。

方法
IBS患者と健常人からなる2つのコホートで糞便サンプルを採取した。コホートAでは、連続5日間に採取した糞便サンプルをガスクロマトグラフィー-タンデム質量分析計（GC-MS/MS）で分析した。コホートBでは、0週目（健常者とIBS）と4週目（患者のみ）に採取した糞便サンプルを液体クロマトグラフィーMS（LC-MS）で分析した。便の硬さはBristol Stool Form scaleで判定した。

主な結果
コホートA（健常者7名、IBS患者8名）およびコホートB（健常者7名、IBS患者11名）から糞便サンプルが採取された。IBS患者の糞便メタボロームは、短期（コホートA、5日間および同日中）および長期（コホートB、4週間）で安定していた。健常者、IBS患者ともに、メタボロームの非類似性は経時的に参加者内よりも参加者間で大きかった。さらなる解析の結果、患者は健常者よりも便の形態（タイプ）の幅が広かったが、メタボローム動態には明らかな影響はなかった。

結論と推論
糞便メタボロームは、健常者と同様にIBS患者においても経時的に安定している。このことは、便の一貫性に変動があるにもかかわらず、IBSでは糞便メタボロームが安定しているという概念を支持するものであり、糞便メタボロームがIBSの病態にどのように関連しているかをさらに調べるために、シングルタイムポイントサンプリングを使用することを支持するものである。

キーポイント
糞便メタボロームは過敏性腸症候群（IBS）のバイオマーカーとなる可能性が示唆されているが、その安定性や便の硬さの経時的変動の影響についてはこれまで評価されていなかった。
本研究は、IBS患者の糞便メタボロームが、便の粘性の変動にもかかわらず、被験者特異的であり、短期的にも長期的にも安定していることを実証した。
本研究で得られた知見は、被験者特異的で安定した糞便メタボロームという概念を支持するとともに、IBSにおける糞便メタボロームをさらに探索するためのシングルタイムポイント測定の有効性を支持するものである。
1 はじめに
世界的に広範な研究が行われているにもかかわらず1、過敏性腸症候群（IBS）は複雑で多因子性であるため、疾患特異的なバイオマーカーの同定が困難である2, 3。その結果、IBSは症状ベースの基準4, 5によって診断され、管理および研究の目的で、患者はしばしば優勢な腸の癖に基づいてIBSサブタイプに分類される6。

腸内細菌叢は潰瘍性大腸炎7, 11やクローン病8 の患者において経時的に非常に安定しており、診断に利用できる可能性がある。IBSでは、横断的研究により、患者のサブセットが糞便微生物叢組成の変化13-20および/または糞便微生物由来メタボロームのアンバランス10, 15, 17, 19を呈することが示されており、これらはIBSのサブタイプ、10, 21臨床症状13, 18、さらには精神症状19, 20と関連する可能性があるが、すべての報告が完全に一致しているわけではない15、 19, 22 しかしながら、これらの研究のほとんどは、腸管通過時間の変化23、便の粘稠度の変動24、および消化管症状25を含みうるIBSの動的な疾患経過を考慮していない、 28 縦断的には、便通の変動に関係なく、コアとなる微生物叢が日々安定していることを示す研究もある26, 29, 30。このことは、バイオマーカーとしての糞便微生物叢の可能性と、シングルポイント糞便サンプリングの妥当性を裏付けている。我々の知る限り、IBSにおける糞便メタボロームの安定性を明確に評価した研究はないが、少なくとも特定の特異的な代謝物は、微生物叢の調整後もかなり安定しているようだと報告する臨床試験はいくつかある。

2 材料と方法
2.1 研究対象集団
本研究は、メタボローム解析のために糞便サンプルを提供した成人IBS患者と健常者（18歳以上）からなる2つのコホートで構成された。臨床データとサンプルは、前向きかつ独立した研究の一部であった。

コホートAは、Rome III基準に従ってIBSと診断された患者を包含していた4。すべてのサブタイプからの糞便サンプルは、本原稿で発表されたものとは別の主要評価項目を有する大規模研究の一部として、2016年から2018年にかけて収集された（未発表）。Bristol Stool Form（BSF）スケール33に従った混合性腸習慣（IBS-M）のIBS患者から、少なくとも連続4検体以上の検体のみを採取し、糞便代謝産物の分析を行った（下記参照）。現在または過去に胃腸疾患の既往歴のない健康な被験者を同期間の対照とした。重症疾患（肝疾患、肺疾患など）、神経疾患および/または精神疾患、直近1ヵ月間の感染性胃腸炎のエピソード、継続中の上気道感染などの除外基準は、患者と健常者の両方に同じものが適用された。さらに、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）の定期的な摂取（1週間に1錠以上）、アルコールや薬物への既知の依存症は除外理由となった。特定の食習慣など、糞便メタボローム解析の結果に影響を及ぼす可能性のある他の因子は、当初の研究では記録されていなかった。被験者は、プロバイオティクスや薬剤の摂取など、本研究の結果に影響を与えうる他の要因についてはコントロールされていなかった。さらに、IBS患者は過去5年間に大腸内視鏡検査を受けたことが必要であり、大腸内視鏡検査で1cmを超える炎症や腫瘍（良性およびがん由来）のような重大な所見が報告された場合は除外された。コホートAの全患者は、スウェーデンのSödra Älvsborgにあるプライマリーヘルスケアセンター（すなわち、Gråbo、Lerum、Floda、Sandared）、およびスウェーデンのBoråsにあるSödra Älvsborgs病院の消化器病棟から募集した。健康な被験者は、Södra Älvsborgs病院において、病院職員、学生、患者の健康な親族を対象とした内部広告によって募集された。

コホートBは、2017年から2018年の間に糞便サンプルを提供したRome IV基準5に従って診断されたIBS患者を包含した。既報の介入研究34、35のプラセボ群参加者の中から、BSFスケール33に基づく下痢優位（IBS-D）または混合性腸習慣（IBS-M）のいずれかの患者からの検体のみを選択し、代謝産物について分析した（下記参照）。当初は、IBS-D（Bristol Stool Form (BSF)スケール33によると、主に水様便（スコア6および7）を呈する）と分類された患者が、グループサイズを増やすために以前の研究から選ばれた37。しかし、プラセボ群では、このIBSサブタ イプの便サンプルが限られていたため、IBS-SSS 総スコア≧175で定義される症状の重症度が高 いIBS-M患者を少人数で追加した。これらの患者は、サンプリング時にIBS-Dのようなプロフィールを報告した患者の中から無作為に選ばれた。対照として、2017年に実施された先行研究から消化器疾患の既往歴のない健常者を無作為に抽出した38。コホートBの患者については、他の重篤な器質的疾患、精神疾患、神経疾患の存在、妊娠、授乳が除外理由となった。そのほか、患者はサンプル採取の少なくとも1ヵ月前からプロバイオティクス、抗生物質、薬剤を服用することはできなかった。34、35 IBS患者はSahlgrenska大学病院（スウェーデン、ヨーテボリ）の機能性胃腸障害外来から、または地元新聞の広告を通じて募集され、健康な被験者は病院職員、学生、または患者の健康な親族の広告を通じて募集され、金銭的報酬を受け取った。

両コホートとも、被験者全員が口頭および書面による説明を受け、ヘルシンキ宣言に従ってインフォームド・コンセントを行った。参加者がスウェーデン語を理解できない場合は、対象外とした。本試験に組み入れられたすべてのIBS患者は、それぞれの試験期間を通じて胃腸症状を経験した。対応する研究プロトコルは、地域倫理審査委員会の承認を得た： Dnr 590-16（2016年9月7日）（コホートA）、Dnr 266-16（2016年4月18日）、Dnr 548-16（2016年7月4日）（コホートB）。

2.2 臨床質問票およびサンプル収集
組み入れ時に、すべての被験者は、現在の消化管IBS症状の全体的な重症度（Gastrointestinal Symptom Rating Scale-IBS、GSRS-IBS）39および不安と抑うつ（Hospital Anxiety and Depression scale、HAD）の存在を評価する有効な自己報告式の症状質問票を紙または電子的に記入した。簡単に説明すると、GSRS-IBSの質問票は、13の消化器症状の重症度を評価する5つの主要領域（腹痛、腹部膨満感、便秘、下痢、満腹感）で構成されている。各質問は、7段階のリッカート尺度（全く不快感なし＝1、非常にひどい不快感＝7）を用いて評定され、合計点の最小値は13点、最大値は91点である39。HAD質問票は、不安と抑うつの次元に関する14の質問からなり、合計点の範囲はそれぞれ0～21点である。各領域について、この質問票には臨床的に重要な精神症状の有無（スコア8以上）により患者を分類するための有効なカットオフがあり、スコアが高いほど重症度が高いことを示す40。

要するに、この尺度は、便の形態を7つのカテゴリーに分類するもので、分離した硬い塊（タイプ1）から完全に液状の便（タイプ7）まである33。コホートAでは、サンプル採取は、登録された排便時刻と便の硬さに関連していた。対照的に、コホートBでは、対応するクリニックの受診日（第0週と第4週）の前日（最大7日間）に便日誌を記入した35。このサンプル採取と便形態の報告における違いは、コホートBの各参加者がクリニックを受診する前に最後に採取した便サンプルの便形態（BSF）を使用することで対処した。

サンプル採取の概要を図1に示す。コホートAの被験者には、連続5日間の排便ごとにサンプルを採取してもらった。この中から、各日の最初の糞便サンプルが分析用に選択された。さらに、IBS患者からは、そのうちの1日において連続3回までの排便サンプルを追加で採取した。コホートBの被験者は全員、クリニック受診の最大4日前に糞便サンプルを採取し、IBS患者のみ4週間後に追加糞便サンプルを提供した35。すべての場合において、被験者は検体全体を輸送用チューブにひとすくい採取し、自宅の冷凍庫（約-18℃）で保管した。コホートAでは特別な指導は受けなかったが、両コホートとも検体採取に役立つ便座紙が提供された。自宅でのサンプル保管期間は両コホートとも同様で、コホートAでは最初のサンプリング時点から7日以内、コホートBでは対応するセンターに渡すまで最大3日以内であった。その後、すべてのサンプルは、さらなる分析が行われるまで、その場で-80℃で保存された。

詳細は画像に続くキャプションを参照。
図1
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キャプション
2.3 糞便上清とメタボローム解析
メタボローム解析には、糞便サンプルを超遠心分離して得られた糞便上清を使用した。簡単に説明すると、糞便を秤量し（約1g）、冷たいリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解した（2x w/v）。この混合液は、3000gで10分間遠心した後、35000gで2時間、4℃で超遠心するという2段階の遠心工程を経た。得られた糞便上清を回収し、Chalmers Mass Spectrometry Infrastructure（スウェーデン、ヨーテボリ）で分析するまで-80℃で保存した。

コホートAからの糞便上清は、以前に記載されたように、ガスクロマトグラフィー-タンデム質量分析（GC-MS/MS）を用いて1バッチで分析した41。代謝物は、10個の安定同位体標識内部標準物質を含む水：メタノール（1：9 v/v）溶液で糞便上清から抽出し、次いで蒸発乾固し、オキシム化とシリル化により誘導体化した。誘導体化した抽出物をGC-MS/MSシステム（島津GCMS TQ-8030システム、Shimadzu Europa GmbH、Duisberg、ドイツ）に注入し、分析した。50～750m/zのフルスキャンデータを収集し、社内のMatlab（Mathworks, Natick, MA, USA）スクリプトを用いてデータを処理した42。スペクトルの特徴の同定は、保持指標（RI）、診断イオン、スペクトルマッチングを用いて行い、ピークを目視して確認した。シグナル強度（ピーク）は、内部標準ピーク強度41 に基づいて正規化され、生物学的データの歪度を低減するために、統計解析の前に対数10変換された。最終的なデータセットは、合計 155 種類のユニークな代謝物から構成されました。

コホート B の糞便上清は、液体クロマトグラフィー-四重極飛行時間型質量分析計 (UHPLC-qTOF) を用いて 2 回に分けて分析しました。サンプルは、逆相（Waters Acquity UPLC HSS T3カラム）と親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）（Waters Acquity UPLC NH2）カラムの両方を用いて注入・分離された。簡単に説明すると、逆相の移動相は(A)水と(B)メタノールで、どちらも0.04%のギ酸を含み、0.4 mL/minの流速で、以下のような直線グラジエント溶出を行った： HILIC移動相は、(A)10mMギ酸アンモニウム水溶液、(B)20mMギ酸アンモニウム90/10(v/v)アセトニトリル/水溶液で、以下のグラジエント：0-1分100%B、1-8分100-30%B、8-8.1分70-100%B。エレクトロスプレーイオン化は、ポジティブモードとネガティブモードの両方で使用され、データはセントロイドモードでm/z 50-1600の間で閾値アバンダンス200で収集された。RStudio（Rバージョン4.2.1、ウィーン、オーストリア）のnotame分析ワークフロー44を使用してデータを前処理しました。このスクリプトでは、バッチ内およびバッチ間のドリフト補正、missForestパッケージを使用したランダムフォレストベースのインピュテーション、弱い特徴や繰り返される特徴を除去するための特徴のクラスタリングが行われた44。最終的なデータセットは、合計6999個のスペクトル特徴から構成された。

2.4 データと統計解析
今回の研究デザインは、すでに利用可能なコホートとデータセットを用いた探索的なものであったため、検出力の計算は行わなかった。参加者の人口統計学的データは、χ2検定およびMann-Whitney U検定を用いて分析した。各コホートの人口統計学的分析は、IBM SPSS Statistics for Windows、バージョン28.0.1（IBM Corp.アーモンク、ニューヨーク州、米国）を用いて行った。すべての統計解析において、p＜0.05を統計的に有意とみなした。

多変量解析はR Studio（バージョン4.2.1）で行った。コホートAとコホートBそれぞれの研究グループ間のメタボロームプロファイル（X変数）のパターンは、pca3dパッケージ、prcomp-functionを使用した主成分分析（PCA）プロットで、zスコアスケーリングで評価した。さらに、経時的な糞便メタボロームプロファイルの均等性は、veganパッケージのBray-Curtis非類似度を用いて推定した（非類似度指数値が0の場合はメタボローム組成が同一であることを示し、非同一の場合は1に等しい）。

糞便メタボローム非類似度のデータおよび統計解析は、GraphPad Prism（バージョン9.4.1）で行った。箱ひげ図を用いて、参加者一人一人のサンプル間のすべての非類似度（内）と、参加者一人一人のその研究グループのすべての非関連サンプルに対する非類似度（間）の、組み入れ時および経時的な被験者内対被験者間の分析を示した。各研究グループ内の比較（参加者内の非類似度と参加者間の非類似度）は、マン・ホイットニーのU検定を用いて行った。参加者間の非類似度指数（参加者内分析：1対2、2対3など）および参加者間の非類似度指数（各時点におけるその研究グループのすべての非関連サンプルに対する）の平均値を計算し、代謝物プロファイルの経時変化を示すためにドットプロットで示した。最後に、グループ間のBSF値の比較は、IBM SPSS Statistics for Windowsの等分散に関するノンパラメトリックLevene検定を用いて行った。

3 結果
3.1 試験参加者の人口統計学的および臨床的特徴
両研究コホート（AおよびB）の組み入れ時の特徴を表1に示す。コホートAには、健常人7人と、このコホートの組み入れ基準を満たす下痢と便秘を交互に繰り返すIBS患者（IBS-M）8人が含まれていた。年齢、性別、Bristol stool form（BSF）スケールに基づいて報告された便のタイプ、不安および/または抑うつの有無の割合は、両群間でほぼ同じであった。予想されたように、患者は健常者と比較して、より重篤な消化器症状（Gastrointestinal Symptom Rating Score for IBS、GSRS-IBSトータルスコア）（p<0.001）を報告し、Hospital Anxiety and Depression（HAD）トータルスコア（p<0.01）も高かった（表1）。コホートBでは、7人の健常者と11人のIBS患者（下痢優位（IBS-D）の患者8人とIBS-Mの患者3人）が対応する組み入れ基準を満たした。コホートBでは、IBS患者は健常者よりも高齢であった（p < 0.01）。GSRS-IBSの総スコア（p < 0.001）によると、患者はより重度の胃腸症状を示したが、コホートBの両群とも性別分布はほぼ同じで、不安と抑うつのスコアもほぼ同じであった（表1）。

表1. 組み入れ時の患者属性
コホートA コホートB
健康（n = 7） IBS（n = 8） 健康（n = 7） IBS（n = 11）
年齢a 42 [28-47] 42 [20-50] 22 [20-36] 54 [26-71]*2
性別（女性：男性）b 5:2 7:1 5:2 7:4
IBSサブタイプ - IBS-M = 8

IBS-D = 8

IBS-M = 3

Bristol stool scale, stool form (type)a,c 3 [2-6] 3 [1-6] 4 [3-5] 6 [2-7].
GSRS-IBS総得点 1.23 (1.1-1.5) 3.9 (2.8-4.5)** 1.15 (1-1.2) 3.6 (2.9-4.5)***
HADS 総スコア 3.57 (3-5) 10.50 (6-14.2)** 10 (7-10) 10 (4-11)
不安なし：不安b,e 7:0 5:3 6:1 8:3
抑うつなし：抑うつb,e 7:0 7:1 7:0 11:0
略語 IBS、過敏性腸症候群；IBS-D、下痢が主なIBS；IBS-M、緩い便と硬い便が混在するIBS；GSRS-IBS、IBSの胃腸症状評価スコア；HADS、病院不安・抑うつ尺度。
注：同一コホート内の群間差は太字で記号を付して示した（P＜0.05 vs.健常人；P＜0.01 vs.健常人；またはP＜0.001 vs.健常人）。
a データは中央値および範囲で示す。
b 被験者数。
c Cohort A、Bristol stool scaleは採取した糞便サンプルの便形態（タイプ）に対応する。コホートBのブリストル便スケールは、検体採取前に報告された最後の便型に対応する。
d データは中央値（25～75パーセンタイル）で示した。
e 不安と抑うつを有する患者は、検証されたカットオフレベル≧8（臨床的に関連する症状）に基づいて分類された。
試験対象者は、表2で指定された時点で糞便サンプルを提供した。コホートAでは、被験者は5日間連続で検体を提供した（IBS＝37検体、健常者＝29検体）。健常者5人は5日目に糞便サンプルを採取しなかった。また、IBS患者は、同じ日に合計23検体の糞便を採取した（表2）。コホートBでは、組み入れ時（0週目）に健常者から7検体の糞便サンプルが得られたが、IBS患者では0週目と4週目に合計22検体が採取された（表2）。

表2. 糞便サンプル採取の概要
コホートA コホートB
健常人（n = 7） IBS患者（n = 8） 健常人（n = 7） IBS患者（n = 11）
1日目/0週目 7 8 7 11
2日目 6 8
3日目 7 8
4日目 7 6
5日目 2 7
第4週
タイムポイント1 8
タイムポイント2
タイムポイント3 7
3.2 IBS患者と健常人の糞便メタボロームの日間動態
コホートAでは、GC-MS/MSを用いて糞便上清中のメタボロームの経日的動態を評価した。1日目の糞便メタボロームプロファイル（n = 155スペクトル特徴）の主成分分析（PCA）では、健常者とIBS患者でクラスタリングは認められず（図2）、年齢、性別、便の形態による影響は認められなかった（図S1）。スペクトル特徴強度信号に基づく検体間の組成分散をBray-Curtis非類似度により評価した。健常者とIBS患者のメタボローム組成は類似していたが（非類似度指数は0に近い）、IBS患者では非類似度が高い傾向があった（p = 0.10）（図2B）。糞便メタボロームプロファイルに基づくPCAでは、5日間にわたって提供された個人内サンプルをその重心にリンクさせた結果、糞便上清は同じ個人から提供されたサンプルの近くに局在する傾向があり、研究グループ間で明確な分離は見られなかった（図2C）。さらに、健常者もIBS患者も、メタボロームにおいて個人内よりも個人間で高い非類似性を示した（図2D）。全体として、被験者内および被験者間の時間的変動はわずかであった（図2E、F）。重要なことは、IBS群と健常群では、経時的な便の形の平均が同程度であったにもかかわらず（図2G）、IBS群では健常群よりも経時的な便の形の分散が大きかったことである（p < 0.001、等分散のノンパラメトリックLevene検定）。

詳細は画像に続くキャプションにある
図2
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次に、コホートAのIBS患者から提供された同じ日に採取された連続サンプルの糞便メタボローム動態を評価した。同じ日に提供された個体内サンプルとその重心を結ぶ糞便メタボロームプロファイルに基づいてPCAプロットを作成すると、同じ個体からのサンプルのほとんどが近くに集まる傾向があることが明らかになった（図3A）。また、同じ日に採取された連続したサンプルは、患者内よりも患者間で組成のばらつきが大きかった（図3B）。個体レベルでは、3つのサンプリングポイントにわたって、個体内および個体間の非類似度は非常に安定していた（図3C、D）。ただ1人、同じ日の中でメタボロームプロファイルがより不安定で、サンプリングポイントを通して極端な便のタイプ（2から7まで）を報告した人がいた。とはいえ、BSFスコア（図3E）、胃腸症状（中等度から中等度）、精神症状には大きなばらつきがあるにもかかわらず、一般的にメタボロームプロファイルは安定している。

詳細は画像に続くキャプションを参照。
図3
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3.3 IBS患者における4週間にわたる糞便メタボロームの動態
次にコホートBでは、糞便上清中のメタボロームの時間的動態をLC-MSメタボロミクスで解析した。0週目において、糞便メタボロームプロファイル（n = 6999スペクトル特徴）のPCAは、健常者とIBS患者で大きな重複を示した（図4A）。この場合も、年齢、性別、便の形態は、IBS患者と健常者のメタボロームに影響を与えないようであった（図S2A-C）。非類似度指数が0に近いIBS患者では、0週目の健常人と比較して、メタボロームプロファイルがより異なっており（非類似度が高い）（p < 0.05）（図4B）、IBS患者は0週目の健常人グループよりも経時的に便型の範囲が広く、正常な便（3～5型）のみを報告していた（図4C）。0週目と4週目に提供された個人内サンプルを連結した糞便メタボローム・プロファイルに基づくPCAでは、便通の一貫性にかかわらず、同じ個人から提供されたサンプルのほとんどが互いに近接して局在する傾向があることが示された（図4D）。グループレベルでは、患者は便の形態とは無関係に、0週目と4週目で同様のメタボロームを示した（図S2D）。最後に、Bray-Curtis非類似度を評価することにより、4週間にわたる時間的安定性を評価したところ、コホートA同様、IBS患者内よりも患者間でメタボロームのばらつきが大きいことが示されました（図4D）。

詳細は画像に続くキャプションに記載
図4
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4 解釈
本研究により、IBS患者の糞便メタボロームプロファイルの短期的および長期的安定性と、健常人の糞便メタボロームプロファイルの短期的安定性の両方が証明された。経時的なメタボローム非類似度は、IBS患者と健常者ともに個人間よりも個人間で高かった。さらに、IBS患者では便の形態に大きな幅があるが、糞便メタボローム動態には明らかな影響はなかった。これらの知見を総合すると、IBS患者では便の一貫性が変動するにもかかわらず、糞便メタボロームが安定しているという考え方が支持される。

しかし、便の形状、排便回数、便水分量、通過時間の変動が疾患の特徴であるIBSにおいて、このような便バイオマーカーが有効であるかどうかは不明であった。したがって、個々のIBS患者内の糞便メタボロームが、数時間、数日、数週間にわたって比較的一定であることを示した今回の研究は、非常に重要である。IBS患者と健常者のBray-Curtis非類似度指数はゼロに近く、調査期間を通じて両群の糞便代謝物組成が全体的に類似していることを裏付けている。この結果は、IBS患者および健常者の糞便メタボロームにおいて、個体内差よりも個体間差の方が大きく、両群のメタボローム非類似度の経時的変動パターンは同等であることを明確に示している。従って、今回の知見は、安定した経時的な個人特異的糞便代謝物シグネチャーを支持するものであり、IBSに適合する症状を有する個人の単一タイムポイントサンプリングが、この疾患のバイオマーカーとして使用できる可能性を示唆するものである。

我々の知る限り、IBSにおける腸内微小環境の縦断的プロファイリングを目的とした研究の数は限られており21, 30, 45, 46、主に糞便微生物叢組成に焦点が当てられている。代謝産物に関しては、IBS患者を含む臨床試験のプラセボ群から抽出されたデータから、少なくとも特定の特異的代謝産物は経時的に一定であることが示されている26, 31, 32。2人のIBS患者のみを含む別の研究では、遺伝子発現レベルで測定された機能的微生物プロファイルは、症状が軽い場合は被験者内で安定しているが、症状が悪化すると安定性が低下することが示された47。最近の研究では、IBS患者の大規模コホートにおける微生物叢と代謝産物の経時的側面について重要な知見が追加されたが、代謝産物プロファイルの経時的な個人差については報告されていない21。しかし、コール酸やチェノデオキシコール酸のような特定の微生物由来の代謝産物は、再燃と関連することが報告されている21。このテーマに関する研究は少ないため、IBS患者における糞便メタボロームプロファイルの経時的安定性を明らかにする本研究は、今のところ満たされていないニーズを満たすものであるが、痛みを含む症状の変動に関連する特定の代謝産物の経時的変動に関する調査を含め、知識を拡大し深めるさらなる研究が必要である。さらに、この研究にはIBS-C患者は含まれていないが、連続したサンプル採取に関連する明らかな困難を念頭に置いて、これらの患者からのサンプルにおける糞便代謝物の動態を評価することは興味深い。さらに、今後の研究では、生殖年齢の女性における代謝物の週ごとの変動を検討する際に、月経周期の位相のコントロールを考慮すべきである48。

IBSの症状（重症度や主な便のパターンなど）は、日によって変動 することがあり24, 28、腸内微小環境は腸の習慣によって変化することが示唆 されている。興味深いことに、最近、微生物叢の経時的な被験者間変動は、IBS患者の便の一貫性の変動によって部分的に説明できるが、被験者内変動は説明できないと報告された28。同様に、別の研究では、便中微生物叢組成または短鎖脂肪酸シグネチャーとIBS重症度または便パターンとの経時的な一貫した関連性は認められなかった26。文献24によると、健常人の便は正常であったのに対し、IBS患者では経時的な便型の幅が大きかった。総じて、メタボロームプロファイルの安定性と便の硬さの変化との関連性は確認できなかった。しかし、この関連性の欠如は、便の水分量を補正していないこと、また、IBSのサブタイプ判定における便の硬さの主観的評価の正確性が最近疑問視されていることから、慎重に解釈すべきである。

我々の知る限り、IBS患者と健常人の便の固さに関連した糞便メタボロームの変動を数時間、数日、数週間にわたって評価した縦断的研究は今回が初めてである。発表された知見はこの分野に大きな影響を与えると思われるが、本研究にはいくつかの限界がある。第一に、本研究は便中代謝産物の縦断的変動を捉えることを目的としており、他の目的で考案された先行研究のメタボロームデータを利用している。サンプルサイズが小さく、IBSの病態生理が不均一であるため、IBSと健常人のメタボロームシグネチャーの違いについて確固たる結論を導き出すことや、IBSや健康に関連する特定の特異的代謝物を同定することには限界がある。そのため、研究グループ別の代謝物パネルは示していない。さらに、代謝産物に影響を与えることが知られている食習慣については考慮しなかったが、参加者には試験期間中、食生活を変えないよう求めた。コホートBでは食習慣や投薬の大きな変化は検出されなかったが、コホートAではこのような情報は得られなかった。それでも、食事登録に関する潜在的な異質性を考慮すると、参加者はどちらのコホートでも経時的に安定した糞便メタボロームを示した。糞便サンプルは水分含量が異なる可能性があるため、コホートAの参加者には毎回の排便後の硬さを記録してもらったが、コホートBではこの作業は行われなかった。したがって、コホートBの糞便メタボロームと便の硬さの関連性は、両コホートでパターンが類似していたとしても、慎重に解釈する必要があることを認める。しかし、2つのIBS研究グループがそれぞれ異なるタイプの医療センターで募集され、Rome IIIまたはIVに基づく異なるIBSサブタイプに属していたことは強みであると考えられる。さらに、リクルート方法、研究のタイムライン、サンプル採取のタイムポイントがコホート間で異なっていたため、両者の直接的な比較は制限されたが、短期間および長期間の安定性を明らかにすることができた。サンプル採取や短期保存の違いなど、糞便サンプリング51に関連するその他の課題はコントロールできなかった。とはいえ、すべてのサンプルは長期保存され、同じように調製された。2つの異なるメタボローム解析方法を使用したため、2つのコホート間の詳細な比較はできませんでしたが、どちらの方法論的アプローチも同様のパターンを示しており、異なるデータセットサイズ（155代謝物対6999スペクトル特徴量）に基づくメタボロームシグネチャーは、深さは異なるものの、糞便メタボロームプロファイルの決定に同様に有用である可能性が示唆されました。

要約すると、連続サンプリングと2つの異なるメタボローム解析法を適用することで、便の一貫性の変動にかかわらず、IBS患者における糞便メタボロームプロファイルの短期的および長期的な安定性が示された。同様のパターンが健常者においても短期間で見られた。今後、より大規模な研究が必要であるが、本研究は、対象者固有の安定したメタボロームという概念を支持するとともに、糞便メタボロームがIBSの病態にどのように関連しているかを探るために、単一タイムポイントサンプリングを使用することを支持するものである。

著者貢献
CIは生物学的データの処理、解析、解釈、データの可視化、原稿の作成を行った。MS（サプナラ）は糞便上清を調製した。OSはサンプルのメタボローム解析を行い、メタボローム解析法と統計解析について知的・科学的意見を提供した。MS（Simrén）とHTは、被験物質の収集を行い、原稿に知的・科学的意見を提供した。MKMは生物学的データの処理、解析、解釈を行い、原稿を作成した。LÖは本研究のコンセプト立案、資金調達、原稿執筆に関与した。MKMとLÖはシニアオーサーシップを共有する。すべての著者が、著者リストを含む論文の最終版を承認した。

謝辞
著者らは、コホートAの募集を企画し、糞便サンプルを提供してくれたAnders Lasson氏、および方法のセクションで意見を寄せてくれたAnders Lasson氏に深く感謝したい。また、コホートBに含まれるIBS患者のリクルートを含む研究を後援してくれたGlycom A/S（現DSM）にも感謝したい。

資金提供
本研究は、The Research and Development Council of the County of Södra Älvsborg（助成金番号：VGFOUSA-265131）、Wilhelm and Martina Lundgren's foundation、Region Västra Götaland（助成金番号：VGFOUREG-9408）の助成を受けた。VGFOUREG-940815、VGFOUREG-273759）、ALF-agreement（助成金番号ALFGBG-723921、ALFGBG-965619、ALFGBG-965173）、Swedish Research Council（助成金番号2019-01052、2021-00947）、Erling-Persson Foundation。

利益相反声明
CI、OS、MS（サプナラ）、HTは申告すべき利益相反はない。MS（Simrén）は、Danone、Ferring Pharmaceuticals、Glycom（現DSM）から無制限の研究助成金を受領しており、Almirall、Allergan、Albireo、AstraZeneca、Danone、Nestlé、Glycom（現DSMの一部）、Menarini、Shireの諮問委員会委員、AlfaSigma、Allergan、Almirall、Alimentary Health、Biocodex、協和キリン、Menarini、Tillotts、武田薬品工業、Shireのスピーカーを務めた。MKMはヤンセン・シラグ社および武田薬品工業のスピーカーを務めたことがある。LÖは、Genetic Analysis AS社、Biocodex社、Danone Research社、AstraZeneca社から研究資金援助を受けており、Genetic Analysis AS社ではコンサルタント／諮問委員会メンバーを、Biocodex社、Ferring Pharmaceuticals社、武田薬品工業、AbbVie社、Meda社ではスピーカーを務めた。

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