百寿者の抗酸化システムとしての腸内細菌叢と腸内常在乳酸菌の高い抗酸化活性の関連性

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公開日：2022年12月24日
百寿者の抗酸化システムとしての腸内細菌叢と腸内常在乳酸菌の高い抗酸化活性の関連性
Lei Wu, Xinqiang Xie, ...Qingping Wu 著者を表示する
npj Biofilms and Microbiomes 第8巻 記事番号：102（2022） この記事を引用する

3 アルトメトリック

メトリクス詳細

概要
腸内細菌叢は人間の健康と長寿に重要な役割を果たしており、百寿者の腸内細菌叢はユニークな特徴を示している。現在、長寿に関する微生物研究の多くは、通常、バイオインフォマティクスレベルに限られており、機能性微生物の培養に関する有効な情報が不足している。ここでは、メタゲノム配列解析と大規模in vitro培養を組み合わせ、世界的な長寿の町・中国膠嶺の百寿者や様々な年齢の人々のユニークな腸内細菌構造を明らかにした。機能性菌株をin vitroで分離・スクリーニングし、腸内細菌と長寿の関係の可能性をin vivoで探索・検証した。百寿者18人を含む、年齢の異なる247人の健康な広東出身者が研究に参加した。若年成人と比較して、百寿者の腸内細菌叢は、高い微生物多様性、ゼノバイオティクス生分解・代謝、酸化還元酵素、宿主代謝に有益であることが知られている複数の種（潜在的プロバイオティクスLactobacillus、Akkermansia、メタン生成Methanobrevibacter、腸管酪酸生成メンバー Roseburia、SCFA生成種（Clostridiales、Ruminococcaceae））が存在することが明らかにされた。これらの菌種は年齢とともに常に変化している。また、これらのサンプルから大規模in vitro培養により2055株を分離したが、そのほとんどがメタゲノム解析により検出され、両者の間に明確な相補性が認められた。さらに、独自に知的財産権を有する加齢性腸内常在乳酸菌をスクリーニングしたところ、その代謝物（L-アスコルビン酸）とそれ自体が良好な抗酸化作用を有していることが判明しました。この結果は、ヒトの腸内細菌叢には加齢に伴う軌道が存在すること、また、抗酸化システムとして異なる腸内細菌叢と腸内常在菌が健康や長寿に寄与する可能性を強調するものであった。

はじめに
人口の高齢化は、今日、世界が直面している大きな問題であり、いかにして寿命を延ばし、健康的な加齢を維持するかが焦点となってきている。老化は複雑なプロセスであり、世界中の科学者が老化の根本的なメカニズムを探求し、老化を制御すると思われる重要な因子を特定することによって老化を遅らせようと懸命に努力している1,2。加齢には遺伝や環境など様々な要因が関係しており、遺伝的要因が25-30%、環境要因が70-75%を占めています3,4。様々な環境要因の中でも、腸内細菌叢はヒトの健康や長寿と密接に関係しており5,6,7,8、したがって、腸内細菌叢は老化の治療標的として浮上し、健康な老化を実現するための新しい戦略を提供する可能性がある9.

様々な動物モデルを用いた実験により、腸内細菌叢が宿主の長寿の制御に重要な役割を果たすことが示されています。モデル生物として、本来短命な脊椎動物であるアフリカツメダカ（Nothobranchius furzeri）を用い、中年者の腸内に若いドナーからの細菌を再コロニー化すると寿命が延び、行動の低下が遅れることから、脊椎動物の寿命の調節に腸内細菌叢が重要な役割を果たしていることが示唆されている10。ショウジョウバエの腸は、微生物叢が単純であり、哺乳類の腸と生理的に類似していることから、ヒトの腸の病態生理を研究するためのモデルとして選ばれている。研究により、微生物由来の代謝物が宿主の酵素によって変換されると、上皮細胞のターンオーバーや宿主の寿命に影響を与えることが示されている11。ハダカデバネズミ（Heterocephalus glaber）は、健康的な老化と長寿の生物学を研究するための優れたモデルである。今回初めて、ハダカデバネズミの腸内細菌生態系をヒトや他の哺乳類のものと比較し、百寿者やハドザ族狩猟採集民の腸内細菌生態系と共通する構成的特徴をいくつか見いだした。これらのデータは、哺乳類の生物学と健康の適応的パートナーとしての腸内細菌生態系の重要性を確認するものである12。ミツバチのような社会性昆虫では、同じ遺伝子型でも寿命に極端な差が出ることがあります。寿命の短い（働き蜂）の老化した腸内細菌叢は、プロテオバクテリアを産生し、ラクトバチルスとビフィドバクテリウムを枯渇させる。一方、長寿のミツバチ（女王蜂）は、酸化ストレス遺伝子の発現がかなり低く、若々しい細胞機能を維持しており、加齢に伴う微生物の継承についてユニークな視点を提供している13。

また、臨床研究により、腸内細菌叢の多様性と構成は、加齢に伴い非線形的に変化することが示されている。百寿者では、RoseburiaとEscherichiaの存在量が非百寿者に比べて有意に高く、Lactobacillus, Faecalibacterium, Parabacteroides, Butyricimonas, Coprococcus, Megamonas, Mitsuokella, Sutterella, and Akkermansiaは非百寿者に比べて有意に少なかった14。ヒトの腸内細菌群の加齢に伴う軌跡は、短鎖脂肪酸産生の遺伝子が失われ、解糖能が全体的に低下する一方で、タンパク質分解機能は若年成人の腸内メタゲノムよりも豊富であることが特徴的である15。イタリアのサルデーニャ島で、年齢層に関連する腸内細菌叢の組成および機能の違いを特定するためにメタゲノムシークエンシングを用いた研究が行われました。そのデータによると、サルデーニャの百寿者の腸内細菌叢は、若年層と老年層と比較して、主にFaecalibacterium prausnitziiとEubacterium rectaleの枯渇によって特徴付けられる一方、Methanobrevibacter smithiiとBifidobacterium adolescentisが濃縮されていることが分かった。機能解析の結果、百寿者は代謝能力、特に解糖と短鎖脂肪酸（SCFA）の発酵が高く、繊維やガラクトースなどの炭水化物分解酵素をコードする遺伝子は低いことが示された16。百寿者は、リトコール酸（LCA）の様々な異性体を含む独特の二次胆汁酸を産生できる微生物が豊富な独特の腸内細菌叢を持っていることが研究で明らかにされている。これらの知見は、特定の胆汁酸の代謝が病原性感染症のリスク低減に関与している可能性を示唆しており、ひいては腸内恒常性の維持に寄与している可能性がある17。長寿は腸内細菌叢の恒常性を維持することで達成されているように思われるが、腸内細菌叢の変化が老化の結果なのか原因なのか、また腸内細菌叢と老化の正確な関係については、今後さらに検討が必要である。

腸内細菌叢と寿命の関係を探るため、数多くのメタゲノム研究が行われているが、メタゲノム解析では、さらなる菌株の特性解析や機能評価のための生存可能な微生物を提供できていない17,18。メタゲノム解析の限界により、健康で長寿な人々の実際の腸内細菌叢は、十分に解明されているとは言い難い状況です。最近の研究では、このギャップを埋めるために、最適な経路と適切な培養条件さえ見つかれば、すべての微生物が培養可能であると思われるカルトロミクスが注目されている19。これは、腸内細菌組成を包括的に特徴付けるためのメタゲノムシーケンスを効果的に補完するものとなっている。現在、カルトロミクスとメタゲノミクスは高い補完性を示しており、テストした種のうち15%のみが両技術で共存しています20,21。しかし、これらの結果はメタゲノム解析と小規模培養オミックスによって得られたものであり、この結論を証明するためには大規模培養オミックスがまだ必要である。

本研究では、メタゲノム配列解析と大規模in vitro培養を組み合わせ、世界的な長寿の町・中国膠嶺の百寿者や様々な年齢の人々のユニークな腸内細菌構造を明らかにしました。試験管内で機能性株を分離してスクリーニングし、腸内細菌と長寿の関係の可能性を探り、生体内で検証した結果、腸内細菌叢と年齢および多くの臨床・代謝パラメータとの関連性が明らかになりました。百寿者に濃縮された7つの微生物分類群のコアセット、百寿者の腸内細菌叢は高いゼノバイオティクス生分解・代謝、オキシドレダクターゼを示すなど、年齢特異的な腸内細菌叢の特性を明らかにした。我々は、すべての集団において、α多様性の増加、Akkermansia、Lactobacillus、短鎖脂肪酸（SCFA）産生菌などの健康関連菌の存在量の増加などの年齢に関連した腸内細菌の特性を明らかにし、代謝産物とそれ自体が優れた抗酸化作用を有する独立した知的財産権を有する年齢に関連した腸内常在乳酸菌を標的としてスクリーニングを行った。

研究成果
被験者の特徴
世界長寿の郷-中国嘉陵市」から、百寿者18名（Y120グループ）、81-99歳19名（Y100グループ）、61-80歳77名（Y80グループ）、41-60歳81名（Y60グループ）、21-40歳30名（Y40グループ）、0-20歳22名（Y20グループ）の合計247名を募集しました（表1）。多職種による健康診断の結果、明らかな疾病はなく健康であった。すべての被験者は雑食で、調査前の3ヶ月間に抗生物質を服用していなかった（図1a；表S1）。

表1 世界的な長寿の町、中国・嘉陵の人口統計学的特性。
原寸表
図1 サンプリング地域の概要と腸内細菌叢における組成の特徴。
図1
a 中国南部の広東省膠嶺市（世界長寿の郷）にある8つの町から抽出されたサンプリング地域の概要。16S rRNA 遺伝子とメタゲノム配列の解析と in vitro および in vivo での検証実験プロセス。 b 上位 100 種と年齢関連株の属レベルでの系統関係。グループ間の統計解析は平均値±SDで表し、エラーバーは標準偏差を表す。

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加齢に伴う腸内細菌の特徴
腸内細菌叢が加齢とどのように関連しているかを研究するために、Jiaolingコホートが設立されました。このコホートから、0～110歳の全個体の糞便サンプルの16S rRNA遺伝子アンプリコンデータとメタゲノムデータを宿主の代謝状態とともに解析し、メタゲノミクスの指導の下で分離した株を試験管内でスクリーニングして、生体内で抗酸化機能を検証した（図1a；表S1）。

観察種、Chao1、Shannon、ACEなどのα-diversity指標は、若年層（Y20、Y40、Y60）よりも高齢層（Y80、Y100、Y120）で顕著に増加した（図S1a-d）。これは、Seppら22が示した、長寿者では若年者よりも微生物叢の豊かさと多様性、遺伝性微生物と環境微生物の存在量が高いという結果と一致する。PCoAによると、非加重UniFrac距離を用いて、高齢者群（Y80、Y100、Y120）と若年者群（Y20、Y40、Y60）の腸内細菌叢は有意に異なった（Fig. S1e）。また、α多様性、β多様性ともに、Y20, Y40, Y60グループ間、Y80, Y100, Y120グループ間で有意差は見られなかった（図S1a-d）。しかし、Bianら23は、健康な高齢中国人の腸内細菌叢が健康な若者のそれと類似していることを示した。微生物の多様性は、健康なマイクロバイオームを表現するためのパラメータであるが、生態学的メカニズムをさらに探求するための出発点として位置づけられる必要がある24。

腸内細菌叢は、16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンスにより、22の植物群に属する270属107科で構成されていた。種のアノテーションの結果（Fig. S1f-h）、腸内細菌叢の門レベルは主にFirmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteriaであった（Fig. S1f）。Y120百寿者群では、ファミリーレベルでMethanobacteriaceae, Akkermansiaceae, Muribaculaceae, Ruminococcaceae, Christensenellaceae, Lactobacillaceaeが他のグループより多く存在した。Lachnospiraceae、Burkholderiaceae、Bifidobacteriaceaeは存在量が少なかった（図S1g）。また、潜在的な有用菌であるAkkermansiaceae, Lactobacillaceae, ChristensenellaceaeはY120の百寿者グループにも見いだされた。これらの細菌群は年齢とともに徐々に増加し、過去の報告25,26と同様であった。属レベルでは、Akkermansia, Methanobrevibacter, Klebsiella, Parabacteroides, Phascolarctobacterium, Barnosiella, Alisipes, Butyricimonas, Lachnoclostridium, Blautiaの種がY120の100歳群では他の群より高い存在度を示した（図S1h）。これは、百寿者に関連する主なバイオマーカーがVerrucomicrobia門に属することを示したPalmasらの結果27と一致している。その中には、腸の健全性を促進する能力があることから、腸の恒常性の重要なバイオマーカーと考えられているAkkermansia muciniphila種が含まれる。上位100種の系統関係を属レベルで解析したところ、Akkermansia、Methanobrevibacter、Klebsiella、Parabacteroides、Phascolarctobacterium、Barnosiella、Arisipes、Butyricimonas、Lachnoclostridium、Blautiaなどの相対量が年齢とともに徐々に増加することが明確に観察された（図1b）。研究により、Akkermansia は早老マウスの寿命を延ばし、腸管バリアーを強化することが示されている28,29。

腸内細菌叢の多様性が増加するコホートの特徴がよくわかったので、次に、これらのコホートの中で加齢に関連するヒトの腸内細菌の特徴を特定できるかどうか尋ねてみた。その結果、高齢者グループ（Y80、Y100、Y120）では、13属が高レベルであることが判明した。これらの属には、プロバイオティクスとして期待されるLactobacillus、Akkermansia、メタン生成菌のMethanobrevibacter、Alistipes、Parabacteroides、Erysipelotrichaceae, Butyrivibrio, Butyricimonas, Barnesiella, Phascolarctobacterium、腸内の酪酸生産菌Roseburia、SCFA生産菌Clostridiales、Ruminococcaceaeなどの菌が含まれていた(Fig. 1b)。(Fig. 1b, Fig. 2a, Fig. S2）。このように、これらの分類群は、年齢が上がるにつれて、複雑な共起ネットワーク関係を持つようになり、年齢関連のコア分類群として定義された（図2b）。その結果、BarnesiellaceaeはBMI、CHOL、TGなどの代謝プロファイル（図3a）と、LactobacillaceaeはGLO、BUNなどの臨床パラメータと、AkkermansiaceaeはGLOと有意な逆相関が見られた（図3a）。各群の臨床パラメータから、長寿地域の人々の身体健康指数が良好であることが観察された（図3b）。注目すべきは、マウスやヒトの研究において、アッケシソウと宿主代謝の利点との因果関係が証明されており、アリジスの多さは、動脈硬化性心疾患32、低TGレベルまたは低BMI33，34の低リスクと関連することが報告されていることである。これらのデータは、加齢に伴う腸内細菌叢の軌跡を特徴づけるものであった。

図2：加齢に伴う腸内細菌の特徴
図2
a 年齢に関連した腸内細菌叢の相対的存在量 Lactobacillus, Akkermansia, Methanobrevibacter, Alistipes, Parabacteroides, Uncl Erysipelotrichaceae, Butyrivibrio, Butyricimonas, Barnesiella, Wilcoxon順位和検定による若年層（Y20, Y40, Y60）と高齢層（Y80, Y100, Y120）の間のPhascolarctobacterium, Roseburia, Clostridiales, Ruminococcaceae Unclの比較、*はp<0. 05; **はp < 0.01; ***はp < 0.001を示す。 b属レベルでの腸内細菌叢の共起ネットワーク分析。異なるノードは異なる属を表し、ノードの大きさはその属の平均相対存在量を表し、同じ門のノードは同じ色を持ち、ノード間の線の太さは種の相互作用の相関係数の絶対値と正相関を持つ。接続の色と相関の正負の対応（赤の正相関、青の負相関）。

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図3：腸内細菌叢と臨床パラメーターの相関分析。
図3
a 選択した細菌ファミリーの相対的存在量と臨床パラメーターとの相関。p < 0.05の相関を示す。Benjamini and Hochberg法を用いて調整したSpearmanのrho統計量。年齢 歳、丙身長、丙体重、BMI body mass index、NCE neck circumference、ACE abdominal circumference、WSBP systolic blood pressure、WDP diastolic blood pressure、CHO cholineterase、ALB albumin、GLO globulin, γ-GPE γ-glutamyl transpeptidase, ALK alkaline phosphatase, AST aspartate aminotransferase, TBN total bilirubin, ALT alanine aminotransferase, Ca calcium, BUN urea nitrogen, UA uric acid, Cr creatinine, CHOL total cholesterol, TG triglyceride, HDL. c 高密度リポ蛋白、LDL.c 低密度リポ蛋白。HBA1c 糖化ヘモグロビン、PLC 血小板数、WBCC 白血球数、LAV リンパ球絶対値、NAV 好中球絶対値、Hb ヘモグロビン濃度 b 全群の臨床パラメータ。各年齢群の臨床指標の変化。* はp＜0.05、**はp＜0.01、***はp＜0.001、nsは有意ではない、一元配置分散分析、平均±SDで表され、エラーバーは標準偏差である。

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加齢に伴う腸の機能的特徴
機能レベルでは、メタゲノム解析により、糖質代謝、アミノ酸代謝、補酵素・ビタミン代謝、糖鎖生合成・代謝、脂質代謝、その他アミノ酸代謝、その他二次代謝産物の生合成、テルペノイド・ポリケチド代謝、有害物質の生分解・代謝といった多くの代謝経路が確認されました。若いグループと比較して、高齢者グループの腸内細菌叢は、有害物質の生分解および代謝に関連する一連の遺伝子をより多く保有しており、これらは年齢の上昇と有意な関連を示した（図4a）。特に、アミノベンゾエート分解、アトラジン分解、ベンゾエート分解、カプロラクタム分解、クロロシクロヘキサンおよびクロロベンゼン分解、ダイオキシン分解、エチルベンゼン分解、フルオロベンゾエート分解、多環芳香族炭化水素分解、スチレン分解、トルエン分解およびキシレン分解の高いレベルは年齢の上昇と有意に関連していた（図S3a）。

図4：年齢による腸管機能特性
図4
a 腸内細菌の KEGG パスウェイアノテーション（ゼノバイオティクス生分解・代謝、アミノ酸代謝、糖質代謝、脂質代謝、その他の二次代謝産物の生合成、その他のアミノ酸代謝、補酵素・ビタミン代謝、糖鎖生合成・代謝、テルペノイド・ポリケチドの代謝）を示すボックスプロットとバーチャートの表示。P 値は両側 Wilcoxon rank-sum 検定により求めた。箱ひげ図では、中央の線が中央値を表す。箱ひげ図では、中心線は中央値、箱の境界線は第1四分位と第3四分位を表す。上ひげはヒンジから1.5 * 四分位範囲 (IQR) 以内の最大値まで伸びている。b RNAポリメラーゼ、デヒドロゲナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、オキシドレダクターゼ、アセチルトランスフェラーゼの腸内細菌機能を6つの年齢層で比較したヒートマップです。スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンストランスフェラーゼ、カタラーゼの年齢群による変化を示す箱ひげ図 c, d 選択した年齢関連細菌属と代謝経路および酸化還元酵素との相関。* Wilcoxon rank-sum testにより、*はp<0.05、**はp<0.01、**はp<0.001を示す。

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また、Y120群では、酸化還元酵素、メチル基転移酵素、アセチルトランスフェラーゼ、脱水素酵素が多く、スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオン基転移酵素、カタラーゼは年齢上昇と有意に関連することがわかった（図4b、図S3b）。これらの結果は、有害物質の生分解や代謝、酸化還元酵素など、加齢に関連した腸の機能特性が、年齢上昇と有意に関連することを示している。注目すべきは、加齢に関連した腸内細菌叢と機能にも有意な関連が見られたことである。アッカーマンシアは、ゼノバイオティクスの生分解と代謝、糖鎖の生合成と代謝、その他の二次代謝産物の生合成、スーパーオキシドディスムターゼ、カタラーゼと、ラクトバチルスは、ゼノバイオティクス生分解と代謝、テルペノイドとポリケチドの代謝、スーパーオキシドディスムターゼと有意な関連性が見られた（図4C、図4D）。これらのデータは、加齢に伴う腸の機能的特徴を示している。

加齢関連株のターゲット分離とスクリーニング
加齢に伴う腸内細菌叢とその機能の特徴を明らかにした上で、これらの加齢に伴う腸内細菌叢と機能株をターゲットとして分離し、スクリーニングできないか、と考えた。実際、中国膠嶺市（世界長寿の郷）において、年齢と微生物の多様性、種の相対的存在量、機能との間に多くの有意な関連性が検出された。

これらの加齢に伴う腸内細菌叢と機能の相関を検証するため、2055株を分離・精製したところ、Lactobacillus 26.67 %、Enterococcus 20.63 %、Escherichia 18. 39 %、Weissella 14.21 %、Lactococcus 5.35 %、Pediococcus 4.48 %、Streptococcus 2.68 %、Klebsiella 1.65 %、未培養菌 1.51 %、Staphylococcus 1.31 %、Shigella 0.68 %、Bacillus 0.49 %など、2055 株を分離精製した（図 5、図 S4a）。単一培地を選択し、嫌気性環境で培養しただけなので、上記のビッグデータで解析したすべての年齢別菌株を分離したわけではない。幸い、L. salivarius, L. fermentum, L. plantarum, L. mucosae, L. gasseri, L. paragasseri, L. animalis, L. crispatus等を中心とした多数の乳酸菌を分離することができた（図5）。

図5：加齢に伴う腸内細菌叢の標的分離。
図5
糞便サンプルから分離された全菌株の属レベルでの割合を示す円グラフであり、合計2,055株が分離された。図6 糞便サンプルから分離された上位6属（Lactobacillus, Enterococcus, Escherichia, Weissella, Lactococcus, Pediococcus）の詳細な構成を示す棒グラフである。

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次に、抗酸化プロバイオティクスのスクリーニングのために、いくつかの糞便分離株を選択した。予備スクリーニング（菌懸濁液）、再スクリーニング（菌懸濁液、細胞外物質、細胞内物質、菌片）を経て、最終的にLactobacillus plantarum 124（LP124）と名付けられた強い抗酸化活性を持つ株がin vitroでスクリーニングされた。抗酸化スクリーニングの指標としては、1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）の消去率、L-cysteine相当（μmol/L）の還元活性、水酸化フリーラジカル（-OH）の消去率、鉄イオン（Fe2＋）のキレート率、スーパーオキシドアニオン（O2-）の消去率、脂質過酸化抑制を示した（表S2、3、図S5j）。これらの結果から、腸内細菌からより優れた抗酸化活性を持つ菌株を分離し、in vitroでスクリーニングを行い、Lactobacillus plantarum124と命名した。

加齢黄斑変性症腸内常在菌の抗酸化機構
加齢黄斑菌LP124はin vitroで抗酸化活性を示すことが知られているが、in vivoで酸化還元酵素関連遺伝子が存在するかどうか、全ゲノム配列の解読を行ったところ、塩基長3210286、（C+G）% 44.61%であった。そして、GO (Gene Ontology) データベースで遺伝子の機能を、KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) データベースでパスウェイをアノテーションした。興味深いことに、代謝プロセス、細胞プロセス、触媒活性、結合、トランスポーター活性、抗酸化活性を含む多数の生物学的プロセス、分子機能、細胞構成遺伝子があることが分かった。最終的に、12の抗酸化活性GO番号と140の抗酸化活性遺伝子番号が見出された（図6、図S4b）。酸化還元酵素関連遺伝子群は、主にsrlD: SDR family oxidoreductase (EC:1.1.1.140, ko00051 Fructose and mannose metabolism), ndh.を含むアノテーションがなされている。NAD(P)/FAD依存性酸化還元酵素 (EC:1.6.99.3, ko00190 酸化的リン酸化)、gpx: グルタチオンペルオキシダーゼ (EC:1.11.1.9, ko00480 グルタチオン代謝； ko00590 アラキドン酸代謝； ko04918 甲状腺ホルモン合成), trxA: チオレドキシン (ko04621 NOD-like receptor signalway; ko05418 流動せん断ストレスと動脈硬化 ), trxB: チオレドキシン二硫化還元器 (EC:1.8.1.9, ko00240 ピリジン二硫化還元器 ), ko00490 NOD 様シグナル伝達回路 (Ko00420) 9、ko00240 ピリミジン代謝；ko00450 セレノ化合物代謝）、msrA：ペプチド-メチオニン（S）-S-オキシド還元酵素（EC：1.8.4.11）、katE、CAT、catB、srpA：カタラーゼ（EC：1.11.1. 6、ko00380 トリプトファン代謝；ko00630 グリオキシル酸およびジカルボン酸代謝；ko01200 炭素代謝；ko04011 MAPKシグナル伝達経路-酵母；ko04016 MAPKシグナル伝達）などが見つかった（Fig.6）。また、糖質代謝、アミノ酸代謝、エネルギー代謝、ヌクレオチド代謝、脂質代謝、その他アミノ酸の代謝、ゼノバイオティクス生分解・代謝など、多数の遺伝子を見出した（図S4c）。パンゲノミクス解析により、LP124 の特異的分子標的配列 124_03212 を発掘し（図 S4d）、広東科学院微生物研究所文化収集センターに寄託し、寄託番号は GDMCC61123であった（表 S4）。これらの結果から、LP124 は生体内で多くの酸化還元酵素関連遺伝子を獲得していることが示唆された。

図6】Lactobacillus plantarum 124の全ゲノム解析結果。
図6
LP124のゲノムサークルマップとオキシドレダクターゼ関連遺伝子。コーディング遺伝子は、BLASTによりNational Center for Biotechnology Information (NCBI) NRデータベースでアノテーションした。外側から内側へ。1つ目の円はゲノム位置情報、2つ目の円はGC content情報、3つ目の円は正鎖のコーディング遺伝子（赤でマーク）、4つ目の円は負鎖のコーディング遺伝子（緑でマーク）。5番目の円はプラス鎖のncRNA情報（青色で表示）、6番目の円はマイナス鎖のncRNA情報（紫色で表示）、7番目の円はゲノム中の長い繰り返し配列の情報（オレンジ色で表示）、8番目の円は酸化還元酵素に関連する遺伝子を表しています。

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さらに、腸内に常駐するLP124が動物の酸化ストレスも緩和できるかどうかを検証するため、LP124をマウスに胃内注入した（図7a、図S5k,l）。レシピエントマウスの腸内細菌プロファイルを、8週目に16S rRNA遺伝子アンプリコン配列決定によって分析した（図S5a〜c）。予想通り、LP124は、酸化損傷マウスの腸内細菌叢の組成および機能を調節することができた。さらに、属レベルでは、Akkermansia, Bacteroides, Alloprevotella, Prevotellaceae_UCG-001, Lachnospiraceae_NK4A136 でモデルグループと比較して存在量が増加した (Fig. S5a)．さらに、機能レベルでは、Lactobacillusの糖質代謝アミノ酸代謝、脂質代謝、ゼノバイオティクス生分解、代謝が多く観察された。これらの結果は、LP124 群の腸内細菌叢の組成と機能に深遠な変化があることを明らかにし、LP124 が腸内細菌の発育に重要であることを示すものであった。

図7：Lactobacillus plantarum 124とAkkermansiaのマウス酸化損傷緩和効果。
図7
a マウス実験デザインの概略図。 b, e マウス肝臓および腎臓の抗酸化能測定（グルタチオンペルオキシダーゼ（GSH-Px）活性、スーパーオキシドディスムターゼ（SOD）活性、チオレドキシン還元酵素（TrxR）活性、総合抗酸化力（T-AOC）、マロンアルデヒド（MDA）量、総合カルボニル（Carbonl）量など）。c, f 酸化損傷マウスの肝臓および腎臓組織におけるGSH-Px, SOD, Nrf2, TrxRの相対発現。 d 異なるマウス群の肝臓腎臓および腸の組織形態学的解析（原倍率、×400；スケールバー＝50μm）。 g マウス血清エンドトキシン測定値。図中の異なる文字（a、b、c、d）は、群間の有意差（p < 0.05, 一元配置分散分析）を示し、同じ文字は有意差なしを示す。群間の統計解析は平均値±SDで表し、エラーバーは標準偏差を表す。

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グルタチオンペルオキシダーゼ（GSH-Px）、スーパーオキシドディスムターゼ（SOD）、チオレドキシン還元酵素（TrxR）、総合抗酸化能値（T-AOC）、マロンジアルデヒド（MDA）、カルボニル、エンドトキシン（ET）は、酸化ストレス障害の病態形成に重要な役割を果たすと考えられている。8 週間後、モデルマウスはコントロールマウスと比較して、肝臓の GSH-Px, SOD, TrxR, T-AOC が有意に低下し、MDA, カルボニルレベルが高くなった。注目すべきは、LPマウスはモデルマウスと比較して、GSH-Px, SOD, TrxR, T-AOCが有意に高く、MDA, カルボニルレベルが低かったことである（Fig.7b）。同様に、LPマウスの腎臓も肝臓と同様の結果を示した（Fig.7e）。次に、肝臓と腎臓における遺伝子GSH-Px, SOD, TrxR, nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) messenger expressionの変化を検討した。特に、GSH-Px、SOD、TrxR、Nrf2 mRNAのレベルは、マウスのモデルグループと比較して、LPグループで有意に増加した（図7c、f）。LP124が肝臓、腎臓にどのような影響を与えるかを調べるために、それらの構造を調べた。組織形態学的解析の結果、モデル群では対照群に比べ、肝臓の構造変化が顕著であった（Fig. 7d）。また、腎臓の形態についても、モデル群では対照群との違いが明らかになった（図7d）。モデルマウスでは、肝臓と腎臓に重篤な病変が見られた。しかし、LP群では、肝臓と腎臓の形態はコントロールと同様であった。さらに、LP群とビタミンC（Vc）群では、目に見える病理組織学的な異常は観察されなかった（Fig. 7d）。これらの結果は、LP124が肝臓と腎臓における酸化ストレスを緩和する機能を持つことを示した。

腸における体の健康反応の低下は、腸管バリアー機能障害と関連していることが知られている35。我々は、腸に常駐するLP124が腸のバリア機能に影響を与えるかどうかを調査した。LP124は、LPマウスの血漿中エンドトキシン濃度を顕著に低下させた（図7g）。次に、腸の病理組織学的変化に対する LP124 の影響を検討した。モデル群では対照群に比べ腸の構造変化が顕著であり、LPマウスではVc群に比べ上皮の形態に明らかな差は見られなかった（Fig. 7d）。これらの結果から、LP124 には腸管バリアーを保護する機能があることが示された。

腸内に存在する LP124 が遠方で抗酸化活性を発揮するメカニズムを明らかにするため、モデル群に対して LP124 を投与した動物の血清中に存在する低分子物質を LC-MS で特性評価した。その後、タンデム質量分析により、LP124投与動物の血清中に有意に濃縮された候補低分子を同定し、そのうち2つはL-アスコルビン酸とメサコン酸であると負に同定された（Fig. 8a, d, Fig. S5f, h）、一方、5つは、酪酸リジン、D-アラニル-D-アラニン、ノロキシコドン-d3、PC（16：1/16：1）、PC（17：1/17：2）として正の同定を行った（図8b、図S5d、g、i）。さらに解析したところ、上記の代謝物には15の代謝パスウェイが有意差をもって関与していることが判明した（Fig.） 幸いなことに、これら 7 つの有意に濃縮された低分子化合物の中から、非常に強い抗酸化作用を持つことでよく知られている非常に重要な代謝物 L-ascorbate を検出することができました36,37,38。これらの知見を裏付けるため、我々は生体内における Vc (L-ascorbate) の酸化活性を測定した。その結果、Vcマウスはモデルマウスと比較して、肝臓と腎臓でGSH-Px、SOD、TrxR、T-AOCのレベルが有意に高く、MDA、カルボニルレベルが低いことが確認された（図7b、e）。同様に、肝臓と腎臓におけるGSH-Px、SOD、TrxR、Nrf2 mRNAの発現量も、Vc群はモデルマウス群に比べ有意に増加した（図7c,f）。また、Vcマウスでは、上皮の形態に対照群との明らかな差は見られなかった（Fig.7d）。

図8】Lactobacillus plantarum 124のマウスの酸化的損傷を制御する血清メタボロームの解析結果。
図8
a, b 超高分解能質量分析により同定された、モデル群と比較してLP群で有意に発現が増加した代謝物および発現が減少した代謝物の特徴。ボルケーノチャートは、様々な代謝物の全体的な分布を視覚的に表示することができます。有意に上昇した代謝物を赤い点、有意に下降した代謝物を緑の点で表し、点の大きさは VIP 値を表しています。横軸の値が大きいほど、そのパスウェイにおける差分代謝産物の濃縮度が高いことを示す。点の色は、超幾何学検定の p 値を表している。値が小さいほど、検定の信頼性が高く、統計的に有意であることを示す。ドットの大きさは、対応する経路の異なる代謝物の数を表しています。d 異なる代謝物の相関図（posはポジティブイオンモード、negはネガティブイオンモード）。正の相関は赤、負の相関は青。色のない部分はp値 > 0.05。図は、p値の小さいものから大きいものへと並べた上位20の差分代謝物の相関図。

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最後に、L-アスコルビン酸の起源がLP124によって生成されているかどうかを調べるために、そのメタボロミクス解析を行いました（表S5,6）。その後、質量分析により、LP124の培養上清にL-アスコルビン酸が蓄積していることを確認しました（表S5）。さらに解析したところ、L-アスコルビン酸の代謝物には、アスコルビン酸およびアルダル酸代謝、ビタミン消化吸収、HIF-1シグナル伝達経路、グルタチオン代謝といくつかの代謝経路が関与していることが明らかとなった。特に、L-アスコルビン酸は、フルクトースおよびマンノース代謝、アミノ糖およびヌクレオチド糖代謝の代謝物として、Fig.8eに示されたように、L-アスコルビン酸の代謝物である。これらのデータから、腸内常在乳酸菌由来の低分子化合物であるL-アスコルビン酸は、抗酸化反応に関与する有効な物質として作用することが明らかとなった。

考察
世界の長寿郷である中国の膠嶺は、百寿者の発生率が高く、人口が比較的単一であり、ライフスタイルと食生活が独特である。長寿を研究するには理想的な地域である。したがって、世界一の長寿の郷である膠嶺の百寿者の腸内細菌叢を詳細に研究することは、長寿のメカニズムについての理解を深めることにつながるであろう。腸内細菌叢は人間の健康を決定する重要な因子と考えられているが39、長寿集団における腸内細菌叢の構造や長寿に影響を与えるメカニズムは十分に理解されていない。さらに、腸内細菌叢の構成をどのように徹底的に解析するかは、大きな課題として残されている。本研究の主な目的は、中国国内でのみ異なる年齢の人々の腸内細菌叢の特徴を明らかにすることで、「世界長寿の郷・中国膠嶺」に属する地域長寿の要因を掘り起こすことである。そこで、他国、あるいは世界のビッグデータを選択することなく、メタゲノムとカルチュロミクスによって、世界長寿の郷・膠嶺の長寿者の腸内細菌叢の特徴を深く探った。我々の知る限り、世界一の長寿の町、膠嶺で糞便微生物のメタゲノム配列解析と大規模培養オミクスを組み合わせ、腸内細菌叢と健康長寿の関係を徹底的に探った研究は初めてであった。本研究では、世界一の長寿の町・中国膠嶺のコホートを対象に包括的な解析を行い、年齢に応じた腸内細菌の組成・機能特性の存在を明らかにしました。また、これまであまり認識されていなかった抗酸化反応における微生物の役割も明らかにした。さらに、乳酸菌の試験管内培養の培養上清とLactobacillus plantarum 124 gavage動物の血清の両方からL-アスコルビン酸を検出したことから、乳酸菌がこの効果の媒介者であることも特定した（Fig. 9）。

図9：百寿者の腸内細菌叢の構造と機能特性および長寿メカニズムの可能性。
図9
ヒトの腸内細菌叢には加齢に伴う軌道が存在し、抗酸化システムとしての明確な腸内細菌叢と腸内常在が健康や長寿に寄与している可能性があること。

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本研究では、同じ地域に住む一般の若者と比較して、高齢者、特に百寿者のグループは、若いグループよりも高い腸内細菌の多様性を示しました。百寿者の腸内細菌叢の構造と機能には、独特の特徴があります。しかし、研究によると、百寿者はしばしば、α多様性の減少、酪酸産生菌（例えば、Faecalibacterium、Rosetella、Eubacterium、Ruminococcus）の減少、日和見病原体の増加といった特徴を示すことが分かっている40。これは、中高年者では若年者に比べて大腸通過時間が長く41,42、大腸通過時間の長さは腸内細菌の多様性の高さと関連しているためと考えられる43。さらに、我々の研究では、高齢者集団は、Akkermansia、Lactobacillus、多くのSCFA産生菌などのいくつかの健康な細菌種の存在量も高いことがわかった（Fig. 9）。また，Akkermansiaceae，Lactobacillaceae，Barnesiellaceaeなどは，臨床指標と有意な相関があった．ここで、年代的な加齢と生物学的な加齢を区別する必要がある。年代とは、その人の実年齢を表し、人生の経過時間に基づいて算出されます44。生物学的年齢とは、ある時点の生理的年齢における個人の総合的な健康状態を指します。一般的には、環境、食事、生活、心理的要因などを考慮する必要がある。生物学的年齢は年代よりも優れた予測因子であることが明らかにされており、その測定は大腸内視鏡検査に関連する大腸腺腫リスクの評価を容易にすることができる45。脂質異常症、糖尿病、炎症も加齢に伴う疾患である。少なくとも、これらのバイオマーカーで加齢に関連する分類学的マーカーの再検証を行うことができるだろう。個人の生物学的老化の程度は、これらのバイオマーカーの年齢関連残差に基づき、上記の分類群の存在量は、これらの年齢調整残差と関連付けられる可能性があります。一方、Methanobrevibacterの存在量も加齢とともに徐々に増加した。高齢者におけるAkkermansiaの喪失と、その大腸粘液厚の維持や抗炎症免疫状態への役割が、マウスで報告されている46。これまでの知見と一致して、加齢に伴うMethanobrevibacterの存在量、メタン生成遺伝子、および微生物の多様性の有意な増加は、高齢者で観察された大腸通過時間の延長と関連している可能性がある47,48。Methanobrevibacterは年齢とともに徐々に濃縮され、これは長寿に関与している可能性がある49。

我々の解析では、高齢者、特に百寿者は、年齢が上がるにつれて、有害物質の生分解と代謝、酸化還元酵素を含むいくつかの健康増進機能の存在量が高くなることが明らかになった。百寿者は長寿者であるため、外圧にさらされた重要な履歴を持つ可能性がある。また、移動が少なくなるため、若い人よりも家の中で過ごす時間が長くなり、室内汚染物質への曝露が増加する。したがって、彼らのマイクロバイオームは、これらの有害物質をよりよく分解することができると容易に推測される。このような曝露と反応によって、長寿者の腸内細菌叢に蓄積された有害物質分解能力が促進される可能性がある。ここでは、長寿者の異生物分解能力は、これらの特に長寿者の生活習慣に関連したトップダウンの選択過程の結果である可能性を推測している。以前の研究では、イタリアの成人の腸内細菌叢もゼノバイオティクスを分解できることが分かっており50、これはこれらの化合物への曝露に対する機能的反応である可能性がある51。

実際、人間の多くの全身性疾患は、腸内の微生物構成によって制御されている52。このような認識から、プロバイオティクスの使用によりマイクロバイオームを治療的に調節する試みが進められている。しかし、特定の細菌およびその産物が、どのようなメカニズムで個別の有益な効果を発揮するのかは、まだわかっていません。そのため、プロバイオティクスが影響を及ぼす分子経路を明らかにすることで、プロバイオティクスをより標的として使用したり、微生物由来の低分子を利用したりすることが可能になると考えられています。我々は、in vitro大規模培養技術を用いて、糞便サンプルから2055株を分離し、1つの乳酸菌の標的分離とスクリーニングを行い、L-アスコルビン酸をLP124由来の小分子として同定したが、我々の特定のメタボロームプラットフォームを用いて同定できなかったLP124に反応した他の多くの小分子は、おそらくあるであろう。このことは、腸内細菌叢を包括的に理解するために、カルチュロミクスがメタゲノミクスを補完する重要な手段であることを示唆している。カルトロミクスで検索された腸内細菌種の株数は、各生物種の実際の存在量を反映していないが、それでもカルトロミクスの高い分離率は、糞便中のこの種の相対的な存在量の多さをある程度示している。本研究では、世界的な長寿の町である中国の膠嶺で培養されたLactobacillusとEnterococcusの株数が多く、この2つの分類群が百寿者においてより多く存在する可能性を示唆する結果を得ました。これらの結果は、メタゲノムデータに関する過去の文献報告53と一致する。我々は、カルトロミクスによって、L. salivariusがLactobacillusの中で最も豊富な種であることを見出した。また、カルチュロミクスによる乳酸菌分離の精度を確認するために、メタゲノムによる腸内細菌叢の種レベルでの分類レベルを解析したところ、上位20種は、L. mucosae、L. salivarius、L. delbrueckii, L. fermentum, L. rogosae, L. johnsonii, L. amylovorus, L. reuteri, L. ruminis, L. equicursoris, L. murinus, L. gasseri, L. bifermentans, L. casei, L. ceti, L. plantarum, L. crispatus, L. iners, L. ingluviei, L. brevis であった。ここで、L. salivariusが種レベルで2位にランクされていることがよくわかる。これは、腸内細菌叢におけるL. salivariusの存在量が非常に多いことを示しており、L. salivariusを大量に分離できるのが普通であることがわかります。この結果は、Kristinaらが報告した大腸に大量のLactobacillusが存在することに関する結果とも一致する54。ご存知のように、腸内細菌叢に存在する株の大部分は培養不可能である。メタゲノム解析では、さらなる菌株の特性解析や機能評価のための生存可能な微生物を得ることができなかった。このギャップを埋めることができるのが、カルチュロミクスであると思われる。これは、腸内細菌組成を包括的に特徴付けるために、メタゲノムシーケンスを効果的に補完するものです。現在、カルトロミクスとメタゲノミクスは高い補完性を示し、ある程度の相互検証も可能です。したがって、カルトロミクスは腸内細菌叢の組成のさらなる理解に貢献し、微生物のダークマターを浮き彫りにすることができます。カルチュロミクスとメタゲノム解析のデータを組み合わせることで、腸内細菌群集の構造と機能に関する知見が得られる。今後、さまざまな機能性菌株に曝露した動物でトランスクリプトーム、プロテオーム、リピドミクス研究を検討することにより、腸内細菌叢と人間の健康や長寿との因果関係に関する包括的な理解に貢献することが期待されます。

結論として、本研究は、腸内細菌叢とヒトの健康・長寿との関係に対する我々の理解を深めるものである。メタゲノム解析とin vitro大規模培養の組み合わせにより、世界一の長寿郷である膠嶺の健康長寿集団の腸内細菌叢の構造・機能的特徴と、そのユニークな濃縮腸内細菌を初めて明らかにした。さらに、ラクトバチルスがヒトの健康を強力に促進することを立証し、抗酸化物質としての可能性について重要な文献的裏付けを追加しています。また、これらのデータは、腸内細菌叢が、その本質的にコード化された特定の生体触媒活性に加えて、摂取した外来生物に影響を及ぼす可能性のある宿主の生体処理経路を誘導することができることを示唆するものである。腸内細菌叢の年齢に関連した軌跡、および横断的データでは捉えきれない世代に関連した差異を解明するためには、幅広い年齢層にわたるヒトの制御された縦断的研究がさらに必要である。

研究方法
研究対象者
Jiaoling（世界長寿の郷、中国広東省梅州市Jiaoling県）コホートの全体的な研究目的は、腸内細菌叢が年齢に関連してどのように変化し、これが健康にどのように影響するかを研究することである。本研究は、広東薬科大学第一付属病院/臨床医学院の倫理委員会により承認されました。広東薬科大学第一付属病院/臨床医学院：2021(13).

国の市民登録制度に基づき、8つの町から合計247名の参加者を無作為に抽選した。参加者は、以下の基準に基づいて適格とされた。(1)嘉陵で出生、(2)サンプリング地点から遡って嘉陵に5年以上継続して居住、(3)年齢0～110歳。登録されたすべての参加者は、身体検査と生体材料採取の前に、インフォームド・コンセントに署名した。その後、以下の条件を満たす247名がメタゲノム研究に参加した：(1)糞便および血液サンプルがある、(2)生体試料採取前の過去1ヶ月間に抗生物質治療を受けていない、(3)重篤な疾患（末期癌、腎臓または肝臓疾患）がない。糞便サンプルは各被験者から新鮮に採取し、直ちに-20℃で凍結し、アイスパックで実験室に運び、分析まで-80℃の冷蔵庫で保管した。年齢による群間比較分析のため、嘉陵コホートの被験者を20歳をカットオフとして6つの年齢群に分けた。臨床的測定、身長、体重、およびウエスト周囲径は、標準化されたプロトコルに従って訓練を受けたスタッフによって測定された。BMI（kg/m2）を含む人体測定パラメータを算出し、さらなる解析のために保存した。血圧（mmHg）は自動血圧計で3回測定し、測定値の平均を解析に用いた。因子の統計は、表1、表S1、図3にまとめてある。

16S rRNA 遺伝子アンプリコンおよびメタゲノム配列解析
微生物 DNA は、QIAamp DNA stool mini kit (QIAGEN, Hilden, Germany) を用いて、標準的な方法55 でビーズビートと加熱のステップを追加して抽出した。Cutadapt (v1.9.1, http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/) 56 を用いてリードのカットとフィルタリングを行い、サンプルあたり平均 85,170 リードを測定しました。品質管理 (https://github.com/torognes/vsearch/) 57 後、平均 80,024 のクリーンリード58 が得られ、品質管理効率は 94.01% に達しました。Uparseソフトウェア（v7.0.1001, http://www.drive5.com/uparse/）59を用いて、配列を操作上の分類単位（OTU）にクラスタリングし、3,436個のOTUが得られました。その後、Mothur法およびSSUrRNA60、SILVA132のデータベース（http://www.arb-silva.de/）61を用いて、OTUの種アノテーション解析を行った（閾値は0.8-1に設定）。群集多様性のShannon指数の算出には、QIIMEソフトウェア（v1.9.1）を使用した。主座標分析（PCoA）図は、Rソフトウェア（v2.15.3）とWGCNA、stats、ggplot2ソフトウェアパッケージを使ってプロットした。α多様性とβ多様性指数のグループ間差は、Rソフトウェアを用いて分析した。グループ間の差異を説明するために、線形判別分析効果量（LEfSe）を行った62。共起ネットワークグラフの描画にはGraphviz-2.38.0を使用した。DIAMONDソフトウェア63,64を用い、非冗長遺伝子セットに対する共通機能データベースアノテーションを行った（e-value ≤ 10-5）。合計3,264,476 (60.85%) ORFをKEGGデータベース65,66、3,204,116 (59.72%) ORFをeggNOGデータベース67、 165,799 (3.09%) ORFをCAZyデータベース68と比較検討した結果、ORFはKEGGデータベースと比較された。

加齢関連株のターゲット分離とスクリーニング
すべてのサンプルをMRS (De Man, Rogosa, Sharpe) 寒天培地で培養し、好気性および嫌気性で37℃、24時間インキュベートした。各サンプルから典型的な形態を持つ疑わしいコロニーを8〜10個選び出し，同定を行った。糞便サンプルから2055株の分離株を得た。MALDI-TOF MS（Biomerieux, France）または16S分子鑑定により分離株を同定した後、最終的にLactobacillus 548、Enterococcus 424、Weissella 292、 Escherichia 378、 Lactococcus 110、 Pediococcus 92、 Streptococcus 55、 Klebsiella 34などとカウントされた。185株を無作為に選び、1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) の消去率69、L-cysteine equivalent (μmol/L) の還元活性70、水酸化フリーラジカル (-OH) の消去率71、鉄イオン (Fe2+) のキレート率72などの抗酸化指標によってスクリーニングを実施した。スーパーオキシドアニオンの消去率(O2-)73、過酸化脂質の抑制率74を予備スクリーニング（菌懸濁液）、再スクリーニング（菌懸濁液、細胞外物質、細胞内物質、菌片）でも同様に評価した。

菌体懸濁液、細胞外物質、細胞内物質、菌体片の調製。自己分離で得られた乳酸菌を1.5mLのMRS液体培地に接種し、37℃で24時間培養したものを接種菌として、2％接種のMRS液体培地50mLに接種し、24時間培養して、菌株の培養液を得る。10,000 r/minで10分間、4℃で遠心分離する。上清は細胞外物質である。10～15 mL を 15 mL の遠心管に採取する。滅菌生理食塩水で再懸濁し、細胞密度 109 CFU/mL, OD600 = 1.0 ± 0.1 に調整し、菌懸濁液とする。少なくとも 3 mL を 15 mL 遠心管に取り、氷浴中で超音波処理（750 W, 休憩 5 s, 断続 5 s, 作業時間 7. 5分、総時間15分）、遠心分離（10,000 r/min、4℃、25分）し、上清を細胞内物質として回収し、沈殿を回収し、相当量の通常食塩水を加え、菌体片とする。

全ゲノムシークエンス
次世代シーケンサー用ライブラリーの調製は、製造元のプロトコールにしたがって行った。各サンプルについて、200 ngのゲノムDNAを超音波処理（Covaris S220）によりランダムに<500 bpに断片化した。この断片をEnd Prep Enzyme Mixで処理し、末端修復、5' Phosphorylation、dA-tailingを一度に行い、その後、T-A ligationで両端にAdaptorを付加した。その後、Beadsを用いてAdaptor-ligationしたDNAのサイズセレクションを行い、~470 bpの断片（おおよそのインサートサイズは350 bp）を回収した。PCR産物はBeadsで洗浄し、Qsep100 (Bioptic, Taiwan, China) でバリデートし、Qubit3.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) で定量を行った。

その後、異なるインデックスのライブラリーをマルチプレックスし、製造者の指示に従ってIllumina HiSeq/Novaseq instrument (Illumina, San Diego, CA, USA) または製造者の指示に従ってMGI2000 instrument (MGI, Shenzhen, China)にロードした。Pacbioでは、ゲノムDNAをせん断し、10Kbの二本鎖DNA断片を選択した。DNA断片は末端損傷を修復し、ユニバーサルヘアピンアダプターでライゲーションした。その後、製造元の指示に従い、SMRTbellライブラリーを作製した。このライブラリーをPacBio SEQUEL instrument75でシークエンシングした。

PacBioのリードは、WGS-Assembler 8.276,77,78,79,80,81のHGAP4/Falconを用いてアセンブルした。そして、過去のilluminaデータを用いたソフトウェアPilon、またはPacbioリードを用いたソフトウェアQuiverでゲノムを再修正する。コーディング遺伝子の探索には、遺伝子探索ソフトウェアProdigal82/Augustus83を使用した。コーディング遺伝子は、BLASTによりNational Center for Biotechnology Information (NCBI) NRデータベースを用いてアノテーションを行った。また、GO84 (Gene Ontology) データベースで遺伝子の機能を、KEGG85 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) データベースでパスウェイをアノテーションした。

パンゲノムによる Lactobacillus plantarum 124 の特異的標的の探索
Lactobacillus plantarumのGenBankで公開されている全ての完全閉鎖型ゲノム配列をダウンロードし、種のパンゲノム86を生成するための解析に含めた。この解析に基づいて、各生物種に固有の遺伝子、すなわち、ある生物種に存在し、他の生物種には存在しない遺伝子のリストが作成された。これらの遺伝子の特異性を確認するために、各生物種についてリストアップされたユニークな遺伝子の検索を行った。第一に、Lactobacillus plantarumの全ゲノムに対して、第二に、原核生物のNCBIデータベースに対して、検索を行った。種のバイオマーカーとして示唆されたユニーク遺伝子の検証のため、Lactobacillusおよび非Lactobacillusの227の分離株を、パンゲノム解析から決定したユニーク遺伝子マーカーの存在についてPCRによりスクリーニングした（表S7）。

動物実験および酸化還元酵素活性の測定
広東省科学院微生物研究所動物実験倫理承認番号。GT-ICUC201909026。昆明マウス（SPFグレード）は南医科大学（中国広東省）から入手し、gnotobiotic施設内で12時間の明暗サイクルの下で飼育した。すべてのマウスに無菌の餌と水を自由摂取させた。対照群には通常生理食塩水（200 mg/kg/day）を皮下投与し、毎日0.2 mLの通常生理食塩水を経口摂取させた。モデル群にはD-ガラクトース（200 mg/kg/day）を皮下注射し、毎日0.2 mLの通常生理食塩水をギャベリングした。試験群にはD-ガラクトース（200 mg/kg/day）を皮下投与し、1.01 ± 0.05 × l09 CFU/mL A/B 株溶液を毎日 0.2 mL ゲイビングさせた。A株はLactobacillus plantarum 124株（試験菌株）、B株はAkkermansia muciniphila ATCC BAA-835株（対照菌株）から構成された。陽性薬物Vc群にはD-ガラクトース（200 mg/kg/day）を皮下注射し、抗酸化物質Vc（200 mg/kg/day）を毎日経口投与した。給餌サイクルは9週間であった。肝臓と腎臓の組織ホモジネートを調製し、グルタチオンペルオキシダーゼ（GSH-Px）、スーパーオキシドディスムターゼ（SOD）、チオレドキシン還元酵素（TrxR）、総抗酸化能レベル（T-AOC）、マロンジアルデヒド（MDA）、カルボニル、エンドトキシン（ET）といった酸化ストレスマーカーを分析対象とした。

形態学的観察
動物を犠牲にした後、肝臓、腎臓、小腸を分離した。組織と臓器は10％ホルマリンで固定し、通常のパラフィンに包埋し、4〜5μmの厚さに切開し、ヘマトキシリンとエオシン（HE）で染色し、病理学の専門家が結果を読み取った。切片は病変の重症度に応じて評価した：軽度（＋）、中等度（＋＋）、重度（＋＋）、病変組織なし（-）。

遺伝子発現解析
RNeasy mini kit (Huangshi Yanke Biotechnology Co., LTD, Hubei, China) を用いて、マウスの肝臓および腎臓から、製造者の指示に従ってトータルRNAを抽出した。定量的RT-PCRは、SYBR Premix Ex Taq (Huangshi Yanke Biotechnology Co., LTD, Hubei, China) を用いて、Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR Systemで実施した。mRNA発現量の算出は、ハウスキーピング遺伝子であるGSH-Px、SOD、TrxR、Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2（Nrf2）の幾何平均を用いて、2-ΔΔCT法により行った。遺伝子とプライマー配列を表S8に示す。群間の比較は、群あたりn＝6〜9の一元配置分散分析を用いて行った。すべての結果は、生物学的複製の平均値±SDとして示される。

質量分析
モデル動物およびLP動物から血清サンプルを採取し（各群n = 6）、アセトニトリルを用いてタンパク質沈殿により代謝物を抽出した。Thermo Scientific High-Field Qexactive質量分析計（HILIC/ESI+、C18/ESI-、85-1275 m/z、120k分解能）に連結した液体クロマトグラフィーを用いて、非標的メタボロミクスプロファイリングを実施しました。同定代謝物および未同定代謝物に対応するスペクトルフィーチャー (m/z, リテンションタイム) は、apLCMS/xMSanalyzer ソフトウェアを使用して統合およびアライメントされました。統計解析には Metaboanalyst87 を、パスウェイ濃縮解析には Mummichog ソフトウェア88 を使用し、保持時間、m/z、MS/MS は認証標準物質で検証しました。候補となる分子は、Thermo Scientific Fusion 質量分析計を用いたイオン解離実験により同定し、スペクトルライブラリは Compound Discoverer 3.0 を用いて mzCloud、mzVault、および MassList ライブラリとマッチングさせた。

統計解析
データの違いにより、Wilcoxonの順位和検定、Studentのt検定、または一元配置分散分析によりグループ間の統計分析を行い、平均値±SDで表した。属レベルのShannon indexはQIIME (v1.9.1)で算出した。アルファ多様性指数とベータ多様性指数の群間差の解析にはRソフトウェア（v2.15.3）を用いた。p < 0.05は統計的有意性を示す。統計解析とデータの可視化は、Rソフトウェア（v2.15.3）を用いて、WGCNA、stats、ggplot2ソフトウェアパッケージで行った。

報告書の概要
研究デザインに関する詳細な情報は、この論文にリンクされているNature Research Reporting Summaryで入手可能である。

データの利用可能性
全サンプルの配列データは、NCBI Sequence Read Archive (SRA) にアクセッションコードBIOProjectで寄託されています。PRJNA895352 本研究の結果を裏付けるその他のデータは、論文およびその補足情報ファイルから入手可能である。

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謝辞
本研究は、広東省重点研究開発プログラム（2018B020205002）、広東省科学院イノベーション駆動型発展能力構築特別プロジェクト（2020GDASYL-20200301002）、広東省科学技術局プロジェクト（2019QN01N107）からの研究助成により共同で行われたものである。研究に参加されたすべての方々、特に研究対象者と北京ノボジェン技術有限公司に感謝します。

著者情報
著者ノート
これらの著者は等しく貢献した。Lei Wu、Xinqiang Xie、Ying Li。

著者と所属
広東省微生物安全衛生重点実験室、中国南部応用微生物学重点実験室、広東科学院微生物研究所、広東省広州市、中国

Lei Wu, Xinqiang Xie, Ying Li, Tingting Liang, Haojie Zhong, Lingshuang Yang, Yu Xi, Jumei Zhang & Qingping Wu

広東薬科大学第一附属病院（中国広東省広州市

呉磊（Lei Wu）・中浩傑（Haojie Zhong

華南理工大学生物工学部（中国広東省広州市

呉磊（Lei Wu）・中浩傑（Haojie Zhong)

済南大学食品科学技術学部、食品安全栄養研究所、中国広東省広州市

丁 裕

寄稿
Q.W.、Y.D.、L.W.、J.Z.は本研究を構想し、設計した。L.W.、X.X.、Y.L.、T.L.はコホートの構築、標本および生物学的データの収集を行った。H.Z.は、検体および臨床メタデータの転送を監督し、臨床的な洞察を提供した。L.W.、L.Y.、Y.X.は糞便サンプルの培養実験と分離ゲノムDNA抽出を行った。L.W.は動物実験を担当した。L.W.は臨床メタデータ、ショットガンメタゲノムシーケンスデータ、分離株ゲノムシーケンスデータ、ファンクショナルメタゲノムデータを解析した。L.W.は原稿を執筆した。L.W.、Q.W.、Y.D.は原稿を改訂した。Q.W.、Y.D.はプロジェクトの監修を行った。L.W.、X.X.、Y.L.の貢献度は同等である。最終的な原稿は全著者が承認した。

対応する著者
Yu DingまたはQingping Wuに連絡すること。

倫理的宣言
利益相反
著者らは、競合する利益を宣言していない。

追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や所属機関に関する管轄権の主張に関して中立的な立場を維持しています。

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Wu, L., Xie, X., Li, Y. et al. Gut microbiota as an antioxidant system in centenarians associated with high antioxidant activities of gut-resident Lactobacillus. npj Biofilms Microbiomes 8, 102 (2022). https://doi.org/10.1038/s41522-022-00366-0。

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受付終了
2022年5月26日

Accepted
2022年12月08日

掲載
2022年12月24日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41522-022-00366-0