スクラロース-6-アセテートとその親スクラロースの毒性学的および薬物動

2023年6月9日 22:14

トキシコロジー＆環境衛生ジャーナルB編
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スクラロース-6-アセテートとその親スクラロースの毒性学的および薬物動態学的特性：in vitroスクリーニングアッセイ

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/10937404.2023.2213903

スーザン・S・シフマン
,
エリザベス・H・ショール
,
テレンス・S・フューリー
&
H. トロイ・ネイグル
オンライン公開：2023年5月29日
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https://doi.org/10.1080/10937404.2023.2213903
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ABSTRACT
本研究の目的は、人工甘味料スクラロースの構造類似体であるスクラロース-6-アセテートの毒性学的および薬物動態学的特性を明らかにすることであった。スクラロース-6-アセテートはスクラロースの製造における中間体および不純物であり、最近の市販スクラロース試料には最大0.67%のスクラロース-6-アセテートが含まれていることが判明している。また、ネズミを用いた研究では、スクラロース-6-アセテートは糞便中にも存在し、スクラロースに対して最大10%まで存在することが分かっており、スクラロースが腸内でもアセチル化されていることが示唆されています。ハイスループット遺伝毒性スクリーニングツールであるMultiFlow®アッセイと細胞遺伝学的障害を検出する小核（MN）テストにより、スクラロース-6-アセテートには遺伝毒性があることが示唆されました。また、作用機序は、MultiFlow®アッセイを用いて、クラストジェニック（DNA鎖切断を生じる）と分類されました。1日1本のスクラロース入り飲料に含まれるスクラロース-6-アセテートの量は、遺伝毒性に関する毒性学的懸念の閾値（TTCgenotox）である0.15μg/人/日をはるかに超える可能性があります。RepliGut®システムを用いてヒト腸管上皮をスクラロース-6-アセテートおよびスクラロースに曝露し、RNA-seq解析を行い、これらの曝露により誘導される遺伝子発現を明らかにしました。スクラロース-6-アセテートは、メタロチオネイン1 G遺伝子（MT1G）の発現量が最大となり、炎症、酸化ストレス、がんに関連する遺伝子の発現を有意に増加させました。ヒト横行結腸上皮の経上皮電気抵抗（TEER）と透過性を測定した結果、スクラロース-6-アセテートとスクラロースはともに腸管バリアの完全性を損なうことがわかった。また、スクラロース-6-アセテートは、チトクロームP450ファミリーの2つのメンバー（CYP1A2およびCYP2C19）を阻害した。全体として、スクラロース-6-アセテートの毒物学的および薬物動態学的知見は、スクラロース自体の安全性および規制状況について重大な健康上の懸念を提起するものである。
KEYWORDS
スクラロース
スクラロース-6-アセテート
遺伝毒性
遺伝子発現
腸管バリア
はじめに
背景発見と合成
スクラロースは塩素化された人工甘味料であり、砂糖の代替品として世界中で何千もの食品、飲料、医薬品に使用されている（Schiffman and Rother Citation2013）。スクラロースの甘味は、ロンドンのクイーン・エリザベス・カレッジ（Hough and Phadnis Citation1976）で、スクロース（テーブルシュガー）を化学的に修飾して産業応用するプログラムの一環として発見されました。この化学修飾は、新規な二糖類であるフルクトガラクトースの3つの水酸基を塩素原子で置換したもので、化学名は1,6-ジクロロ-1,6-ジデオキシ-β-D-フルクトフラノシル-4-クロロ-4-デオキシ-α-Dガラクトピラノシッドである。この化合物は当初、トリクロロガラクトスクロース（TGS）と呼ばれていたが、その後スクラロースという名前が付けられた。スクラロースの甘味効力は、特定の用途に応じて、スクロースの約385～650倍の重量になります（DuboisらCitation1991; Schiffman, Sattely-Miller, and Bishay Citation2008）。製造工程では、スクロースからスクラロース-6-アセテートを多段階で合成し、その後脱アシル化してスクラロースを製造する（Hao Citation2011; Mufti and Khan Citation1983; Wang et al.Citation2011）. スクラロース-6-アセテートとスクラロースの化学構造を図1に示す。製造過程で生成するスクラロース-6-アセテート中間体は、スクラロースの商業的供給源において不純物として保持されている（Catani et al. Citation2006; OpAns Citation2021; United States Food and Drug Administration US FDA Citation2021; Werness Citation2021）。
図1. スクラロース-6-アセテート（分子量439.7、CAS番号105066-21-5）およびスクラロース（分子量397.6、CAS番号56038-13-2）の化学構造。
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歴史的な安全性の主張
スクラロースは、北米、欧州、アジアにおいて、1日摂取許容量（ADI）の設定とともに規制当局の承認を得ています（カナダ公報引用1991年、欧州連合EU引用2004年、日本厚生省JMHW引用1999年、食品科学委員会SCF引用2000年、米国食品医薬品局US FDA引用1998年、引用1999年）。規制当局によるADIの承認と設定は、1980年代から1990年代前半にかけてラット、マウス、イヌ、ウサギ、ヒトで行われた歴史的な研究に基づいており、最終的には2000年に一部が発表されました（BairdらCitation2000; Goldsmith Citation2000; Grice and Goldsmith Citation2000; John, Wood, and Hawkins Citation2000a, Citation2000b; KilleらCitation2000a、Citation2000b; Robertsら Citation2000; SimsらCitation2000; Wood, John, and Hawkins Citation2000）. これらの歴史的研究は、スクラロースに関して以下の6つの主張を行い、規制当局の承認の根拠を構成していた：

生体内での安定性：腸内を変化なく通過する。
2）腸内細菌叢：腸内細菌叢に影響を与えない。
腸管バリア：腸管組織への影響はない。
生物濃縮性生物濃縮しない。
代謝血糖値やインスリンなどの代謝に影響を与えない。
生物学的/毒物学的影響：遺伝毒性はなく、生物学的に重要な影響もなく、熱に安定である。
これらの歴史的主張に基づき、FAO/WHO合同食品添加物専門委員会JECFA（Citation1991）および食品科学委員会SCF（Citation2000）により、ヒトに対するADI15mg/kg体重/日が設定されました。米国食品医薬品局US FDA（Citation1998）では、より低い5 mg/kg体重/日のADIが設定されています。
過去の安全性研究に反する独立した研究
しかし、規制当局の承認後の多くの科学的研究調査は、スクラロースの生物学的運命や安全性に関する初期の6つの歴史的主張のいずれも裏付けていない。
生体内での安定性
スクラロースを投与したラットの尿および糞便中に2種類のアセチル化スクラロース生体内変換産物が検出され（Bornemann et al. Citation2018）、この発見は、スクラロースが安定で腸内で変化せず（すなわち代謝されず）排泄されるという過去の主張と矛盾している。より豊富なアセチル化代謝物はスクラロース-6-アセテートとして同定され（Werness and Schiffman Citation2020）、スクラロース曝露の生物学的結果に対するその相対的寄与はまだ決定されていない。
腸内細菌叢
ヒトおよび/または動物が承認されたADIレベル内でスクラロースを摂取すると、消化管（GIT）のマイクロバイオームが乱れることが判明した（Abou-DoniaらCitation2008、BianらCitation2017、Méndez-GarcíaらCitation2022、SuezらCitation2022、ZhangらCitation2022）。妊娠中および授乳中のマウスにおける母親のスクラロース摂取は、その子孫のマイクロバイオームにも影響を与えた（Dai et al. Citation2020, Citation2021; Olivier-Van Stichelen, Rother, and Hanover Citation2019）。また、授乳中の女性から採取したヒト母乳サンプルからもスクラロースが検出されており、授乳中の乳児が摂取していることを示しています（Sylvetsky et al.引用2015年）。
腸のバリア
スクラロースは、腸の組織にも影響を及ぼします。スクラロースの摂取は、腸上皮へのリンパ球の浸潤、腺の無秩序化、上皮の瘢痕化などの病理組織学的変化を引き起こしました（Abou-Donia et al. Citation2008）、クローン病様回腸炎における回腸固有層への細菌浸潤の増加（Rodriguez-Palacios et al. Citation2018）、パイエルパッチにおけるCD3+T細胞、CD19+B細胞、IgA+プラズマ細胞の％上昇（Rosales-Gómez et al. Citation2018）、糞便のキモトリプシンおよびトリプシンのレベルを有意に増加させ、糞便のβ-グルクロニダーゼを減少させ（Li et al. Citation2016）、回腸および結腸のリンパ球凝集を開始し（Zheng et al. Citation2022）、炎症および大腸炎関連大腸がんリスクを促進した（Guo et al. Citation2021; Li et al. Citation2020、Wang et al. Citation2019）。さらに、母親のスクラロースの摂取は、腸の発達を阻害し、バリア機能を破壊し、子孫にパネス細胞の欠損を誘発した（Dai et al.Citation2020, Citation2021）。In vitroの研究では、スクラロースは腸上皮細胞への細菌の侵入とともにバイオフィルム形成を促進し（Shil and Chichger Citation2021）、腸上皮モデルにおいてタイトジャンクションとバリア機能を破壊する（Shil et al. Citation2020）ことが示されました。
生物濃縮
スクラロースはラットの脂肪組織に生物濃縮され、尿や糞便から消失しているにもかかわらず、40日間の摂食期間終了の2週間後に存在することが確認されました（Bornemann et al. Citation2018）。in vitroの研究では、スクラロースが培養脂肪細胞における脂質の蓄積と脂肪細胞分化遺伝子の発現を増加させることが報告されています（Azad et al. Citation2020)。
メタボリズム（Metabolism
スクラロースの摂取は、液体またはカプセルで提供された場合、一部のヒト被験者の血漿中のグルコースおよび／またはインスリン濃度を変化させることが指摘されています（Lertrit et al. Citation2018; Méndez-García et al. Citation2022; Pepino et al. Citation2013; Romo-Romoら Citation2018; Schiffman and Rother Citation2013; Suezら Citation2022）、炭水化物（Dalenbergら Citation2020）または別の非カロリー甘味料（Youngら Citation2017）を伴う場合。妊娠中の母親のスクラロース摂取は、肝解毒機構のダウンレギュレーションや細菌代謝物の変化など、子孫の代謝に影響を与えた（Olivier-Van Stichelen, Rother, and Hanover Citation2019）. 追加の研究では、スクラロースが、グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）およびグルコース依存性インスリントロピックポリペプチド（GIP）ならびにナトリウム依存性グルコース共輸送体-1（SGLT-1）を含むインクレチンホルモンに影響を及ぼす可能性があると報告されました（Kreuch et al. Citation2018; Lertrit et al. Citation2018; Margolskee et al. Citation2007; Sun et al. Citation2017; Young et al. Citation2017）．さらに、スクラロースは甲状腺機能を鈍らせることが実証されました（Pałkowska-Goździk, Bigos, and Rosołowska-Huszcz Citation2018）。米国と欧州で規制承認されているレベルのスクラロースの慢性摂取は、糞便メタボローム（Bian et al. Citation2017）、肝臓プロテオーム（Liu et al. Citation2019）を変更し、初回通過代謝に関わる2つの腸内タンパク質、特にP糖タンパク質（P-gp）とチトクロームP450（CYP3A4）の発現を誘導する（Abou-Donia et al. Citation2008）。
生物学的／毒性学的影響
規制当局の承認後、追加の独立した研究調査により、スクラロース曝露後の遺伝毒性およびがんリスクを含む毒性学的知見が報告された。出生前から寿命まで飼料中に投与されたスクラロースは、雄マウスに白血病などの造血器系新生物を誘発しました（Soffritti et al. Citation2016）。大腸がんモデルマウスにおいて、スクラロース投与後に大腸腫瘍の数と大きさの有意な上昇が検出された（Li et al.、Citation2020）。コメットアッセイを利用した4つの異なる研究により、スクラロースはDNAを損傷することが判明した（Pasqualli et al.）また、スクラロースは大腸菌の抗菌剤耐性や変異頻度を高めています（Qu et al. Citation2017）。さらに、スクラロースをグリセロールや脂質と一緒に加熱すると、潜在的に毒性のある化合物のクラスであるクロロプロパノールが生成されることが判明し（Rahn and Yaylayan Citation2010）、この発見は、その後の調査でも、穏やかな温度条件でも有害なポリ塩化化合物の生成を伴うスクラロースの熱不安定性が報告されており（De Oliveira, de Menezes, and Catharino Citation2015、Eisenreich, Gürtler, and Schäfer Citation2020）裏付けられた。
安全性試験の追加の根拠
規制当局の承認後に報告された生物学的有害所見が、スクラロース自体、アセチル化スクラロース（例：スクラロース-6-アセテート）、またはその両方への曝露によるものかどうかはまだ確立されていない。スクラロース-6-アセテートへの曝露は、スクラロースの摂取中に起こるかもしれないし、腸内でスクラロースが代謝されることによって生じるかもしれない。最近の市販スクラロースサンプルに不純物として保持されているスクラロース-6-アセテートの量は、最大0.67%まで変化している（Werness Citation2021）。McNeil Specialty Products Companyは、承認前の米国FDAへの食品添加物申請において、スクラロースのバッチにスクラロース-6-アセテートが存在することを認めた（0.8%と記載したが1.3%未満）（United States Food and Drug Administration US FDA Citation2021）。しかし、スクラロースを投与したラットの糞便中のスクラロースに対するスクラロース-6-アセテートの濃度は、市販のスクラロースサンプルの量よりも有意に高く、糞便中のスクラロース-6-アセテート濃度は最大10％であった（Bornemann et al. Citation2018; Werness and Schiffman Citation2020）．このように、糞便サンプル中のスクラロースに対するスクラロース-6-アセテートの比率が著しく上昇するのは、GIT内の常在菌によるスクラロースのアセチル化に起因すると考えられます。腸内常在菌は、ゼノバイオティック化合物をアセチル化することが知られている（Delomenie et al.引用2001；Dull, Salata, and Goldman引用1987）。以前、Labare and Alexander（Citation1994）は、バクテリアを含む微生物が下水および土壌サンプルにおいてスクラロースを代謝することが判明したことを指摘した。さらに、Sunら（Citation2017）は、細菌であるBacillus amyloliquefaciensがスクラロースをアセチル化および脱アセチル化の両方が可能であることを報告しました。これらの知見から、スクラロース-6-アセテートへの生物学的曝露は、市販の不純物スクラロースの摂取だけでなく、腸内におけるスクラロースのアセチル化からも起こりうることがわかりました。
スクラロース-6-アセテートへの曝露による潜在的な健康への悪影響は、この化学物質がヒトのリスクを評価するための毒性試験で個別に試験されていないため、まだ分かっていません。政府のウェブサイト、化学データベース、特許文献、科学出版物を含む科学文献を包括的かつ体系的に検索した結果、スクラロース-6-アセテートに起因する遺伝毒性および細胞毒性に関する明白な情報は得られなかった。
追加研究の実施
本報告書では、スクラロース-6-アセテートとその構造上の親であるスクラロース（対照）の毒性および薬物動態特性をスクリーニングするために、一連の8つの実験を実施しました。これらの8つの実験では、以下の試験が利用されました。
遺伝毒性の可能性を判断するために、クラストジェニシティ（誘発されたDNA鎖切断）とアニュージェニシティ（染色体数の変化）を予測する迅速なハイスループットスクリーニングツールであるin vitro MultiFlow®アッセイが使用されました（Bryce et al. Citation2017; Citation2018）．
チミジンキナーゼ6（TK6）細胞における従来のin vitro哺乳類細胞小核アッセイを実施し、潜在的な細胞遺伝学的／染色体損傷を評価した（経済協力開発機構 OECD Citation2016）.
遺伝子変異を誘発する可能性のある構造化学的特徴を検出するために、in silico Model Applier Leadscope®プログラムを採用した（Dearfield et al. Citation2017）。
変異原性を評価するために、従来の細菌逆変異試験（Ames試験）を実施した（経済協力開発機構OECD Citation2020）。
ヒト横行結腸の経上皮電気抵抗（TEER）および透過性をRepliGut®システムを用いて評価し、腸管バリアの潜在的障害および完全性を調査した（Allbritton et al. Citation2021; Altis Biosystems, Durham, North Carolina, USA）。
RNA-seq（RNA-sequencing）を利用して、遺伝子発現を調査し、ヒト腸管上皮における差次発現遺伝子を特定した（Marioni et al. Citation2008; Wang, Gerstein, and Snyder Citation2009）。
肝ミクロソーム安定性試験は、潜在的な肝生成を評価するために採用された（Houston Citation1994）．
薬物-薬物相互作用につながる可能性のある解毒酵素の鈍化を評価するために、チトクロームP450（CYP450）阻害試験が実施された（Obach et al. Citation2006）。
これらの毒物学的および薬物動態学的試験は、特定のin vitro技術に関する専門知識に基づいて選択された独立した分析ラボで実施されました。このように複数のアッセイからなる試験群を実施したのは、単一の試験で化合物の潜在的な毒性学的および薬物動態学的特性を決定的に特定することができないためです。
試験方法
試験品
スクラロース-6-アセテートとスクラロースという2つの試験品を8回の実験に使用し、毒性および薬物動態学的特性を測定した。スクラロース-6-アセテート（4,1,6-トリクロロスクラロース-6-アセテート）は、Jiangyin PharmaAdvance, Inc, 6 Dongsheng, West Road, Building D1, Jiangyin, Province, P. R. China 214431によって合成されました。スクラロース-6-アセテートは、99.7%の純度で構造に適合し、1H NMRスペクトル、マススペクトルおよび蒸発光散乱検出器付き高速液体クロマトグラフィー（HPLC-ELSD）により証明されました。いくつかの研究で対照と比較に使用されたスクラロースは、Sigma-Aldrichから入手した。これは、HPLC-MS/MS（OpAns, Durham, North Carolina, USA）によって測定された0.5%のスクラロース-6-アセテートを含み、市販の食品用スクラロースと一致する。
実験1：TK6細胞におけるin vitro MultiFlow® DNA損傷アッセイ
96ウェルフォーマットを用いて、ヒトTK6細胞におけるスクラロース-6-アセテートおよびスクラロースの遺伝毒性能を評価するために、迅速なハイスループットのフローサイトメトリーアッセイ（in vitro MultiFlow® Assay）が実施されました。このDNA損傷のスクリーニングツールは、2つのクラストゲン感受性バイオマーカー（γH2A×、p53）および2つのアニューゲン感受性バイオマーカー（p-H3、polyploidy）の増加に基づいて、化合物がクラストゲン、アニューゲン、または非遺伝毒性であるかを予測します（Bernacki et al. Citation2016; Bryce et al. Citation2014、 Citation2016、 Citation2017, Citation2018）。リン酸化ヒストンγH2A×は二本鎖DNA切断の指標となり、腫瘍タンパク質p53の核への転位はDNA損傷応答の指標となる。ホスホヒストン3（p-H3）は、アニューゲンにさらされた細胞で蓄積され、多倍体化はアニューゲン活性の結果である。DNA損傷応答経路のこれらのエンドポイントを評価するMultiFlow®アッセイの方法論は、以前に説明されています（Bryce et al. Citation2017; Hung et al. Citation2020）。このアッセイは、BioReliance（Rockville, MD）により、In Vitro Clastogenic, Aneugenic, or Non-Genotoxic (CAN) FlowScreen Assay in TK6 Cells（BioReliance Citation2020a、Citation2021）というプロトコルで実施しました。高性能の数学的アルゴリズムを用いて、各バイオマーカーについて有意な倍率の増加を示すカットオフ値を提供する確立されたグローバル評価因子（GEF）を用いて、クラストジェニックおよびアニュージェニックのバイオマーカーのシグネチャーに基づく作用様式（MoA）を予測した（Bryce et al.Citation2017 ）。
材料について
核の解放、クロマチンの染色、および特定の核エピトープの免疫学的標識（MultiFlow® DNA Damage Kit - p53, γH2A×, Phospho-Histone H3 kit）のための材料は、Litron Laboratories, Rochester, NYから購入しました。独自キットの成分および試薬は以下の通りである： Nuclei Release Solution with Counting Beads（細胞を溶解し、ビーズの絶対数を提供）、フローサイトメトリー分析で識別するために遊離核を標識するDNA Stain（ヨウ化プロピジウム）、RNAを除去するRNase Solution、タンパク質p53の核転位を検出するp53 Antibody FITC、2本鎖切断を検出するγH2A× Antibody Alexa Fluor® 647、分裂細胞を検出する Phospho-Histone H3 Antibody PE。Multiflow®による解析は、試験品による処理開始後2時点（4時間および24時間）で実施しました。核密度および細胞毒性指標の算出には、ラテックスマイクロスフィアカウントビーズを使用しました。Multiflow®試薬溶液は、キットの取扱説明書に従って、これらの成分から調製されました。
外因性代謝活性化システム（MutazymeTM、雄のSprague Dawleyラット由来のPhenobarbital/β-Naphthoflavone（PB/NF）誘導肝臓S9）はMoltox®, Boone, NCから入手しました（www.moltox.com)。対照として、クラストジェニックまたはアニュージェニックMoAのいずれかを有する4つの遺伝毒性化合物を採用した。メタンスルホン酸メチル（MMS）とカルベンダジム（両化合物とも100、50、25、または12.5μM）は、S9（-S9）活性化なしの処理の陽性対照として利用された。シクロホスファミド（80、40、20または10μM）およびベンゾ（a）ピレン（100、50、25または12.5μM）は、S9（+S9）活性化を伴う処理の陽性対照として使用された。陽性コントロールは、試験システムの応答性、適切なクラストジェニックおよび/またはアノイジェニックMoA予測を保証するために採用されたが、試験品との比較のための基準を提供するためではなかった。陽性コントロールの溶媒としてジメチルスルホキシド（DMSO）を使用した。
TK6細胞培養試験システム
TK6細胞、ヒト由来のリンパ芽球系細胞は、American Type Culture Collection（リポジトリ番号CRL-8015）、Manassas、VAから入手した。TK6細胞株はp53プロフィシェンシーであり、異なる遺伝毒性メカニズムに敏感で、倍加時間は12-14時間である。TK6細胞における突然変異および染色体変化の自発頻度は、ヒト初代細胞と大きな違いはない（Schwartz et al. Citation2004）. TK6細胞は、10％の熱不活性化馬血清とペニシリン-ストレプトマイシン完全培養液（CCM）を補充したL-グルタミン（Sigma-Aldrich）入りRPMI1640培地でT-75 cm2フラスコで培養した。培養は37℃、5％CO2、湿度85％以上で行った。22～26時間の培養後、T-75cm2フラスコ内の細胞密度をセルカウント後に算出した。S9非存在下および存在下でのMultiflow®試験に必要な標的細胞ストックを算出し、適量の細胞懸濁液を50mlチューブに移し、150×g、6分間遠心分離した。培養液を吸引し、使用直前にCCM液で細胞密度をS9非存在下で2×105cells/ml、S9存在下で2.2×105cells/mlに調整しました。
処理、およびフローサイトメトリー解析
TK6細胞を、96ウェルプレートを用いて、ビヒクルコントロール単独とともに代謝活性化の存在下（+S9）および非存在下（-S9）で、20濃度のスクラロース-6-アセテート（最大4.5489 mMまたは2000 μg/ml）または20濃度のスクラロース（最大10 mMまたは3980 μg/ml）に1.4142（2の平方根）用量間隔で曝露した。試験品は、細胞懸濁液中の最終DMSO濃度が1％以下となるようにDMSOを用いて調製した。S9条件では、細胞をS9（MutazymeTM）に4時間曝露した後、S9を洗浄し、2回遠心分離（340×gで5分間）し、新しい培養液で再インキュベートした。4時間後（洗浄前）と24時間後に+S9処理ウェルからアリコートを採取し、50μlのMultiFlow®-kit試薬溶液をあらかじめセットした新しいプレートに移し替え、さらに24時間培養した。S9条件では、4時間および24時間の培養時にアリコートを採取し、同じくMultiFlow®-kit試薬溶液をプレロードした新しいプレートに移した。収穫した細胞の細胞質膜の消化、核の遊離、蛍光核酸色素によるクロマチン染色、蛍光抗体によるγH2A×、p-H3、p53の標識を同時に行うため、キットの指示に従い試薬ミックス中で細胞をインキュベートした。試薬ミックス中の蛍光マイクロスフェアは、4時間後と24時間後に単純な細胞毒性指標として核とビーズの比率を求めるために使用した。解析は、BD FACSCanto IIフローサイトメーターとBD FACSDivaTMソフトウェア（BD Biosciences）を利用したフローサイトメトリーで行い、バイオマーカーのフォールドシフトを決定しました。
サイトメトリー結果の解析
高性能の数学的アルゴリズム（Bernacki et al. Citation2016; Bryce et al. Citation2016, Citation2017）を用いて、各バイオマーカーの有意な倍数上昇を表すカットオフ値を提供するグローバル評価因子（GEF）を用いて、クラストジェニックおよび無精子性のバイオマーカーのマルチエンドポイントに基づくMoA予測を実施した。MoAコールを行うための条件は、3つのケースで確立された。まず、S9処理（+S9）については、4つのクラストジェン感受性バイオマーカーのうち少なくとも2つについてGEFを満たすか超える連続した2つの濃度の倍率上昇によってクラストジェニックコールが作られ、少なくとも1つの反応にγH2A×が必要となりました：
≥1.44倍以上の4時間γH2A×、
≥24時間γH2A×の1.31倍以上、
≥1.23倍以上の4時間核p53、
≥24時間核p53は≧1.12倍であった。
次に、24時間処理（-S9）では、4つのクラストジェン感受性バイオマーカーのうち、少なくとも2つのバイオマーカーのカットオフ値を満たすか超える連続した2つの濃度の倍率上昇によって、クラストジェニックコールが作られました：
≥1.51倍以上の4時間後γH2A×、
≥2.11倍以上の24時間γH2A×、
≥1.40倍以上の4時間核p53、
≥24時間核p53は1.45倍以上であった。
第3に、連続する2つの濃度における倍率が、以下の異種反応のうち少なくとも2つのカットオフ値を満たすか超えることにより、異種シグネチャーが示された：
≥1.71倍以上の4時間ホスホヒストンH3、
≥1.52倍以上の24時間ホスホ-ヒストンH3、
≥5.86倍以上の24時間倍数性、
≥1.45倍以上の24時間核p53。
クラストゲン感受性またはアノイゲン感受性のバイオマーカーが2つ未満で上記のGEFを満たさないか超えない場合、コールには試験条件下で非遺伝毒性があるとした。細胞毒性は、個々の培養物の核数の減少に基づくものであった。
実験2：TK6細胞におけるin vitro哺乳類細胞小核試験
スクラロース-6-アセテートに暴露された細胞の細胞質にMNが存在するかどうかを調べるために、TK6細胞のin vitro哺乳類細胞小核（MN）試験を使用しました。微小核は、DNAの切断によって生じる（クラストゲン）、あるいは数値的な染色体異常によって誘導される（アニューゲン）小さな核外構造である（OECD 487, Citation2016）。MN頻度の上昇は、細胞遺伝学的／染色体損傷のバイオマーカーとなる。MNアッセイは、経済協力開発機構（OECD487、Citation2016）の標準プロトコルガイドラインに従って、TK6細胞を用いてBioReliance社（Citation2020b）により実施されました。
TK6細胞および処理
アッセイは、TK6細胞を、試験品（スクラロース-6-アセテート）の濃度範囲、ならびに陽性およびビヒクルコントロールで処理することにより実施した。TK6細胞の調製手順は、Multiflow®試験について前述したとおりであり、外因性代謝活性化の非存在下および存在下で、細胞密度を2.5×105細胞/mlに調整した（S9）。DMSOはスクラロース-6-アセテートのビヒクルであり、各処理タイプのビヒクルコントロールとして機能した。スクラロース-6-アセテートおよび／またはその代謝物のTK6細胞におけるMN誘導の可能性を、S9の存在下（4時間処理）および非存在下（27時間処理）において評価した。4時間のインキュベーションの後、細胞を遠心分離して処理液を除去し、CCMに再懸濁し、さらに23時間インキュベートした。スクラロース-6-アセテートは、以下の濃度で評価した。4時間のインキュベーションでは、スクラロース-6-アセテートの濃度は、2000、1500、1000、750、700、600、500、400、350、300、200、および100μg/mlであった。27時間の暴露では、スクラロース-6-アセテートの濃度は、2000、1500、1250、1000、750、500、250、125、100、80、40、20μg/mlだった。4時間処理の陽性対照としてシクロホスファミド（水で調製した2.5、3または4μg/ml）を採用し、27時間処理の陽性対照としてビンブラスチン（水で調製した10または12ng/ml）を使用した。
微小核のスコアリングと統計解析
4時間処理では4濃度、27時間処理では5濃度で、最低2000個の単核細胞、最低200個の二核/多核細胞をスクラロース-6-アセテートに暴露した後、小核のスコアリングを実施した。スコアリングには、本試験ではスクラロース-6-アセテートの濃度が高いほど二核細胞の増加が顕著であったため、単核細胞だけでなく二核細胞や多核細胞におけるMNの数と頻度を含めた。スコアリングは、4時間の暴露では300、500、700、1000μg/ml、27時間のインキュベーションでは100、250、500、750、1000μg/mlで実施した。
有意性は、溶媒対照に対するFisher's Exact Test (Fisher Citation1954)で評価しました。コクラン・アーミテージ傾向検定は、スクラロース-6-アセテートの濃度の上昇に伴い、小核化細胞数に傾向があるかどうかを判定するために行った（Agresti Citation2002; Armitage Citation1955; Cochran Citation1954）. 有意性の基準は、p < .05とした。計算はExcel（Microsoft Corporation）で行った。スクラロース自体のMN試験は、以前に実施され報告されているため、今回の研究では実施しなかった（United States Food and Drug Administration US FDA Citation1998）.
実験3：Leadscope®による変異原性のインシリコ評価
定量的構造活性ツールであるLeadscope®（Leadscope® Citation2019）を用いて、化学構造に基づいてスクラロース-6-アセテートおよびスクラロースの遺伝毒性能をインシリコで予測し、Aclairo Pharmaceutical Development Group（AclairoCitation2019）により実行されました。Leadscope®モデルは、SAR Genetoxという大規模な変異原性毒性データベースを、国際ヒト用医薬品技術要件調和評議会（ICH M7）に基づき（米国食品医薬品局US FDA Citation2018）、検証済みの構造を利用して、計算上の構造-活性予測を生成します（ヘブナー Citation2018）。また、このツールは、これらの分子の活性/主要部分または分子フラグメント（複数可）に対する細菌変異アラートを提供します。警告の知識ベースは、利用可能な細菌変異原性データと科学文献の体系的な分析から構築されました。スクラロース-6-アセテートとその親スクラロース（コントロール）の化学構造は、化学構造全体に関連する属性を含むファイルフォーマットであるMOLファイルとしてLeadscope®モデルアプリヤに入力しました（CTFile Formats Citation2005年）。
実験4：細菌性逆転突然変異試験（エイムズ試験）
OECDガイドライン（経済協力開発機構OECD Citation2020）に従い、BioReliance社（Citation2020c）により細菌性逆変異試験が実施された。この古典的な変異原性試験は、スクラロース-6-アセテート、スクラロースおよび／またはそれらの代謝物が、外因性代謝活性化システムの存在下および非存在下で、サルモネラ・チフィムリウムのTA98、TA100、TA1535およびTA1537株、大腸菌のWP2 uvrA株の遺伝子座に逆変異を誘発する可能性を評価するために用いられた（S9）。試験品であるスクラロース-6-アセテートはDMSOで調製し、スクラロースは滅菌脱イオン水中で調製した。両試験品は、1.5、5、15、50、150、500、1500、5000μg/plateの8濃度でプレート組み込み法により評価された。細胞懸濁液中の最終DMSO濃度は1%v/v以下であった。各菌株の細菌性逆変異試験における陽性対照を表1に示す。
表1. 代謝活性化の有無による各細菌株の陽性コントロール。
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実験5：ヒト横行結腸上皮の経上皮電気抵抗（TEER）および透過性の評価
高スループットin vitro腸管幹細胞プラットフォーム（RepliGut®, Altis Biosystems, Durham, NC USA）を利用して、スクラロース-6-アセテートおよびスクラロースのヒト横行結腸への影響をスクリーニングしました。アッセイはAltis Biosystems (Citation2020, Citation2021)によって行われました。RepliGut®システムは、正常な腸管バリア機能を模倣したトランスウェル上で増殖した偏光腸管細胞で構成されています（Allbritton et al. Citation2021）。スクラロース-6-アセテートとスクラロースがTEERと透過性に及ぼす影響を、2つの別々の試験で評価しました。TEERは、バリア機能とタイトジャンクションの完全性の間接的な尺度である単層抵抗の尺度である（Elbrecht, Long, and Hickman Citation2016; Srinivasan et al. Citation2015）。試験1では、TEERは、単一の有効濃度の試験品（10mMスクラロース-6-アセテートまたは10mMスクラロース）にレプリガット®システムを曝露した後に決定した。試験2では、スクラロース-6-アセテート（0.3125mM～10mM）とスクラロース（5mM～160mM）の有効濃度の範囲でTEERと透過性を評価しました。両試験とも、無処理（コントロール）条件も追加した。
横行結腸細胞は、薄いハイドロゲルでコーティングされたRepliGut®トランスウェルプレートに直接プレーティングされました。培養物は、明視野顕微鏡を使用して細胞のコンフルエンスを目で確認した。上皮細胞は4日後にコンフルエントになった。コンフルエントになったところで、培地を独自のAltis Differentiation Media (ADM)に変更した。その後、ADM中で細胞を2日間培養した。ADM中で細胞が増殖している間、細胞のコンフルエンスをモニターするために、STX2電極を備えたEVOM2 Epithelial Volt/Ohm Meter (World Precision Instruments)を用いてTEERを測定した。
ADM中で48時間培養した後、各トランスウェルでTEERを測定した。その後、試験化合物を各トランスウェルの頂部側と底部側の両方に添加した。トランスウェルを試験化合物とともに24時間インキュベートし、トライアル1および2のすべてのトランスウェルでTEERを測定した。試験2においては、40kDaのフルオレッセインイソチオシアネート標識デキストラン（FITC）を用いた透過性アッセイも各トランスウェルで行い、4時間にわたるデキストランのフラックスを計測した。TEERがイオンコンダクタンスの指標であるのに対し、40kDa FTICは副細胞透過性の指標である（Utami et al. Citation2018）．
Trial1では、細胞採取前にすべてのトランスウェルからapical supernatantとbasal supernatantを採取し、チューブに移し替えて-80℃で保存しました。アピカル上清およびベーサル上清をクロマトグラフィー分析に供し、スクラロース曝露横行結腸細胞におけるスクラロース-6-アセテートへの変換またはスクラロース-6-アセテート曝露細胞におけるスクラロースへの脱アセチル化があるかどうかを判定した（OpAns、Durham、NC USA）。細胞回収後、500μlのRNA Lysis Bufferを各トランスウェルの先端側に添加した。溶解液を10回上下にピペッティングし、明視野顕微鏡を使用して完全な溶解を確認した。溶解液は個々のチューブに移し、RNA抽出とRNA-seq解析のために-80℃で保存した。
実験6：横行結腸におけるRNA-seqと遺伝子発現
実験5のTrial 1でRepliGut®システムでスクラロース-6-アセテートとスクラロース（無処理コントロールとともに）に曝露した横行結腸細胞を用いて、Altis BiosystemsによりRNAの単離、定量化、品質チェックを行いました。サンプルは12個で、スクラロース、スクラロース-6-アセテート、および無処理コントロールからそれぞれ4個ずつ採取しました。RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit（Invitrogen Cat#AM1931）を用いてRNAを分離し、-80℃で保存した。RNA 濃度は、Qubit RNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Cat#Q32852) と Qubit 3.0 Fluorometer を用いて測定した。RNA Integrity（RIN）値は、Bioanalyzer 2100マシンでRNA 6000 Pico Kit（Agilent, Cat#5067-1513）を使用して測定した。その後、RNA濃度とRIN値を決定した。
RNA-seq（RNA配列決定）を採用してトランスクリプトームを解析し、コントロール（無処理）に対するスクラロース-6-アセテートおよびスクラロースへのそれぞれの曝露による遺伝子発現の変化を決定した。RNAseqはNorth Carolina State University (NCSU) Genomic Sciences Laboratoryで実施し、サンプルはNovaSeq 6000 (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) で150bpペアエンドリードとして実行した。生リードは、Trim Galore version 0.6.1 (Babraham Bioinformatics Citation2019)を用いて、2色フラグセットでアダプターおよび品質についてトリミングした。Trim Galoreは、アダプターのトリミングにcutadapt (v2.1) (Martin Citation2011)を呼び出します。Qualityカットオフを20に設定し、両方のリードの最小配列長を20bpに設定しました。すべてのリードは、最初の品質と長さのフィルターを通過した。トリミング後の塩基数は、全分析塩基数の95.7～98%であった。シーケンシング中に混入した可能性のあるポリGランを考慮した2回目のトリミングを、アダプタートリミングを無効にしてポリGテールトリミングを実施したfastp (version 0.19.10) (Chen et al. Citation2018) で行い、トリミング後のリードを98.77～99.36%保持した。
トリミングされたリードは、GRCh38（Genome Reference Consortium Human Build 38, National Center for Biotechnology Information, USA）のno alt解析セットで表されるヒトゲノムに、下流処理のために- dta-cufflinksフラグを設定したHISAT2（v2.1.0）でアライメントしました（キムら引用2019；キム、ランズミート、サルツバーグ引用2015；ペルテアら引用2016）。アライメント率は95.92～97.62%であった。得られたSAM（Sequence Alignment Map）ファイルをソートし、samtools（Li et al. Citation2009）を用いてBAM（Binary Alignment Map）バイナリファイルへ変換した。Stringtie2（Perteaら、Citation2015）を各レプリケートの個々のBAMファイルに対して展開し、アラインメントを潜在的な転写物に組み立て、得られたレプリケート遺伝子転送フォーマット（GTF）ファイルを単一の発現トランスクリプトームへとマージした。カバレッジテーブルは、Stringtie -eBコマンドで作成し、Ballgownオブジェクトディレクトリを作成しました。
Ballgown Rパッケージ（Frazee et al. Citation2015）を導入し、カウントデータにアクセスしました。異なるレプリケート間の遺伝子発現のユークリッド距離を用いた階層的クラスタリングにより、4つのコントロールのうちの1つ（コントロール2レプリケート）が異常値であることが示されました。そのため、さらなる解析から除外された。残りの複製物はすべて、PCA/MDSおよび階層的クラスタリング分析に基づく品質管理に合格した。遺伝子発現値は、低存在率フィルターにかけられ、すべてのサンプルで発現の分散が1未満の遺伝子は、さらなる分析から除外された。そして、4種類の比較を行いました： Sucralose-6-Acetate vs Control、Sucralose vs Control、Sucralose vs Sucralose-6-Acetate、および全サンプルに対する三者比較。有意性は、偽発見率q値0.05で判定した。有意な遺伝子の過剰発現テストは、デフォルトのパラメータを用いたgProfilerのGostサービス、バージョン：e101_eg48_p14_baf17f0（Raudvere et al. Citation2019）を使用して達成した。
実験7：半減期（T1/2）決定のための肝ミクロソーム安定性アッセイ
チトクロームP450（CYP450）を含む膜結合型代謝酵素を含む肝臓ミクロソームの存在下で、2つの試験品、スクラロース-6-アセテートおよびスクラロースのインビトロ半減期T1/2（分）を決定するための標準化プロトコルを用いて、BioDuro-Sundia（中国、上海）によりミクロソーム安定アッセイが行われた。このアッセイの目的は、酵素補因子としてジヒドロニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・ホスフェート/NADPH（ACROS Cat#328742500）を用いて、5種類の動物（ヒト、サル、イヌ、ラット、マウス）において第1相代謝を決定することにある。マイクロソームの安定性は、5つの時点（0、5、15、30、60分）で各試験品100μMの一重インキュベーションを使用して評価した。サンプルは、液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析（LC/MS/MS）を用いてピーク面積比で評価し、固有クリアランス（Clint）の推定値とともに、T1/2を決定した。肝臓で除去される各試験品の割合（抽出率）は、Houston（Citation1994）およびDavies and Morris（Citation1993）が報告した生理学的変数に基づいて、5つの異なる種についてそれぞれ計算された。その後の肝臓安定性アッセイも、Cyprotex（Watertown, MA USA）により、ヒト肝ミクロソームにおいて、NADPHあり、なしの両方で、標準化されたプロトコル（Cyprotex Citation2022）を用いて行われた。
実験8：ヒト肝ミクロソームにおけるシトクロムP450（CYP450）異種物質解毒酵素の阻害作用
スクラロース-6-アセテートまたはスクラロースが、外因性化合物だけでなく内因性化合物を代謝するCYP酵素の阻害剤であるかどうかを調べるために、BioDuro-Sundia（中国、上海）によりチトクロームP450（CYP450）阻害アッセイが実施されました。CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、およびCYP3A4/5は、米国食品医薬品局（Citation2020）が推奨する評価対象として選択しました。各CYPアイソフォームのプローブ基質と陽性対照として使用した阻害剤を表2に示す。CYPアイソフォーム特異的基質は、BioDuro-Sundia社の標準化されたプロトコルに従って、スクラロース-6-アセテートまたはスクラロースとともにヒト肝ミクロソームとインキュベートした。試験1では、スクラロース-6-アセテートを0, 0.137, 0.412, 1.23, 3.7, 11.1, 33.3, 100μMで二重にインキュベートし、スクラロースを0, 4.12, 12.3, 37, 111, 333, 1000μMで二重にインキュベートした（バイオデュロスンディア引用2021a）。試験2では、試験1と結果を比較するためにスクラロース-6-アセテートを再評価し、0, 0.098, 0.39, 1.56, 6.3, 25, 100μMで二重にインキュベートした（BioDuro-Sundia Citation2022）。各インキュベーションの終了時に、残存するプローブ基質の量をLC/MS/MSでモニターし、スクラロースおよびスクラロース-6-アセテートのIC50（半極限阻害濃度）値を計算した。
表2. CYP450阻害試験。
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試験結果
実験1：TK6細胞を用いたin vitro MultiFlow® DNA損傷アッセイ
スクラロース-6-アセテートについてTK6細胞を用いたMultiFlow®アッセイの結果、スクラロース-6-アセテートは+S9および-S9の両条件で原型的なクラストジェニックシグネチャーを示すことが示されました。S9および-S9処理について、コントロールに対するγH2A×および核p53の倍増をそれぞれ表3および表4に示す。表3の+S9処理では、スクラロース-6-アセテートの連続3濃度におけるフォールド上昇が、24時間γH2A×（1.31）および24時間核p53（1.12）バイオマーカーのGEFカットオフを満たすか超えるため、クラストジェニックと判定された。スクラロース-6-アセテートについてS9で観察された遺伝毒性の最低濃度は353 µg/ml（803 µM）であった。表4では、S9を使用しない24時間処理において、連続する2つの濃度の増加倍率が4時間核p53倍（1.40）および24時間核p53倍（1.45）のカットオフを超え、1つの濃度が24時間γH2A×のカットオフを超えたため、クラストジェニックコールが検知された（2.11）。S9を含まないスクラロース-6-アセテートの遺伝毒性に関する最低観察濃度は707μg/ml（1607μMまたは1.607mM）であった。このように，スクラロース-6-アセテートのクラストジェニックコールは，S9の代謝活性化を伴う方が，S9の活性化を伴わない場合よりも低い濃度で発生した．スクラロース-6-アセテートは、無遺伝子性シグネチャーを示さなかった。
表3. スクラロース-6-アセテート（+S9）条件でのMultiFlow®アッセイ。
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表4. スクラロース-6-アセテート（-S9）条件でのMultiFlow®アッセイ。
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スクラロースのMultiFlow®アッセイでは、3980 µg/mlまでの濃度で、TK6細胞においてS9の有無にかかわらず、遺伝毒性の顕著な予測は得られませんでした。しかし、非活性化処理において994 µg/ml（2.5mM）から始まる4回の連続したスクラロースの濃度上昇により、DNA切断のマーカーであるγH2A×が2倍以上上昇した。
実験2：TK6細胞を用いたin vitro哺乳類細胞MN試験
表5及び表6に示すTK6細胞を用いたin vitro哺乳類細胞小核試験の結果、S9を含まない27時間処理ではスクラロース-6-アセテートが陽性であったが、S9を含む27時間処理では陽性でなかったことがわかった。すなわち、スクラロース-6-アセテート（-S9）は、細胞遺伝学的/染色体損傷のバイオマーカーであるMN頻度を上昇させた。また、高濃度では二核細胞の発生が促進された。そこで、単核細胞、二核細胞、多核細胞を組み合わせて、MN頻度を測定した。すべての細胞集団を組み合わせて評価したところ（単核、二核、多核）、27時間-S9処理では1000μg/mlで有意な上昇がみられた。500、750、1000μg/mlの上位3濃度（1137、1705、2274μM）のCochran Armitage Trend Testでは、その濃度範囲内で有意な濃度依存性の上昇が見られ、MN頻度は過去のビークルコントロール限界値から外れていることが示された。データは、スクラロース-6-アセテートが遺伝毒性を有することを示し、これはMultiFlow®アッセイと一致する。
表5. 小核試験：S9を含まない27時間処理。
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表6. 小核試験： S9を用いた4時間処理。
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スクラロース自体のMN試験は、規制評価時に提出した過去のMN試験で結論が出ず（米国食品医薬品局 US FDA Citation1998）、MultiFlow®アッセイも陽性ではなかったため、今回の試験では実施していない。
実験3：Leadscope®による変異原性インシリコ評価
Leadscope®の定量的構造活性ツールによるコンセンサスコールでは、スクラロース-6-アセテートは変異原性があり、永久に伝達可能な遺伝子変異を誘発する可能性があると予測されました。また、Leadscope®は、スクラロース-6-アセテートの懸念される活性/一次部分または分子断片として、二次アルキルハライドの細菌変異アラートを提示しました（図2）。このプログラムでは、サルモネラ・チフムリウムおよび/または大腸菌の標準菌株を用いた細菌逆変異試験によるフォローアップを推奨しています。スクラロースに関するこれらの知見は曖昧なものでした。
図2. Leadscope®による細菌変異の警告を発生させたスクラロース-6-アセテートの2級アルキルハライド（囲み部分）。
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実験4：細菌性逆変異試験（エイムズ試験）
表7および表8の細菌逆変異試験のデータから、スクラロース-6-アセテートおよびスクラロースは、試験プロトコルの条件下、基準に従って、ともに陰性（非変異原性）であることが示されました。スクラロース-6-アセテートおよびスクラロース、および／またはその代謝物は、外因性代謝活性化システムの存在下および非存在下で、4つのSalmonella typhimurium株（TA98、TA100、TA1535およびTA1537）またはEscherichia coliのWP2 uvrA株で逆転変異を誘発しなかった（S9）。これらの結果は、Leadscope®によるin silico予測を裏付けるものではなく、スクラロース-6-アセテートおよびスクラロースには変異原性がないことが示唆されました。これらのことから、スクラロース-6-アセテートはMultiFlow®およびMN試験の両方で遺伝毒性を示したが、スクラロース-6-アセテートが開始したDNA損傷は、変異原性がないため、さらなる世代の細胞で永久的な変化を引き起こさない可能性があることが示唆された。
表7. スクラロース-6-アセテートのバクテリアによる逆変異試験。
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表8. スクラロースのバクテリア逆変異試験。
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実験5：ヒト横行結腸上皮における経上皮電気抵抗（TEER）および透過性の評価
スクラロース-6-アセテートおよびスクラロースのいずれも、細菌の非存在下で、mM濃度のヒト結腸上皮単層におけるTEERおよび透過性を変化させた。以下の図3a,bの結果は、スクラロース-6-アセテートによる24時間の単一処理によるTEERの減少が5mMで始まり、10mMで完全に崩壊することを示すものである。図3cでは、40 kDa FTIC-デキストランに対する相対透過性が、10 mMのスクラロース-6-アセテートへの曝露後に著しく増加した。
図3. (a)横行結腸単層膜の補正TEERは、5 mMで減少が始まり、10 mMで完全に消失することを示す；(b)補正TEERから計算した横行結腸のTEERの変化率；(c)10 mMでの40 kDaFTIC-デキストラン転移への透過性の変化を示す。
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図4a,bは、スクラロースによる24時間の単一処理によるTEERの低下が40mMで始まり、80mMで完全に崩壊することを示す。図4cは、40 kDa FTIC-デキストランに対する相対透過性が、80 mMおよび160 mMのスクラロースとのインキュベーション後に有意に上昇したことを示す図である。
図4. スクラロースに対するヒト横行結腸上皮の応答：（a）横行結腸単層膜の補正TEER（注：80mMおよび160mMの結果は重複する）；（b）横行結腸のTEERの変化率；（c）80mMでの40kDa FTIC-デキストラン転移への透過性の変化。
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実験6：横行結腸におけるRNA-seqと遺伝子発現の解析
差分遺伝子発現解析を用いて、スクラロース-6-アセテートおよびスクラロースによって誘導されるヒト横行結腸の遺伝子発現の変化を、それぞれコントロール（無処理）との相対的な比較で明らかにした。低アバンダンスフィルタリング後、合計12,553個の遺伝子を解析した。RパッケージBallgownの「stattest」関数を用いた4つの比較は以下の通り： Sucralose-6-Acetate vs Control、Sucralose vs Control、Sucralose vs Sucralose-6-Acetate、および全サンプルに対する三者比較（Sucralose vs Sucralose-6-Acetate vs Control）。
スクラロース-6-アセテート vs コントロール
スクラロース-6-アセテートとコントロールのサンプル間で34個の遺伝子が差分発現し、そのうち23個が同定された。同定された遺伝子のうち16個の発現は、コントロールと比較してスクラロース-6-アセテート試料で有意に増加し（表9）、同定された遺伝子のうち7個の発現は、コントロールと比較してスクラロース-6-アセテート試料で有意に減少していた（表10）。表9において、LOC399900、LOC105371483、およびLOC107986058を含む、名前が付いているが特性不明の3つの追加遺伝子も、スクラロース-6-アセテートにおいてコントロールよりも有意に高い発現を示した。23個の遺伝子のうち20個はタンパク質をコードしており、そのうち2個はノンコーディングRNA、1個は偽遺伝子であった。各遺伝子の簡単な説明を、フォールドチェンジと有意値とともに表9と表10に示す。メタロチオネイン1G（MT1G）、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（SHMT2）、活性化転写因子3（ATF3）の3つの遺伝子の対照に対するスクラロース-6-アセテートの変化量は、それぞれ253.82, 81.23, 54.49 と非常に大きいことが示された。
表9. スクラロース-6-アセテートに対する遺伝子発現の差で、フォールドチェンジが1以上のもの。
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表10. スクラロース-6-アセテートに関する遺伝子発現の差（fold change <1）。
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スクラロースとコントロールの比較
2つのタンパク質コード遺伝子のみが、スクラロースとコントロールのサンプル間で差次的に発現した。これらの2つの遺伝子の簡単な説明は、フォールドチェンジと有意値とともに表11に示されている。COX10については、遺伝子発現はコントロールよりもスクラロースで高かった。FAM166Aについては、コントロールよりもスクラロースで遺伝子発現が低下した。
表11. スクラロースの遺伝子発現の差
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スクラロースとスクラロース-6-アセテートとの比較
スクラロースとスクラロース-6-アセテートの比較で、差次的に発現した遺伝子は186個でした。62の遺伝子について、スクラロースサンプルでの発現はスクラロース-6-アセテートサンプルよりも高く、平均4.63 ± 4.53の上昇を示した。126の遺伝子について、発現はスクラロースよりもスクラロース-6-アセテートで高かったが、平均フォールド変化はわずか0.28±0.2という低いものであった。コレステロール生合成の最初の特異的酵素をコードするファルネシル-二リン酸ファルネシルトランスフェラーゼ遺伝子（FDFT1）（Genecards Citation2023; The Human Protein Atlas Citation2023）はスクラロースで最大の発現変化を示し、スクラロース6-アセテートに対して30.93倍上昇した（P（q）値 3.6E-4（0.02））。その他、スクラロースでスクラロース-6-アセテートに対して3倍以上発現が上昇した遺伝子は以下の通りです： TFRC（細胞内鉄分取り込み）、PFKP（解糖制御）、RHOT1（ミトコンドリア輸送）、MRPL16（ミトコンドリア内でのタンパク質合成）、PRDX4（酸化ストレスからの保護）、PLCB3（二次メッセンジャーのジアシルグリセロールとイノシトール1，4，5-トリフォスフェートの生産）、 ABO（ABO血液型タンパク質の生産）、FAM3D（インスリン調節）、ACADVL（脂肪からのエネルギー）、OGDH（クレブスサイクル中の生化学変換）、ACTR1A（微小管ベースの小胞運動）、VPS13A（膜間の脂質移動）、PTPRA（細胞接着と増殖）。
三者間比較：スクラロース vs スクラロース-6-アセテート vs コントロール
差次的に発現が確認された遺伝子は464個でした。"Cellular Component "の下に記載された7つのGene Ontology (Ashburner et al. Citation2000; The Gene Ontology Consortium Citation2019) カテゴリーで過剰発現がみられた。また、TRANSFAC（Wingender Citation2008）の43個の総制御モチーフは、Human Protein Atlas（The Human Protein Atlas Citation2023; Uhlén et al. Citation2015）の33項と同様に著しく過剰発現された。Cellular componentsは、cytoplasm, cytosol, integral component of Golgi membrane, intracellular, intracellular membrane-bound organelle, intrinsic component of Golgi membrane, and membrane-bound organelleでした。Human Protein Atlasでは、小腸、気管支、結腸、虫垂、十二指腸、唾液腺、膵臓、直腸、膀胱、胃、肺、前立腺、子宮内膜、腎臓に由来する33種類の組織での発現が示されました。転写因子結合部位は、266の遺伝子と関連していた。同定された23の転写因子は以下の通りである： AP-2gamma： Elk-1, AP-2gamma, BEN, Churchill, E2F-1, E2F-2, E2F-3:HES-7, E2F-3, E2F-4, E2F-7, E2F, ETF, IRX-1, MAZ, MOVO-B, Sp1, TCF-1, TR4, WT1, ZF5, ZIC4, p300, pax-6.
4つの比較対象で共通する遺伝子
図5のベン図は、4つの比較で共通して見つかった遺伝子座（名前付き遺伝子と名前なし遺伝子の両方）の重なりを示しています：スクラロース-6-アセテート対コントロール、スクラロース対コントロール、スクラロース対スクラロース-6-アセテート、および全サンプルの三者比較（スクラロース対スクラロース-6-アセテート対コントロール）です。Sucralose vs Controlの比較における2つの遺伝子は、他の3つの比較のいずれにも見つからなかった。スクラロース-6-アセテートを含む比較の間では、20の遺伝子座が共通していた。その20個のうち、LOC399900、LOC105371483、およびLOC107986058とともに、16個の命名遺伝子（ABO、ATE1-AS1、CASKIN1、CHST3、ELP5、EWSR1、KCNQ1DN、MCM2、MT1G、MTMR9、TNFSF14、UVRAG-DT、ZSCAN10）はテーブル9に含まれています。
図5. 4つの比較で共通して見つかった遺伝子座（名前付き遺伝子と名前なし遺伝子の両方を含む）の重なりを示すベン図：スクラロース-6-アセテート対コントロール、スクラロース対コントロール、スクラロース対スクラロース-6-アセテート、および全サンプルの三者比較（スクラロース対スクラロース-6-アセテート対コントロール）。
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実験7：半減期（T1/2）決定のための肝ミクロソーム安定性アッセイ
ヒト、サル、イヌ、ラット、マウスの各ミクロソームにおいて、NADPHを用いた肝ミクロソーム安定性アッセイの結果を、スクラロース-6-アセテート及びスクラロースの双方について表12に示す。肝臓によって除去されたスクラロース-6-アセテートの割合（抽出比）は、ヒューストン（Citation1994）およびデイヴィスおよびモリス（Citation1993）のデータを用いてスクラロース-6-アセテートについて計算した。その後のヒト肝ミクロソームを用いた研究では、スクラロース-6-アセテートのT1/2の値は37.6分（NADPHあり・なし）、スクラロース（NADPHあり・なし）は>180となった（Cyprotex Citation2022）。データは、NADPHがスクラロース-6-アセテートの抽出に必要でないことを示す。
表12. NADPHを用いたマイクロソーム安定性アッセイで決定したT1/2（分）、内在性クリアランス（CLint）、肝クリアランス（CLhep）および抽出比（BioDuro-Sundia Citation2021b）。
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実験8：ヒト肝ミクロソームにおけるチトクロームP450（CYP450）異種物質解毒酵素の阻害作用
スクラロース-6-アセテートは、ヒト肝ミクロソームにおいて、CYP1A2およびCYP2C19の阻害剤であることが判明したが、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4/5については顕著な阻害作用が検出されなかった。スクラロースについては、どのCYP450酵素に対しても顕著な阻害作用は認められませんでした。阻害試験は、最初にスクラロース-6-アセテートとスクラロースの両方で二重に行い、8ヵ月後にスクラロース-6-アセテートで二重に行い、結果を確認しました。スクラロース-6-アセテートについての初回調査および反復調査の平均IC50（μM）値を表13および表14に示す。初回調査では、CYP1A2の平均IC50値は42.9μM、CYP2C19の平均IC50値は89.3μMであった。反復試験では、CYP1A2およびCYP2C19の平均IC50値は、65.1μMおよび46.3μMであった。図6aおよび図6bは、IC50（μM）の決定に使用したスクラロース-6-アセテートからのCYP1A2およびCYP2C19の反応パターンを報告している。表15は、スクラロースについて顕著なCYP阻害が生じないことを示す。
図6（a）。CYP450阻害-初期試験：スクラロース-6-アセテートのCYP1A2およびCYP2C19に対するIC50 (µM)曲線。BioDuro-Sundiaの結果（Citation2021a）。
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図6(b). CYP450阻害作用-反復試験：スクラロース-6-アセテートのCYP1A2およびCYP2C19に対するIC50（μM）曲線。BioDuro-Sundiaの結果(引用2022)。
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表13. CYP450阻害作用の初期試験：スクラロース-6-アセテートに対するIC50（μM）（BioDuro-Sundia Citation2021a）。
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表14. CYP450阻害の再現試験：スクラロース-6-アセテートに対するIC50（μM）（BioDuro-Sundia Citation2022）。
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表15. CYP450阻害試験：スクラロース試験（BioDuro-Sundia Citation2021a）のIC50（μM）。
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考察
本研究で実施した実験により、スクラロース-6-アセテートは遺伝毒性があり、MoAはクラストジェニック（DNA鎖切断の誘発）に分類されることがわかりました。さらに、ヒト腸管上皮をスクラロース-6-アセテートだけでなくスクラロースそのものに曝露すると、mMの濃度でタイトジャンクションが損傷し、腸のバリア機能が損なわれた。RNA-seqを用いて決定したヒト腸管組織のトランスクリプトームは、スクラロース-6-アセテートが炎症、酸化ストレス、および癌に関連する遺伝子の発現を有意に増加させることを指摘した。また、スクラロース-6-アセテートは、低濃度のµMでCYP450ファミリーの2つのメンバーを阻害し、薬剤を含む内因性および外因性の化学物質の代謝を阻害する可能性があります。
遺伝毒性
スクラロースの不純物および代謝物であるスクラロース-6-アセテートは、MultiFlow®ハイスループットアッセイおよび標準MNテストの両方で、ヒトリンパ芽球系細胞において遺伝毒性があることが確認されました。MultiFlow®試験において、代謝活性化を伴わないスクラロース-6-アセテートの遺伝毒性の最低観察濃度は1.607 mM、代謝活性化を伴う遺伝毒性の最低観察レベルは803 µMでした。代謝活性化により遺伝毒性の観察濃度が低くなったことは、スクラロース-6-アセテートがさらなるDNA反応性代謝物に変換される可能性を示唆している。MoAは、MultiFlow®アッセイにより、クラストジェニック（DNA鎖切断の誘導）であると結論づけられました。Multiflow®アッセイによるスクラロース-6-アセテートの遺伝毒性に関するこれらの観察は、哺乳類細胞小核アッセイにおける細胞遺伝学的/染色体損傷によって裏付けられました。
スクラロース-6-アセテートの遺伝毒性に起因する潜在的な健康への悪影響は、科学的なアーカイブの出版物ではまだ取り上げられていません。さらに、この甘味料が食品供給に入って以来、スクラロースの暴露による健康影響について、製造者による明らかな体系的市販後調査が行われていない。表16は、スクラロースで甘味をつけた飲料を1本摂取した場合に起こりうるスクラロース-6-アセテートへの暴露レベルの3つの例を示している。この暴露は、現在の市販のスクラロースサンプルに最大0.67％のレベルのスクラロース-6-アセテートが存在することに基づいている（Werness Citation2021）。
表16. 一般的な飲料に含まれるスクラロース-6-アセテート含有量の推定値の3つの例。
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遺伝毒性曝露の許容レベルは存在しないとする規制機関もあるが、他の機関は潜在的な曝露とMoAに関連する遺伝毒性リスクを評価した。食事中の低レベルの化学物質については、0.15μg/人・日（60kgの人で0.0025μg/kg bw/日）の遺伝毒性に関する毒性学的懸念閾値（TTCgenotox）が示唆された（欧州食品安全機関EFSA Citation2016; Gooderham et al. Citation2020; Kroes et al. Citation2004; Serafimova, Coja, and Kass Citation2021）。表16のデータは、スクラロース含有飲料の1人前が、TTCgenotoxの0.15μg/人/日を4桁以上超えるレベルのスクラロース-6-アセテートを含む可能性を示している。
しかし、スクラロース-6-アセテートへの実際の曝露量は、反復投与、腸内でのスクラロースからスクラロース-6-アセテートへの生物変換、および生物蓄積の可能性により、表16のレベルをはるかに超えていると思われる。この不純物は、スクラロースの摂取を中止した後、少なくとも11日間体内に残留することが報告されている（Bornemann et al. Citation2018）ため、毎日の反復投与によりスクラロース-6-アセテートへの曝露が増加する。スクラロース-6-アセテートの全身への残留は、本研究でこの化合物が肝臓で部分的に抽出されることが示されたにもかかわらず発生しました。スクラロースからスクラロース-6-アセテートへの生体内変換が腸管で起こることが示され、市販のスクラロースサンプルでの％よりも約20倍上昇した（Bornemannら引用2018；Werness引用2021）。さらに、スクラロース-6-アセテートはスクラロース自体よりも親油性であるため、腸管吸収が促進され、細胞バリアを越えて輸送されることで生物濃縮を促進する可能性があります。
スクラロースの遺伝毒性に関する以前の疑問が提起されたが、これらの影響に対するスクラロース-6-アセテートの寄与は明らかに調査されていなかった。マウスMN試験と培養ヒトリンパ球の染色体異常試験でスクラロースの遺伝毒性の可能性を調べた初期の試験では、結論は出なかった（United States Food and Drug Administration US FDA Citation1998年）。その後、4種類のコメットアッセイ（in vivo 2種類、in vitro 2種類）により、血液細胞（Pasqualli et al. Citation2020）、結腸細胞株（Van Eyk Citation2015）、消化器（Sasaki et al. Citation2002）、脳、腎臓、肝臓組織（Raya et al. Citation2020）でスクラロースによりDNA損傷が開始することを発見しました。Pasqualliら（Citation2020）およびVan Eyk（Citation2015）が採用したin vitroコメットアッセイは、それぞれμMおよびmMの範囲でDNA損傷を検出しました。スクラロース-6-アセテートが遺伝毒性を有するという我々の現在の発見は、コメット試験におけるスクラロースに関するこれらの先行観察を部分的に説明できるかもしれません。胎児期12日目から寿命までのスクラロースの食餌暴露は、雄マウスにおいて、悪性腫瘍の発生率を有意な用量関連で上昇させ、造血新生物の発生率を有意な用量関連で上昇させることがわかった（Soffritti et al. Citation2016）. 胎生期から始まるスクラロース曝露が造血器新生物を生み出すメカニズムは不明ですが、スクラロース-6-アセテート（分子量500ダルトン未満、親油性）などの化合物は、胎盤の脂質膜を容易に拡散し（Griffiths and Campbell Citation2015）、授乳中の母親の乳腺組織（Sylvetsky et al. Citation2015）、時間とともに生物濃縮する恐れがあります。
最近の疫学研究では、多くの中・高所得国で大腸直腸がんやその他の消化器系のがんの早期発症が急速に増加しており、このヒトのがん発症率の上昇は、食事の選択やディスバイオシスと関連していることがわかりました（Ugai et al. Citation2022）。大腸がんの世界的な増加は、同じく世界的に増加している炎症性腸疾患（IBD）の負担と並行しています（Alatab et al. Citation2020）。スクラロースの摂取は、IBDの原因因子としてだけでなく、動物モデルにおける大腸がんのリスク因子としても注目されましたが（Guo et al. Citation2021; Li et al. Citation2020; Rosales-Gómez et al. Citation2018; Wang et al. Citation2019) 、この知見に対するスクラロース-6-アセテートの寄与の可能性はまだわかっていません。スクラロースの摂取がヒトのIBDにも寄与しているのではないかという疑問が科学文献で提起されています（Qin Citation2011）。
腸管バリア機能への影響
今回のin vitro試験におけるヒト横行結腸上皮の経上皮電気抵抗（TEER）と透過性の評価では、スクラロース-6-アセテートとスクラロースはともに、細菌のいない状態でmM濃度で胃腸上皮のタイトジャンクションと粘膜バリア機能を破壊することがわかった。TEERの著しい崩壊は、40mMのスクラロースに24時間単回暴露した後に起こったが、これは、現在、欧州連合（Citation2004）が単回シロップタイプの食品サプリメントに使用することを承認したスクラロース濃度2400mg/kg（6mM）の6.7倍しかない値である。腸管上皮バリアの完全性は、隣接する細胞をつなぎ、イオン、溶質、高分子、および細胞が内腔から細胞間隙を通過して拡散するのを制限または制御する物理的および機能的バリアとなる特殊複合体であるタイトジャンクションに依存しています。スクラロース-6-アセテートとスクラロースは、経上皮抵抗を減少させ、イオンや高分子が腸上皮の先端側（内腔側）から基底側へ、傍細胞路を通過することを可能にした。微生物や代謝物の体内への通過を可能にする腸管透過性の亢進（リーキーガット）は、IBD（リー引用2015、ウェルカーら引用2004）、慢性肝疾患（モハンダスとバイラパン引用2017）、さらには大腸がんの発症（サンチェス-アルコルドら引用2020）に大きな役割を果たします。さらに、腸管透過性の上昇と摂取の繰り返し、数日間にわたる大腸内容物の滞留により、スクラロースおよびスクラロース-6-アセテートの管内濃度、吸収、全身への曝露が増加し、生物濃縮や毒性を長期的にもたらすと考えられます。
これまでの研究で、スクラロースおよびスクラロース-6-アセテートとタイトジャンクションとの直接的な相互作用に加え、スクラロースへの曝露による腸管バリアの破壊に関与する要因があることが示されている（Schiffman and Rother Citation2013）。これらの要因には、微生物の腸内フローラのディスバイオシスだけでなく、酸化ストレスや炎症性サイトカインの存在の上昇に関連する炎症が含まれます。Abou-Donia et al. (Citation2008)は、常在嫌気性細菌の菌株特異的な減少が、上皮へのリンパ球浸潤、上皮瘢痕化、萎縮/無秩序化/建築的破壊、腺の炎症、粘膜下（および/または固有層）リンパ球集合体、リンパ濾胞、杯細胞の軽度の枯渇、表層のムチン喪失などの結腸の組織学的変化と関連していることを最初に報告しています。これらの影響は、規制当局が承認したレベルのスクラロースをラットが90日間摂取した後に発生しました。その後の研究でも、スクラロースの暴露による腸内細菌の変化が実証されています（Bian et al. Citation2017; Méndez-García et al. Citation2022; Suez et al. Citation2014, Citation2022; Zhang et al. Citation2022）。これらの調査は、「スクラロースは好気性微生物と嫌気性微生物のいずれをも阻害しない」（米国食品医薬品局US FDA Citation2021）という米国FDAによる規制承認申請食品添加物の歴史的主張を裏付けるものではない。妊娠中のマウスにおける母親のスクラロース摂取は、その子孫のマイクロバイオームにも影響を与えました（Dai et al. Citation2020, Citation2021; Olivier-Van Stichelen, Rother, and Hanover Citation2019 ）。腸内細菌とその代謝物は、in vivoとin vitroの両方のモデルにおいて、タイトジャンクションタンパク質の発現を調節することが示されました（Anderson et al. Citation2010; Bansal et al. Citation2010; Ewaschuk et al. Citation2008; Ukena et al. Citation2007）. 炎症は、腸管バリアの完全性の崩壊とともにディスバイオシスとも関連しており（Al Bander et al. Citation2020）、スクラロースの摂取によって炎症バイオマーカーが誘導されることが多数の研究で報告されています（Bian et al. Citation2017; Farid et al. Citation2020; Li et al. Citation2020; Rosales-Gómez et al. Citation2018; Shil and Chichger Citation2021）。腸の炎症は、腸外の組織でも遺伝毒性を誘発する可能性がある（Westbrookら、引用2011年）。
細菌が存在しない状態でのヒト横行結腸の今回の研究から導き出されるもう一つの結論は、Bornemannら（引用2018）が観察したスクラロースからスクラロース-6-アセテートへのバイオコンバージョンが、宿主代謝ではなく、細菌によって媒介されたというものである。頂部および基底部上清のクロマトグラフィー分析により、RepliGut®システム（OpAns Citation2021）においてスクラロースからスクラロース-6-アセテートへの明らかな変換がないことが示されました。したがって、Bornemannら（引用2018）が報告した糞便サンプル中のスクラロース-6-アセテート対スクラロース比の濃縮は、宿主腸管上皮におけるアセチル補酵素A（アセチルCoA）による代謝ではなく、細菌代謝による可能性が最も高いと考えられます。腸内におけるスクラロースのアセチル化は、スクラロースの極性を低下させることで微生物細胞からの排泄を促進するため、細菌の解毒機構として機能すると考えられる（Koppel, Rekdal, and Balskus Citation2018）。また、Abou-Doniaら（Citation2008）がスクラロース摂取後に報告した腸内嫌気性菌の増殖鈍化にも、スクラロース-6-アセテートが寄与している可能性があります。5-アミノサリチル酸系薬剤などの医薬化合物のアセチル化は、以前、嫌気性菌の増殖を抑制することが判明している（Delomenie et al. Citation2001）。
遺伝子発現
本研究におけるRNA-seqおよび遺伝子発現解析は、スクラロース-6-アセテートが横行結腸において、有害な化学物質や条件に対する生体反応に関連する遺伝子の発現を上昇させることを示した。メタロチオネイン1 G（MT1G）は、スクラロース-6-アセテートにおいて最大の発現変化を示し、未処理のコントロールに対して253.82倍の上昇を示しました。メタロチオネイン（MT）遺伝子は、炎症、酸化ストレス、癌、および殺虫剤、除草剤、金属、その他の異種生物化合物による細胞毒性のバイオマーカーとなるタンパク質をコードする（Bauman et al. Citation1991; Dai et al. Citation2021; Migliaccio et al. Citation2020; Ostrakhovitch et al. Citation2006; Rodrigo et al. Citation2020; Ruttkay-Nedecky et al. Citation2013; Si and Lang Citation2018; Tong et al. Citation2020）。MT1Gのアップレギュレーションは、急性前骨髄球性白血病細胞の成長期におけるG1/S転移を促進する（Hirako and Takahashi Citation2021）。MTの発現亢進はIBDでも報告されている（Brüwer et al. Citation2001; Dooley et al. Citation2004）. 前述のように、造血器新生物（Soffrittiら Citation2016）およびIBD（Liら Citation2016；Citation2020；Wangら Citation2019；Guoら Citation2021；Rodriguez-Palaciosら Citation2018）はスクラロース負荷齧歯類モデルで生じる。しかし、造血器新生物またはIBDの発生に対するスクラロース-6-アセテートの潜在的な寄与は、明らかに検討されていない。
SHMT2、ATF3、Carbohydrate sulfotransferase 3 (CHST3)の3つの遺伝子も、スクラロース-6-アセテートによって著しく発現し、未処理のコントロールに対して81.23倍、54.49倍、9.26倍に上昇した。SHMT2は、腸管上皮細胞に高濃度に存在するセリンとグリシンの反応を触媒する重要なミトコンドリア酵素、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ-2をコードしている。SHMT2は、エピジェネティックな癌抑制因子のサイレンシングを通じてリンパ腫の発生を開始し（Parsaら、引用2020）、大腸癌の進行を促進し（Cuiら、引用2022；Liuら、引用2021）、口腔扁平上皮癌の攻撃的プロセスを増強し（Zhengら、引用2022）、横紋筋肉腫の腫瘍形成（Nguyenら、引用2021）を促進します。ATF3は、哺乳類の活性化転写因子/CAMP応答性エレメント結合（CREB）タンパク質ファミリーの転写因子のメンバーをコードしています。ATF3は、酸化ストレスのマーカーであり（Ketola et al. Citation2012）、代謝、免疫、および発癌の調節に役割を果たしている（Yin et al. Citation2008; Ku and Cheng Citation2020）。炭水化物硫酸転移酵素3（CHST3）遺伝子は、コンドロイチン6-硫酸の形成に関与する酵素（コンドロイチン6-O-硫酸転移酵素1またはC6ST-1）をコードする（MedlinePlus Citation2023）。コンドロイチン6-硫酸は、ナイーブTリンパ球と同様に骨格の発生と維持に関与している（Uchimura et al. Citation2002）。コンドロイチン6-硫酸の発現は、ヒトの神経膠腫細胞でアップレギュレーションされ、このアップレギュレーションは神経膠腫の悪性度と相関している（Pan et al. Citation2020）。
スクラロース-6-アセテートでコントロールより発現が大きくなった他の遺伝子も、一部の組織で癌に関与していた。ミニクロモソーム維持複合体成分2（MCM2）は、扁平上皮／腺扁平上皮がんおよび胆嚢の腺がん（Liu et al. Citation2016）および肝細胞がん（Tang et al. Citation2022）における予後不良の指標となる。神経膠腫組織におけるzinc finger and SCAN domain containing 10（ZSCAN10）の発現の上昇は、神経膠腫の予後不良と関連していた（Jiang et al.、Citation2019)。EWS RNA Binding Protein 1（EWSR1）は、予後不良な肝臓がんの予後マーカーである（Jiang et al. Citation2021）。腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー14（TNFSF14）は、腎細胞がんにおいてアップレギュレートされ、予後不良のマーカーとなる（Xu et al. Citation2020）、SET核プロトオンコジーンは、肝臓がんの予後不良のマーカーとなる（Van Nguyen et al. Citation2021）。Elongator acetyltransferase complex subunit 5 (ELP5)は、メラノーマ細胞の腫瘍形成に関与している（Close et al. Citation2012）。
スクラロースとコントロールサンプルの間で差のある発現が見られたのは2つの遺伝子だけでした。COX10は、コントロールと比較して、スクラロースインキュベーションで高い数値の発現を示しました。COX10遺伝子は、ミトコンドリア電子輸送鎖の構成要素をコードし、ナチュラルキラー（NK）細胞の拡張に必要である（Mah-Somら、引用2021）。精子形成に関与するFAM166A（The Human Protein Atlas, Citation2023）は、コントロールではスクラロースよりも高い数値の発現を示した。このように、スクラロース暴露下でFAM166Aの発現量がコントロールに比べて低下するという知見は、スクラロース-6-アセテートでは起こらず、この精子形成関連遺伝子の発現低下はスクラロース自体によって引き起こされるようである。スクラロースによる精子形成遺伝子FAM166Aの発現減少の影響は不明である。ラット精子におけるスクラロースの解糖活性に関する歴史的な28日間の経口投与試験では、顕著な効果は認められなかった（Kille et al. Citation2000b）。しかし、28日間の試験期間は、ラットの精子形成の全期間である52日間を評価するには不十分である可能性がある（Clouthier et al. Citation1996）。4週間の摂食試験で、スクラロースを含む市販の人工甘味料とアセスルファムKがマウスの精子形成に変化を与えることがわかった（Al-Qudsi and Al-Dosssary, Citation2020）。スクラロースの精子形成への影響に関するヒトの摂食試験は実施されていないが、有機塩素化合物への曝露は、ヒト男性の精液品質の変化、DNA断片化、染色体異数性に関連している（Giulioni et al.引用2022）。
今回の研究では、遺伝子発現のスクラロース対スクラロース-6-アセテート比較の結果は、スクラロース-6-アセテート対コントロール比較と一致しており、スクラロース-6-アセテートは正常な細胞機能を損なうことを示しています。必須および基本的な細胞機能の遺伝子の発現は、スクラロース-6-アセテートではスクラロースとの比較で低くなった。コレステロール生合成の最初の特定酵素をコードするファルネシル二リン酸ファルネシルトランスフェラーゼ（FDFT1）遺伝子は、30.93倍の変化でスクラロース-6-アセテートと比較してスクラロースで顕著に発現していました。コレステロールは細胞膜の安定性だけでなく、タイトジャンクションの形成にも必須である（Shigetomi et al. Citation2023）。スクラロースとスクラロース-6-アセテートの比較から得られたデータを総合すると、スクラロース-6-アセテートとコントロールの比較におけるMT1G、SHMT2、ATF3、CHST3の発現増加とともに、ヒト腸管上皮がスクラロース-6-アセテートにさらされると、必須の細胞プロセスが混乱することが示されました。
これまでの研究で、スクラロース曝露後の炎症に関連する遺伝子発現の変化が報告されています。肝炎マーカー（MMP-2およびiNOS）の遺伝子発現の増加がスクラロース処理マウスで検出されたが（Bianら引用2017）、これがスクラロースまたはスクラロース-6-アセテートによる肝細胞の直接的刺激によるものか、スクラロース曝露後の機能／代謝的変化によるものか不明である。また、スクラロースは、ヒト脂肪組織を用いたin vitroの研究において、脂肪形成と抗酸化遺伝子の発現を促進した（Kundu et al. Citation2020）。抗酸化遺伝子GPX3のアップレギュレーションは、活性酸素種（ROS）の細胞内蓄積の上昇に対する代償反応であると解釈された。脂肪組織における別のin vitroの調査では、スクラロースが、NF-κBを介した炎症性反応の抑制因子であるPPARγをアップレギュレートすることがわかりました（Azad et al. Citation2020）。スクラロースとアセスルファムK（別の人工甘味料）で甘味をつけたダイエットソーダの摂取は、皮下脂肪組織におけるNF-κBシグナルを含む炎症性トランスクリプトーム経路を変化させた（Sylvetsky et al.、引用2020）。
薬物動態学
肝ミクロソームにおける半減期（T1/2）の研究から、スクラロース-6-アセテートは肝臓である程度抽出され、ラットよりもヒトで大きな効果があることが示されているが、スクラロース-6-アセテートの吸収と代謝はまだ十分に特徴づけられていない。抽出はNADPHに依存しないため、ヒト肝ミクロソームでの第1相代謝は関与していないようです。スクラロース-6-アセテートはスクラロースよりも抽出率が高いが、スクラロース-6-アセテートはスクラロース摂取中止後、スクラロースよりも5日間長く尿中に検出された。これは、スクラロース-6-アセテートの方が親油性が高く、生物濃縮性が高いことに起因していると考えられる。
ヒト肝ミクロソーム中のゼノバイオティクス解毒酵素を調べたところ、スクラロース-6-アセテートはチトクロームP450（CYP450）ファミリーの2つのメンバー（CYP1A2およびCYP2C19）を阻害することがわかった。これらの酵素の阻害は、薬剤のバイオアベイラビリティや内因性基質のレベルに影響を及ぼす可能性がある。スクラロースのCYP450酵素に対する有意な阻害作用は認められませんでした。CYP1A2およびCYP2C19の阻害は、内因性および外因性の化学物質の代謝を低下させ、潜在的に有害な代謝作用を促進する可能性がある。
CYP1A2は、レチノール、メラトニン、ステロイド（エストラジオールを含む）、エストロゲン、ウロポルフィリノーゲン、アラキドン酸など多くの内因性化合物を代謝する。CYP1A2を阻害すると、エストラジオール濃度が上昇する可能性があり、エストラジオールと乳がんには関連がある（Cummings et al. Citation2002; DrugBank Citation2022; PubChem Citation2022）。また、CYP1A2の阻害は、カフェイン（CYP1A2の基質）の血漿中濃度を上昇させ、不安、睡眠障害、高血圧を悪化させる可能性がある。
また、スクラロース-6-アセテートによるCYP1A2の阻害は、CYP1A2基質である医薬品の血漿中濃度を上昇させる可能性がある。代表的なCYP1A2基質（生物学的機能／効能とともに）としては、アロセトロン（過敏性腸症候群）、アキシチニブ（腎細胞がん）、カフェイン（中枢神経刺激薬）、クロザピン（抗精神病薬）、フルタミド（前立腺がん）、フロバトリプタン（片頭痛）、メラトニン（睡眠覚醒周期）、メキシレチン（不整脈）、ミルタザピン（抗うつ剤）、オランザピン（抗精神病薬）、ラサギリン（パーキンソン病）、タクリン（アルツハイマー病）、テオフィリン（気管支拡張剤）、チザニジン（筋弛緩剤）、トリアムテレン（利尿剤）。スクラロース-6-アセテートによるCYP2C19の阻害は、CYP2C19の基質血漿中濃度を上昇させる可能性がある。CYP2C19阻害剤によって著しく影響を受けることが知られている代表的なCYP2C19基質（生物学的機能／効能とともに）には、アブロシチニブ（アトピー性皮膚炎）、カンナビジオール（発作）、カリソプロドール（筋弛緩剤）、シロスタゾール（跛行）、シタロプラム（抗うつ剤）、クロバザム（鎮静剤）、クロピドグレル（血液サラサラ剤）、ジアゼパム（不安症）、エソメプラゾール（胃食道逆流症）、メタドン（麻薬中毒）、オメプラゾール（胃食道逆流症）、フェニトイン（発作）、トファシチニブ（関節リウマチ）（DrugBank Citation2022； PubChem Citation2022）。
今回報告されたスクラロース-6-アセテートによるCYP1A2およびCYP2C19の阻害は、ヒト肝ミクロソームにおいて細菌非存在下でin vitroで観察されました。しかし、腸内細菌叢や炎症は、CYP450代謝酵素やトランスポーターの発現や活性を変化させることがよく知られているため、スクラロース-6-アセテートに起因する阻害や誘導を含む追加の薬物動態作用が生体内で起こる可能性がある（Claus et al. Citation2011; Kuno et al. Citation2016; Toda et al. Citation2009; Selwyn et al. Citation2016; Togao et al. Citation2020; Collins and Patterson Citation2020; Hu et al. Citation2021; Lenoir et al. Citation2021) 。さらに、酸化ストレスは、チトクロームP450 3A4（CYP3A4）（Nagai et al. Citation2004; Strolin-Benedetti et al. Citation1999）だけでなく、トランスポーターP-糖タンパク質／P-gp（Abu-Qare、Elmasry、 and Abou-Donia Citation2003; Callaghan et al. Citation2008; Feng et al. Citation2019; Shchulkin et al. Citation2021）、スクラロース12週間摂取後のin vivoではCYP3A4とP-gpの両方の誘導が報告されています（Abou-Donia et al. Citation2008）。
結論
本研究で実施した8つのプロジェクトは、スクラロースの暴露による生物学的な悪影響を報告する大規模かつ増大する科学文献に追加されるものである。今回の調査では、スクラロースの不純物および代謝物であるスクラロース-6-アセテートが、DNAの切断を誘発するクラスト形成性MoAを持つ遺伝毒性を有することが判明した。腸内細菌の非存在下でスクラロース-6-アセテートとスクラロースの両方をmM濃度でin vitroの腸管上皮に曝露すると、腸管バリア機能の完全性が損なわれた。スクラロース-6-アセテートは、腸上皮において、MT1GやSHMT2などの炎症、酸化ストレス、癌に関連する遺伝子の発現を誘導した。また、スクラロース-6-アセテートは、有害な毒性学的曝露につながる可能性のある内因性及び異種化合物を代謝するチトクロームP450ファミリーの2つのメンバー（CYP1A2及びCYP2C19）をブロックした。これらの知見は、食品供給におけるスクラロースの継続的な存在に関する健康および安全上の懸念を提起し、規制状況の見直しが必要であることを示しています。
情報開示
著者は、潜在的な利益相反を報告していない。
データの利用可能性に関する声明
本研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求があれば、対応する著者であるSSSから入手可能である。
追加情報
資金提供
この研究は、ノースカロライナ州立大学のエンジニアリング・ファウンデーションから支援を受けた。
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