糞便微生物叢移植は過敏性腸症候群患者の症状緩和とは無関係に微生物叢に影響を及ぼす

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糞便微生物叢移植は過敏性腸症候群患者の症状緩和とは無関係に微生物叢に影響を及ぼす


バイオフィルムとマイクロバイオーム 第10巻、記事番号：73（2024）この記事を引用する

要旨

過敏性腸症候群（IBS）の病態生理には、不均衡な微生物叢が関与している可能性があるため、便微生物叢移植（FMT）が治療の可能性として示唆されている。FMT後の臨床的改善と微生物叢の関係に関するこれまでの研究では、結論は得られていない。本研究では、49名のIBS患者を対象とした無作為化プラセボ対照FMT試験から得られた16S rRNA遺伝子アンプリコンデータとショットガンメタゲノミクスデータを用いて、FMT後の微生物叢組成の変化とその機能的可能性を解析し、微生物叢と患者の臨床転帰との関連を明らかにした。その結果、健康なドナーからのFMTによって微生物叢の組成と機能的プロファイルがうまく調節されても、IBS患者の症状の消失とは関連しないことがわかった。注目すべきは、FMT前のP. copriの相対量が少なかったFMT群の患者では、ドナー由来のPrevotella copri株が微生物叢を支配していたことである。この結果は、IBSの多因子性と、ドナー由来株のコロニー形成におけるレシピエントの微生物叢の役割を強調している。

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はじめに

過敏性腸症候群（IBS）は機能性消化管障害の1つであり、腹痛の再発、便習慣の変化、腹部膨満感などの症状を引き起こし、患者のQOLを低下させる1。患者は主症状によって4つのサブタイプに分類される： 便秘を伴うIBS（IBS-C）、下痢を伴うIBS（IBS-D）、混合性腸習慣（IBS-M）、分類不能（IBS-U）である。IBSの有病率は全世界で約4％2であるが、地域や診断基準によって有病率は異なる1,3。この症候群の病因と病態生理学は、現在も調査中である。既存の研究では、患者の一部は腸内細菌叢の組成と機能に変化があることが認められている4。胃腸（GI）感染後に本症を発症する患者もいることから、腸内細菌叢のアンバランスとの関連が示唆されている5,6。しかし、16S rRNA遺伝子配列決定による腸内細菌叢組成の研究では、IBSにおける腸内細菌叢の役割について包括的な理解は得られていない。この観点から、その機能的可能性の調査と、種および菌株レベルでの腸内細菌叢組成のより詳細な説明が重要である。さらに、腸管透過性、免疫活性、エンテロクロマフィン細胞の機能の変化がIBSと関連していることから、腸内微小環境はIBSの病態生理に関与しているようである7。IBS患者と健常対照者では、粘膜微生物叢の組成が異なることが報告されており8,9、IBSの腸内微小環境の変化は、粘膜に生息する微生物にも影響を及ぼし、その逆もまた然りであることが示唆されている。

現在、IBSの治療法としては、例えば非吸収性抗生物質やプロバイオティクス、あるいは食生活の改善などがある4。特に、発酵性オリゴ糖、二糖類、単糖類、ポリオールのレベルを下げること（FODMAP食）は、症状の緩和に役立つ可能性がある10。にもかかわらず、すべての患者が現在の治療法の恩恵を受けられるわけではなく、IBSに対する新たな治療戦略が強く求められている。

近年、便微生物叢移植（FMT）が、推奨される適応である再発性クロストリジオイデスディフィシル感染症（rCDI）以外の疾患でも研究されている。FMTはIBS患者の治療法としても研究されているが、一貫した結果は得られていない11,12,13,14,15,16,17,18,19,20。IBSに関する先行研究では、FMT後の糞便微生物叢組成のシフトが報告されている11,13,15,16,21,22,23。しかし、特定の細菌分類群とIBS症状との関連については、矛盾した知見がある21,22,23,24。さらに、IBS-FMT研究のほとんどは、16S rRNAアンプリコンベースのシークエンシング法を用いて行われており、属レベルの解析に限られている。これまでのところ、IBS-FMT試験において腸内細菌叢の機能的可能性や微生物代謝産物に関する結果を報告している研究はごく少数である。

以前、われわれは、49人のIBS患者を対象に、大腸内視鏡検査によって普遍的な健常人ドナーからのFMT（FMT群）またはプラセボとしての自家移植（プラセボ群）を1回だけ受けた（プラセボ対照無作為化臨床試験）17。FMT群では、3ヵ月時点でベースラインと比較して一過性の症状緩和が認められた。また、FMT群では、レスポンダー（IBS症状重症度スコアがベースラインと比較して50ポイント低下）と分類された患者において、治療後のQOLの改善と精神症状の軽減が認められた。また、前回の研究では、FMT群で細菌濃度が増加し、FMT群の患者の微生物叢組成が変化することを示した17。これに基づき、本研究の目的は、微生物叢組成を種レベル、さらには株レベルまで詳細に分析し、それが症状緩和と関連しうるかどうかを検討することであった。われわれは、ベースラインの糞便および大腸粘膜の微生物叢と、1年間の追跡調査におけるドナーの微生物叢の生着について研究した。さらに、IBSにおけるFMTの効果をより明確にするため、また治療による微生物の変化と臨床転帰との間の複雑な相互作用を探るため、微生物叢の機能的潜在能力の変化に取り組むことを目的とした。

結果

ベースライン時のIBS患者の糞便微生物叢はバクテロイデス科に富んでいた

まず、16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングを用いて、ベースライン時のIBS患者と健常人ドナーの糞便微生物叢組成をプロファイリングした。その結果、IBS患者ではバクテロイデス科の相対濃度が高いことが観察された（図1A）。より具体的には、ベースライン時のIBS患者の糞便微生物叢において、バクテロイデス科の分類群は平均相対存在量21.32％（±9.78）を占めた。一方、健常人ドナーのバクテロイデス科の相対存在量は低かった（平均2.42％±2.66）（図1A）。16S rRNA遺伝子配列決定によって評価されたベースライン時の属レベルの糞便微生物叢組成は、主要アウトカムの時点（12週）において、IBS患者が反応者であった場合と非反応者であった場合とでPCoAに差はなかった（全患者についてp= 0.779、999通りの並べ替えによるPERMANOVA、補足図1A）。FMT群の患者においても同様の結果が観察された（FMT群のp＝0.833、999通りの並べ替えによるPERMANOVA、補足図1B）。ベースライン時の患者の糞便微生物叢組成は、ドナーの糞便組成よりも他のIBS患者と有意に類似していた（Bray-Curtis非類似度、p< 0.001、Wilcoxon符号付順位検定、補足図2）。

図1：IBS患者、ドナー、非IBS対照のベースライン糞便および粘膜微生物叢組成。

A16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングで評価した糞便微生物叢の家族レベルの平均相対存在量。ベースライン（BL）時のIBS患者（n＝49）およびドナー（n＝1）において、存在量が1％以上、有病率が20％以上の家族を示す。B16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングで評価した粘膜微生物叢のファミリーレベルの平均相対存在量。IBS患者（IBS、n= 49）および非IBS対照（n= 7）において、存在量が1％を超えるファミリーおよび有病率が20％を超えるファミリーを示す。C16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングで評価した属レベルの粘膜微生物叢組成のPCoAプロット。Bray-Curtis非類似度指数で測定。IBS患者は対照群とは別にグループ分けされたが、グループの分散も有意に異なっていた（p= 0.003, PERMANOVA with 999 permutations,p= 0.0003, betadisper）。

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ベースライン時のIBS患者の糞便微生物叢において、ショットガンメタゲノミクスで評価された最も優勢な3種は、Prevotella copri（5.56％±13.43）、Phocaeicola dorei（4.71％±6.53）、Agathobacter rectalis（4.15％±4.11）であった（補足図3A）。特に、Prevotella copriはベースライン時に4人の患者で高い相対量を示した（平均相対量37.882％±11.0）（補足図3A）。ドナーの場合、Gemmiger qucibialis（10.12％±2.52）、Agathobacter rectalis（5.03％±2.07）およびRuminococcus E bromii B（2.94％±2.62）が糞便微生物叢の最も豊富な3種であった（補足図3B）。

粘膜微生物叢の組成はIBS患者と非IBS対照群との間に差はなかった

次に、IBS患者と7人の非IBS対照について、16S rRNA遺伝子配列決定を用いて下行結腸のベースライン粘膜微生物叢を比較した（図1B）。属レベルでPERMANOVA検定を行ったところ、IBS患者の粘膜微生物叢は非IBS対照群と有意に異なっていた（図1C、p= 0.003, PERMANOVA with 999 permutations,p= 0.0003, betadisper）。しかし、ベータ分散も2群間で有意に異なることがわかり、分散の違いは示唆されたが、組成の違いは示唆されなかった（図1C）。このことは、2つのグループ間で科や属レベルで存在量に有意な差があることがわかった分類群がなかったことからも確認された（科や属レベルの注釈に関する線形モデル、q> 0.05）。この結果は、サンプル数が少なかったこと（IBS患者49人、非IBS対照7人）で説明できるかもしれない。さらに、主要アウトカムの時点（12週）で反応したIBS患者全員と反応しなかったFMT群の患者との間で、ベースライン時の粘膜微生物叢組成に有意差は観察されなかった（全患者でp＝0.373、FMT群でp＝0.795、999通りの並べ替えによるPERMANOVA、補足図4A、B）。

健康なドナーからのFMTは微生物叢プロファイルに長期的な変化を誘発した

われわれは以前に、FMT群の患者の55％がFMT後12週目にベースラインと比較して症状が緩和した、すなわちレスポンダーであったことを示した17。しかし、16S rRNAアンプリコンプロファイリングに基づく長期的な微生物叢組成の変化にもかかわらず、症状の軽減は一過性であった17。ここで我々は、FMT群における糞便微生物叢プロファイルの長期的変化に寄与する分類群をさらに探索した。

16S rRNA遺伝子配列決定によって評価したファミリーレベルでは、FMT群の糞便微生物叢組成においてベースライン試料と比較して最も顕著な変化は、ベースラインと比較してFMT群でPrevotellaceaeが有意に増加し（ファミリーレベルのアノテーションに関する線形モデル、q> 0.05）、Bacteroidaceaeが有意に減少したことであった（図2A、補足表2）。それにもかかわらず、FMT群ではどのサンプリング時点においても、応答者と非応答者の間の微生物叢組成に有意差は観察されなかった（ファミリーレベルのアノテーションに関する線形モデル、q> 0.05）。さらに、16S rRNA遺伝子配列決定によって評価されたプレボテラ属の相対存在量は、ベースラインでも12週時点でも、主要アウトカムの時点（12週）で反応者であった患者と非反応者であった患者の間で、全コホートでもFMT群内のみでも差がなかった（ウィルコクソンの符号付き順位検定、補足図5A-D）。プラセボ群では、4週時点でベースラインと比較して有意に異なるファミリーレベルの分類群が1つだけ観察された（補足表2）。このように、腸管洗浄と自家移植の併用は、微生物叢組成にわずかな変化をもたらした。

図2：FMTはIBS患者の糞便微生物叢の組成変化を誘発した。

A16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングで評価したファミリーレベルの相対的存在量では、存在量が1％以上、有病率が20％以上のファミリーが選択されている。特にプレボテラ科の存在量がFMT群で増加した。BFMT群（n＝23）とプラセボ群（n＝26）における16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングで評価した細菌の豊富さ。バイオリンプロットはデータの分布を示し、ドットは個々のサンプルを示す。リッチネスは、FMT群ではベースラインと比較して有意に増加（Wilcoxon符号順位検定、p＜0.01）したが、反応者と非反応者（ベースラインと比較して少なくとも50ポイントの減少に基づいて分類）の間に有意差はなかった。プラセボ群では、反応者でも非反応者でも、豊かさの増加は検出されなかった。** =p< 0.01, *** =p< 0.001, NS.=有意ではない。C16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングで評価したプレボテラ/バクテロイデス比（P/B比）。ボックスは第1四分位群および第3四分位群の四分位範囲（IQR）を示し、内線は中央値を示す。ボックスプロットのひげは、第1四分位がIQRの-1.5倍、第3四分位がIQRの+1.5倍を示す。ドットは全サンプルを示す。FMT群（n＝23）では、ベースライン時と比較してFMT後のP/B比が有意に増加した。 Wilcoxon signed-rank検定、*＝p＜0.05、**＝p＜0.01、***＝p＜0.001。プラセボ群（n＝26）では有意差は認められなかった（Wilcoxon signed-rank検定、NS＝有意ではない）。

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FMT群の糞便微生物叢では、ベースラインと比較して細菌濃度が有意に増加した（Wilcoxon符号付順位検定、p＜0.01）が、プラセボ群では差は認められなかった（図2B）。しかし、いずれの群においても、反応者と非反応者の間に統計学的に有意な差は認められなかった（Wilcoxonの符号付き順位検定）。

次に、16S rRNA遺伝子の塩基配列解析により、Prevotella/Bacteroides比（P/B比）を評価した。P/B比は、個人を異なる微生物腸型に分化させる可能性を示している25。P/B比の高低の閾値としては、既報26,27と同様に0.01を用いた。ドナーの検体はすべてP/B比が高かった（図2C）。FMT群では、P/B比が有意に上昇し、12人中11人がベースライン時の低P/B比カテゴリーから4週時点の高P/B比カテゴリーに移行した（図2C、Wilcoxon符号順位検定、p<0.05）。一方、プラセボ群ではP/B比は有意に上昇せず、ベースライン時に低P/B比であった患者18人中2人だけが4週時点で高P/B比に変化した（図2C、Wilcoxon符号順位検定）。しかし、FMT群でもプラセボ群でも、どの時点でも反応者と非反応者のP/B比に有意差はなかった（ウィルコクソンの符号順位検定、補足図6A-D）。

興味深いことに、12週時点では、治療に反応した患者は、反応しなかった患者と比較して、ドナーとの類似性が低いことがわかった（Bray-Curtis非類似度指数とJaccard指数で測定、それぞれp＜0.001とp＜0.01、Wilcoxon符号順位検定、補足図7A、B）。さらに、16S rRNA遺伝子配列決定で評価された糞便の科または属レベルの組成と、測定された臨床パラメータ（IBS-SSS、δIBS-SSS、IBS-QOL、D15、BDIまたはBAI）のいずれとも有意な関連を示す証拠は見つからなかった。これらを総合すると、ドナーからの微生物叢移植は症状を改善せず、微生物叢プロファイルの変化はIBS症状や他の臨床パラメータと関連づけられなかった。

ベースラインの糞便微生物叢がドナーのPrevotella株の移植を決定した

16S rRNA遺伝子の塩基配列決定に加えて、我々はショットガン・メタゲノミクスを用いて、微生物叢の種レベルの組成と機能的可能性を評価した。この解析のために、縦断的サンプルと完全な臨床メタデータの入手可能性に基づいて、サンプルのサブセット（30人の患者とドナーからの133の糞便サンプル）を選択した。

FMT患者とプラセボ患者の糞便微生物叢組成は、治療後に有意に異なっていたが、両群の分散の差も有意であった（図3A、p= 0.001、PERMANOVA with 999 permutations、p= 0.02、betadisper）。メタゲノミクスで評価した種のレベルでは、ドナーからのFMTが糞便微生物叢組成を大きく変化させることがわかった。特に、Prevotella copriは、追跡調査期間を通じて、FMT群のほぼすべての患者において支配的な種となった（図3B）。さらに、Alistipessp 000434235、Coprococcus eutactusA、Alistipes putredinisを含む他のいくつかの種は、ベースラインと比較して、追跡調査時点においてFMT群で濃縮された（種レベルの注釈に関する線形モデル、q＞0.05、補足表3）。

図3：各患者で最も優勢な種と、ドナーとPrevotella copri株のクラスタリング。

A治療後のFMT群とプラセボ群の分離を示すBray-Curtis非類似度指数によるメタゲノミクス評価による種レベルのPCoAプロット（p= 0.01、999通りの並べ替えによるPERMANOVA、p= 0.02、betadisper）。B治療後に最も優勢な種。プレボテラ・コプリがFMT群の患者の微生物叢を支配していた。CメタゲノミクスとStrainPhlAnによって評価されたPrevotella copriクレードAの系統樹。ドナーサンプル（薄い黄色で表示）とグループ化されたサンプル（薄い青で表示）はすべて、FMT後のFMT群患者からのものであった。個体内サンプルでクラスタリングされたFMT群の4人の患者（4つの異なる緑色で表示）は、P. copriの初期相対存在量が高かった。プラセボ患者1人（灰色で表示）からクレードマーカーが検出され、Prevotella copriDSM 18205が参照ゲノムとして使用された（茶色で表示）。

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次に、FMT群に豊富に存在するP. copriの起源を調べ、ドナー由来かどうかを評価した。StrainPhlAnを用いて菌株レベルのアノテーションを行ったところ、サンプル中に非常に豊富に存在するPrevotella copriclade Aのマーカーを検出することができた。ほとんどの菌株は、2つのドナー株とともにグループ化されていた（図3C）。興味深いことに、これらの菌株はすべてFMT後のFMT群の患者からのものであり、これらの患者はベースライン時のP. copri存在量が低かった（1.018％±1.91、補足図2A）。一方、個体差のある4名の患者では、ベースライン時のP. copriの相対存在量が高かった（37.882％±11.0、補足図2A）。プラセボ群では、1人の患者にのみクレードマーカーが認められた。

全体として、FMT群の患者の微生物叢は、Prevotella、Faecalibacterium、Alistipesなどの嫌気性分類群に富んでいた。特にPrevotella copriは、初期P. copriの濃度が低いFMT群に属する患者で濃縮されており、ドナー由来の菌株が患者をコロニー形成するのに有効であり、FMT後の優勢株であったことが示唆された。しかし、ベースライン時のP. copriの存在量が高いと、ドナー株の生着が効果的に阻止されるようであった。プラセボ治療を受けた患者は、メタゲノミクスによって評価された微生物叢組成の点では、自家移植の影響をほとんど受けていないようであった。FMT群でもプラセボ群でも、臨床転帰とメタゲノミクスで評価した微生物叢組成の変化とを関連付けることはできなかった。

FMTは腸内細菌叢の機能的可能性に長期的な変化を誘発した

我々は、FMT後の糞便微生物叢組成の変化を同定し、この組成変化がFMT患者の微生物群集の機能的潜在性に影響を及ぼすかどうかを評価することを目的とした。ベースライン時には、FMT群とプラセボ群との間に有意な機能的経路の違いは見られなかった（機能的経路に関する線形モデル、補足表4）。追跡期間中、FMT群とプラセボ群ではPCoAに差がみられた（p= 0.001, PERMANOVA with 999 permutations,p= 0.30, betadisper, 図4A）。FMT群とプラセボ群では、4週後、12週後、26週後において、それぞれ7、4、17の機能的経路が有意に異なっていた（機能的経路に関する線形モデル、q< 0.1、図4B、補足表4）。これらの有意差のある経路のうち、アミノ酸生合成経路を含む19経路がFMT群で増加していた。

図4：メタゲノムシークエンシングで評価した管腔細菌叢の機能的可能性。

ドナー、ベースライン時の全患者、追跡時点でのFMT群とプラセボ群の機能的経路のPCoAプロット。Bray-Curtis非類似度指数で測定。FMT群はプラセボ群と比較して、追跡期間中に有意差が認められた（p= 0.001, PERMANOVA with 999 permutations,p= 0.30, betadisper）。さらに、FMTフォローアップ検体はベースライン検体と有意に異なっていた（p= 0.001, PERMANOVA with 999 permutations,p= 0.52, betadisper）。B4週間の時点でFMT群とプラセボ群の間で存在量に有意差のあるパスウェイを示す棒グラフ（機能パスウェイに関する線形モデル、q< 0.1）。C4週間の時点とベースラインの間でFMT群内の存在量に有意差がある経路を示す棒グラフ（機能的経路に関する線形モデル、q< 0.1）。Dベースライン（BL）と追跡時点におけるFMT群とプラセボ群のD-アラビノース分解I経路の相対的存在量。ボックスは第1四分位と第3四分位の四分位範囲（IQR）を示し、内線は中央値を示す。ボックスプロットのひげは、第1四分位がIQRの-1.5倍、第3四分位がIQRの+1.5倍を示す。ドットはすべてのサンプルを示す。Eベースライン（BL）と追跡時点におけるFMT群とプラセボ群の5-オキソ-L-プロリン代謝経路の相対的存在量。ボックスは第1四分位群および第3四分位群の四分位範囲（IQR）を示し、内線は中央値を示す。ボックスプロットのひげは、第1四分位がIQRの-1.5倍、第3四分位がIQRの+1.5倍を示す。ドットはすべてのサンプルを示す。

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FMT群の中で、追跡調査サンプルはベースライン・サンプルと有意に異なっていた（p= 0.001, PERMANOVA with 999 permutations,p= 0.52, betadisper, 図4A）。FMT群では、4週後、26週後、52週後において、ベースライン時と追跡時でそれぞれ7、38、1パスウェイが有意に異なっていた（機能パスウェイに関する線形モデル、q< 0.1、図4C、補足表5）。このうち19のパスウェイがFMT後の微生物叢で増加した。D-アラビノース分解経路と5-オキソ-L-プロリン代謝経路は全期間を通じて増加傾向が見られたが、D-アラビノース分解経路では4週目に、5-オキソ-プロリン代謝経路では4週目と26週目に有意差が検出された（図4D、E）。プラセボ群では、26週目とベースラインとの間で2つの経路のみが有意に異なっていた（機能的経路に関する線形モデル、q<0.1、補足表6）。さらに、反応者と非反応者の間で機能的可能性を比較したが、これらの群間に有意差は認められなかった（機能パスウェイに関する線形モデル）。

その結果、FMT群でP. copriが12週または26週の時点で強く寄与する8つの機能パスウェイが同定された（補足表4、5）。これらのパスウェイには、分岐鎖アミノ酸（BCAA）生合成のスーパーパスウェイ、L-メチオニン生合成IVおよびL-イソロイシン生合成I（スレオニンから）パスウェイが含まれ、これらのパスウェイはFMT後に増加し、P. copriは主要な貢献者であった（図5、補足表4、5）。

図5: ドナーおよびIBS患者の微生物叢におけるL-イソロイシン生合成I（スレオニンから）経路。

この経路は、26週時点ではFMT群とプラセボ群の間で、またFMT群内では26週時点とベースラインの間で存在量に差があり（機能的経路に関する線形モデル、q< 0.1、補足表4、5）、P. copriの寄与が高いことを示している。

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最後に、代謝パスウェイと臨床データとの関連性を両群で別々に検討した。解析には、ベースライン時と比較した追跡時点での臨床測定値の変化であるデルタ値を用いた。その結果、代謝パスウェイは症状の重症度（IBS-SSS）の変化とは関連しなかった（機能パスウェイに関する線形モデル、補足表7、補足図8）。FMT群では、BAIとBDIの変化と関連するパスウェイがそれぞれ4つと1つ見つかった（機能的パスウェイに関する線形モデル、q< 0.1、補足表7、補足図8A-E）。1つのパスウェイ、UPD-グルコース由来のO-抗原ビルディングブロック生合成のスーパーパスウェイは、デルタBAIとデルタBDIの両方に有意に関連していた。さらに、O-抗原ビルディングブロック生合成（E. coli）はデルタBAIと関連していた。1つの経路（dTDP-β-D-フコフラノース生合成）は、FMT群内のIBS-QOLの変化と有意に関連していた（補足表7、補足図8F）。

以上より、FMTは患者の微生物叢の機能的可能性に劇的な変化を引き起こし、FMT群ではメタゲノムプロファイルに長期にわたる大きな変化が観察されたのに対し、プラセボ群のプロファイルはわずかな変化にとどまった。最も影響を受けた経路は、アミノ酸、特にBCAAsの生合成に関するものであった。濃縮度の高いP. copriは、FMT後にいくつかのパスウェイに寄与した。しかし、機能的潜在能力は、反応者と非反応者の間に差はなかった。したがって、臨床転帰は微生物叢の機能的可能性とは関連しなかったが、他の臨床パラメータと代謝経路との関連性を示唆する結果が得られた。

考察

本研究では、49人の患者17を対象とした無作為化プラセボ対照IBS-FMT臨床試験から、16S rRNA遺伝子とショットガン・メタゲノミクスの両方を用いた詳細な微生物叢プロファイリングの結果を報告する。その結果、IBS患者と非IBS対照群との間で粘膜微生物叢に有意差は認められなかった。さらに、健康なドナーからのFMTは、FMT後の糞便微生物叢組成とその機能的能力の両方において、最長1年間の長期的変化を誘発し、レシピエント微生物叢におけるドナーの菌株の持続性も示した。にもかかわらず、治療が奏効した患者と奏効しなかった患者の間で、糞便微生物叢組成や機能的潜在能力に有意差は認められなかった。

ドナーの微生物叢がうまく生着することと、良好な臨床転帰が、一般的に、またIBSにおいて関連するかどうかについては、現在も議論が続いている。IBSを含むいくつかの異なる患者集団のメタゲノミクスデータを利用した最近の2つの研究では、この問題に関して相反する結論が出ている。一方、最初の研究では、ドナー株のコロニー形成と一般的な臨床的成功との間に関連性は認められなかった28。一方、2番目の研究では、ドナー微生物叢の生着といくつかの疾患に対する良好な臨床転帰との間に関連があることが示された29。IBS患者を対象としたFMTの先行研究では、特に便中微生物叢組成および/またはその機能的可能性とIBS症状およびFMT後の微生物組成変化との関連を評価しているが、一貫性のない結果が報告されている。ある研究では、FMT治療が奏効した患者の微生物叢はドナー微生物叢組成に向かう傾向を示したが、微生物叢の機能的ポテンシャルの変化は臨床的成功と有意な関連は認められなかったと報告している21。別の研究では、9つの分類群とIBS-SSSとの間に関連が認められたが、標準的な16S rRNAシーケンスとは別の方法を用いた22。さらに、IBS-D患者を対象とした最近のFMT研究では、FMTは患者のIBS-SSSを有意に改善しなかったが、腹部膨満感の重症度は改善し、これは硫化水素産生経路の減少およびそれに寄与する細菌分類群の相対的存在量と関連していた23。Browneたちは、FMT後に嫌気性菌分類群の増加を示したが、16S rRNA配列決定やChao1リッチネスで測定した微生物叢組成の変化と臨床的改善との関連は見いだせなかった24。われわれの知見は、Browneらの知見を再現するものであり、FMT群でのみ細菌数の有意な増加が認められたが、反応者と非反応者の間に有意差は認められなかった。興味深いことに、われわれのコホートでは、12週時点において、反応者の微生物叢は非反応者の微生物叢よりもドナーとの類似性が低かった。したがって、これらの結果は、IBSの病態における微生物叢の役割は複雑であり、生着そのものでは症状の緩和は得られないという仮説をさらに支持するものである。

この分野における未解決の疑問の一つは、特定のドナーからのFMTが症状緩和において優れた性能を示す「スーパードナー」現象である30。これは主に炎症性腸疾患患者で示唆されているが、IBSにも関連する可能性がある。El-SalhyらによるIBSに対するFMT試験の成功例では、いわゆる "スーパードナー "が使用された。"スーパードナー "は、健康基準に加え、微生物叢に影響を与えることが知られている他の因子、例えば経膣分娩であること、抗生物質への曝露が最小限であることなどに基づいてスクリーニングされた16,22。この "スーパードナー "はまた、"normobiotic "に分類され、ファーミキューテス門に属する12の分類群の存在度が高いことが示された。我々の試験のドナーも健康で、推奨される基準31に基づいて選ばれたが、出生様式などの追加的な選択基準は用いなかった。それにもかかわらず、我々のドナーは「スーパードナー」を定義する11の基準のうち6つを満たしていた32。ドナーの食事は、"スーパー・ドナー "のステータスに特に関係しているという仮説がある因子のひとつである30。しかし、具体的にどのような食事が有益であるかを決定するためには、さらなる研究が不可欠である。さらに、単一の「スーパードナー」がすべての患者に適合するのか、それともFMTを個別化医療としてより考慮すべきなのかは、まだ不明である。我々はドナーの微生物叢の移入に成功したことを示したが、これはIBS症状の変化とは関連づけられなかった。さらに、患者の常在微生物叢が、ドナー由来の菌株によるコロニー形成に影響することもわかった。これらの結果は、どのドナー株がレシピエントにコロニー形成するか、またそれらがレシピエントの生態系でどのように機能するかが重要であることを示唆している。

以前の研究で、FMT治療前の反応者ではプレボテラの相対存在量が増加していたことが報告されている14。ここでも、一部の患者でベースライン時のプレボテラの相対存在量が高いことが検出されたが、反応者と非反応者の間に有意差は認められなかった。実際、本研究におけるFMT後のPrevotella copriの高存在は、臨床的成功には結びつかなかった。以前の研究では、プレボテラが優勢な腸型はIBSの重症度が低いことと関連していた33。今回の研究では、ほとんどのFMTレシピエントでバクテロイデス（Bacteroides）優位の腸型からプレボテラ（Prevotella）優位の腸型への変化が観察されたが、この変化を測定された臨床パラメータのいずれとも関連付けることはできなかった。この理由として、重症のIBS患者が少なかったこと、また我々のコホートのサンプル数が少なかったことが考えられる。

プレボテラ（Prevotella）属は、消化管の健康と疾患における二重の役割のために関心を集めている。このグループの最も一般的なメンバーはプレボテラ・コプリ（Prevotella copri）で、遺伝的多様性の高い少なくとも4つの系統学的クレードを持ち、異なる腸内生態系で増殖できることが示されている34。この細菌は高繊維食35と関連しているが、腸内細菌叢におけるプレボテラの増加がIBS-Dや関節リウマチ36,37,38と関連していることを示唆する報告もある。さらに、P. copriclade Aのメンバーは、FMT後に上位に移植される菌種のひとつであり、P. copriは他の菌種よりもドナー-レシピエント株の共存が少なかったことが報告されている28,29,39。我々は、FMT後にP. copriの相対存在量が有意に増加することを見いだし、ベースライン時にレシピエント自身のP. copriの存在量が低い場合にのみ、ドナー株が生着することを示した。観察されたP. copriの相対存在量の増加は、IBSにおける特定の有益な意味合いよりも、むしろこの株が効果的に腸内をコロニー形成する能力に起因している可能性がある。したがって、ニッチの利用可能性あるいはドナーとレシピエントの適合性は、FMTにおいて考慮すべき重要な因子である。全体として、P. copriの多彩な機能的形質とこれらの知見は、他の適応症に対するFMTの開発、特に特定の食事療法との組み合わせや薬物療法に対するFMTの影響などを考慮する際に役立つ可能性がある。P.コプリがIBS患者にとって有益なのか有害なのかはまだ不明である。それゆえ、その論争の的となる役割は、最終的にFMT治療に取って代わる、定義された微生物コンソーシアムの開発の必要性をさらに浮き彫りにしている。そうすれば、治療の安全性と再現性が向上し、個別化医療として実施しやすくなる。

我々は、微生物叢の機能的ポテンシャルの違いを評価し、FMT群内だけでなく試験群間でも違いを見出した。予想通り、P. copriはFMT後に増加したいくつかの経路に寄与していた。特に、P. copriはBCAA生合成に関連する経路に寄与していることが示された。特に、P. copriがBCAA生合成に関連する経路に寄与していることが示された。注目すべきことに、以前の研究で、P. copri株の選択には、ライフスタイル、すなわち菜食、ベジタリアン、雑食のいずれもが相関していることが判明しており、これは菌株の遺伝的能力や宿主-微生物会合に反映されている可能性がある35。特に雑食性の食事は、BCAAの生合成に関連する遺伝子の有病率の高さと関連していた。さらに、別の研究では、P. copriの血漿中濃度が高い人の血漿中BCAA濃度が高く、この細菌がインスリン抵抗性と関連していることが報告されている40。ここでは、FMT後にBCAA生合成の機能的可能性が増加することを示しただけで、宿主のBCAAレベルが変化したかどうかは評価できなかった。また、代謝経路と臨床パラメータとの関連も検討したところ、IBS症状の重症度スコア以外の臨床因子との関連も見られた。特に、2つのO-抗原ビルディングブロック生合成経路は、BAIおよび/またはBDIの変化と正の相関を示した。グラム陰性菌の外膜にはリポ多糖があり、O-抗原はこの構造の一部である41。したがって、微生物叢におけるO-抗原生合成能が高ければ、IBS患者の不安や抑うつの症状に悪影響を及ぼす可能性がある。しかし、今回の臨床試験はこのような疑問を調査するためにデザインされたものではないため、可能性のある関連性を調査するためにはさらなる研究が必要である。

現在までのところ、本研究はIBS患者に対するFMT治療によってもたらされる微生物叢の変化に関する最も詳細な記述のひとつである。臨床試験のランダム化およびプラセボ対照の性質により、試験群間の差異を適切に比較することができた。さらに、この臨床試験には1年間の追跡期間があったため、縦断的な影響も扱うことができた。われわれは高品質のメタゲノムデータを作成し、信頼性の高い結果を得るために複数の解析ツールを使用した。しかしながら、われわれの研究にも限界があり、特に患者数が比較的少ないため、統計解析の検出力に限界があることを認識している。加えて、治療効果に影響を与える可能性があると仮定されているドナーの食事療法は行っていない32。さらに、使用したメタゲノミクスのシーケンス深度では、P. copriやその他の対象種の遺伝的組成について、より詳細な菌株追跡や解析はできなかった。最後に、メタトランスクリプトミクスやメタボロミクスを追加すれば、FMTにおける糞便微生物叢の変化とIBSとの関連性を理解する上で貴重な知見が得られたであろう。

本研究では、大腸内視鏡検査による1回のFMTが、レシピエントの腸内細菌叢組成とその機能的可能性を長期的に効果的に変化させることが示されたが、これらの変化は臨床転帰とは関連しなかった。今後の研究では、IBSの病態生理と微生物叢の関連を解明するために、ドナーと患者の選択と適合性、FMTのルートや他の治療法または食事療法との併用などのFMTプロトコル、臨床試験に参加する患者数、オミックス技術の広範な利用などに関するいくつかの側面を考慮する必要がある。

方法

臨床試験デザインとドナー

試験の詳細なデザインは以前に報告されている17。簡単に言えば、IBSと診断された49人を無作為臨床試験に組み入れ、FMT群（n=23）とプラセボ群（n=26）に分けた（図6）。健康なドナーからのFMT（ここではFMT群と呼ぶ）または自家移植（ここではプラセボ群と呼ぶ）が、大腸内視鏡で盲腸に投与された。健康な万能ドナーは、以前に推奨されたように、ドナーのスクリーニングのための医学的評価および臨床検査を受けた若い男性であった31。この試験のClinicalTrials.gov登録番号はNCT03561519である。

図6：試験デザイン。

臨床試験では、49人の患者がFMT群（n=23）とプラセボ群（n=26）に無作為に割り付けられた。便サンプルは6時点で採取され、ベースライン時には粘膜生検が行われた。さらに、7人の非IBS対照が粘膜サンプルを提供した。便サンプルは16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンスで配列決定され、4～5時点のサンプルの一部はショットガンメタゲノミクスで配列決定された。52週時点では、FMT群のみがショットガンシーケンスで配列決定された。粘膜生検は16S rRNA遺伝子配列決定でのみ行われた。IBS-SSSはすべての時点で測定された。各時点でIBS-SSSおよび16S rRNA遺伝子配列決定サンプルが得られた患者のうち、反応者と非反応者の数を図に示した。(IBS-SSS = 過敏性腸症候群症状重症度スコア） Biorender.comで作成。

フルサイズ画像

便サンプルはベースライン時、FMTまたはプラセボ投与後4、8、12、26、52週目に採取された。下行結腸の粘膜生検はベースライン時に採取した。比較のため、IBSと診断されていない被験者（非IBS対照、n=7）の粘膜サンプルも採取した。対照者は、ポリープのコントロール（n= 6）、または大腸癌に対する遺伝的感受性（n= 1）のいずれかの理由で大腸内視鏡検査に参加し、内視鏡検査および組織検査で正常粘膜が認められた。

IBS症状スコア（IBS-SSS）は6つの時点すべてで測定した（図6）。原著論文17に記載されているように、患者を反応者と非反応者に分類した。手短に言えば、どの時点でもIBS-SSSがベースライン値と比較して少なくとも50ポイント減少していれば、患者を反応者とみなした（図6）。さらに、主要アウトカムの時点（12週）での応答者の状態を用いて、ベースラインの微生物叢組成が応答者と非応答者で異なるかどうかを評価した。さらに、患者は2つのQOL測定（IBS-QOL、15D）、Beck's Depression Inventory（BDI）、Beck Anxiety Inventory（BAI）を含むその他の質問票を提供した。

倫理

全患者は臨床試験に関する説明を受け、書面によるインフォームド・コンセントを得た。臨床試験はヘルシンキ大学病院の倫理委員会により承認された（登録番号40/13/03/01/2015）。非IBS対照の検体はHUS 29/13/03/01/2014の承認を得て採取した。

サンプル調製

便DNAは、機械的細胞溶解段階としてビーズ叩打を繰り返す既述の方法で抽出した42。ハイスループットDNA精製は、KingFisher™ Flex Purification System, KingFisher with 96 PCR head（Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland）を用いて行った。粘膜DNA抽出には、機械的および化学的な細胞溶解が含まれた43。糞便DNA濃度はQuant-iT™ dsDNA High-Sensitivity Assay Kit（Thermo Fisher Scientific, Eugene, Oregon, USA）で、粘膜DNA濃度はNanoDrop™ 2000 Spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific）で測定した。全サンプルは塩基配列決定のために配送された（Teagasc Next Generation DNA Sequencing Facility、コーク、アイルランド）。

塩基配列決定および塩基配列処理

すべての時点および患者の粘膜および糞便微生物叢プロファイリングは、MiSeq（Illumina、米国カリフォルニア州サンディエゴ）の超可変領域V3-V4の16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングにより行った（患者49人とドナーから合計279の糞便サンプル、および患者49人と非IBS対照7人から合計279の粘膜サンプル）。16S rRNA遺伝子ベースの微生物プロファイリングは、Rパッケージmare44パイプラインを用いて行った。フォワードリードは品質フィルター（truncQ = 2, maxEE = 1）、低存在リード（糞便データでは0.001%未満、粘膜データでは0.01%）、キメラを除去し、リードは180 bp長に切り詰めた。RDPデータベース（RDP training set v16）に対して、USEARCH45（v11）を用いて分類学的アノテーションを行った。10,000リード未満の粘膜サンプルは1つ廃棄した。処理後の平均リード数は、糞便サンプルで41,728（±7875）、粘膜サンプルで31,831（±9722）であった。

さらに、30人の患者とドナーから採取した133の糞便サンプルについて、ショットガンメタゲノムシーケンスを実施した。患者のサブセットは、縦断的サンプルと完全な臨床メタデータが利用可能であることに基づいて選択された。シーケンスライブラリーの調製にはNextera XTライブラリー調製キットを使用し、シーケンシングはNextSeq 550（高出力、300サイクル）で行った。シーケンスはまずFastQCとMultiQCソフトウェアで品質管理された。次に、TRIMMOMATIC46（バージョン0.39）をアダプター配列のトリミングに使用し、「ILLUMINACLIP:NexteraPE-PE.fa:2:30:10:2:True LEADING:3 TRAILING:3 MINLEN:50」のパラメータで配列の品質フィルターを行った。その後、Bowtie247,48(version 2.3.5.1)を用いてヒト染色体データベース(GRCh38)に対してアライメントを行い、samtools49 (1.16.1)を用いてマッピングされていないリードをフィルタリングし、ペアエンドリードをファイルに分割してヒトリードを除去した。処理後の平均リード数は3,748,621（±1,497,298）。分類学的分類には、HumGut53データベースに対してKraken250（バージョン2.1.2）とBracken51,52（バージョン2.7.0）を使用した。機能アノテーションはHUMAnN354（バージョン3.0.1）を用いて行った。

16S rRNA遺伝子アンプリコンデータとショットガンメタゲノミクスデータの両方が、ENAのアクセッション番号PRJEB65418で公開されている。

統計解析

統計解析はRソフトウェア55（バージョン4.3.0）とR-studio56（バージョン2023.06.0）を用いて行った。図はggplot257およびmiaViz58 Rパッケージを用いて作成した。微生物相組成の比較は、相対存在量またはJaccard indexを用いたBray-Curtis非類似度（Rパッケージvegan59を使用）を計算し、主座標分析（PCoA）プロット（Rパッケージmare44の'PCoA'関数またはRパッケージscater60の'plotReduceDim'のいずれかを使用）で可視化した。選択したグループ間の微生物叢組成における統計的有意性を検定するために、パーミュテーショナル分散分析（PERMANOVA）を使用した。Rパッケージvegan59の関数'adonis2'を、相対存在量データ、Bray-Curtis非類似度、および999回の並べ替えで使用した。グループ分散の均質性は、PERMDISP2法とRパッケージvegan59の関数'anova'、'betadisper'で計算した。最も優勢な種は、「Orchestrating Microbiome Analysis with R and Bioconductor」61 のコードを改変して可視化した。豊かさの推定値はRパッケージvegan59で作成した。群間または時点間の統計的差異は、Wilcoxon 符号順位検定（ノンパラメトリックデータ用）を用いて測定した。

16S rRNA遺伝子シーケンス（ファミリーレベルのデータ）およびメタゲノミクスデータ（種レベルのデータおよび機能プロファイル）に対する存在量の差の検定は、Maaslin262RパッケージのMaAsLin2関数を用いて行った。非稀釈化カウントデータには平方根変換と総和スケーリング正規化を用いた。min_abundance」は0.0001、「min_prevalence」は0.1に指定した。縦断的サンプルを使用する場合は、ランダム効果として患者IDを指定した。MaAsLin2は、デフォルトの変換と正規化、微生物叢データと同様のprevalanceとabundanceフィルタリングで、層別化されていないCPM正規化機能プロファイルにも使用された。関数は線形モデルをフィッティングし、Wald検定で有意性を検定し、BH FDR補正p値（q値）として出力した。q値が<0.05と<0.1の結果は、それぞれ微生物叢と機能プロファイルで有意であるとみなされた。

StrainPhlAn63,64を使用して、相対存在量の高い種を選択し、分類学的および機能的アノテーションを行い、菌株の特性解析を行った。まず、MetaPhlAn63（バージョン4.0.2）を用いて分類学的および機能的アノテーションを行った。次に、StrainPhlAn64 (version 4.0.6)を、デフォルトのパラメータ（'-marker_in_n_samples 5', '-sample_with_n_markers 5'、Prevotella copriclade AマーカーSGB1626を除く）で実行した。参照ゲノムとしてPrevotella copriDSM 18205 (GCA_020735445.1、現在はSegatella copriであることが示唆されている)のゲノムアセンブリを用いた。得られた系統樹はMEGAX65,66（バージョン10.2.6）で可視化し、iTol67（バージョン6）で修正した。

われわれは、微生物叢の構成とその機能的可能性を臨床転帰と結びつけることを複数の方法で目指した。細菌の豊富さ、ドナーとの微生物叢の類似性（Bray-Curtis非類似度指数とJaccard指数で測定）、微生物叢の組成とその機能的能力を、反応者と非反応者の間で比較した。さらに、Rパッケージmare44の'CovariateTest'を用いて、IBS-SSSまたはdelta IBS-SSS（ベースラインと比較したIBS-SSSの変化）、BDI、BAI、15D、またはIBS-QOLスコアと関連する細菌属またはファミリーを同定した（共変量の詳細な説明は補足表1にある）。関数はまず、リードカウントをオフセットとして負の二項モデル、線形モデル、一般化最小二乗モデル、線形混合モデルをデータに当てはめる。非独立サンプルには混合モデルを用いた。選択されたモデルは、細菌の分類群と測定されたスコアとの間の有意性を推定する。さらに、MaAsLin2を用いて、臨床パラメータ（デルタIBS-SSS、デルタBAI、デルタBDI、デルタIBS-QOL、デルタ15D、補足表1の説明）の変化を、両研究群で別々に代謝経路と関連づけた。

データの利用可能性

16S rRNA遺伝子アンプリコンデータとショットガンメタゲノミクスデータの両方が、ENAのアクセッション番号PRJEB65418で公開されている。微生物叢解析に使用した臨床サンプルは、臨床材料の配布が制限されているため、他の研究者は入手できない。

コードの利用可能性

バイオインフォマティクス解析および統計に使用したコードは、対応する著者にリクエストすれば入手可能である。

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参考文献のダウンロード

謝辞

本研究はヘルシンキ大学博士課程（A.K.H.）、Sigrid Juselius財団（R.S.の上級研究員助成金）、フィンランド研究評議会（旧フィンランドアカデミー、助成金番号R.S.：323156、J.J.：316338）より助成を受けた。臨床試験に参加してくれた患者に感謝する。CSC - IT Center for Science, Finlandに計算資源を提供していただいた。オープンアクセスはヘルシンキ大学図書館より助成を受けた。

著者情報

著者および所属

  1. ヒトマイクロバイオーム研究プログラム、ヘルシンキ大学医学部、ヘルシンキ、フィンランド
    アンナ・K・ハーティカイネン、ヨナ・ヤランカ、アリース・J・ポンセロ、リーッタ・サトカリ

  2. ヘルシンキ大学医学部、ヘルシンキ、フィンランド
    ペルトゥ・ラフティネン＆ペルトゥ・アルキラ

  3. フィンランド、ラハティ、パイヤット＝ヘーメ中央病院、消化器科
    ペルトゥ・ラフティネン

  4. 米国アリゾナ州ツーソン、アリゾナ大学BIO5研究所およびバイオシステム工学科
    アリーゼ・J・ポンセロ

  5. ヘルシンキ大学病院神経科、HUS、ヘルシンキ、フィンランド
    トゥオマス・マーツァルミ

  6. ヘルシンキ大学臨床神経科学科、HUS、私書箱800、FI-00029、ヘルシンキ、フィンランド
    トゥオマス・マーツァルミ

  7. ティーガス食品研究センター、ムーアパーク、ファーモイ、コーク、アイルランド
    ローラ・フィネガン、フィオナ・クリスピー、ポール・D・コッター

  8. APCマイクロバイオーム、アイルランド、コーク
    ローラ・フィネガン、フィオナ・クリスピー、ポール・D・コッター

  9. ヘルシンキ大学病院消化器科、ヘルシンキ、フィンランド
    Perttu Arkkila

貢献

R.S.、P.A.、P.L.、J.J.が臨床試験のコンセプト立案とデザインを行った。R.S.、P.L.、P.A.、T.M.、J.J.は臨床試験を実施し、サンプルを収集した。P.L.、T.M.、P.A.は患者データを収集した。A.K.H.、J.J.、A.J.P.、R.S.が本研究の検体解析を計画した。A.K.H.、L.F.、F.C.、P.C.がデータを作成した。A.K.H.とA.J.P.はバイオインフォマティクスと統計解析を行った。R.S.とJ.J.は解析を監督した。A.K.H.、J.J.、A.J.P.、R.S.は結果を解釈し、原稿を執筆した。すべての著者が原稿を読み、編集し、修正した。最終原稿は著者全員が読み、承認した。

責任著者

Anna K. Hartikainenまで。

倫理申告

競合利益

著者らは競合する利益はないと宣言している。

追加情報

出版社注：シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

補足情報

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報告書概要

権利と許可

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この記事について

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Hartikainen, A.K., Jalanka, J., Lahtinen, P.et al.糞便微生物叢移植は、過敏性腸症候群患者の症状緩和とは無関係に微生物叢に影響を及ぼす。npj Biofilms Microbiomes 10, 73 (2024). https://doi.org/10.1038/s41522-024-00549-x

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  • 2024年3月25日受領

  • 2024年8月20日受理

  • 2024年8月28日発行

  • DOIhttps://doi.org/10.1038/s41522-024-00549-x

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バイオフィルムとマイクロバイオーム (npj Biofilms Microbiomes)ISSN 2055-5008 (online)

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