高密度熱水マットにおける遠縁の微生物ドメインにまたがる宿主とウイルスの相互作用

2023年4月9日 11:55

オープンアクセス
発行：2023年4月6日
高密度熱水マットにおける遠縁の微生物ドメインにまたがる宿主とウイルスの相互作用

https://www.nature.com/articles/s41564-023-01347-5

ユンハ・ホァン
シモン・ルー
...
ピーター・R・ジルギース
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Nature Microbiology (2023)この記事を引用する
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メトリックス詳細
アブストラクト
自然界に存在する多くの微生物は、代謝的に相互依存的な密な共同体に存在する。我々は、バイオマス密度が高い深海熱水マットにおける微生物-ウイルス相互作用を調べることで、微生物密度とシントロフィーに関連した微生物-ウイルス相互作用の性質と程度を調査しました。メタゲノム解析により、系統的に離れた（ドメインレベルまで）微生物が、マット内の同じウイルスに対してCRISPRベースの免疫をコード化する事例を多数発見した。ウイルスと宿主の相互作用は、微生物のドメインを横断しており、特に嫌気性メタン増殖に従事する微生物など、既知の共栄パートナーとの間で顕著である。これらのパターンは、近接ライゲーションに基づく推論（Hi-C）により裏付けられた。公開されているデータセットを調査したところ、合成栄養生物膜が存在することが知られている多様な生態系において、ドメインを越えて宿主と相互作用するウイルスが追加されていることが判明した。我々は、ウイルス粒子やDNAが一次宿主以外の細胞に侵入することは、人口密度の高い生態系でよく見られる現象であり、合成栄養微生物やCRISPRを介したウイルスに対する回復力の集団間増強に生態進化的な影響を与える可能性があることを提案する。
主な内容
自然界に存在する細菌や古細菌の多くは、集合体やバイオフィルムとして存在している1。しかし、宿主とウイルスの相互作用の多くは、均質な液体培養で研究されており、高密度で基質に縛られた異質なバイオフィルムにおける宿主とウイルスの相互作用の理解には多くのギャップが残っている3。特に、遺伝的に多様で系統的に遠い微生物が近接して共存し、高度に入れ子構造になった代謝を行う複雑な微生物群集における宿主範囲、ウイルスのライフサイクル、拡散様式、宿主-ウイルス共進化に関して、大きな疑問が存在する。
一般に、ウイルスは狭い範囲の宿主にしか感染しないと考えられている。しかし、最近の研究では、自然界には広い宿主範囲のウイルスが存在し、栽培の偏りによって見落とされている可能性が指摘されている4。現在までに、複数の細菌種5、目6、場合によっては門7,8,9に感染するウイルスの報告がある。さらに、ウイルスの宿主範囲は動的な特性であることも示されている10。特に、最近の研究11では、ファージの細胞への吸着と侵入は、溶菌サイクルの完全な完了とは一致しないことが報告されており、ウイルスは、完全な感染サイクルを実行できるより多様な細胞集合と相互作用する可能性があることが示されている。
我々は、系統的に多様な微生物と接触し、細胞外高分子物質（EPS）と空間的不均一性によって宿主とウイルスの分散や生息域が制限されるため、合成栄養代謝を支配するバイオフィルムでは、より広い宿主範囲のウイルスが蔓延するのではないかという仮説を立てている。この仮説に対処するため、我々は深海の熱水微生物マット（熱水噴出孔周辺の偏在する化学栄養生物膜）におけるウイルスゲノムと細菌または古細菌とのあらゆるウイルス相互作用（以下、宿主-ウイルス相互作用と呼ぶ）の特性を調べた。これらのマットは、バクテリアと古細菌の非常に高密度で代謝的に結合した群集からなり12、温度と地球化学の鋭い空間勾配と時間変動が特徴である13。我々は、系統的に離れた微生物（すなわち、異なる系統やドメインに属する分類群）が、マットの中で、同じウイルスに対するCRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）ベースの免疫をコードしていることが多いことを示している。このパターンは、物理的に隣接する熱水プルームサンプルからは検出されず、代謝的に類似したコミュニティーのバイオマスが低いことが特徴です。さらに、これらの微生物ゲノムは、Hi-Cプロキシミティライゲーションシーケンスに基づき、同じウイルスゲノムと共局在を示した。また、公開されているメタゲノムから、合成栄養バイオフィルムが存在することが知られている他の生態系において、細菌および古細菌の分類群との相互作用を示すウイルスを発見した。さらに、ウイルスゲノムの補助代謝遺伝子（AMG）を調べ、選択を受けているウイルスおよび微生物遺伝子を特定することで、これらの宿主-ウイルス相互作用の生態系進化的意味を調べた。最後に、合成栄養宿主とのウイルス多価相互作用の4つのモデルを提案し、特に水平遺伝子伝達、遺伝子の多様化、CRISPRを介したコミュニティ全体の免疫記憶に関して、微生物の進化への影響を議論する。
研究成果
合成栄養的で代謝的に相互依存する微生物マット
Expedition RR2107は、2021年11月11日から12月5日まで、メキシコのグアイマス海盆で行われました。遠隔操作船（ROV）ジェイソンのJ2-1398ダイブで、連続した熱水マットから10個のプッシュコア（直径7.5cm、長さ30cm）が回収されました。このマットは温度も化学的性質も不均一で、地下の温度は21 ℃から53 ℃の範囲にあった（図1a、bおよび補足表1a）。各プッシュコアサンプルの表層マットと表層堆積物から抽出したDNAをメタゲノム配列決定のテンプレートとして使用し、18億個の150bpリードペアを得た（補足表1cの配列決定統計参照）。リードカバレッジ、k-mer頻度、および/または近接ライゲーションデータ（Methods）に基づくゲノムビニングを用いて、マット全体から中～高品質の遺伝的に定義された代表的な微生物メタゲノム集合ゲノム（rep_mMAGs）303を回収した（Supplementary Table 2）．10サンプルのうち、8サンプルは、すべてベギタリス科に属するガンマプロテオバクテリアの遺伝的に定義された（97%の平均塩基同一性（ANI）、種レベル）5集団で占められており（図1c）、硝酸結合硫黄酸化のゲノム容量を有していた（補足表3）。他の2つのサンプル（M2およびM7）は、より高い種の均等性（シャノンの多様性指数、Extended Data Fig.1a）を示した。半数以上（n = 153）の集団が1つのサンプルでユニークに検出され、3つのrep_mMAG（Gammaproteobacteria_19_1, Campylobacteria_146_1, Acidimicrobiia_30_1）のみが10サンプルすべてで検出されました。マットの形態的・環境的なパッチ性が高いことが明らかであるにもかかわらず（補足表1）、マットの微生物群集組成は、豊富な硫黄酸化細菌（SOB）集団の組成のシフトによって、空間的に整理された2組にグループ化することができ（拡張データ図1b）、物理的近さがおそらく群集形成に大きな役割を果たすことを示唆した。環境条件（例えば、温度や硫化水素など）のばらつきが大きいことが、希少な集団のサンプル固有のばらつきを説明する可能性があり、これらの生物が代謝することができる他の地球化学種（例えば、メタンやアンモニア）を測定することでさらに調べることができます。既述のように14、これらの微生物マットは、地熱由来の還元性硫黄、窒素、炭化水素化合物に支えられている化学栄養細菌と古細菌によって支配されており、rep_mAG 303個のうち223個、192個、40個がそれぞれ硫黄、窒素、メタン代謝に関わる少なくとも一つの遺伝子をコードしていた（補足表2）。これらの熱水堆積物における微生物代謝は相互依存性が高いと考えられており15、これまでの研究では、嫌気性メタン酸化を硫酸還元に結びつける嫌気性メタン酸化細菌（ANME）古細菌と硫酸還元細菌（SRB）16、およびSRBとSOB17間の硫黄ベースの共栄の仮説の証拠が発見されている。特に、これらのrep_mAGの76%は、ヒドロゲナーゼ、c型シトクロム、PilAのいずれかをコードしており、基質を介した、あるいは直接の種間電子伝達の可能性が広くあることを示している（補足表2）。
図1：高度に不均質でありながら連続した深海熱水マット。
a, サンプリングされた微生物マットの視覚的概略図。サンプリング位置は、サンプリング中に観察された3つの主要な色（オレンジ、黄色、白）に基づいて図解されている。距離と形状はおおよそのもので、ROVジェイソンの潜水中に撮影された高解像度のビデオと写真を用いて再構築された。プッシュコアの位置は、その場の温度に基づいて色分けされています。b, サンプリングされたマットの中央部（aの破線枠で囲まれた部分）の上面図。 c, 各サンプルで最も豊富な上位10個のrep_mMAG（種レベル、97% ANIカットオフ）の相対存在量。 d, 各サンプルで高品質または完全rep_vMAG47個の正規化存在量（95% ANIカットオフ）。最も多い上位5つのrep_vMAGを色分けしている。
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完全体に近いウイルスゲノムの特性評価
10個のメタゲノムにまたがって、高信頼性の完全性推定法を用いたCheckV18に従って、完全（n = 27）または高品質（n = 20）である47個の代表的なウイルスMAG（rep_vMAG、95% ANIで脱複製）を回収した（詳細は方法、rep_vMAGの統計については補足表4参照）。これらのrep_vMAGは、12kbpから437kbpまでと、大きさに大きなばらつきがあった。CheckV18を用いてプロウイルスとして検出されたのは、2つのrep_vMAG（vMAG_46とvMAG_25）のみであった。rep_vMAGの存在量プロファイルは、rep_mMAGのそれよりも不均一で、近接ベースのクラスタリングはあまり見られなかった（Extended Data Fig. 1d）。微生物集団と同様に、rep_vMAGの半数以上（n = 26）は1つのサンプルで検出され（生息域が狭いことを示唆）、10サンプルすべてで検出されたrep_vMAGは1つ（rep_vMAG_22）だけだった。1つのサンプル（M3）では、最近のウイルス感染と一致する溶解性ウイルス集団（rep_vMAG_1）が7倍以上存在した（図1d）。ウイルスの多様性は、微生物種の多様性と高い相関を示したが（ピアソンの相関係数：0.83、n = 10、P = 0.00293; 拡張データ図1c）、微生物とウイルスの組成の間に統計的に有意な共対応19（sCoCA、n = 10、P > 0.05）は確認されていない。本研究で回収されたrep_vMAGは、参照ウイルスゲノムが占める遺伝的多様性空間に対して、非常に高い分類学的および遺伝子含有量の多様性を示した（Extended Data Fig.2）。参照ウイルスゲノムと「属」レベル20でクラスタリングできたrep_vMAGは4つだけで、2つの（以前に指定された）Podoviridae、1つのMyoviridae、1つのSiphoviridaeに分類される（Supplementary Table 4）。特に、7つのrep_vMAGからなる分類学的クラスターはフラボバクテリウムファージと遠縁にあり、rep_vMAGのうち3つは、特徴付けられたどの参照ウイルス配列とも類似遺伝子を共有しない新規属レベルのクラスターを形成した。大多数（49種中29種）は、参照配列とも互いに遺伝子含有量の高い類似性を共有しなかった。多くのウイルスゲノムには、Rubiscoラージドメイン含有タンパク質、アルドラーゼIIドメイン含有タンパク質、ニトロレダクターゼドメイン含有タンパク質、リン酸飢餓誘導性タンパク質PhoH、テリリウム耐性タンパク質TerDなどの新規補助代謝遺伝子（AMGs）が含まれていた（拡張データ図3a、b）。また、RelE/StbEファミリー毒素、HigAファミリー解毒剤、推定感染阻止タンパク質などの防御機構をコードするウイルスゲノムもあり、宿主とウイルスの軍拡競争の証拠も検出された（Extended Data Fig.3c）。注釈付きAMGおよびその他の注目すべきウイルス遺伝子の完全なリストは、補足表5に記載されています。
微生物CRISPR-Cas遺伝子座
本研究で回収したrep_mMAGは、多様で豊富なCRISPR-Casシステムを備えていた。303個のrep_mAGのうち、119個で317個のcas遺伝子座を検出した（補足表6）。集団ゲノムに含まれるcas遺伝子座の数は1〜16個で、ANME-1 rep_mMAG（Syntropharchaeia_272_1）では、多様なサブタイプ（クラス1サブタイプIB 6、クラス1サブタイプIIIA 3、クラス1サブタイプIIIC 2、クラス1タイプI 1、クラス1タイプ III 2、未分類クラスタ 2）に属する16個のcas遺伝子座がコードされていました。さらに、65の遺伝的に定義された集団において、116のユニークなCRISPRリピートを同定した（Extended Data Fig.4および補足表7）。これらのCRISPRリピートは、配列の類似性（95%以上のヌクレオチド同一性（ID））により102のクラスターに分類されました。検出されたCRISPRのほとんど（91％）は集団に特異的であり、CRISPRをコードする集団の80％は、最大で2つのユニークなCRISPRと関連していた。しかし、系統的に離れた集団間で共有される同一またはそれに近い（ID95%以上）CRISPRリピートも観察された。これらのCRISPR遺伝子座は水平移動した可能性があるが21、その反復性と発散性に起因するビニングエラーの可能性も排除できない。このような分類群間で検出されたCRISPRリピートは、リピートに特定の宿主分類群を割り当てることが曖昧であるため、スペーサーベースの宿主-ウイルスマッチングから除外された。さらに、6個の異なるCRISPRリピートをコードする集団（Gammaproteobacteria_17_1, Desulfobacteria_193_1, Desulfobacteria_189_1）が確認され、おそらくCRISPR遺伝子座の集団内多様性を表していると考えられた。ユニークなCRISPRの数とrep_mMAGのサイズ、相対的な存在量、生息域の間に相関は見られなかった。
宿主とウイルスの歴史的相互作用を再構築する
集団特異的なCRISPRリピートを用いて、10種類のメタゲノムから278,929個のユニークなスペーサーを抽出しました。rep_mMAGとrep_vMAGのスペーサー間（スペーサーの鋳型となるウイルスゲノムの領域で、その後CRISPR-Casシステムによって標的とされる）の一致は、特定のウイルスに対する宿主適応免疫、ひいては過去の宿主-ウイルス相互作用を推測するために用いられた。その結果、rep_vMAG28個とrep_mMAG29個の間に、rep_mMAG特異的CRISPR39個と22,466個のスペーサーとプロトスペーサーのマッチから、96個の相互作用が確認されました。プロトスペーサーのごく一部（0.01%, 25スペーサー）は、最大で2つのrep_vMAGの非特異的な領域に見出されました。CRISPRの大部分（66%）がウイルスの標的と高確率で一致しなかったことから、メタゲノムシーケンスで検出されるよりもウイルス集団に高い多様性が存在する可能性があり、この環境ではウイルス集団のターンアラウンドが早いことが示唆された。図2aでは、少なくとも2つのプロトスペーサーとスペーサーが一致する宿主-ウイルスペアについて、CRISPRスペーサーに基づく宿主-ウイルス相互作用を示した（すべての相互作用は拡張データ図5aで可視化し、補足表8でリストアップしている）。このことは、rep_vMAG_1が他のrep_vMAGよりも桁違いに高い正規化アバンダンスを持っていることと一致する（図1d）。また、同じrep_vMAGとCRISPRスペーサーが一致する既知および仮説の合成パートナー（ANME-SRB、SOB-SRB）のパターンが顕著に観察された。図2aに示した宿主とウイルスの一致は、独自のCRISPRを用いたもので、CRISPRアレイの横持ちとは異なり、おそらく歴史的な相互作用に起因する免疫であることがわかります。さらに、異なる微生物集団からのCRISPRスペーサーのマッチは、ウイルスコンティグ全体に分布し、特定のゲノム領域をターゲットとする優先順位は見られませんでした（例えば、図2b...）。興味深いことに、rep_vMAGのサイズとCRISPRスペーサーを用いて関連付けることができる宿主の数の間に統計的に有意な正の相関（ピアソンの両側相関係数 = 0.8, 調整後P < 1 × 10-6, n = 36; 拡張データ図6a）を見出したことから、分類学的に多様な微生物によるCRISPRターゲティングが、より大きなウイルスでより一般的であるかもしれないということが示唆されました。
図2: CRISPRスペーサーとプロトスペーサーの一致に基づく過去の宿主-ウイルス相互作用の刈り込み。
a, rep_mMAGとrep_vMAG間のスペーサー-プロトスペーサー間の一致で、少なくとも2つの異なる一致が見つかったものをエッジで表している。複数のrep_mMAGで見つかったCRISPRリピートは、このネットワークから除外した。エッジの幅は、異なるマッチの数に対応する。宿主ノードの形と色は、それぞれ宿主門と推定代謝を表す。ウイルスノードのサイズは対応するrep_vMAGの長さに比例する。 b, 異なる系統とドメインに属する少なくとも8つの宿主に特異的なCRISPRに関連するスペーサーを持つウイルスコンティグに沿ったプロトスペーサーの一致を視覚化した。
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Hi-Cプロキシミティライゲーションによる宿主-ウイルスゲノムの連結の解明
CRISPRのスペーサーとプロトスペーサーの一致は、宿主とウイルスの過去の相互作用に関する信頼性の高い情報を提供するが、CRISPRをコードしない宿主もおり22、CRISPRアレイはその反復性のためショットガンアセンブリではしばしばアセンブリできない。宿主とウイルスのゲノムの連結は、近接ライゲーション法23を用いてin situでプローブすることができる。我々は、細胞内ウイルスゲノムと宿主ゲノム間の接触を含む、推定染色体接触に関する情報（補足図1a-jの各サンプルの接触マトリックス参照）をコードする10個のHi-Cメタゲノムライブラリー（合計15億Hi-C 150bpリードペア；補足表9のサンプルごとのマッピング率などの関連統計情報）を構築し配列決定しました。ビニングされたコンティグ（生ノイズ = 0.021 ± 0.016）およびビニングされたコンティグのオーダーレベル分類（リラックスノイズ = 0.016 ± 0.011; ノイズ比の計算については方法を参照）を用いてHi-Cコンタクトのノイズ対シグナル比を推定しました。その結果、ウイルスと宿主のコンティグ間に5,292個の連結が検出され、31の異なる系統に属する36個のrep_vMAGと241個のrep_mMAG間の859個の連結（うち24％は複数サンプルで再現）に集約でき、宿主とウイルス間の相互作用の可能性が高い入れ子構造を持つネットワークを明らかにした（図3；すべての相互作用を補足表10に記載する）。正規化24後、宿主とウイルスのコンティグ間のユニークな連結の数（図3のエッジの幅で可視化）と宿主とウイルスのペア間の連結の最大強度（ウイルスと微生物のコンティグのペア間の正規化接触の最大数；エッジの暗さで可視化）の両方で、いくつかの宿主-ウイルスゲノム相互作用がより顕著になることが観察されました。これらの宿主-ウイルス間のリンクは、宿主-ウイルス間のin situ感染の存在を示すシグナルと解釈することができ、Hi-Cリードは特定の宿主細胞内で活発に複製するウイルスゲノムを捉えることができます。場合によっては、サンプルM3のrep_vMAG_1とGammaproteobacteria_15_1の間の強い近接ライゲーションシグナルを、vMAGとmMAGのカバー率の増加（拡張データ図7a）およびこのサンプルのrep_vMAG相対存在量（図1d）の桁の高さに合わせることができます。しかし、他のほとんどの宿主とウイルスのペアでは、架橋時の感染イベントのHi-Cキャプチャが比較的まれであるため、有意なHi-C結合のこれらの測定は、必ずしも集団全体の感染率の高さと相関しないことに注意することが重要である。ここでは、これらのシグナルを用いて、ウイルスの潜在的な一次宿主を同定し、その多価の相互作用を分解した。例えば、ウイルスと微生物の存在量がサンプル間で大きく異なるにもかかわらず、ウイルスが複数の宿主と相互作用し、一部の宿主との間でより大きな相互作用があるサンプル間で一貫したパターンを観察しました（拡張データ図7b）。このことは、CRISPRに基づく免疫25の集団内および／または株レベルの不均一性（宿主集団の異なるサブセット／株が異なるウイルスに対するCRISPR免疫を持っている場合）を反映していると考えられる。Hi-Cリンクに基づく宿主-ウイルス相互作用ネットワークは、CRISPRベースのアプローチで観察されたものと一致しており、ウイルスは相互依存的な代謝を特徴とする系統的に離れた生物と共局在していることがわかります。メタゲノムに含まれるHi-Cリンクは固有のノイズを含んでいるため、推定された宿主-ウイルス間のリンクの一部が偽陽性である可能性を否定することはできません。しかし、CRISPRと近接ライゲーションデータの間で一貫した結果が得られたことから、この熱水マットでは、ウイルスと微生物の相互作用ネットワークが、通常観察されたり予想されたりするよりも、より入れ子状に存在することが示唆された。CRISPRデータで観察されたパターンと同様に、より大きなrep_vMAG（ウイルスノードのサイズ）が、系統的に多様なrep_mMAGと、より多くの（より多くの）エッジと有意な（より太く濃いエッジ）連結を示すパターンを観察した（拡張データ図6）。しかし、Hi-Cリードシグナルにはコンティグ長やカバレッジに偏りがあり、正規化しても完全にコントロールすることはできない24; したがって、この観察は、コンティグ長に偏りの少ない補完的手法（例えば、単一細胞のウイルスタギング26）を用いてさらに検討する必要がある。興味深いことに、rep_vMAGの塩基多様性、平均存在量、生息域と、CRISPRベースとHi-Cベースの方法で推定された宿主範囲との間に相関は見られなかった。
図3：Hi-Cプロキシミティライゲーションによるin situ宿主-ウイルス相互作用ネットワークの情報提供。
rep_mMAGとrep_vMAGを正規化Hi-Cコンタクトに基づきネットワークで可視化した。rep_mMAGは、分類学的分類を表す色（グレー：その他）で、正方形のノードで円状に配置されている。rep_vMAGは、中心に沿って黒い円形のノードでrep_vMAGサイズが大きくなるように縦に配置されている。rep_vMAG IDは赤いラベル（例えば、1 は rep_vMAG_1に相当）で示される。エッジの太さはコンティグ間リンクの数を表し、エッジの暗さは宿主-ウイルスペア内の任意の2つのコンティグ間のHi-Cコンタクトの最大正規化強度と相関している。CRISPR-spacerマッチを使用して以前に検出された宿主-ウイルスペアは赤色で表示されています。
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熱水プルーム水試料との比較
我々は、微生物マットの密度と空間構造が、CRISPRベースの免疫ネットワークの入れ子パターンに寄与していると仮定した。この関係を調べるために、熱水プルーム（マットから約45km離れた場所）から採取した9つのサンプルと、マットの上にある水から採取した1つのサンプルからなる、熱水の影響を受けた水サンプル（以下、熱水（HW）サンプルと呼ぶ）の10メタゲノムに対して同じCRISPRベースのホスト-ウイルスネットワーク解析を実施しました。HWメタゲノムは、マットメタゲノムと配列深度、アセンブリサイズともに類似していた（補足表1c；Welchのt検定、両側、n = 20、P > 0.05）。10個のHWアセンブリに168個の中・高品質rep_mMAG（詳細については補足表11を参照）をビニングし、マットアセンブリから回収したrep_mMAGとは分類学的に異なるが、この2つのデータセットには、同様の代謝能力（補足表12および拡張データ図8a）および同様のレベルの種の均一性（拡張データ図8b、ウェルチのt-検定、両対立、n = 20, P > 0.05) を示した。HWサンプルの微生物群集は、HWサンプル間の物理的距離が大きいにもかかわらず、マットサンプルよりも均質であった（拡張データ図8c）。マット試料と同様に、HW試料は2種類の硫黄酸化性ガンマプロテオバクテリア（HW_Gammaproteobacteria_164_1、HW_Gammaproteobacteria_163_1；Extended Data Fig.9a）によって支配されていた。興味深いことに、HW集合体では、Mat集合体と比較して、CRISPR遺伝子座の検出頻度が一桁少ないことが確認された（補足表13、Welchのt検定、両側、n = 20、P = 0.001）。さらに、HW集合体のCRISPRのうち、中〜高品質のMAGと関連付けることができたのは12個だけであり（補足表14）、SOB（HW_Gammaproteobacterira_162_1）とウイルスの間の1つだけ確信できる相互作用を持つCRISPRベースの免疫ネットワーク（拡張データ図5bおよび補足表15）ははるかに疎で堅牢性に欠けるという結果になった。プルームとマットのサンプルには、地理的な近さ、コミュニティの代謝能力、シーケンスの深さなどの類似点があり、比較の根拠と機会を与えています。プルームサンプルにおけるCRISPRの存在量が少ないことから、プルームコミュニティはCRISPRに基づく適応免疫への依存度が低いことがわかります。CRISPRに基づく免疫の伝達性と特異性から、この観察は生態学的に重要であり、このような免疫学的記憶が異なる環境においてどのように選択されるかという疑問が生じる。この比較は、マットとプルームにおける宿主-ウイルス相互作用の性質と範囲における重要な違いを明らかにする一方で、さらなる解釈のために考慮すべきいくつかの注意点がある。第一に、プルームのCRISPRベースの免疫ネットワークが疎であることは、微生物に感染したウイルスや0.022 μm以上の粒子に付着したウイルスの一部しか回収されておらず（補足表16および拡張データ図9b）、回収されたウイルスのコンティグの存在量や多様性が低いことに一因があると考えられる。第二に、CRISPRに基づく免疫の違いは、必ずしもin situの宿主とウイルスの相互作用の基礎となるネットワークのパターンを反映しているわけではないことである。
微生物ドメイン横断型ウイルスの世界分布
系統的な距離が大きい宿主とウイルスの相互作用の特徴を明らかにするために、古細菌と細菌のCRISPR遺伝子座に見られるスペーサーに対応するウイルスを公開データベースから探しました。その結果、5カ所から採取した25サンプルで26個のウイルスが検出されました（表1）。これらのウイルスは、バイオフィルムの形成が確認され（例えば、嫌気性消化槽汚泥27、尾鉱池の石油化学廃水28、CO2が豊富な地下帯水層29）、共起ネットワーク30、メタトラスクリプトミクス31、リピドミクス29など様々な手法を用いて代謝の相互依存性が強調されている生態系で見つかりました。さらに、一致したCRISPRスペーサーの多くは、Methanosarcinales32、Methanoculleus33、Smithella34、Thermotogales35などの既知または仮説の共栄養分類群に見られました（補足表17）。前述のように、CRISPRを用いた宿主-ウイルス相互作用の推論は、豊富なCRISPR遺伝子座を組み立て、ビン詰めできる環境に限られる。したがって、このような系統的距離の大きな宿主-ウイルス相互作用は、この方法で検出できるよりも、自然界ではより一般的で、より広く存在している可能性があります。例えば、ハワイ海洋時系列やバミューダ大西洋時系列36の貧栄養水サンプルや、サンフランシスコ沖で採取された深海堆積物37のような、微生物マットがなく、微生物密度が低い（そしておそらく代謝合成が少ない）大規模メタゲノムデータセットのMAGでは、ビニングした高信頼度のCRISPR座位はほとんど検出できなかった（補表13）。
表1 細菌と古細菌のCRISPRスペーサーに一致するウイルスを含むメタゲノム（一般公開されているもの
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微生物マット遺伝子の選択と多様化
宿主-ウイルス相互作用ネットワークの高度な入れ子構造と、マットサンプル間のウイルス群集の高い不均一性に基づいて、ウイルスと微生物の両方で選択を受けている遺伝子の多くは、それぞれ宿主範囲とウイルス防御に関連しているだろうと仮定した。ウイルスと微生物の遺伝子について、pN/pS比（非同義多型と同義多型の比）を計算し、その機能の予測を試みた。その結果、18個のウイルス遺伝子が多様化選択を受けたと考えられる（pN/pS > 2.5）ことが判明したが、そのほとんどは機能をアノテーションすることができなかった。興味深いことに、多様化選択を受けた4つの注釈付き遺伝子のうち3つは、DNA-directed RNA polymerase (RNAP) beta and beta prime (rep_vMAG_21), DNA ligase (rep_vMAG_31) and Superfamily II DNA/RNA helicase (rep_vMAG_6) などDNAおよびRNA代謝に関わっている遺伝子であることがわかった。また、シグナル伝達や細胞接着に関与すると考えられるLamGドメイン含有タンパク質（vMAG_4）が多様化選択を受けていることが検出された。rep_vMAG_21のRNAPをコードする遺伝子（RNAP1；拡張データ図10a）は、pN/pS比が4.9と最も高く、8個の非同義変異がタンパク質中に散らばっていた（拡張データ図10b）。注目すべきは、rep_vMAG_21がβサブユニット（RNAP2）をコードする第二のRNAP遺伝子断片（拡張データ図10a）を備えていることで、RNAP1とは相同性が悪く、選択を受けていないようで、RNAP1に対する精製選択が緩和されたことに貢献していると思われます。RNAP1は、これまでに特徴付けられたRNAP配列から大きく分岐しており、Caudoviricetes multimeric RNAP clade38の基部に根ざしていた（Extended Data Fig. 10c）。RNAP1に対する多様化選択のこの例は、これらのウイルスが、細胞生物において通常浄化選択を受けるハウスキーピングタンパク質の進化を促進する重要な役割を担っている可能性を示唆している。多様化選択を受けた微生物遺伝子（pN/pS > 2）には、II型毒素-抗毒素系RelE/ParE毒素、HindIIIファミリーII型制限酵素、III-B型CRISPRモジュールRAMPタンパク質Cmr1、さらに最近特徴付けられたPARISおよびSeptu抗ファージアーセナル39に関わる遺伝子などの様々な防御システムに関わる生成物をコードする遺伝子が含まれていた。
考察
本研究では、微生物の密度と代謝的相互依存性が、微生物マットにおける宿主とウイルスの相互作用をどのように形成するかを調べた。その結果、高い生物量密度、多様性、代謝協力を特徴とする微生物マットやバイオフィルムにおいて、ウイルスが系統発生的に遠い微生物と相互作用する可能性があるという有力な証拠が得られた。私たちは、この予想外の観察結果をよりよく理解し、説明するために、4つの非相反するモデルを提案します（図4）。1つ目のモデルでは、ウイルスゲノムが、ウイルスが感染できない細胞（つまり「非一次宿主」）に侵入する可能性があることを提唱しています。第二のモデルは、ウイルス粒子および/またはゲノムが、異なるドメインに属するものであっても、合成栄養微生物間または微生物間で接触的に移動する可能性を提示するものである。大きな系統的距離を越えた共役的な移動が証明されており40、自然界ではより一般的であると仮定されており41、今回のデータはこの推測を裏付けるものである。いずれの場合も、ウイルスゲノムの非一次宿主細胞への導入は、CRISPRベースの免疫応答を引き起こし、スペーサーイベントの獲得につながるであろう42。このようなメカニズムにより、集団全体でファージに対する免疫学的な記憶と応答が増加する可能性があり、生物の体力がファージに対する合成相手の抵抗力と密接に関連している場合に、特に選択される可能性がある。このことは、集団内の汎免疫性43の概念を拡張し、集団間や大きな系統的距離を超えた共有免疫を含む可能性がある。特に、微生物間の代謝的共生と「防御的共生」44の間の未解明な関連性を浮き彫りにしている。3つ目と4つ目のモデルでは、微生物マットのような高密度な生態系が、ウイルスの宿主交代や宿主範囲の拡大のホットスポットである可能性を提唱している。しかし、このようなファージの宿主交代や宿主域の拡大は、ビリオンの産生など実験的に確認される必要がある。
図4：微生物密度が高く、代謝の相互依存性が高い生態系における宿主-ウイルス相互作用の4つのモデル案。
赤と緑のセルは、系統的に遠く、代謝的に独立した宿主を表す（例えば、ANME-SRB）。青の網掛けは、ウイルスと細胞外DNAの拡散を制限するEPSマトリックスを表しています。最初のモデルでは、「プロミスキャス」ウイルスが吸着して非主要宿主細胞（緑色）に侵入し、CRISPRスペーサーの獲得イベントが発生する可能性を示しています。あるいは、EPSによる分散可能性が限られているため、一次宿主の溶解イベント後にウイルス粒子とウイルスDNAの局所密度が増加する可能性もあります（赤）。その結果、非一次宿主細胞がウイルスDNAを自然に取り込む可能性が高くなり、スペーサー増加現象が起こる可能性がある。2つ目のモデルでは、CRISPRアレイとウイルスDNAの接触による移動の可能性を示しています。この場合も、非一次宿主細胞（緑色）がCRISPRスペーサーを獲得することになります。どちらのモデルでも、この結果、CRISPRを介したコミュニティ全体の免疫記憶と回復力が増強される。3つ目のモデルでは、ウイルスに対する宿主の進化に伴い、T = 0の時点で一次宿主（赤）から最も近い共栄パートナー（緑）へと、時間の経過とともにウイルス宿主が交代する可能性を示しています。最後のモデルでは、宿主の範囲が広くなり、両方の宿主でウイルス感染が成功する可能性を考えています。
フルサイズ画像
このようなウイルスと非一次宿主との相互作用は、生態学的・進化学的に広範な意味を持つが、これらに限定されない： (1)ドメインや系統を超えた水平的な遺伝子移動の仲介、(2)高い微生物密度とシントロフィーを特徴とする生態系における適応免疫の選択的優位性の向上、(3)防御や宿主範囲の拡大に関わる微生物とウイルスの遺伝子がそれぞれ多様化する。今回の発見は、感染以外の相互作用もCRISPRスペーサーの獲得につながる可能性があるため、CRISPRに基づく手法のみでウイルスの宿主への感染性を推論することに注意を促すものです。また、CRISPRスペーサーの情報は、感染以外の宿主とウイルスの相互作用、例えば、系統的な距離の大きな水平遺伝子伝達ネットワークの解明や、コミュニティ全体の協調免疫の特徴付けに利用できる可能性があることも明らかになった。さらに、このような入れ子構造の「免疫ネットワーク」は、新規の微生物-微生物相互作用（例えば、シントロフィー）に関する仮説を生み出すのに利用できることを提案する。基本的に、宿主とウイルスの相互作用のこれらの拡張モデルは、高密度生態系における共存、競争、協力の基本的なメカニズムを解明する上で考慮すべき重要な側面を示している。
研究方法
熱水マットサンプルの収集とメタゲノムおよびHi-Cライブラリのシーケンス
微生物マットサンプルは、R/V Roger Revelleで南グアイマス盆地への調査遠征（RR2107）において、2021年11月28日のダイビングJ2-1398で遠隔操作車ジェイソンを使用して収集されました。2021年7月21日にメキシコ国立統計地理研究所から、フィールドワーク先でのサンプル採取と科学活動に関する海洋科学研究許可証（Autorizacion EG0072021）が発行されました。座標27.00647191°N、111.40935798°W、水深2,005.3mで、幅約10mの微生物マットを横断して10個のプッシュコアサンプルを採取しました（図1a、b）。サンプリングした微生物マットは、Beggiatoaマットに特徴的な白、黄色、オレンジのパッチ状の明確な色調によって視覚的に区別することができた13。合計10個のプッシュコア（直径7.5cm）が、微生物マットの中心から60-70cm離れた場所に挿入された（海底から25cmの位置）。堆積物を採取した直後に、ROVジェイソンに搭載されたサンプリングワンドをプッシュコア痕に隣接する堆積物に挿入し、海底下7cmの温度を調査しました。回収後、プッシュコアは船内の実験室で室温で直ちに処理された。主に微生物マットで構成される最上層は、滅菌金属スプーンを用いて10mlクライオバイアルにサブサンプリングし、液体窒素で直ちに瞬間冷凍し、さらなる処理まで-80℃で保存した。バルクDNA抽出は、ZymoBIOMICS DNA Miniprep kit (cD4300; Zymo Research)を用いて、製造者の説明書に従って実施した。Phase Genomics社のProxiMetaサービスを用いて、各サンプルについてHi-Cライブラリおよびショットガンライブラリを作成した。Hi-Cライブラリーは制限酵素Sau3AIとMluCI45を使用して作成した。Hi-Cおよびショットガンライブラリーは、Illumina NovaSeq S4システムのシングルレーンで配列決定した（ペアエンド、150 bp）。
熱水マットサンプルの地球化学的分析
プッシュコア内の微生物マットと堆積物をサンプリングする前に、堆積物の上にある海水1mlを5％酢酸亜鉛溶液1mlに添加した。堆積物の間隙水地球化学分析のために、各堆積物プッシュコアから上部0-2cm深さの区間を、その上の微生物マットを除去した直後にサブサンプリングした。酸素に敏感な溶質の酸化を最小限に抑えるため、堆積物上にアルゴンを一定に流しながら、ステンレス製スプーンでアルゴン洗浄した50mlプラスチック遠心分離管に堆積物をサンプリングした。間隙水と固相を分離するため、3,400 × g で 10 分間遠心分離した。間隙水1 mlを5%酢酸亜鉛溶液1 mlに加え、将来実験室で溶存硫化物を分析するために直ちに-20 °Cで凍結した。残りの海水と間隙水2mlを2mlのクライオバイアルに移し、将来の溶存硫酸濃度分析のために-20℃で凍結した。保存海水と間隙水は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校のTreude研究グループにより、採取から1年以内に処理された。溶存硫化物濃度を測定するために、海水と間隙水は以前に発表された方法46に従って分析された。硫化物濃度は、島津製作所のUV分光光度計（UV-1800）を用いて測定した。酢酸亜鉛で保存されていない海水と間隙水は、イオンクロマトグラフ（Metrohm 761）47を使用して、硫酸塩濃度を分析した。
水熱の影響を受けた水のサンプル採取とメタゲノム配列決定
8つのプルーム水（PW1-PW8）サンプルは、マットサンプルと同じ調査遠征中に、2021年11月17日から18日の間に、24個の10l容量のニスキン瓶を取り付けた伝導度-温度-深度（CTD）-ロゼットシステム（シーバード）を使用して事前に特定した熱水噴出源（27.40921631° N, 111.38910334° W, water depth 1,810 m）近傍で採取した。PW10とマット上層水のサンプルは、熱水活動源付近（2021年11月19日）とサンプリングした熱水マットの上方（2021年11月29日）で、それぞれROVジェイソン上の5l容量のニスキンボトルを使用して採取しました。深度と座標を含む詳細なサンプル情報は、補足表10に記載されています。CTD回収後、ニスキンボトルは事前に洗浄した（1×10％HCl洗浄、2×ミリQ洗浄、1×サンプル水洗浄）キュービテーナーに空けられ、ろ過まで4℃で保管された。濾過は船上でペリスタルティックポンプ（SN 2021291435、ProMinent）を用いて10 l h-1の速度で行われた。130 µmと15 µmのインラインプレフィルター（8991T31、McMaster-Carr）を使用した後、0.22 µmのPES膜Sterivexフィルター（SVGP01050m、MilliporeSigma）で最終ろ過し、その後-80℃で保存した。サンプル間では、10% HCl、Milli-Q、サンプル水フラッシュを使用して、チューブとプレフィルターを洗浄した。DNeasy PowerWaterキット（14900-100-N、Qiagen）を用いてSterivexフィルターの1/4からゲノムDNAを抽出し、ハーバード大学のBauer Core FacilityでIllumina NovaSeq S4システム（ペアエンド、150 bp）で配列決定しました。
宿主ゲノムのビニング、アノテーション、分類学的分類
ショットガンリードをBBduk (https://sourceforge.net/projects/bbmap/) とsickle (https://github.com/najoshi/sickle) を用いて品質フィルターし、metaSPAdes v3.15 (ref. 48) を用いてアセンブルした。細菌および古細菌のMAGは、DAS Tool52を用いて複数のビニングツール（maxbin2 v2.2.7 (ref. 49), metabat2 v2.15 (ref. 50), CONCOCT v1.1.0 (ref. 51), ABAWACA v1 (https://github.com/CK7/abawaca) and ProxiMeta Hi-C deconvolution45）からの結果を統合してビニングしました。MAG の品質は CheckM v1.1.3 (ref. 53) を用いて評価し、中～高品質（完全性 70%以上、汚染 10%未満）の MAG のみをその後の解析に使用した。中高品質のMAGは、dRep v3.0.1 (参考文献54)を用いて97%ANIで複製解除し、代表MAG (rep_mMAG)とした。rep_mMAGはGTDB-Tk v1.7.0 (参考文献55)で分類学的に分類した。遺伝子は Prodigal v2.6.3 (ref. 56) を用いて予測し、Diamond v2.0.7.145 (ref. 57) を用いて UniRef100 データベース58に対して e-value cut-off 1 × 10-5 でアライメントすることで注釈を付けた。さらに、METABOLIC v4（文献59）およびDefenseFinder v1（文献60）を用いて、それぞれ代謝および抗ウイルス遺伝子の候補を同定した。
ウイルス足場予測、ウイルスゲノムのビニングとアノテーション
VirSorter2（参考文献61）とVIBRANT v1.2.1（参考文献62）を用いて、長さ1kb以上のアセンブルしたスキャフォールドからウイルスカフォールドを予測した。出力のユニオンセットは、CD-HIT64を用いて95%の配列同一性と85%の配列カバー65で複製解除し、Bowtie2 v2.3.2 in sensitive mode66を用いてマッピングリードを使用し各試料のビニングした後にvRhyme v1.1.0 （参考文献63）用いたウイルスMAG (rep_vMAG) に用いた。ウイルスの足場は、vConTACT v220を使用して分類学的に分類されました。vRhymeで同定された円形配列は最終的なrep_vMAGセットに追加され、その後CheckV v0.9.0 (ref. 18)を用いて品質チェックされました。高信頼性予測法（AAI-based、DTR、ITR）を用いて「高品質」または「完全品質」と予測されたrep_vMAGのみが、さらなる解析のために保持された。高品質なrep_vMAGからProkka v1.14.6 (ref. 67)を用いて、UniRef100データベース58に対してアライメントを行い、e値カットオフ1×10-6で遺伝子を予測、アノテーションを行った。また、MMseqs2 v13.5（文献68）、Diamond v2.0.15（文献57）、HMMER v3.3.2 （文献69）を用いて、それぞれPHROGS v4（文献70）、COG-20（文献71）、VOG v213（文献72）データベースに対してアライメントし、遺伝子を注釈した。DRAM-v v1.3.5 (参考文献73)を用いて、rep_vMAGsのAMGs候補を特定した。AMGsスコアが1-3、AMGフラグが-Mと-Fの遺伝子を候補AMGとして分類し、ウイルスコンティグ内での位置、候補AMGとその近傍遺伝子の機能アノテーションを手動でチェックした。
免疫ネットワークのためのCRISPR-Cas解析、スペーサー抽出、プロトスペーサー同士のマッチング
CRISPRCasFinder v4.2.20 (ref. 74) と DefenseFinder v1 (ref. 60) を用いて、すべての中〜高品質 mMAG から CRISPR-Cas 遺伝子座を特定し cas 遺伝子をサブタイプした。エビデンスレベル4のCRISPRアレイからリピートのみを抽出し、metaCRAST75を用いて品質フィルターしたショットガンリードからCRISPRスペーサーを抽出した。抽出されたスペーサーの25bp以上の長さを、high-to complete-quality vMAGs（95%の配列同一性と85%のアライメントカバレッジ65で複製前のユニークなhigh-to complete-quality viral MAGs）に対してローカルアラインメントし、「blastn-short」76を用いて検索した。アライメントカバレッジが100％で、ミスマッチが2つまでのBLASTマッチのみを、高信頼度のプロトスペーサー同士のマッチとみなした。複数の集団に関連するCRISPR（rep_mMAG）は、共有リピートから抽出されたスペーサーを特定の分類群に確実に割り当てることができないため、免疫ネットワークから除外された。宿主-ウイルスネットワークは、Cytoscape v3.9.1 (ref. 77)を用いて可視化した。
Hi-C近接ライゲーションに基づく宿主-ウイルスマッチング
Hi-C chimaeric readsはBBdukとsickleを用いて品質フィルターをかけ、rep_mMAGsとrep_vMAGsを組み合わせた足場データベースに対してBWA mem v0.7.17, flag -5SPを用いてマップした。リードマッピングの前に、CD-HIT-ESTのフラグ-aS 0.85 -c 0.95でスキャフォールドの複製を解除し、Hi-Cリードが非常に似たスキャフォールドにマッピングされ、ホスト-ウイルスが偽陽性となるのを防ぐためにデータベース内の冗長性を削除しました。スキャフォールドカバレッジは、メタゲノミックショットガンリードをbbmap (sourceforge.net/projects/bbmap/) を用いて同じデータベースに対してマッピングすることで算出しました。各サンプルのHi-Cコンタクトマップは、HiCZin24の非標識バージョンを使用して正規化した。宿主-ウイルス感染ネットワークは、Cytoscape v3.9.1 (ref. 77)を用いて可視化した。ノイズ-シグナル比は2つの方法で計算した：（1）生のノイズ：（＃mMAG間接触）/（＃mMAG内接触）、（2）緩和ノイズ： (ここで、# inter-mMAG contacts = 異なるmMAGにマッピングされたHi-Cリードペア、# intra-mMAG contacts = 同じmMAGまたはコンティグにマッピングされたHi-Cリードペア、# inter-order contacts = 異なる分類順に属する異なるmMAGにマッピングされたHi-Cリードペア、# intra-order contacts = 同じコンティグまたは同じ分類順にビン詰めしたコンティグにマッピングしたHi-Cリードペアのこと。対数変換された接触行列は、フラグmax_image_size = 5,000で修正されたbin3C78 mkmap関数を使用して可視化された。
古細菌と細菌のCRISPRスペーサーに一致するウイルスを公開データセットから同定する。
個々のウイルスゲノムが古細菌と細菌の両方のCRISPRスペーサーに一致する頻度を評価するために、細菌または古細菌のCRISPRスペーサーにリンクした47,513ゲノムを含むIMG/VR v3オンラインデータベース79を活用しました。このうち、細菌と古細菌の両方のCRISPRスペーサーと一致するゲノムをリストアップした（n = 26）。サンプルの位置と生態系の種類は、Goldデータベース80から取得した。
他の環境におけるCRISPR遺伝子座の検出
CRISPRリピートは、HOTおよびBATSメタゲノム時系列36の中～高品質MAG81、およびサンフランシスコ沖115kmの深海堆積物（北緯36.61度、西経123.38度、水深3535m）の中～高品質MAG209からCRISPRCasFinder v4.2.20 （文献74）を用いて同定しました37。
rep_mMAGsとrep_vMAGsのSNVコール、塩基多様性、pN/pS、存在量算出について
リードはBowtie2のsensitive modeでrep_mMAGとrep_vMAGを組み合わせたデータベースにマッピングされた。リードマッピングに基づくSNVコールとその後の集団遺伝学的解析は、inStrain v1.3.1 (ref. 82)を用いて、94%の最小パーセント同一性フィルタリングを除くデフォルト設定で実施した。rep_mMAGの平均カバー率が5倍以上、bread（少なくとも1つのリードでカバーされるrep_mMAGの割合）が0.7以上の場合、ゲノム全体の平均リードマッピングカバレッジを用いて各サンプルにおける相対量を決定した。平均カバー率が5倍以上、幅が0.7以上のrep_vMAGについては、各rep_vMAGのウイルス足場の平均カバー率を各サンプルのリード数で正規化することにより、各サンプルの正規化存在量を算出しました。
可視化
すべてのグラフは、R v4.0.2のggplot2 v3.3.6 (文献83)を用いて可視化した。
報告書の概要
研究デザインの詳細については、本記事にリンクされている「Nature Portfolio Reporting Summary」をご参照ください。
データの入手方法
本研究で調査した配列データ（生配列、アセンブリ、rep_mMAG、rep_vMAGを含む）は、BioProjects PRJNA879229 (mat samples) およびPRJNA879230 (HW samples) としてNCBIに寄託した。SRAのアクセッション番号は補足表1c（ショットガンライブラリー）および補足表9（Hi-Cライブラリー）に、BioSample IDは補足表2および11にrep_mMAGについて、補足表4および16にrep_vMAGについて記載されています。UniRef100データベースはhttps://www.uniprot.org/help/downloads、IMG/VRデータベースはhttps://img.jgi.doe.gov/vr、GOLDデータベースはhttps://gold.jgi.doe.gov/ でアクセスできます。PHROGs (https://phrogs.lmge.uca.fr/), COG-20 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/cog-project/), VOG (https://vogdb.org/) データベースはオンラインで利用可能です。
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参考文献のダウンロード
謝辞
研究探検RR2107のRV Roger Revelleの乗組員および科学者、特にB. Travis、S. Wankel、O. Alianのサンプリング支援、O.X. Corderoのサンプリングスキームの初期検討時の提案、 J. Hwangのイラストおよび図デザインの支援、Y. (Y.) DuのHi-Cコンタクト正規化の助言、Treude研究グループ（UCLA）の J. LiuおよびD. Yousavichの孔水地球化学分析への支援に感謝します。この研究は、P.R.G.へのGordon and Betty Moore Foundation grant #9208 、P.R.G.へのNSF OCE-1635365、NASA Network for Life Detectionプログラムを通じて発行された80NSSC18K1140と80NSSC19K1427の助成を受けて、アメリカ航空宇宙局からP.R.G.への援助を受けた。DOE Office of Science User Facilityである米国エネルギー省合同ゲノム研究所（https://ror.org/04xm1d337）で行われた研究は、契約番号DE-AC02-05CH1111の下で運営されている米国エネルギー省科学局の支援を受けています。DE-AC02-05CH11231 の下で運営されています。本論文の計算は、ハーバード大学のScience Research Computing GroupのFAS部門が支援するFASRC Cannonクラスタで実行された。
著者情報
著者と所属
米国マサチューセッツ州ケンブリッジ、ハーバード大学、有機進化生物学教室
ユンハ・ホワン＆ピーター・R・ジルギス
DOE（エネルギー省）合同ゲノム研究所、ローレンスバークレー国立研究所、米国カリフォルニア州バークレー市
シモン・ルー＆クレマン・コクレ
カリフォルニア大学ロサンゼルス校地球惑星宇宙科学科（アメリカ
セバスチャン・J・E・クラウス
貢献度
Y.H.とP.R.G.は本研究の構想および設計を行い、Y.H.、S.J.E.K.、P.R.G.はサンプリングを行い、Y.Hはメタゲノムライブラリーを準備し配列データセットを分析し、S.RとP.R.Gはデータの解釈において意見を提供、S.Kは地球化学分析を実施、C.Cはウイルス遺伝子注釈を行った、Y.Hはすべての共同執筆者から情報を得て記事を執筆した。Y.H.は共著者全員の意見を取り入れながら論文を執筆した。
共著者
Yunha HwangまたはPeter R. Girguisに対応する。
倫理に関する宣言
競合する利益
著者は、競合する利害関係を宣言していない。
査読
ピアレビュー情報
Nature Microbiologyは、Martial Marbouty氏、Sean McAllister氏、Julia Brown氏の本著作物の査読への貢献に感謝します。
追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権の主張に関して中立を保っています。
拡張データ
Extended Data 図1 熱水マットの微生物とウイルスの分類学的多様性と主座標分析（PCoA）。
サンプルM1-10のrep_mMAGのシャノン多様性指数（A）とPCoA（B）、rep_vMAGのシャノン多様性指数（C）およびPcoA（D）。PCoAプロットは、トランセクトを横切る位置に応じてサンプルを着色し（左端：赤、右端：青）、各軸によって説明される分散の割合を対応する軸ラベルに示す。
Extended Data 図2 参照ウイルスゲノムと比較したrep_vMAGの分類学的多様性。
赤色の大きなノードは、本研究でアセンブルしたウイルスである。参照ウイルスゲノムのノードの色は、vCONTACT2データベースで使用されているファミリーレベルの分類に従ったものである。
Extended Data 図3 マットウイルスゲノムのアノテーション。
補助代謝遺伝子とウイルス遺伝子量における宿主とウイルスの軍拡競争。rep_vMAG_36（A）とrep_vMAG_12（B）の推定補助代謝遺伝子（AMG；赤）、rep_vMAG_13（C）の防御システム遺伝子（緑）。これらの遺伝子の両脇には、ファージの特徴的な遺伝子（黄色）と、ファージに見られるその他の注目すべき遺伝子（オレンジ色）が配置されています。プロトスペーサーの位置は下のトラックに示されており、CRISPRがビン詰めされているrep_mMAGに従ってラベル付けされている。
Extended Data 図4 rep_mMAGとそのCRISPR（リピート）のネットワーク可視化。
大きいノードはrep_mMAGを表し、ノードの形はrep_mMAGが属する門を、ノードの大きさはrep_mMAGの大きさに相関し、ノードの色はゲノム情報に基づく代謝能力に対応する。SRB：硫黄還元菌、SOB：硫黄酸化菌、SRB-putative： aprABおよび/またはdsrDをコードする推定硫酸還元細菌。ANME：嫌気性メタン栄養性古細菌（Anaerobic methanotrophic archaea）。
Extended Data 図5 CRISPRを用いた免疫ネットワーク（拡張版）。
(A) CRISPRスペーサーとプロトスペーサーの一致に基づく過去の宿主-ウイルス相互作用（スペーサーとプロトスペーサーの一致が1つしか見つからなかった宿主ウイルス相互作用を含む）の刈り込みなし。複数のrep_mMAGで見つかったCRISPRリピートはこのネットワークでは除外した。エッジの幅は、異なるマッチの数に対応する。宿主ノードの色と形は、それぞれ宿主門と推定代謝を表す。ウイルスノードのサイズは、対応するrep_vMAGの長さに比例している。(B) 熱水サンプルにおけるCRISPR-spacerとprotospacerのマッチング。図3（スペーサー長25bp以上、各エッジは2つの異なるマッチを表す）よりも厳しくない閾値（スペーサー長20bp以上）を用いてネットワークを可視化した。スペーサー長>25 bpの相互作用のみが赤いエッジで強調されている。ウイルスノードはrep_vMAGの長さに比例し、硫黄酸化を行うゲノム能力を持つrep_mMAGは青色で表示されている。
Extended Data Fig. 6 vMAGのサイズと「宿主範囲」の相関関係。
(A) CRISPRスペーサーベースのマッチングを用いてrep_vMAGがリンクできる宿主の数と対応するrep_vMAGのサイズの相関性。(B、C）Hi-Cプロキシミティライゲーションベースのマッチングでrep_vMAGが結合できる宿主数（B）、宿主系統数（C）と対応するrep_vMAGサイズとの相関性。誤差の斜線部分は、線形モデル（"lm"）からの予測に対する95％信頼レベル区間を示す。相関は、両側ピアソン相関検定を用いて計算した（n = 36）。p値は、ボンフェローニ補正（k = 3）を用いて多重仮説補正したものである。
Extended Data Fig. 7 Extended Hi-C analysis.
(A, B) rep_vMAG_1とGammaproteobacteria_15_1のリードマッピングカバレッジのサンプル間における変化。サンプル間の宿主-ウイルスペア間のHi-Cリンクの強度（A：ウイルスと宿主コンティグ間の最大正規化Hi-Cリンク、B：ウイルスと宿主コンティグのユニークなHi-Cリンクペアのカウント）を重ねて表示した。(C）サンプル特異的Hi-C近接ライゲーション、リードマッピングを使用してサンプル特異的存在量を確実に計算できた宿主とウイルスのMAGについて（カバー率>5、幅>0.7）。ウイルスノード（円形）は、対応するrep_vMAG IDに従ってラベル付けされている。微生物ノードは、メイン図3と同じ配色を使用して、分類子に従って着色されている。ノードのサイズは、サンプル固有のリードマッピングのカバー率に対応しています。エッジの太さはコンティグ間リンクの数を表し、エッジの暗さは宿主-ウイルスペア内の任意の2つのコンティグ間のHi-Cコンタクトの最大正規化強度に相関しています。CRISPR-spacerマッチを使用して以前に検出された宿主-ウイルスペアは、赤で着色されている。ウイルス間のHi-C結合が確認されたものは、青色のエッジで示されている。
Extended Data 図8 熱水マットメタゲノム10種と熱水メタゲノム10種の比較。
(A) 2つのメタゲノムからビニングされたrep_mAGsにおいて、METABOLICを用いてアノテーションされ分類された代謝遺伝子量。(B) 2つのサンプルセット間のシャノン多様性指数。統計的に有意な差は検出されなかった（Welchのt-test、n = 20生物学的に独立したサンプル、両側、p > 0.05）。ボックスプロットは四分位数（25、50、75％）を示し、上下のひげはそれぞれ四分位数の1.5倍以内の最大値と最小値を示す。(C) 2つのデータセットにおけるrep_mMAGの主座標分析；熱水マットサンプルは赤、熱水サンプルは青で着色されている。各軸で説明される分散の割合は、軸ラベルに示されている。
Extended Data 図9 熱水サンプルの微生物とウイルスの組成。
(A)熱水サンプルに含まれる、より豊富な上位10個のrep_mAGの相対的な存在量。(B) 熱水サンプル中の高品質で完全なrep_vMAGの正規化された存在量。リードマッピングでカバー率5以上、幅0.7以上で検出されたrep_vMAGのみを示し、プロウイルスは除外した。
Extended Data Fig. 10 多様化する選択を受けるウイルスDNA指向性RNAポリメラーゼサブユニット（RNAP）。
(A) 選択を受けたRNAP1のゲノム状況。同じウイルスゲノムに存在するβサブユニットをコードする非相同RNAP遺伝子の存在に注目。(B）予測される構造と非同義多型の位置（白い球で可視化）。(C) Weinheimer and Aylward (2020)が以前に発表した木におけるRNAP1配列の位置。mReC (multimeric RNAP-encoding Caudovirales) の配列と遠位にクラスターを形成している。超高速ブートストラップで少なくとも95で強く支持された枝は黒丸で示されている。
補足情報
補足情報
補足図1a～j
報告書の概要
補足表
補足表1. a, 深海熱水マット10試料の説明 b, 熱水10試料の説明 c, ショットガンアセンブリの統計値。補足表2. rep_mMAGsを10個のマットサンプルでビニングした統計データ。補足表3. マットに含まれるrep_mMAGのゲノムに基づく代謝能力およびその他の遺伝的特徴。補足表4. 10個のマットサンプルでビニングされた高品質で完全なrep_vMAGsに関する情報。補足表5. 高品質で完全なrep_vMAGのアノテーション。推定されるAMGにはフラグが付けられている。補足表6. ビニングされたCas遺伝子座を持つrep_mMAGのリスト。Cas遺伝子座の同定とサブタイプ分けはDefenseFinderを使用して行った。補足表7. CRISPRリピートとその関連集団（rep_mMAGs）をビニングしたリスト。補足表8. スペーサー長>25のマットで、ミスマッチが2つ以上あるCRISPRスペーサーとプロトスペーサーの全マッチ。補足表9. Hi-Cライブラリーの統計情報。補足表10. rep_vMAGとrep_mMAG間のHi-C正規化連鎖。コンティグ間連鎖情報は、連鎖の数、連鎖の平均残差（正規化した「強さ」）、連鎖の最大残差で集約した。補足表11. 10個の熱水サンプルでビン詰めされたrep_mMAGの統計データ。補足表12. 熱水サンプルに含まれるrep_mMAGのゲノムに基づく代謝能力およびその他の遺伝的特徴。補足表13. 高信頼度（エビデンスレベル＝4）CRISPRリピートの数を環境間でビン詰めした。本研究の熱水マットサンプルと熱水マットサンプルについては、環境間で検出されたエビデンスレベル4のCRISPRの総数だけでなく、中～高品質MAGでビン詰めされたものの情報も含んでいます。補足表14. 水熱水サンプルに含まれるCRISPRリピートをビニングしたもの。補足表15. 熱水試料中のスペーサー長>20のCRISPRスペーサーとプロトスペーサーの全合致で、ミスマッチが最大2つまであるもの。補足表16. 10個の熱水サンプルでビニングされた高品質で完全なrep_vMAGsの情報。補足表17. UViG IDとその推定宿主、宿主予測手法の一覧。
権利と許可
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Hwang, Y., Roux, S., Coclet, C. et al. Viruses interact with host that span distantly related microbial domains in dense hydrothermal mats. Nat Microbiol (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01347-5
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2022年9月29日受理
2023年2月25日受理
2023年4月6日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41564-023-01347-5
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ネイチャー・マイクロバイオロジー（Nat Microbiol）ISSN2058-5276（オンライン版）
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