小児セリアック病の発症における腸内細菌叢、IgA反応、血漿メタボロームの動態
公開日：2023年1月13日
小児セリアック病の発症における腸内細菌叢、IgA反応、血漿メタボロームの動態
Khyati Girdhar, Yusuf Dogus Dogru, ...Emrah Altindis 著者を表示する
Microbiome 11巻 記事番号：9 (2023) この記事を引用する
119 アクセス数
9 Altmetric
指標詳細
概要
背景
セリアック病（CD）は、グルテンの摂取によって引き起こされる自己免疫疾患である。ほぼすべてのCD患者がヒト白血球抗原（HLA）DQ2/DQ8ハプロタイプを持つが、これらの対立遺伝子を持つ人のごく一部のみがCDを発症し、CD発症における環境因子の役割を示している。本研究の目的は、CD発症における腸内細菌叢および微生物代謝産物の寄与を明らかにすることである。この目的のために、我々は前向きコホート研究（ABIS）から2.5歳と5歳の糞便サンプルを入手した。サンプルは、最終サンプル採取後にCDを発症した子ども（CD progressor）と、年齢、HLA遺伝子型、授乳期間、グルテン暴露時間でマッチさせた健常児（n=15-16）から採取した。まず、同じ子どもたち（i）2歳半で対照16人、CD進行者15人、（ii）5歳で対照13人、CD進行者9人から得た糞便試料を用いて、16S配列決定と免疫グロブリンA配列決定（IgA-seq）を実施した。サイトカインプロファイリング、および5歳時に得られた血漿サンプルを用いた血漿メタボロミクスを完了した（n=7-9）。また、微生物叢由来の代謝物の1つであるタウロデオキシコール酸（TDCA）が生体内の小腸と免疫細胞組成に与える影響も明らかにした。
研究結果
CD進行者は健常者と比較して、腸内細菌叢の組成が異なり、IgA反応が亢進し、IgA標的が特異的であることがわかった。特に、5歳時点での血漿中の26種類の代謝物、5種類のサイトカイン、1種類のケモカインが、CDプログレッサーで有意に変化していることがわかった。26種類の代謝物のうち、TDCAは2倍に増加していた。TDCA単独投与は、C57BL/6Jマウスの絨毛の萎縮、CD4+ T細胞、ナチュラルキラー細胞の増加、T細胞上のQa-1とNKG2Dの2つの重要な免疫調節タンパク質の発現を引き起こし、上皮内リンパ球（IEL）におけるT調節細胞の減少を引き起こした。
結論
小児CDプログレッサーは、診断前の腸内細菌叢組成、血漿中メタボローム、サイトカインプロファイルが明瞭である。さらに、CD進行症患者では、腸内細菌叢にIgAで被覆された細菌が多く、IgAのユニークな標的が存在することが判明した。TDCAを単独で与えると、C57BJ/6マウスの小腸で炎症性免疫反応が刺激され、CDの特徴である絨毛萎縮が引き起こされる。このように、CD進行者の血漿中に濃縮された微生物叢由来の代謝物であるTDCAは、小腸の炎症を促進し、CD発症を促進する可能性を持っています。
ビデオ アブストラクト
はじめに
セリアック病（CD）は、世界中で100人に1人が罹患すると予測されているグルテンによる自己免疫疾患である[1]。ほぼすべてのCD患者がHLA-DQ2またはHLA-DQ8を保有している。しかし、欧米では人口の20-40％がこれらの対立遺伝子を持っているにもかかわらず、発症者はわずか1％である[2]。CDの発症率と有病率は過去15年間増加し続けており[3,4,5]、遺伝学だけではこの増加を説明することはできない。様々な環境要因がCDの発症に関与していることが示唆されています[6]。腸内細菌に関する研究では、乳児および成人のCD患者において、微生物および糞便の代謝産物組成の変化が観察されています[7,8,9,10,11,12,13]。腸内細菌と疾患発症の因果関係や寄与関係を明らかにする研究はまだありません。
本研究では、最後のサンプル採取後に発症したCD進行症患者と、年齢、HLA遺伝子型、授乳期間、グルテン曝露期間をマッチさせた健常児の前向きコホートの糞便および血漿サンプルを使用した。小児のCD発症における腸内細菌叢と血漿メタボロームの変化を評価するために、腸内細菌叢の発達の重要な2つの段階を表す2歳半と5歳に採取した糞便サンプルを使用しました[14]。この解析により、CDの進行者は診断前にすでに腸内細菌叢の組成に著しい変化があり、腸内細菌に対する特異なIgA反応、血漿中の代謝物およびサイトカインプロファイルが特異であることが判明しました。さらに、CD進行者で2倍に増加する微生物叢由来の代謝物TDCAが、C57BJ/6マウスの小腸に絨毛萎縮と炎症の増悪を引き起こすことを示しました。したがって、TDCAは小児CDの発症に重要な役割を担っている可能性がある。
研究方法
ヒト糞便サンプル
糞便サンプルは、All Babies in Southeast Sweden (ABIS) コホートの被験者から得た。ABIS研究は、スウェーデンのLinköping大学健康科学部（Ref. 1997/96287および2003/03-092）およびスウェーデンのLund大学医学部（Dnr 99227、Dnr 99321）の研究倫理委員会によって倫理的に承認されている。1997年10月1日から1999年10月1日の間にスウェーデン南東部で生まれたすべての子供（n=21,700）が参加資格を有し、17,055家族がインフォームドコンセント後に参加することを選択した。このうち、2017年12月31日までにCDを発症した小児は181人であった。自宅または診療所で新鮮な糞便サンプルを採取し、直ちに凍結した。1歳、2.5歳、5歳、8歳時にアンケートと生体試料を採取した。その後、11～13歳、17～18歳にそれぞれフォローアップとWebアンケートを実施した。アンケートは、母乳育児期間、抗生物質の使用、グルテンへの暴露時間など、参加者の健康情報を収集するために、両親が記入したものである。本研究では、年齢、性別、HLA型に基づいて、CDの進行者と自己免疫疾患を発症していない健常対照者をマッチングさせた。このマッチング基準を用いて、合計33人の小児を選択することができた。CD進行者16名のうち、1名は2.5歳以前にCDを発症し、4名は2.5歳以降5歳以前にCDを発症していた。したがって、2.5 歳時の糞便サンプルは合計 31 個（対照 16 個、CD 進行者 15 個）、5 歳時の糞便サンプルは合計 22 個（対照 13 個、CD 進行者 9 個）使用した。CD進行者16名のうち、5名は5歳以前にCDを発症していた。さらに、5歳で採取した合計16の血漿サンプル（対照9、CD進行者7）を血漿メタボロミクスおよびサイトカインプロファイリングに用いた（追加ファイル1: 図S1、追加ファイル2: 表S1）。CDの診断は、スウェーデン全国診断登録[15]に従い、少なくとも2回確認された。2012 年まで，CD の診断は，血清検査と小腸生検の両方によって行われた．両方の記録はスウェーデン全国入院患者登録に登録された[15]。
16S rRNA 遺伝子配列の決定
V4 領域の 16S rRNA 配列決定は、Miseq プラットフォームを用い、バーコード付きのプライマーを用いて実施した。簡単に言うと、すべての細菌サンプルを10% RNAse-Aを含む90μlのMicroBead Lysis Solutionに懸濁し、50℃のウォーターバスで5分間超音波処理した。サンプルを50μlのLysing Matrix B (MP Biomedicals)を含むプレートに移し、5分間ビーズビートでホモジナイズした。遠心分離（4122×g, 4℃, 6min）後、上清を2ml deep-well plate (Axygen Scientific)に移した。MagAttract Microbial kit (QIAGEN)を用いて，製造元の指示に従い，試料中の細菌DNAを抽出・精製した。16S リボソーム RNA の V4 領域を増幅するための PCR を二重に行った（33 サイクル）（1 反応あたり 3μl の精製 DNA; Phusion DNA polymerase, New England Bioscience） [16]. 増幅後、PCR産物はSequalPrepTM正規化プレートキット（ThermoFisher Scientific）を用いて正規化し、プールした。プールしたライブラリ濃度は、NGS Library Quantification Completeキット（Roche 07960204001）を用いて算出し、Miseqシーケンサーにロードした。Illumina Miseq Reagent Kit V2（500サイクル）を使用して、2×250bpペアエンドリードを生成しました。生リードをQiime1（バージョン1.9）でデマルチプレックスした。サンプルあたり平均30,471リードを得ることができた。
IgA+菌とIgA-菌の分離
IgA+およびIgA-菌の分離は、既報の通り行った[16]。簡単に説明すると、凍結したヒト糞便サンプルをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（100mg/mL）に懸濁し、セラミックビーズ入りFast Prep Lysing Matrix D（MP Biomedicals）を使用してホモジナイズした。ビーズビートを7秒間行った後（Minibeadbeater; Biospec）、50×g、10分間、4℃で遠心分離を行った。上清中の糞便細菌を回収し（200μl／サンプル）、1％（w／v）ウシ血清アルブミン（BSA、American Bioanalytical）含有500μl PBSで3回洗浄し、遠心分離した（6000×rpm、4℃、5分間）。この洗浄した菌体懸濁液（50μl）を16S配列解析のための前ソーティングサンプルとして採取した。洗浄後、細菌ペレットを50μlのブロッキングバッファー（1％（w/v）BSAおよび20％正常マウス血清（Jackson ImmunoResearch）を含むPBS）に再懸濁し、氷上で20分間インキュベートし、100μl PE標識マウス抗ヒトIgA（1：40；Miltenyi Biotec clone IS11-8E10）で30分間氷上染色をした。その後、フローサイトメトリー解析または細胞分離の前に、1%(w/v)を含む500μl BSAでサンプルを3回洗浄した。PE抗ヒトIgA染色細菌を、抗PE磁気活性化セルソーティング（MACS）ビーズ（Miltenyi Biotec）（1：5）と共に氷上で30分間インキュベートし、カスタム磁気プレートで氷上10分間分離した。磁気プレートに結合した糞便細菌をIgA+サンプルとして回収し、16Sシークエンス解析を行った。マグネットプレートに結合していない染色菌とMACSビーズ結合菌を回収し（20~40μl）、MACS分子カラム（Miltenyi Biotec）に通し（1サンプル/カラム）、その後1%（w/v）BSAを含む480μl PBSでフラッシングを行った。カラム通過分（～1ml）は、16S配列解析用のIgA-サンプルとして保存した。
糞便中IgAフローサイトメトリー解析
本原稿のIgA+およびIgA-細菌分離法の項に記載したように、糞便サンプルから細菌細胞を分離した。細菌をPE抗ヒトIgA抗体（1:100; Miltenyi Biotec clone IS11-8E10）で30分間氷上で染色した。2回洗浄後、糞便の残骸や粒子から細菌を識別するために、TO-PRO®-3（ThermoFisher Scientific）で細菌を染色した。染色した細菌は、TO-PRO®-3+IgA±細胞として、既報の通りBD FACSAriaTM IIIu cell sorter（Becton-Dickinson） で解析した[17]。
血漿メタボローム解析
メタボローム解析のための血漿サンプルは、以前に記載されたとおりに調製しました[18, 19]。血漿からの代謝物抽出は、イソプロパノール、アセトニトリル、水を3：3：2 v/vの割合で混合したものを使用しました。抽出液は、飛行時間型高分解能質量分析装置併用ガスクロマトグラフィー用75μl、高分解能質量分析装置併用逆相液体クロマトグラフィー用150μl、液体クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析装置併用親水性相互作用クロマトグラフィー用150μlに分け、既出の方法で分析した［18, 19］．親水性相互作用液体クロマトグラフィー分析を行うためにTriple Quad 5500 System（AB Sciex, Framingham, MA, USA）と結合したNEXERA XR UPLCシステム（Shimadzu, Columbia, MD, USA）、NEXERA XR UPLCシステム（Shimadzu, Columbia, MD, USA）を使用しました。また、Agilent 7890B ガスクロマトグラフ (Agilent, Palo Alto, CA, USA) を飛行時間型 Pegasus HT 質量分析計 (Leco, St. Joseph, MI, USA) に接続して逆相液体クロマトグラフ分析を実施しました。Joseph, MI, USA）に接続し、ガスクロマトグラフィーを行った。GCシステムには、Gerstel社の温度プログラムインジェクター冷却型注入システム（モデルCIS 4）が装着された。自動ライナー交換装置 (ALEX) (Gerstel, Muhlheim an der Ruhr, Germany) を使用して、サンプルラン間で発生していたサンプルマトリックスからのクロスコンタミネーションを除去しました。品質管理は、代謝物標準試料、混合試料、プールされた試料を用いて行いました。アミノ酸と有機酸の混合物を含む標準品質管理サンプルは、質量分析計の応答を監視するために毎日注入されました。プールされた品質管理サンプルは、試験のすべてのサンプルから同じ容量のアリコートを取り、バッチサンプルの最適な希釈を決定し、代謝物の同定とピーク積分を検証するために、分析済みサンプルで毎日注入して得られたものです。収集した生データは、手作業で検査、マージ、入力し、サンプル中央値で正規化しました。代謝物の同定は、社内の真正標準物質分析を用いて実施しました。代謝物のアノテーションは、記録された保持時間、保持指標を利用して、METLIN、NIST MS、Wiley Registry of Mass Spectral Data、HMDB、MassBank of North America、MassBank Europe、Golm Metabolome Database、SCIEX Accurate Mass Metabolite Spectral Library、MzCloud、IDEOMデータベースと照合して行われた。
メタボロームパスウェイ解析
メタボロームデータは、Tolstikovら[20]の既述に従って解析しました。MetaboAnalyst 4.0 の Metabolite Set Enrichment Analysis (MSEA) モジュールを用いて、同定された代謝物のパスウェイを解析しました。検出された代謝物のアクセッション番号 (HMDB, PubChem, KEGG Identifiers) を生成し、手動で検査した後、正規のパスウェイをマッピングするために使用しました。MSEAは、化合物濃度プロファイルと臨床転帰の相関を記述する機能的関係を調査するために使用されました。
バイオインフォマティクス解析および統計解析
細菌の多様性と統計解析は、細菌16s rRNAアンプリコンシーケンスリードのフィルタリングとトリミングによって行われ、アンプリコン配列をAmplicon Sequence Variant（ASVs）テーブルに変換するサンプル推論は、Ribosomal Database Project Training Set 16 [22] を使用してdada2 [21] によって行われました。探索的分析と推論的分析は、phyloseq [23] と vegan [24] を用いて R (version 4.1.2) で行い、これには Bray-Curtis 非類似度を用いた非計量多次元尺度法 (NMDS) 分析、主成分分析 (PCA) 、アルファおよびベータ多様性推定、分類群凝集が含まれている。統計的有意性は，α多様性についてはANOVA，Bray-Curtis非類似度についてはPERMANOVAによって評価された。ASVの存在量の差は、edgeR [25]による両側経験的ベイズ準尤度F検定で時間点ごとに評価された。P値はBenjamini-Hochberg false discovery rate (FDR)を用いて補正し、FDR < 0.05は統計的に有意とした[26]。IgAソートされたサンプルについては、各分類群についてIgA coating index（ICI）を算出した。ICIは、IgA陽性サンプル中の分類群の相対存在量と、IgA陰性サンプル中の分類群の相対存在量の比として算出されます。ICI値が1より低い分類群は、特定の分類群のICI値が以下の通りである場合を除き、ヒートマップのために破棄された。(ICIControl <1 and ICICeliac > 1）または（ICIControl >1 and ICICeliac <1）。結果は、行（ICIスコア）に基づいて正規化し、pheatmapパッケージ（RRID:SCR_016418）を使用して可視化した。
動物
C57BL/6Jマウスは、Boston College Animal Care Facilityで維持・繁殖させた。すべての動物実験は、米国国立衛生研究所の規制および倫理ガイドラインに従って実施され、ボストンカレッジのIACUCによって承認された（プロトコルNo.#B2019-003および2019-004）。マウスは特定の病原体を含まない条件下で、12時間の暗・明サイクル、オートクレーブ滅菌した水と寝床に自由にアクセスできる状態で維持された。離乳後、3週齢の同腹のマウスを、(1) チャウ食を与えるコントロール群、および (2) 0.4% TDCA (wt/wt) を含むチャウ食を与えるTDCA群の2群に分割した。これらの飼料で10週間飼育した後、マウスを犠牲にし、さらなる解析のために初代細胞および臓器を収集した。
病理組織学的切片作成および染色
十二指腸および回腸のパラフィルム切片を乾燥させ、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色キット（Vector Laboratory）で染色し、正立顕微鏡（Zeiss AxioImager Z2）を用いて解析した。絨毛/クリプト比と形質細胞はFiji/ImageJソフトウェアを用いて定量化した。
初代細胞の分離とフローサイトメトリー
脾臓および腸間膜リンパ節（MLN）から機械的破砕により細胞を単離し、前述 [27] のように固有層（LP）およびパイエル板（PP）を単離した。手短に言えば、腸をPBSで洗浄し、横方向に1cmの小片に切断し、ホルマリンで固定した。残りの腸は縦に切断して内部の上皮層を露出させ、2％牛胎児血清（FBS）を含むリン酸緩衝液（PBS）で2-3回洗浄して糞便を除去した。腸の切断片を新しく調製したジチオスレイトール（DTE）溶液中で20分間、2回攪拌した。20 分後、上清から IEL を回収し、70μm のフィルターを用いてろ過した後、44/67 Percoll gradient を通過させた。腸片をEDTA溶液中で30分間、計2回攪拌した後、完全培地で洗浄した。LPとPPの細胞を分離するために、洗浄した腸とPPをコラゲナーゼ溶液に再懸濁させた。70μmのフィルターを通すことで上清から細胞を回収し、44/67パーコール勾配を通過させた。その後、細胞懸濁液を洗浄し、Additional file 2: Table S6に記載されているように、適切な蛍光色素共役モノクローナル抗体で表面標識した。結果は、flowjo10 ソフトウェアを使用して評価した。
結果
セリアック病進行者は、明確な腸内細菌叢組成を有する
まず、16S rRNA遺伝子配列決定により、CD進行者（n=15、2.5歳、n=9、5歳）と健康マッチング対照者（n=16、2.5歳、n=13、5歳）の腸内細菌叢構成の違いを明らかにした。被験者の特徴は、Additional file 1に記載されている。被験者の特徴をAdditional file 1: Figure S1およびAdditional file 2: Table S1に記載した。合計で575のアンプリコンシークエンスバリアント（ASV）を同定した（Additional file 2: Table S2）。2.5歳と5歳のCD進行者と健常者の間で、αとβの多様性は同程度であった（図1A）。主成分分析（PCA）では有意な分離は見られず（図1B）、相対量分析でも門や属レベルでの違いは確認されなかった（図1C、D、Additional file 2: Table S3）。しかし、ASVレベルでは、両年代とも、有意な発見を報告するための厳しい統計的閾値（FDR <0.05, p <0.01）を用いて、有意な差異を同定した。具体的には、2.5歳では117のASVが、5歳では71のASVが異なっていた（図1Eおよび追加ファイル2: 表S2）。CD進行者サンプルまたは健常者サンプルのいずれにおいても、最も有意に濃縮されたASVを表1およびAdditional file 1に示した。図 S2 に示す。ヒートマップでは、両年齢でCD進行者と健常者が明確に分かれていることがわかります（図1F）。
図1
図1
CDを発症した小児の腸内細菌叢は、ASVレベルで有意に変化していた。A CD進行者（n=9-15）と健常者（n=13-16）の比較を示す箱ひげ図：観察したASVで測定したα多様性（左図）とBray-Curtis非類似度で測定したβ多様性（右図）。統計解析はANOVA（α多様性）とPERMANOVA（Bray-Curtis距離）を用いて行われた。B 2.5歳および5歳におけるCD進行者と健常対照者のサンプルの類似性/非類似性の主成分分析（PCA）順序付け。各円は個々のサンプル、コントロール（緑の棒）およびセリアック（赤の棒）を表す。C, D 年齢、2.5歳、5歳におけるCD進行者と健常対照者の腸内細菌叢の間で、存在量（割合）が1％以上の細菌門（上段）または属（下段）の平均相対存在量（分類群平均相対存在量>1％）。統計解析は、Benjamini and Hochberg法により偽発見率（FDR）を制御した両側t検定で行った。E 2.5歳および5歳におけるCD進行者と健常対照者の腸内細菌叢ASVの比較のためのEmpirical Bayes準尤度F検定分析。頻度：ASVの数。F CD進行者と健常対照者の間で有意に異なる上位ASVの相対的存在度を示すヒートマップ。各列は個々の参加者を表し、各行はASVを表す。
フルサイズ画像
表1 CD患者および対照群における上位ASVの濃縮および/またはIgA標的化
フルサイズの表
CD進行例では、IgAで被覆された細菌が多く、腸における体液性免疫応答が明瞭であることが示される
免疫グロブリンA（IgA）は、粘膜表面で最も豊富な抗体アイソタイプであり、ヒトにおける腸管免疫の主要なメディエーターである[28]。IgA-sequencing（IgA-seq）は、バクテリアセルソーティングとハイスループットシーケンスを組み合わせ、高度にIgAコーティングされた（IgA+）微生物叢とコーティングされていない（IgA-）微生物叢の異なるサブセットを識別します［16、17、29、30］。本研究では、IgA-seqを用いて、マッチさせた健常児（n=16、2.5歳、n=13、5歳）と比較したCD進行者（n=15、2.5歳、n=9、5歳）の腸内細菌叢におけるIgAの標的細菌を明らかにしました。フローチャートとゲーティング戦略は、Additional file 1に記載されている。Figures S3A and S3Bに記載した。PCAでは、2.5歳でIgA+菌とIgA-菌が明確に分離した。しかし、両年齢とも健常者とCD進行者のサンプル間で明確な分離は観察されなかった（図2A）。フローサイトメトリー解析の結果、特に5歳において、対照群（6.02％）と比較してCD進行者（12.8％）ではIgA+菌が2倍に増加していた（n=9-13、p=0.027、図2B）。全体として、我々のデータは、健康な対照者とCD進行者の両方において、腸内細菌叢の発達の最初の5年間は、腸内細菌のごく一部しかIgAで被覆されていないことを示している。5歳時点では、健康な対照群に比べ、CD進行症患者ではより多くのIgA+で覆われた細菌が存在し、CD進行症患者では体液性免疫反応が変化していることが示唆された。
図2.
図2
CDを発症している小児の腸内細菌叢は、5歳の時点で対照群よりもIgA+細菌が多くなっている。A 2.5歳（左）、5歳（右）のコントロール（緑）、CDプログレッサー（赤）のIgA+とIgA-微生物叢のサンプルの類似性/非類似性の主成分分析（PCA）。B 2.5歳および5歳におけるCD進行者と健常対照者の糞便サンプル中のIgA+細菌に関するフローサイトメトリー結果。表示は平均±SEM。データは平均値±SEMで表した。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 統計解析は、二元配置分散分析を用いて行った。C CD進行者と健常対照者の比較を示す箱ひげ図：2.5歳（左パネル）および5歳（右パネル）におけるIgA+/IgA-微生物叢の観察により測定されたα多様性。統計解析はANOVAを用いて行った。D CD進行者と健常対照者の比較を示す箱ひげ図：2.5歳（左パネル）および5歳（右パネル）におけるIgA+/IgA-微生物叢のBray-Curtis非類似度によって測定したβ多様性。統計解析はPERMANOVAを用いて行った。E 2.5歳（左パネル）および5歳（右パネル）におけるCD進行者と健常対照者の腸内細菌叢間のIgA+/IgA-細菌門（上パネル）または属（下パネル）の存在比（割合）が1%超の平均相対存在量。分類群の平均相対存在量＞1％。統計解析は、Benjamini and Hochberg法により偽発見率（FDR）を制御した両側t検定で行った。F 健常者とセリアック病進行者における2.5歳（左）と5歳（右）の正規化IgA coating index（ICI）スコアと31分類群における相対存在度のヒートマップ。ICI値が1未満の分類群は、特定の分類群のICI値が（ICIControl <1かつICICeliac > 1）または（ICIControl >1かつICICeliac <1）である場合を除き、切り捨てた。
フルサイズ画像
IgAの標的は、CDプログレッサーの異なる細菌で構成されている
ヒトの腸内細菌叢の発達初期におけるIgA応答に関する報告は非常に少ない[30]。そこで、まず健常児から得られた結果に注目した。その結果、健常対照者のIgA+とIgA-のサンプル間で有意に異なる2.5歳時の89個のASVと5歳時の37個のASVを同定した（FDR<0.05, p<0.01; Additional file 1: 図S3C、追加ファイル2: 表S2）。2.5歳の健常者におけるIgAのASVターゲットの上位はClostridium IVとBifidobacteriumであり、種レベルではBacteroides clarus、Catenibacterium mitsuokai、Actinomyces odontolyticusが挙げられている。5歳時点の種レベルでは、Clostridium IVとGemmigerが、B. clarus、Bifidobacterium bifidum、Clostridium sensu strictoがASVとして上位に濃縮されており、これらの菌が健常児において免疫調節に関与していることが示された（Table 1）。一方、CDの進行度においてIgA+とIgA-サンプル間で有意に異なるASVを2.5歳で92個、5歳で5個同定した（追加ファイル2: 表S2）。IgA標的分類群の上位は表1の通りであった。2.5歳ではClostridium IV、Elizabethkingia、B. bifidum、5歳ではClostridium IV、Brucella、Streptococcus、Elizabethkingia、Pseudomonasなど、CD progressorは健常者と同様のIgA ASV上位標的を共有していた。一方、2.5歳時点のCDプログレッサーでは、Coprococcus comes, Clostridium sensu stricto, Leuconostoc, Bifidobacterium bifidum, Actinomyces turicensisなど、ASV特有のIgAターゲットが観察された。
選別前のデータと同様に、選別後のサンプル（IgA-, IgA +）では、αおよびβ多様性はともに同等であった（図2C, D）。IgA+またはIgA-微生物群の相対的な存在量に、門または属レベルでの違いは見られなかった（図2E、追加ファイル2: 表S3）。一方、ASVレベルでは有意な差が確認された。2.5歳で、IgA-Seqは、コントロールIgA-サンプルとCDプログレッサーIgA-サンプルの間で124種類の異なるASVを同定した。同様に、対照IgA+サンプルとCD progressorsのIgA+サンプルの間で132の異なるASVを同定した（FDR<0.05、追加ファイル1：図S3DE、追加ファイル2：表S2）。5歳では、18のASVが対照IgA-サンプルとCD IgA-サンプル間で異なり、28のASVがCD IgA+サンプルと対照IgA+サンプル間で異なっていた（FDR<0.05、追加ファイル1: 図S3D, 追加ファイル2: 表S2）。CDプログレッサーに濃縮されたIgA+応答の上位差分標的は、Clostridium IV、Gemmiger、そして種レベルでは、2.5歳でDialister propionicifaciens、Bacteroides vulgatus、Clostridium sensu strictoであった。さらに、CD群では5歳時にDialister、Enterobacter、Clostridium XlVa、Roseburia、Bacteroides、種レベルではDialister propionicifaciens、Clostridium sensu stricto、ASVが高いIgAで被覆されていた。
腸内細菌叢組成の変化による違いに加え、CD進行者と健常対照者の腸内細菌叢では存在量が同等（プレソート）であるが、免疫系が標的とするASVが2歳半で53、5歳で12のASVを確認した（追加ファイル2: 表S4）。例えば、2.5歳のBacteroides vulgatus、Clostridium sensu stricto、（追加ファイル1：図S3E）、A. turicensis ASVと5歳のEnterobacter、Roseburia、Lactococcus、Clostridium sensu stricto ASVはその存在量が同等であるが、CD progressorではIgAで強くコートされていたが、コントロールではされていない（追加ファイル1：図 S3F, 図 S4A & B）。次に、IgA-coating index（ICI）スコアを算出し、健常対照者とCD進行者のIgAコーティングを定量化した（Additional file 2: Table S5, Fig. 2F）。2.5歳時にICIスコアが10以上であった健常児では34の分類群、CD進行者では22の分類群が同定された。同様に、5歳時にICIスコアが10を超えた健常対照者では21分類群、CD進行者では19分類群が同定された（Additional file 2: Table S5, Fig. 2F）。これらの分類群のうち、Coprococcus comesはICIスコアが10を超え、CDプログレッサーで有意に増加した。Prevotella copriとRuminococcaceaeは、2.5歳のCD進行者でICIスコアが10を超えている（Additional file 2: Table S5）。Actinomyces odontolyticusはICIスコアが10を超え、5歳時点でのCD進行者に有意に増加していた。全体として、これらの結果は、腸内細菌叢の組成だけでなく、腸内細菌叢に対するIgA反応もCD進行症において著しく変化していることを示している。
CD進行症患者では診断前に炎症性サイトカインとケモカインが増加している
我々のデータは、CD進行症患者では、腸管において明確かつ強いIgA反応を示すことを示している。このことが全身的な炎症と一致しているかどうかを調べるために、5歳時点でのCD進行症患者7人と健常者9人のサイトカインプロファイルを分析した（図3A）。48種類のサイトカインを評価したところ（Additional file 1: Figure S5A）、診断前のCD進行症例で有意に増加していた3種類の炎症性サイトカイン（IFNA2, IL-1a, IL-17E/(IL25) ）とケモカイン（MIP-1b）が同定された。IL-27とIL12(p70)もCD progressorで増加する傾向を示した（図3A）。CDプログレッサーにおけるこれらの炎症性サイトカインの増加は、CDの進行に潜在的に関与している可能性がある。
図3
図3
血漿中サイトカインおよび代謝産物レベルの変化。A 5歳時点でのCD進行者（n=7）と健常対照者（n=9）のサイトカインプロファイルをLuminexで評価した。データは平均値±SEMで表した。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 統計解析は、両側、対になっていないスチューデントのt検定によって行った。B CD進行者（n=7）と対照者（n=9）の血漿中代謝物の部分最小二乗法-判別分析（PLS-DA）。C CD 進行者と健常対照者の血漿代謝物のボルケーノプロット。fold change threshold (|log2 (FC)|>1.2) と t tests threshold (-log10(p)>0.1) 。赤い点は、閾値以上の代謝物を表しています。Fold Changeはlog2変換、p値はlog10変換しています。D CD進行者と健常対照者の間で最も変化した50の代謝産物を示すヒートマップ。各列は個々の参加者を表し、各行は代謝物を表す。E パスウェイ解析（強力なパスウェイエンリッチメント解析とパスウェイトポロジー解析の組み合わせ）により、CD進行者と健常対照者の間で最も変化した代謝パスウェイが特定された。パスウェイインパクト値（x）は、パスウェイトポロジー解析から計算されます。
フルサイズ画像
血漿メタボローム解析により、CD進行者の炎症性代謝プロファイルが明らかになった
血漿メタボロームにおけるCD進行の初期マーカーを明らかにするために、ターゲット血漿メタボローム解析を適用しました。5歳時点でのCD進行者7名とマッチさせた健常対照者9名から得られた血漿サンプルを使用しました。合計で387の代謝物を同定し、部分最小二乗法-判別分析（PLS-DA）により血漿代謝物の明確な分離を示しました（図3B）。Volcanoプロットは、最も有意に変化した代謝物を示しています（図3C、Additional file 2: Table S6）。具体的には、387代謝物のうち26代謝物が有意に変化しました（p < 0.05, Additional file 2: Table S5, 図3D）。最も変化した代謝物（p < 0.01）は、2-Methyl-3-ketovaleric acid (FC=12.19) (Fig. 3D), TDCA (FC=1.92), Gluconoo-D-lactone (FC=1.51), Isobutyryl-L-carnitine (FC=2.38) で、すべてCD progressorで増加しました。また、抗炎症代謝物であるオレイン酸（FC=0.57）は、CD 進行性で有意に減少していました[31]。
最も変化している代謝物の1つであるTDCAは、主に腸内細菌、特にClostridium XIVaとClostridium XIによって、タウロコール酸とコール酸の7-α-dehydroxylationで作られる抱合胆汁酸である[32]。TDCAは、以前、炎症性代謝物であることが示された[33]。さらに、この結果は、我々の微生物叢解析と一致している。なぜなら、我々は、CDサンプルにおいて、特に5歳において有意に多く存在するいくつかのClostridium XIVa ASVを同定したからである（FC=39.5、FDR=0.01）。さらに、Clostridium XIVa ASVは、CDのプログレッサーにおいてIgAによって高度に標的化されていた（FC=305、FDR=0.006）（追加ファイル1：図S5C）。パスウェイ解析（図3F、Additional file 2: Table S7）を用いて、これらの代謝物に関連する機能を明らかにした。これまでの報告と同様に、CD進行因子ではペントースリン酸経路（PPP）（生p=0.05）が有意に変化していることが示された[9]。また、不飽和脂肪酸の生合成（生p=0.006）に加え、糖脂質の生合成（生p=0.006）も変化していた。 006）、糖脂質代謝（生 p=0.007）、脂肪酸伸長（生 p=0.017）、ガラクトース代謝（生 p=0.039）、アラキドン酸代謝（生 p=0.044）およびリノール酸代謝（生 p=0.047）経路に加え、CD 進行因子が有意に変化していた。
TDCA処理によりC57BL6/Jマウスの絨毛が萎縮し、炎症が促進された
TDCAの宿主への影響を調べるため、C57BL/6J雄および雌マウスに、標準的な飼料または既報[33]のTDCA（0.4％wt/wt）を添加した飼料を10週間与えた（図4A）。TDCAによる摂食量の差は、雌雄の処理群ともに観察されなかった（Fig. 4B）。投与終了後、IEL、LP、MLN、PP、および脾臓細胞などの異なる細胞サブセットを解析した。TDCAを投与した雌マウスのMLNは、雌の対照マウスのMLNと比較して肥大しており、雄マウスでは肥大する傾向が見られた（Fig. 4C）。TDCAを投与した雌雄マウスは、いずれもMLNの細胞数が有意に多く、小腸に炎症が起きていることが示された（図4D）。また、TDCA投与により、雌雄マウスともに腸管上皮細胞（IEC）の数が減少した（図4D）。
図4
図4
TDCA食は十二指腸の絨毛/クリプト比を減少させ、異なる細胞サブセットにおけるT細胞組成を変化させる。A 実験の概略図（n=8/群/雌雄）。マウスには、10週間、チャウ食（コントロール）または0.4%TDCAを含むチャウ食のいずれかを与えた。B マウスの食物摂取量は、1ケージあたりマウス1gあたりの食物摂取量として表した。C 腸間膜リンパ節(MLN)の重量。D 分離後の各腸上皮細胞（IEC）、ペイターズパッチ（PP）、ラミナプリア（LP）、MLN、脾臓について、血球計数器を用いて細胞数を算出した。雌（左パネル）および雄（右パネル）。E コントロールおよびTDCA処理した雌マウスの十二指腸切片のH&E画像。フル画像（左パネル、スケール=200μm）および高倍率画像（右パネル、スケール=50μm）。FコントロールおよびTDCA処理雌マウスの十二指腸切片の絨毛/クリプト比（100絨毛/クリプト/群）。G コントロールとTDCA投与雄マウスの十二指腸切片の絨毛/クリプト比（100villi/crypt/group)
フルサイズ画像
CDの主な特徴は、上皮内リンパ球（IEL）の増加、部分的および全体的な絨毛の萎縮、クリプトの過形成である[34]。TDCA処理による腸の組織学的変化を明らかにするために、コントロール及びTDCA処理マウスの十二指腸切片をH＆Eで染色した。図4Eは、TDCA投与マウスの十二指腸切片の組織学的変化をコントロールマウスと比較した代表的な画像である。雄マウス、雌マウスともに絨毛/クリプト比の有意な減少が観察された（図4F, G）。また、コントロールマウスとTDCAマウスの回腸切片を解析した。その結果、TDCA処理による陰窩構造の歪み、部分的および全体的な絨毛の萎縮が観察された（Additional file 1: Figure S7A）。TDCA投与により、投与10週後の回腸における絨毛長、クリプト深さ、絨毛/クリプト比に有意差は認められなかった（Additional file 1: Figure S7B）。しかし、固有層に存在する形質細胞が5倍に増加していることが観察された（Additional file 1: Figure S7C）。これらの観察結果は、増加した微生物叢由来の代謝物であるTDCAが、マウスの十二指腸における絨毛の萎縮を引き起こし得ることを示すものである。
TDCA処理により、in vivoでCD4+ T細胞、NKG2D受容体の発現が増加し、T調節細胞が減少する。
fig絨毛の萎縮を刺激する免疫変化をより理解するために、我々は10週間のTDCA処理後のIELs、PPs、LPsおよび脾臓における異なるT細胞およびナチュラルキラー（NK）細胞集団について検討した。すべての細胞タイプを決定するためのゲーティング戦略は、Additional file 1に記載されている。図S6に示す。TDCA処理により、雌雄両マウスのPPにおいてTCRβ+細胞が2倍増加した（Additional file 1: 図S7D）。さらに、TDCA処理した雌マウスのIELにおけるCD4+ T細胞の2.1倍の増加を同定し、雄マウスについても同様の傾向を観察した。LPのCD4+ T細胞においても、特にTDCA処理雄性マウスで25％の増加が見られた（Fig.5A）。TDCA処理により、IEL、PP、および脾臓のCD8+ T細胞集団は変化しなかったが、LPでは減少した（Fig. 5B）。
図5
図5
A CD4+T細胞、総TCRβ+細胞数に対する割合。B CD8+T細胞、総TCRβ+細胞数に対する割合。C CD8+ NKG2D+ T細胞、全CD8+細胞の割合として。D メス（左パネル）およびオス（右パネル）マウスのIEL、PP、LP、脾臓におけるCD8+ CD103+ T細胞の総CD8+細胞数に対する割合。コントロール（黒棒）およびTDCA食（赤棒）。データは平均±SEMで表した。*p<0.05, **p <0.01,***p <0.01。統計解析は両側無対称スチューデントのt検定により実施した
フルサイズ画像
NKG2D受容体は、すべてのCD8+αβT細胞、γδT細胞、およびほとんどのNK細胞の表面に特異的に発現しており[35]、MHCクラスI鎖関連タンパク質A（MICA）タンパク質と相互作用することによってCD発症における上皮細胞の破壊に主要な役割を果たす[36]。MICAの発現は、炎症およびストレスを受けた細胞で増加し、免疫細胞活性化のためのNKG2D受容体のリガンドとして機能する。TDCA処理により、雌マウスのIELのT細胞上のNKG2D受容体は2倍増加し、雄マウスでも同様の傾向が見られた（Additional file 1: Figure S7E）。また、TDCA処理により、雌マウスのIELにおけるCD8+T細胞上のNKG2D発現が2倍増加し、雄マウスでも増加する傾向が見られた（図5C）。
Treg細胞は、病原性T細胞を免疫抑制することにより、免疫系の恒常性維持に重要な役割を担っている[37]。CD患者ではTregの機能が損なわれている[38]。CD8a+ TCRβ+ CD103+細胞は、CD8+ Treg細胞の新しいサブタイプで、免疫反応の抑制においてCD4+ Foxp3+Treg細胞の機能を補完している[39]。我々は、CD4+CD103+およびCD8+CD103+ Tregの両方を分析した。TDCA処理は、雌（2.45倍）および雄（3倍）両方のマウスにおいて、IELsにおけるCD4+CD103+ T細胞を減少させた（追加ファイル1：図S7F）。TDCA処理はまた、雌のコントロールと比較して、IELsで15.7%、PPで42.5%、およびLPで15.8%のCD8+CD103+細胞の減少を示した。雄マウスのIELsでは、TDCA処理によりCD8+CD103+ T細胞が9.5%減少していることが確認された(Fig. 5D)。
TDCA処理は、メスマウスのNK細胞集団に有意な影響を及ぼした。TDCAは、IEL（2.4倍）、PP（2.5倍）、LP（1.5倍）、および脾臓（1.6倍）においてNK1.1+細胞を増加させた（図6A）。同様に、TDCA投与雄マウスでは、IEL（4倍）およびLP（2倍）においてNK1.1+細胞が増加した（Fig. 6A）。また、メスマウスのIEL（2.4倍）とPP（3.3倍）、オスマウスのIEL（2.4倍）とLP（2倍）でNKp46+細胞の増加が見られた（Fig.6B）。ナイーブNK細胞の活性化を引き起こすには、2つ以上の受容体活性化受容体（NKG2D、NKp46、NKp44、DNAM1、NKp80、2B4、CD16など）の発現が必要である。そこで、NK細胞上のNKG2D+ NKp46+の両マーカーについて解析した。注目すべきは、NKG2D+ NKp46+集団が雌の脾臓細胞で1.3倍、PPで2.7倍、雄マウスの脾臓細胞で1.5倍減少していることである（Fig. 6C）。
図6
図6
TDCA食はNK細胞を増加させるが、Qa-1発現の増加を通じてNK細胞の活性を低下させる。マウスに10週間、チャウ食（コントロール）または0.4％のTDCAを含むチャウ食を与えた。A NK1.1+細胞のCD45+細胞に対する割合。B NKp46+細胞の全CD45+細胞に対する割合。C NKp46+ NKG2D+細胞の全NKP46+細胞に対する割合。D Qa-1+ cells as % of total TCRβ+ cells E Qa-1+ cells as % of total CD8+ cells in the IELs, PP, LP, and spleen of female (left panel) and male (right panel)マウス。データは平均値±SEMで表した。*p<0.05、**p<0.01。統計解析は、対応のないスチューデントのt検定により行った。
フルサイズ画像
TDCA処理により細胞傷害性T細胞におけるQa-1の発現が増加し、T細胞を溶解から保護する可能性が示された
TDCA処理により、HLA-EのマウスホモログであるQa-1の発現が、雌雄マウスのIELのTCRβ+細胞で2倍、雌マウスの脾臓細胞で1.3倍増加した（図6D）。また、雄マウスのIELのCD8+ T細胞では3倍（図6E）、雌マウスの脾臓細胞のCD4+ T細胞では1.2倍に増加する（Additional file 1: 図S7G）。また、回腸組織におけるQa-1遺伝子の発現は、メスマウス（p = 0.069）、オスマウスともに増加する傾向があることを明らかにした（Additional file 1: Fig. S7H）。以前の研究では、T細胞上のQa-1の発現の増加は、活性化CD4+ T細胞をNK細胞のサブセットによる溶解から守り、CD8+ Treg応答を混乱させることが示された[40]。Treg細胞活性の低下は、回腸組織におけるIL-10遺伝子発現の低下で観察された（追加ファイル1：図S7H）。活性化CD4+T細胞の溶解の減少は、自己反応性CD4+T細胞の増加という結果になる。さらに、Qa-1拘束性T細胞制御活性の欠陥は、自己免疫をもたらす可能性がある[41]。注目すべきは、CDのDQ8-Dd-Villin-IL-15tgマウスモデルにおいて、グルテン摂取後に腸上皮でQa-1の発現が増加し、マウスにグルテンフリー食を与えると減少することから、Qa-1とCD発症の間に重要な関連があることが示されている[42]。
考察
腸内細菌は、消化、免疫調節、グルテン代謝、腸管透過性の維持に重要な役割を担っている。これまでに、CD患者における腸内細菌叢組成の変化を示した報告がいくつかある[8,9,10,11,12,13,43,44]。これらの研究は重要な資料を提供したが、これらの微生物の変化が疾患発症に起因するものか、あるいはCD発症に因果関係があるのかはまだ不明である。腸内細菌叢とCD発症の因果関係を明らかにするために、我々は包括的な研究を完了し、健康な子供と比較したCD進行者の腸内細菌叢、IgA反応、血漿メタボローム、サイトカインプロファイルの変化を明らかにした。16S配列決定法を用いて、門や属のレベルでの変化よりも有益なASVレベルでの有意差を同定した。例えば、Bacteroides属に属するいくつかのASVの存在量が2.5歳で有意に減少していることが観察された[45]。B. uniformis [9]、B. stercoris [8]などの抗炎症性種は、健常者と比較してCD進行者で減少している。これらの結果は、CD 進行者および CD 患者で減少しているという既報と一致する[11]。また、5歳児ではPrevotella属やHoldemanella属が減少しており、これらの属はCD患者において減少することが報告されている[11, 46]。また、CD progressorでは両年齢でDialister ASVの増加が観察され、これも以前の報告と一致した[11]。
Planerらは、健常な米国人双子における生後2年間の粘膜IgA反応の進行について報告している[30]。我々は、同様のアプローチで、健常者とCDの状態における腸管IgA免疫の発達を調べた。腸内細菌叢の成熟過程におけるIgA応答の発達に焦点を当てた。フローサイトメトリー解析の結果、IgA応答は非常に選択的であり、腸内細菌叢のごく一部のみがIgAで高度にコーティングされていることがわかった。注目すべきは、5歳の時点で、健常対照者と比較して、CD進行者ではIgA+菌の割合が高かったことである。CD進行症では、乳児（4〜6ヶ月）の糞便サンプル中の分泌型IgA（sIgA）の減少が以前報告された[10]。一方、我々は、5歳におけるCD進行者のIgA被覆細菌の数が2倍に増加していることを確認した。この2つのコホートでは、サンプリング年齢が異なることに留意することが重要である。本研究では、コントロールとCDプログレッサーのIgA+微生物叢の間に有意差があることを確認した（Fig. 2E）。その結果、2.5歳では133個、5歳では29個のASVがIgAで高密度にコーティングされていることが明らかになった。これらのうち、ASV、Coprococcus comes、Bifidobacterium bifidum（2.5歳）、Clostridium lV（両年齢）がCD進行者の粘膜免疫反応の上位標的であると同定された。これらの分類群は、以前に報告されたように、腸のバリアーを保護する常在菌とみなされている[47]。これらの細菌のうち、C.は最近、ヒトの結腸における主なIgA標的として同定され[48]、Clostridium種は宿主によって消化できない大量の栄養素を利用し、腸の恒常性において重要な役割を果たす短鎖脂肪酸（SCFAs）を生産しうる。Actinomyces odontolyticus、Coprococcus comes、Ruminococcaceae、Prevotella copriの各分類群では、CDプログレッサーにおいてICIスコアが10以上であった。これらのうち、Coprocccus comesとRuminococcaceaeは酪酸産生菌であり、炎症と負の相関がある[49, 50]。しかし、Actinomyces odontolyticusとPrevotella copriは炎症性であることが報告されている[51,52,53]。
我々は、プレソート時の存在量と同程度でありながら、CDプログレッサーで特異的に標的とされる分類群をいくつか確認した。このうち、B. vulgatus [54] とClostridium sensu strictoは、CD発症との関連が以前から報告されていた[55]。一方、Bifidobacterium bifidumは5歳の健常児でIgAによって特異的に標的化され、両年齢でICIスコア>10であった。同様に、2.5歳の健康なコントロールで特異的に標的となるBifidobacteriumのASVを同定した。ビフィズス菌は腸内でIgAの産生を刺激し[56, 57]、樹状細胞やTreg細胞を誘導することで免疫反応を調節することが知られている[58]。これらの結果は、Bifidobacterium種が健常者では免疫調節機能を持ち、CD進行者ではそれが失われている可能性を示唆している。
CDの特徴は腸の炎症であるが、この疾患は様々な組織に影響を及ぼす。CD発症の全身的影響を明らかにするため、48種類のサイトカイン、ケモカイン、成長因子のレベルを測定した。CD進行者では、3種類の炎症性サイトカインと1種類のケモカインが増加していた。これらのうち、IL-12、IL1a、IFNA2サイトカインは、以前にCD患者で増加し、グルテンフリー食（GFD）で減少することが示された[59, 60]。IL-12 (p70)はCDの子供で増加した[61]。同様に、我々の結果と一致して、MIP-1b/CCl4ケモカインは、非治療のCD患者において増加した[61]。これらのうち、IL-17E（IL-25）は、TH17細胞を介して自己免疫プロセスを制御し、組織傷害について免疫細胞に警告を与えることによって恒常性を維持する上で重要な役割を果たす「バリアサイトカイン」である[62]。全体として、我々の知見は、診断前の炎症反応の亢進の存在を示している。
我々の分析では、CD進行者において診断前に血漿中の代謝物が有意に変化していることが明らかになった。血漿中代謝物のパスウェイ解析では、ペントースリン酸経路（PPP）、不飽和脂肪酸の生合成、糖脂質代謝、脂肪酸伸長、ガラクトース代謝、アラキドン酸代謝、リノール酸代謝経路などいくつかの経路が同定された。最近のCDプログレッサーにおける糞便メタボロームの研究では、PPPが最も有意に増加した経路の一つであることが示されています[9]。PPPは、我々の解析でも有意に変化した経路の一つである。この経路は、還元型グルタチオンを再生し、活性酸素中間体（ROI）を中和することによって、抗酸化物質としてのNADPHの形成を刺激し、それによって細胞の炎症を制御します[63]。不飽和脂肪酸合成や脂肪酸伸長などの経路は、nuclear factor kappa B（NF-κB）やToll様受容体4（TLR-4）のシグナルを活性化することで炎症を増強することが報告されている[64, 65]。さらに、ガラクトース代謝の増加は、ガラクトースの産生を誘導し、酸化ストレスや腸内細菌の増加をもたらすことが報告されている[66]。
CDの進行因子で血漿中の代謝物が有意に変化しているTDCAは、主に腸内細菌、特にClostridium XIVaとClostridium XIによって産生される共役胆汁酸である[32]。我々のデータは、TDCAが、5歳時にCD進行者で増加したいくつかのClostridium XIVa分類群によって二次的に生じる可能性があることを示唆している。本研究では、慢性的なTDCAへの曝露が、CDの特徴を模倣するのに十分であることを明らかにした。TDCA処理により、C57B6/Jマウスの絨毛萎縮が起こり、十二指腸の絨毛/クリプト比が減少し、雌マウスのIELと雄マウスのLPでCD4+ T細胞が増加する。これらは、CDの進行中に報告された主な表現型の変化である[67]。したがって、我々の発見は、微生物叢由来の代謝物であるTDCAが、小腸におけるCD進行に関連した変化に潜在的に関連していることを示すものである。
CDでは、CD4+ T細胞はいくつかのサイトカインを分泌し、T細胞の膨張を増加させ、IELを介して腸管上皮細胞の殺傷に関与する[68]。これまでの研究で、CDにおけるT細胞を介した腸管上皮細胞の殺傷は、一連の免疫細胞上のNKG2D受容体の発現およびNKG2D受容体のMICAタンパク質との相互作用によって制御されることが示されている[36]。ここでは、TDCA投与により、雌マウスのIELにおいて、T細胞上およびCD8+αβT細胞上のNKG2Dの発現が誘導されることを示す。さらに、CD8+ CD103+ Treg細胞の減少も確認した。CD8+Treg細胞は、パーフォリンや他のサイトカインを介してエフェクターT細胞を溶解する[69]。したがって、TDCA処理は、CD8+ Treg細胞の減少を刺激し、マウスの小腸におけるエフェクターT細胞の増加を介して、炎症の増加に寄与する可能性があることが分かった。また、TDCA投与により、雌雄マウスの脾臓細胞および雄マウスのPPにおいて、NKG2D/NKp46受容体の表面発現をダウンレギュレートすることにより、NK細胞の活性化が低下することを示す。グランザイムBの産生を亢進させる活性型（NKp44/NKp46二重陽性）NK細胞は、活動性のCD患者で減少するため、このこともCD発症に関連している[70]。
CD8+ Treg細胞のサブセットは、自己寛容の維持に不可欠なQa-1を認識する[71]。Qa-1は、CD8+CD103+Treg細胞の抑制を介して、NK細胞による自己反応性T細胞死を抑制する。Qa-1とNKG2A受容体の結合は、NK細胞だけでなくCD8+ Treg細胞に対しても抑制的なシグナルを誘導し、実験的自己免疫脳脊髄炎で示されたように、自己免疫疾患のリスクを高める可能性がある[72]。ここでは、Qa-1発現の増加、CD8+ Treg細胞の減少、NK細胞の活性化の全面的な抑制が観察され、その結果、TDCA投与マウスの小腸の炎症が加速された。現在、CDを治療する唯一の方法は、GFDを厳密に遵守することであるが、患者の20％はGFDに反応せず、症状が持続または再発し続ける[73]。CD は腸管免疫を永久に再形成し、特に TCRγδ+ 上皮内リンパ球の変化が GFD への非反応の根底にあると思われる[74]。我々の発見は、CD進行者の腸内細菌叢の炎症性、特にTDCAの増加が、CDの腸内炎症の初期の重要な構成要素の1つである可能性を示唆している。本研究で同定された炎症性因子は、食事とは無関係に局所的および全身的な炎症を誘発する可能性があり、一部の患者におけるGFDへの不応答を説明する可能性がある。
結論
本研究の結果、診断前のCD患者において、腸内細菌叢、IgA反応、血漿メタボローム、サイトカインプロファイルが明瞭であることが確認された。さらに、腸内細菌が特異的に産生する代謝物であるTDCAと腸管炎症の間に関連性がある可能性を確立した（図7）。TDCAは病気の早期診断マーカーとなる可能性があり、さらに重要なことは、人生の早い段階でTDCA産生菌をターゲットにすることが、CDを管理するアプローチとなる可能性があることです。CD発症における腸内細菌叢とその産物、特にTDCAの役割を理解することは、疾病の病因を理解するための新たな道を開き、新たな予防および治療モデルを明らかにする可能性がある。
図7
図7
絨毛膜萎縮を引き起こす免疫細胞に対するTDCA作用の実験的アプローチと提案されたメカニズム（Biorender.com)
フルサイズ画像
制約事項
本研究の主な限界の一つは、サンプル数が比較的少ないことである。年齢、性別、HLAサブタイプ、母乳育児が腸内細菌叢の構成に影響を与えることが示されている。そのため、これらの基準に基づいて健常者とCD進行者のサンプルをマッチングさせたため、サンプルサイズが大幅に制限された。より大きなサンプルサイズを用いて我々の結果を確認するために、同様の研究が必要である。また、スウェーデンのコホートからサンプルを収集したため、これらの変化がスウェーデンのCD進行者に特有のものか、腸内細菌叢と血漿メタボロームに関連する普遍的なメカニズム・変化を示しているのかを判断することは困難である。さらに、我々は16Sシーケンスを用いて種レベルでの有意差を同定することができたが、ショットガンシーケンスは高い分類学的解像度でより有意な差を同定することができるだろう[75]。最後に、TDCA処理によりC57BL/6Jマウスの絨毛が萎縮することを示すことができたが、これはCDの進行のモデルにはなっていない。
データおよび資料の利用可能性
本研究で解析したすべてのASV関連データは、この発表論文に含まれている（Additional file 2: Tables S2）。本研究で作成した16S rRNA遺伝子配列の生データは、NCBI Sequence Read Archive Bioproject PRJNA631001を通じて入手可能である。血漿メタボロミクスデータは、この発表論文に含まれている（追加ファイル2: 表S8参照）。本研究で生成された腸内細菌叢解析コードは、こちらのリンクから入手可能です：https://github.com/altindislab/celiac-gut-microbiome。
参考文献
Lebwohl B、Sanders DS、Green PHR。セリアック病。Lancet. 2018;391(10115):70–81.
論文
Google Scholar
Wolters VM, Wijmenga C. Genetic background of celiac disease and its clinical implications. Am J Gastroenterol. 2008;103(1):190-5.
記事
Google Scholar
Almallouhi E, King KS, Patel B, Wi C, Juhn YJ, Murray JA, et al. 北米における小児セリアック病の集団ベースの調査における発生率の上昇と提示の変化。J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2017;65(4):432-7.
論文
Google Scholar
Marine M, Farre C, Alsina M, Vilar P, Cortijo M, Salas A, et al.セリアック病の有病率は成人と比較して小児で有意に高くなる。Aliment Pharmacol Ther. 2011;33(4):477-86.
論文
CAS
Google Scholar
Liu E, Dong F, Baron AE, Taki I, Norris JM, Frohnert BI, et al. セリアック病感受性遺伝子型を持つ青年の長期調査におけるセリアック病の高い発生率。Gastroenterology. 2017;152(6):1329-1336 e1321.
論文
Google Scholar
Lionetti E, Catassi C. The role of environmental factors in the development of celiac disease: What is new? Diseases. 2015;3(4):282-93.
記事
キャス
Google Scholar
Nistal E, Caminero A, Vivas S, Ruiz de Morales JM, Saenz de Miera LE, Rodriguez-Aparicio LB, et al. 健康成人とセリアック病患者における糞便細菌集団と糞便細菌代謝の差異. Biochimie. 2012;94(8):1724-9.
論文
CAS
Google Scholar
Cheng J, Kalliomaki M, Heilig HG, Palva A, Lahteenoja H, de Vos WM, et al. 小児セリアック病における十二指腸微生物相の構成と粘膜の恒常性。BMC Gastroenterol. 2013;13:113.
論文
CAS
Google Scholar
Leonard MM, Valitutti F, Karathia H, Pujolassos M, Kenyon V, Fanelli B, et al. 縦断的前向きコホート研究における、リスクのある小児のセリアック病発症への進行のマイクロバイオームシグネチャー。Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118(29):e2020322118.
Olivares M, Walker AW, Capilla A, Benitez-Paez A, Palau F, Parkhill J, et al. 幼少期の腸内細菌叢トラジェクトリーは、セリアック病の発症を予測する可能性があります。Microbiome. 2018;6(1):36.
記事
Google Scholar
Zafeiropoulou K, Nichols B, Mackinder M, Biskou O, Rizou E, Karanikolou A, et al. 診断時およびグルテンフリー食でのセリアック病患児の腸内細菌叢における変化。Gastroenterology. 2020;159(6):2039-2051 e2020.
論文
CAS
Google Scholar
Serena G, Yan S, Camhi S, Patel S, Lima RS, Sapone A, et al. 炎症性サイトカインであるインターフェロンγと微生物由来の代謝物が、セリアック病におけるフォークヘッドボックスプロテイン3アイソフォーム間のエピジェネティックスイッチを決定しています。Clin Exp Immunol. 2017;187(3):490-506.
論文
キャス
Google Scholar
Sellitto M, Bai G, Serena G, Fricke WF, Sturgeon C, Gajer P, et al. 遺伝的にリスクの高い乳児におけるセリアック病自己免疫に関するマイクロバイオーム-メタボローム解析および遅延グルテン曝露の概念実証（Proof of Concept on Delated gluten exposure in genetic at-risk infants）. PLoS One. 2012;7(3):e33387.
論文
CAS
Google Scholar
Stewart CJ, Ajami NJ, O'Brien JL, Hutchinson DS, Smith DP, Wong MC, et al. TEDDY研究による幼児期における腸内細菌群の時間的な発達。Nature. 2018;562(7728):583–8.
論文
キャス
グーグル スカラー
Ludvigsson JF, Andersson E, Ekbom A, Feychting M, Kim JL, Reuterwall C, et al. Swedish national inpatient registerの外部レビューと検証。BMC Public Health. 2011;11:450.
記事
Google Scholar
炎症性腸疾患における大腸菌を特定する免疫グロブリンaのコーティング。Cell. 2014;158(5):1000-10.
論文
キャス
グーグルスカラー
Wilmore JR, Gaudette BT, Gomez Atria D, Hashemi T, Jones DD, Gardner CA, et al. Commensal microbes induce serum IgA response that protect against polymicrobial sepsis（多菌性敗血症から保護する血清IgA応答を誘発する、コミセンサル微生物）。Cell Host Microbe. 2018;23(3):302-311 e303.
論文
キャス
グーグルスカラー
Baskin AS, Linderman JD, Brychta RJ, McGehee S, Anflick-Chames E, Cero C, et al. Regulation of human adipose tissue activation, gallbladder size, and bile acid metabolism by a beta3-adrenergic receptor agonist.ヒト脂肪組織の活性化、胆嚢サイズ、胆汁酸代謝の調節。Diabetes. 2018;67(10):2113-25.
論文
キャス
グーグルスカラー
Drolet J, Tolstikov V, Williams BA, Greenwood BP, Hill C, Vishnudas VK, et al. ヒト乾燥血液スポットおよび尿片の統合メタボロミクス評価. Metabolites. 2017;7(3):35.
トルスティコフV、ニコラエフA、ドンS、ザオG、クオMS. ヒトがん細胞に対するニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（NAMPT）阻害の代謝効果のメタボロミクス解析。PLoS One. 2014;9(12):e114019.
論文
Google Scholar
Callahan BJ, McMurdie PJ, Rosen MJ, Han AW, Johnson AJ, Holmes SP. DADA2: Illuminaアンプリコンデータからの高解像度サンプル推定。Nat Methods. 2016;13(7):581-3.
論文
キャス
Google Scholar
Cole JR, Wang Q, Fish JA, Chai B, McGarrell DM, Sun Y, et al. Ribosomal database project: data and tools for high throughput rRNA analysis.リボソームデータベースプロジェクト：ハイスループットrRNA解析のためのデータとツール。Nucleic Acids Res. 2014;42(Database issue):D633-42.
論文
キャス
Google Scholar
McMurdie PJ, Holmes S. Phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data.（Phyloseq：マイクロバイオームセンサスデータの再現性の高いインタラクティブな解析とグラフィックスのためのRパッケージ）。PLoS One. 2013;8(4):e61217.
論文
CAS
Google Scholar
al OJe: vegan: community ecology package. R' ' パッケージ。The Comprehensive R Archive Network (CRAN) 2019.
Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK. edgeR: a bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.（エッジアール：デジタル遺伝子発現データの差分発現解析のためのバイオコンダクターパッケージ）. Bioinformatics. 2010;26(1):139-40.
論文
CAS
Google Scholar
Benjamini YH, Y. 偽発見率の制御：多重検定に対する実用的で強力なアプローチ。J R Stat Soc Ser B Methodol. 1995;57:289-300.
Google Scholar
Qiu Z, Sheridan BS. マウス小腸免疫系からのリンパ球の単離。J Vis Exp. 2018;132:57281.
Bunker JJ, Bendelac A. IgA responses to microbiota.（微生物叢に対するIgAの反応）。Immunity. 2018;49(2):211-24.
論文
キャス
グーグル・スカラー
Bunker JJ, Erickson SA, Flynn TM, Henry C, Koval JC, Meisel M, et al. 天然多反応性IgA抗体は腸内細菌叢を被覆する. サイエンス. 2017;358:eaan6619.
Planer JD, Peng Y, Kau AL, Blanton LV, Ndao IM, Tarr PI, et al. 双子およびgnotobioticマウスにおける腸内細菌叢と粘膜IgA応答の発達。ネイチャー. 2016;534(7606):263–6.
論文
キャス
Google Scholar
Oh YT, Lee JY, Lee J, Lee JH, Kim JE, Ha J, et al. Oleamide suppresses lipopolysaccharide-induced expression of iNOS and COX-2 through inhibition of NF-kappaB activation in BV2 murine microglial cells. Neurosci Lett.
論文
CAS
Google Scholar
リドロンJM、カンDJ、ヒレモンPB. ヒト腸内細菌による胆汁酸塩の生変換。J Lipid Res. 2006;47(2):241-59.
論文
CAS
Google Scholar
腸内細菌叢と代謝に対する抗生物質の効果は宿主依存的である。J Clin Invest. 2016;126(12):4430–43.
論文
グーグルスカラー
Dickson BC, Streutker CJ, Chetty R. Coeliac disease: an update for pathologists. J Clin Pathol. 2006;59(10):1008-16.
記事
CAS
Google Scholar
NKG2D：免疫細胞の反応性を制御するマスターレギュレーター。Front Immunol. 2018;9:441.
論文
Google Scholar
Hue S, Mention JJ, Monteiro RC, Zhang S, Cellier C, Schmitz J, et al. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease.セリアック病における絨毛の萎縮。Immunity. 2004;21(3):367-77.
記事
Google Scholar
セリアック病患者の腸管粘膜に存在するグリアジン特異的1型制御性T細胞は、病原性T細胞を抑制する。J Immunol. 2006;177(6):4178-86.
論文
CAS
Google Scholar
グランゾットM、ダルボーS、クアリアS、トンマシーニA、ピシアンツE、バレンシックE、その他、セリアック病では制御性T細胞機能が低下している。Dig Dis Sci. 2009;54(7):1513-9.
論文
CAS
Google Scholar
Uss E, Rowshani AT, Hooibrink B, Lardy NM, van Lier RA, ten Berge IJ.（ウスE、ロウシャニAT、フイブリンクB、ラーディNM、ヴァン・リエRA、テン・ベルジIJ）。CD103は、アロ抗原によって誘導される制御性CD8+T細胞のマーカーである。J Immunol. 2006;177(5):2775-83.
論文
CAS
Google Scholar
Lu L, Ikizawa K, Hu D, Werneck MB, Wucherpfennig KW, Cantor H. Qa-1-NKG2A 阻害経路を介したNK細胞による活性化 CD4+ T細胞の制御. Immunity. 2007;26(5):593-604.
論文
CAS
Google Scholar
Qa-1拘束性CD8+制御性T細胞による自己寛容の制御。Semin Immunol. 2011;23(6):446-52.
論文
CAS
Google Scholar
IL-15、グルテン、HLA-DQ8は、セリアック病の組織破壊を促進する。Nature. 2020;578(7796):600–4.
論文
CAS
Google Scholar
Olivares M, Benitez-Paez A, de Palma G, Capilla A, Nova E, Castillejo G, et al. セリアック病発症リスクのある乳児の腸内細菌叢における病原細菌の陽性率の上昇：PROFICELスタディ。Gut Microbes. 2018;9(6):551-8.
Google Scholar
Leonard MM, Karathia H, Pujolassos M, Troisi J, Valitutti F, Subramanian P, et al. Multi-omics analysis reveals the influence of genetic and environmental risk factors on developing gut microbiota in infants at risk of celiac disease. Microbiome. 2020;8(1):130.
論文
CAS
Google Scholar
Sanchez E, Donat E, Ribes-Koninckx C, Calabuig M, Sanz Y. コリアック病と関連する腸内バクテロイデス属菌種。J Clin Pathol. 2010;63(12):1105-11.
論文
CAS
Google Scholar
Di Biase AR, Marasco G, Ravaioli F, Dajti E, Colecchia L, Righi B, et al. セリアック病小児の発症時の腸内細菌叢サインと臨床症状：試験的研究。J Gastroenterol Hepatol. 2021;36(2):446-54.
論文
Google Scholar
Deleu S, Machiels K, Raes J, Verbeke K, Vermeire S. Short chain fatty acids and its producing organisms: an overlooked therapy for IBD? EBioMedicine. 2021;66:103293.
論文
CAS
Google Scholar
Sterlin D, Fieschi C, Malphettes M, Larsen M, Gorochov G, Fadlallah J. Human IgA deficiencyにおける免疫/微生物界面の擾乱。Gut Microbes. 2019;10(3):429-33.
論文
キャス
グーグル スカラー
Wang L, Liao Y, Yang R, Zhu Z, Zhang L, Wu Z, et al. Sj16を分泌する人工プロバイオティクスは、Ruminococcaceae/butyrate/retinoic acid軸を介して大腸炎を改善する。Bioeng Transl Med. 2021;6(3):e10219.
論文
CAS
Google Scholar
Wang G, Huang S, Wang Y, Cai S, Yu H, Liu H, et al. 代謝物による腸管免疫と腸内細菌叢の架け橋. Cell Mol Life Sci. 2019;76(20):3917-37.
論文
キャス
Google Scholar
Valour F, Senechal A, Dupieux C, Karsenty J, Lustig S, Breton P, et al. Actinomycosis: etiology, clinical features, diagnosis, treatment, and management.「放線菌症：病因、臨床的特徴、診断、治療、管理」。Infect Drug Resist. 2014;7:183-97.
Google Scholar
Scher JU, Sczesnak A, Longman RS, Segata N, Ubeda C, Bielski C, et al. 腸内プレボテラ・コプリの拡大が関節炎に対する感受性の増強と相関していること。Elife. 2013;2:e01202.
論文
Google Scholar
Larsen JM. 慢性炎症性疾患におけるプレボテラ菌に対する免疫応答。Immunology. 2017;151(4):363-74.
論文
キャス
グーグル スカラー
Sanchez E, De Palma G, Capilla A, Nova E, Pozo T, Castillejo G, et al. セリアック病リスクに関連する環境および遺伝因子が、Bacteroides種による乳児腸管コロニー形成に与える影響。Appl Environ Microbiol. 2011;77(15):5316-23.
論文
CAS
Google Scholar
Marasco G, Di Biase AR, Colecchia A. Microbial signatures in celiac disease: still far from a final answer. Gastroenterology. 2021;161(1):358-9.
論文
Google Scholar
Park JH, Um JI, Lee BJ, Goh JS, Park SY, Kim WS, et al. Encapsulated Bifidobacterium bifidum potentiates intestinal IgA production（カプセル化ビフィズス菌は腸内IgA産生を増強する。Cell Immunol. 2002;219(1):22-7.
論文
CAS
Google Scholar
健康な小児の腸管免疫グロブリン産生に及ぼすプロバイオティクス製剤の影響。Int J Food Microbiol. 1998;42(1-2):39-44.
論文
CAS
Google Scholar
Konieczna P, Groeger D, Ziegler M, Frei R, Ferstl R, Shanahan F, et al. Bifidobacterium infantis 35624投与によるヒト末梢血中のFoxp3 T制御細胞の誘導：骨髄系および形質細胞系樹状細胞の役割の可能性. Gut. 2012;61(3):354-66.
論文
CAS
Google Scholar
Manavalan JS, Hernandez L, Shah JG, Konikkara J, Naiyer AJ, Lee AR, et al. Serum cytokine elevations in celiac disease: association with disease presentation（セリアック病における血清サイトカインの上昇：病状との関連）。Hum Immunol. 2010;71(1):50-7.
論文
CAS
Google Scholar
Monteleone G, Pender SL, Alstead E, Hauer AC, Lionetti P, McKenzie C, et al. コリアック病の小腸におけるTヘルパー細胞1型反応の促進におけるインターフェロンアルファの役割。Gut. 2001;48(3):425-9.
記事
CAS
Google Scholar
Bjorck S, Lindehammer SR, Fex M, Agardh D. Serum cytokine pattern in young children with screening detected coeliac disease（スクリーニングで検出されたセリアック病の幼児における血清サイトカインパターン）。Clin Exp Immunol. 2015;179(2):230-5.
論文
キャス
Google Scholar
Borowczyk J, Shutova M, Brembilla NC, Boehncke WH. 上皮の免疫学と病態生理におけるIL-25（IL-17E）。J Allergy Clin Immunol. 2021;148(1):40-52.
論文
CAS
Google Scholar
Perl A, Hanczko R, Telarico T, Oaks Z, Landas S. 酸化ストレス、炎症、発がんはトランスアルドラーゼによるペントースリン酸経路で制御されている。Trends Mol Med. 2011;17(7):395-403.
論文
CAS
Google Scholar
炎症性腸疾患における長鎖脂肪酸の役割。Mediat Inflamm. 2019;2019:8495913.
論文
Google Scholar
カルダーPC. 長鎖脂肪酸と炎症。Proc Nutr Soc. 2012;71(2):284-9.
記事
Googleスカラー
Han H, Liu Z, Yin J, Gao J, He L, Wang C, et al. D-ガラクトースは離乳子豚の慢性酸化ストレスを誘発し、腸内細菌叢を変化させる。Front Physiol.2021;12:634283。
論文
Google Scholar
Lauwers GY, Fasano A, Brown IS. 腸症を伴わない、あるいは最小限の十二指腸リンパ球増加症：Much ado about nothing? Mod Pathol. 2015;28(Suppl 1):S22-9.
論文
Google Scholar
ジャブリB、ソリッドLM。セリアック病におけるT細胞。J Immunol. 2017;198(8):3005-14.
論文
キャス
Google Scholar
ワンYM、アレクサンダーSI. CD8制御性T細胞：古いものは今新しい。免疫細胞生物学 2009;87(3):192-3.
論文
CAS
Google Scholar
セリアック病に関連する炎症は、Nkp44/Nkp46ダブル陽性のナチュラルキラー細胞の減少によって特徴づけられる。PLoS One. 2016;11(5):e0155103.
論文
Google Scholar
Choi JY, Eskandari SK, Cai S, Sulkaj I, Assaker JP, Allos H, et al. CD4 T-ヘルパー細胞が発現するQa-1を認識する制御性CD8 T細胞は心臓移植片の拒絶反応を抑制する. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020;117(11):6042-6.
論文
CAS
Google Scholar
Hu D, Ikizawa K, Lu L, Sanchirico ME, Shinohara ML, Cantor H. Qa-1欠損マウスにおける制御性CD8 T細胞の解析。Nat Immunol. 2004;5(5):516-23.
論文
CAS
Google Scholar
Stasi E, Marafini I, Caruso R, Soderino F, Angelucci E, Del Vecchio BG, et al. 長期グルテンフリー食のセリアック病患者における持続的症状の頻度と原因。J Clin Gastroenterol. 2016;50(3):239-43.
論文
キャス
Google Scholar
Mayassi T, Ladell K, Gudjonson H, McLaren JE, Shaw DG, Tran MT, et al. 慢性炎症はセリアック病の組織常在免疫を恒久的に再形成しています。Cell. 2019;176(5):967-981 e919.
論文
キャス
Google Scholar
Wensel CR、Pluznick JL、Salzberg SL、Sears CL. 次世代シーケンサー：マイクロバイオームの臨床的調査を進めるための洞察。J Clin Invest. 2022;132(7):e154944.
参考文献のダウンロード
謝辞
ABIS研究に参加されたすべてのお子様とそのご両親に感謝します。Ingela Johansson, KEF, Linköpingの巧みなサンプル処理、およびÅshild Faresjöのデータ登録に感謝する。Hui PanとJonathan Dreyfussには、最初のバイオインフォマティクス解析（Joslin Diabetes Center Bioinformatics Core）を行っていただいたことに感謝する。Patrick Autissier (Boston College Flow Cytometry Core) および Bret Judson (Boston College Microscopy core)に感謝する。また、Boston Collegeの学部生Typhania Zanou、Yena Sung、Kaan Sevgi、大学院ローテーション生Minqi Shen、Jelena Momirovの技術協力に感謝する。
資金提供
本研究は，G. Harold and Leila Y. Mathers財団の助成金（MF-2006-00926およびMF-1905-00311）により，EAに提供されたものである．ABIS研究は、Swedish Research Council (K2005-72X-11242-11A and K2008-69X-20826-01-4) and the Swedish Child Diabetes Foundation (Barndiabetesfonden), JDRF Wallenberg Foundation (K 98-99D-12813-01A), Medical Research Council of Southeast Sweden (FORSS), Swedish Council for Working Life and Social Research (FAS2004-1775) and Östgöta Brandstodsbolagからサポートされてきた。
著者情報
著者および所属
ボストンカレッジ生物学部、チェスナットヒル、マサチューセッツ州、02467、米国
Khyati Girdhar, Yusuf Dogus Dogru, Qian Huang, Amol Raisingani, Martina Chrudinova, Jaewon Oh, Kristina Kelley & Emrah Altindis
イェール大学医学部免疫生物学教室（米国コネチカット州ニューヘブン、06510
イー・ヤン＆ノア・W・パーム
BERG, LLC, Framingham, MA, USA
ウラジミール・トルスティコフ＆マイケル・A・キービッシュ
スウェーデン、ストックホルム、カロリンスカ研究所、医療疫学・生物統計学部門
Jonas F. Ludvigsson
スウェーデン、エーレブロー、エーレブロー大学病院小児科
Jonas F. Ludvigsson（ヨナス・F・ルドヴィグソン
スウェーデン・リンショーピン大学小児科・生物医学・臨床科学部・ヴィクトリア王女病院（58185, SE, リンショーピン, スウェーデン)
ジョニー・ルドヴィグソン
寄稿
K.GとE.Aは研究計画、データ分析、論文執筆を行った。Y.D.Dはバイオインフォマティクス解析に協力した。K.GとA.R.はすべての動物実験、FACS染色、解析を、M.CとE.Aは多くの動物実験を手伝った。J.L.はABIS研究の責任者で、ヒトの糞便サンプルの収集、分類、データの解釈を支援した。Q.H、Y.Y、N.W.PはIgA-seq実験と解析に協力した。V.TとM.A.Kは血漿メタボローム解析に協力しました。J.F.Lは研究デザインおよび執筆に協力した。著者は、最終版の原稿の作成と承認に貢献したデータの解析に協力した。
共著者
Emrah Altindisにご連絡ください。
倫理に関する宣言
倫理的承認と参加への同意
本研究は、スウェーデンのリンショーピン大学健康科学部（Dnr Linköping 287-96, Linköping 03-092, Linköping 2018/380-32）およびスウェーデンのルンド大学医学部（Dnr Lund 83-97）の研究倫理委員会で承認された。ビデオフィルムの提示に加え、本研究に参加した子どもの保護者から口頭および書面によるインフォームドコンセントを得た。
論文発表の同意
該当なし。
競合する利益
J.F.LはSwedish IBD quality register (SWIBREG)の代表として研究を調整し、本研究はヤンセン株式会社から資金提供を受けている。M.A.KとV.TはBERG, LLCの現従業員であり、ストックオプションを保有しています。他の著者は、競合する利害関係がないことを宣言しています。
追加情報
出版社からのコメント
Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して、中立的な立場を維持しています。
補足情報
追加ファイル1: 図S1.
CDプログレッサーのデモグラフィックとサンプルサイズを説明するフローチャート。図S2. 健常対照者と比較したCD progressorにおける最も濃縮された属/種のバイオリンプロット表示。A. 2.5歳でのASVのFold変化 CD progressor（左パネル、n=15）と健常対照者（右パネル、n=16）。B. 5歳時点でのCD進行症患者（左パネル、n=10）と健常対照者（右パネル、n=13）のASVのFold変化。図S3. IgA配列決定および解析のためのゲーティング戦略。A. CD進行者および健常対照者の便サンプルの16S rRNA遺伝子配列決定（IgA-seq）と組み合わせたIgAベースの便中細菌分離の概略図。MACS。Magnetic-activated cell separation（磁気活性化細胞分離）。B. CD進行者および健常対照者の糞便サンプルからIgA-/+細菌を分離するためのゲーティング戦略。C. 2歳半および5歳の健常対照者（上段）とCD進行者（下段）におけるIgAコートおよび非コート腸内細菌叢ASVを比較したEmpirical Bayes準尤度F検定解析。頻度：ASVの数。FDR。False Discovery Rate（偽発見率）。D. CD進行者と健常対照者（上段：2.5歳、下段：5歳）のIgAコートまたは非コート腸内細菌叢ASVの比較に関するEmpirical Bayes準尤度F-検定分析結果。F. 2.5歳において、腸内細菌叢（プレソーティングサンプル）の存在量は同等であるが、IgAによる標的が異なる代表的なASVを示した箱ひげ図。E. バイオリンプロットは、5歳において、腸内細菌叢（プレソーティングサンプル）において存在量が類似しているが、IgAによって異なる標的となっている代表的なASVを示したものである。図S4. CDの進行者と健常者におけるIgA標的を示すヒートマップ。A. 2.5歳B.5歳におけるCD進行者と健常対照者のIgA+とIgA-サンプル間で有意に異なる上位ASV（ASVs=51、p値に基づいて選択）の相対存在度を示すヒートマップ。各列は個々の参加者を表し、各行はASVを表す。図S5. CD進行因子とCD患者のサイトカインと血漿メタボロームプロファイル。A. 5歳時のCD進行症患者（n=10）と健常対照者（n=10）から得た血漿サンプルで分析した全48サイトカインの比較。データは平均値±SEMで表した。*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. 統計解析は、両側、対になっていない学生のt-検定によって行われた。B. CD進行者と健常対照者の代表的なClostridium XIVa菌の存在量を示すバイオリンプロット（左：IgAコーティングによる分離前、右：IgA+菌の場合）。図S6. フローサイトメトリー解析のためのゲーティング戦略。Strategy 1- TCRβ+細胞におけるNK1.1およびQa-1発現に対するゲーティング戦略。戦略2- CD8、CD4、NKG2D、CD103、およびNKp46のためのゲーティング戦略。図S7．TDCA食は、異なる細胞サブセットにおけるT細胞組成の変化を誘発する。A. コントロールおよびTDCA処理雌マウスの回腸組織切片のH&E画像。フル画像（上段）および高倍率画像（下段）。スケール=20μm。B. コントロールおよびTDCA処理雌マウスの回腸組織切片における絨毛／陰窩比率。C. 雌マウスの回腸組織切片の固有層における形質細胞の数。D. TCRβ+細胞の全CD45+細胞に対する割合。E. NKG2D+細胞のTCRβ+ CD45+細胞に対する割合。F. CD103+細胞、全CD4+細胞の割合として。G. メス（左パネル）およびオス（右パネル）マウスのIELs、PP、LP、脾臓におけるCD4+細胞総数に対するQa-1+細胞の割合。H qPCRを用いて解析した回腸組織におけるQa-1およびIL-10の相対的な遺伝子発現。10週間のTDCA処理後の雌（左パネル）および雄（右パネル）マウスをコントロールと比較した。データは平均値±SEMで表した。*p<0.05, **p <0.01, ***p<0.001. 統計解析は、両側無対称のStudent's t-testによって行った。
追加ファイル2:
表S1. 詳細なコホートおよび糞便サンプル情報コピー。表S2. 完全な16S分類学データおよび解析。表S3. 相対的存在量分析。表S4. CD Progressorにおける2.5および5でのIgA標的ASV。表S5. 各タクソンについて計算されたICIスコア。表S6. 有意に変化した血漿代謝物。表S7. 代謝経路のピアソン相関。表S8. フローサイトメトリー用抗体一覧。
権利と許可
オープンアクセス この記事はクリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスの下に提供されており、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製が許可されています。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれます。もし素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合には、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの献呈放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）は、データへのクレジットラインに特に記載がない限り、この記事で利用可能となったデータに適用されます。
転載と許可
この記事について
CrossMarkで通貨と真偽を確認する
この記事の引用
Girdhar, K., Dogru, Y.D., Huang, Q. et al. 小児セリアック病の発症における腸内マイクロバイオーム、IgA反応、血漿メタボロームの動態. Microbiome 11, 9 (2023). https://doi.org/10.1186/s40168-022-01429-2
引用文献のダウンロード
受付終了
2022年8月9日
受理済
2022年11月16日
公開日
2023年1月13日
DOI
https://doi.org/10.1186/s40168-022-01429-2