不利な子宮内環境は、双子の腸内細菌叢とメタボロームの異常に寄与している

不利な子宮内環境は、双子の腸内細菌叢とメタボロームの異常に寄与している
Jing Yang1、Lingling Hou2、Jinfeng Wang2、Liwen Xiao2,3、Jinyang Zhang2、Nanlin Yin4、Su Yao5、Kun Cheng5、Wen Zhang1、Zhonghua Shi6、Jing Wang7、Hai Jiang1、Nana Huang1、Yanxia You8、Mingmei Lin1、Ruiyan Shang9、Yuan Wei1、Yangyu Zhao1, http://orcid.org/0000-0002-6216-1235Fangqing Zhao2,3,10,11（敬称略
Fangqing Zhao教授、北京生命科学研究所、中国科学アカデミー、北京、中国； zhfq@biols.ac.cn； Yangyu Zhao； zhaoyangyu@bjmu.edu.cn； Dr Yuan Wei； weiyuanbysy@163.com に対応しています。
要旨
目的 胎児発育制限（FGR）は、周産期死亡率および病的状態を増加させる破壊的な妊娠合併症である。本研究の目的は、新生児の微生物群に対する遺伝的環境と子宮内環境の複合的かつ相対的な影響を明らかにし、選択的なFGRによる腸内細菌叢の乱れ、代謝プロファイルの乱れ、起こりうる転帰を探ることにある。

デザイン 絨毛性と胎児出生時体重の不一致に基づいて4群に分類した150組の双子新生児の腸内細菌コロニーをプロファイリングし、比較した。腸内細菌叢の異常と糞便代謝の変化を16SリボソームRNAとメタゲノム配列およびメタボロミクスによって決定し、2~3年の追跡調査後に実施した身体および神経認知発達の調査によって長期的影響を探った。

結果 選択的FGRに関連する有害な子宮内環境因子は、細菌の多様性を上昇させ、早期の腸内細菌叢の構成を変化させる効果において遺伝を圧倒し、この効果は双子における選択的FGRの重症度と正の相関があることがわかった。腸内細菌に対する遺伝的要因の影響は、選択的FGRの文脈では減少する。選択的FGRと糞便代謝変化を伴う双子新生児における腸内細菌叢の異常は、EnterococcusとAcinetobacterの存在量の減少、メチオニンとシステイン濃度の低下を特徴としている。相関分析により、生後間もない乳児の糞便システインレベルは、身体的および神経認知的発達と正の相関があることが示された。

結論 不健全な子宮内環境の影響を受けた選択的FGRには、微生物叢の異常と顕著な代謝の変化が関連しており、長期的な神経行動発達に生物学的異常が影響を及ぼす可能性が強調された。

データ提供について
データは、合理的な要求があれば入手可能である。研究に関連するすべてのデータは、論文に含まれるか、補足情報としてアップロードされている。該当なし。

http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
本論文は、Creative Commons Attribution Non Commercial (CC BY-NC 4.0) ライセンスに従って配布されるオープンアクセス論文であり、原著作物が適切に引用され、適切なクレジットが与えられ、変更があればそれが示され、使用が非商業的であるという条件で、他の者がこの作品を非商業的に配布、リミックス、改作、基にし、異なる条件でそれらの派生物を許諾することを許可しています。参照： http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/.

http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2021-326482

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この研究の意義
このテーマで既に知られていることは？
胎児発育制限（FGR）は、周産期および新生児期の有害な死亡率や神経認知のアウトカム悪化と関連しています。

双子における選択的FGRモデルは、双子ペア内の胎児遺伝因子と母体因子が同一であることから、胎盤関連成長障害を研究するのに適している。

FGR子豚のいくつかの研究では、FGRによって腸内細菌叢のコロニー形成が著しくアンバランスになり、代謝プロファイルが乱されることが示されています。

新しい知見は何ですか？
我々は、73組の一絨毛膜性双生児（MC）と77組の二絨毛膜性双生児（DC）を含む双子出生コホートを構築した。これは、双胎間出生体重不一致のDC双子とMC双子の数としては世界最多となる。

子宮内環境と遺伝の両方が新生児微生物群集を形成し、子宮内環境が悪いと遺伝性分類群のコロニー形成が低下することが明らかになった。

選択的FGRの双子新生児における腸内細菌叢の異常と糞便代謝の変化は、腸球菌の存在量の減少、メチオニンおよびシステインレベルのダウンレギュレーションによって特徴づけられた。

選択的FGRに関連する有害な子宮内環境因子は、乳児の神経行動学的発達に長期的な影響を及ぼしている。

本研究の意義
当面の臨床にどのような影響を及ぼす可能性があるか？
選択的FGRの新生児におけるEnterococcusとAcinetobacterの存在量の減少、それに伴うメチオニンおよびシステインレベルのダウンレギュレーションは、酸化ストレスと1-C（炭素1）代謝レベルの低下を誘発し、選択的FGRの病因に関係する可能性があります。

FGRに起因する縦断的な微生物シフトと代謝プロファイルの障害と相関する神経行動学的障害は、有害な予後を改善するための非侵襲的モニタリングと介入戦略を提供する可能性がある。

はじめに
胎児発育制限（FGR）とは、一般に、母体、胎児、胎盤の様々な条件下で、個体の成長能が制限されることを指す。1 FGRは妊娠の最大10％に生じ、乳児の罹患率と死亡率の主要原因である2 3 さらに、FGRは、長期の神経障害4 5 認知・学習障害6 将来のメタボリック症候群の発症リスク増加およびそれに伴う心臓血管や内分泌疾患7 8など生涯にわたって健康に悪影響を与える可能性がある。

最近、腸内細菌と代謝産物が腸-全身代謝の相互作用において無視できない役割を担っていることが新たな研究により明らかになり、それが幼少期の免疫・代謝発達に影響を与え9 10 、マイクロバイオータ-腸-脳軸を通じて子孫の認知発達と行動に影響を及ぼす可能性があります11 12 宿主遺伝、出生前環境および出産形態が出生時にマイクロバイオームを形成することを示す研究が増えてきました13 双子は遺伝学および環境的に類似しており、遺伝要因と環境要因が腸内マイクロバイオータ形成に及ぼす影響について分離する優れたモデルであると考えられています。例えば、いくつかの双子研究では、腸内細菌叢の遺伝的決定要因について研究されています14 15。しかし、子宮内環境が幼少期の腸内細菌叢に与える影響に関する知見は、現在までのところほとんど知られていないのが現状です。

双子は二絨毛膜二羊膜性（DCDA）と一絨毛膜二羊膜性（MCDA）に分類され、時に周産期の有害事象に悩まされ、主に絨毛性、出生時体重不一致、FGRの胎児が少なくとも1人関与する16 17 二絨毛膜性（DC）双胎妊娠における出生時体重不一致は胎盤量の違いや胎盤不全など様々な遺伝要因または環境要因によることがある18。19 二卵性双胎妊娠と比較して、出生時体重の不一致、すなわち選択的FGRを有する一卵性双胎妊娠は、遺伝的類似性がより高く、末梢臍帯挿入、胎盤の不均一な共有、胎盤血管解剖の特徴に影響される子宮内環境の差に主に起因する20 21、これは、DC双胎のそれよりもMC双胎の周産期の死亡率の上昇につながるかもしれない22選択的FGRモデルは胎盤関連成長障害および遺伝要因と環境要因が腸内マイクロバイオームをいかに形成するかを調べるために最適である。したがって、腸内細菌叢に対する遺伝的および子宮内環境の影響を解明するために、出生時体重不一致を伴う十分にデザインされた双子研究が緊急に必要である。

ここでは、生後数日後の最初の腸の排出から排出までの糞便サンプルを採取し、それらを16SリボソームRNA（rRNA）配列決定、メタボノミクス、メタゲノム配列決定に使用しました。428個の糞便サンプルの16S rRNA配列決定を行い、早期の微生物叢の擾乱を同定した。新生児の腸内細菌代謝に対する遺伝的および環境要因の影響を調べるため、出生直後の糞便サンプル218個について非標的のガス代謝学的研究を実施した。これらの結果を合わせると、不利な子宮内環境に関連する腸内細菌叢の異常と糞便の代謝変化に関するデータが得られた。さらに、選択的FGR双生児12組と出生時体重が一致するMC双生児10組を対象にメタゲノム解析を行い、選択的FGR関連微生物種とその代謝プロファイルへの影響を明らかにした。平均年齢2.5歳の94組の双子の追跡調査を行うことで、さらに幼少期の腸内細菌と代謝産物が長期的な身体および神経行動発達に及ぼす影響を評価した。

材料と方法
被験者の募集
本研究は、現在進行中の双子コホート研究（臨床試験ID：NCT03220750）に基づき実施されました。2017年2月から2018年12月にかけて、中国の北京大学第三病院にて、母親に対してインフォームドコンセントの打診を行った。包含基準は、MCDAおよびDCDAの双子妊娠から2人の生きた新生児、帝王切開分娩、出生後のフォローアップを受けることに同意することなどであった。除外基準は、妊娠第3期の抗生物質使用、内科的合併症、重度の妊娠合併症を含む母体因子、少なくとも1つの胎児における主要な先天性異常または異数性を含む胎児因子（オンライン補足図S1）であった。および双胎間輸血症候群（TTTS）、選択的FGRに重畳したTTTS、TTTSに対するレーザー治療後の選択的FGR、双胎貧血多血症シーケンスを伴う選択的FGR合併、双胎逆動脈灌流などの合併MC双胎妊娠（オンラインの補足図 S2）。

補足資料
[gutjnl-2021-326482supp001.pdf]
図1
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図1
双子コホートの概要と腸内細菌叢のコロニー形成に及ぼす子宮内環境の影響。DCDA-CとDCDA-Dは、それぞれ出生時体重が一致したDC双子と不一致したDC双子を表す。MCDA-CとMCDはそれぞれ出生時体重が一致したMC双生児と出生時体重が不一致のMC双生児を表す。(A）双胎妊娠150例のコホートは、絨毛性と胎児出生時体重の不一致に基づいて4群に分けられた。腸内細菌叢プロファイリング、メタボノミクス、追跡調査について、各双子グループのサンプル数を右表に示す。(B）DCDA-C群、DCDA-D群、MCDA-D群、MCDA-C群における腸内細菌叢のα多様性の比較。(C) Bray-Curtis距離を算出し、4群間で比較した。統計的有意性はWilcoxonの順位和検定で判定した。(D）DCDA-C群、DCDA-D群、MCDA-D群、MCDA-C群における新生児腸内細菌叢の主成分分析プロット。楕円は95％CIを表す。(E）DC双子（赤ノード）とMC双子（青ノード）における胎児出生体重の不一致と一致における各税素の平均相対存在度の比を示す。x軸は異なる細菌を表す。(F)4群における判別性分類群の累積頻度。x軸は4群間の識別性分類群を指す。Y軸は、対応するグループにおける各分類群の累積サンプル頻度を表す。(G) R の Pheatmap パッケージを用いた、4 群の識別分類群のクラスタリング。

図2
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図2
子宮内環境因子と遺伝的因子の両方が新生児の腸内細菌組成を形成する。DCDA-CとDCDA-Dは、それぞれ出生時体重が一致したDC双子と不一致したDC双子を表す。MCDA-CとMCDA-Dは、それぞれ出生時体重が一致したMC双生児と不一致したMC双生児を表す。MCDA-D-LとMCDA-D-Sは、各MCDA-D双生児ペアの出生時体重に応じた大きい双生児と小さい双生児をそれぞれ表す。(A) ACEモデルを用いた新生児の腸内細菌叢形成に対する様々な要因の寄与の定量化。このモデルでは、全分散が遺伝的効果（A）、共通環境（C）、固有環境（E）に分割される。x軸は属レベルで腸内細菌を指し、出生時体重が一致した双子におけるA値に基づいてランク付けされている。y軸は各属の遺伝的効果（赤）、共通環境効果（青）、特異的環境効果（灰）の比率を表す。(B）DCDA-D群とDCDA-C群間、またはMCDA-D群とMCDA-C群間で同定された識別属名。x軸は識別属の相対的な存在比を表す。青丸はDCDA-DまたはMCDA-Dが減少した属、赤丸はDCDA-DまたはMCDA-Dが増加した属をそれぞれ表す。(C) MCDA-C群、MCDA-D-L群、MCDA-D-S群の間で有意差がある細菌属（調整済みp<0.05）。各サンプルにおける属の存在量は104リードで正規化した。(D) MCDA-C、MCDA-D-L、MCDA-D-Sグループ間のメタゲノムシーケンスデータからの4種の相対的存在量。P値は両側Wilcoxonの順位和検定により決定した。DCは二卵性、DCDAは二卵性-羊水性、MCは一卵性、MCDAは一卵性-羊水性。

本研究では、双子の新生児を募集し、絨毛性と胎児出生時体重の不一致によってグループ分けを行った。不一致双生児は、コンセンサスに基づく診断基準24とDCDAとMCDA双生児の出生時体重の不一致の一貫した基準に基づいて、出生時体重の不一致が25％を超え、DCDA双生児の一方の出生時体重が10％未満である双生児と定義された。MCDA双生児における不一致双生児は、TTTSがない場合、上記の同じ2つのパラメータと定義された24。双子新生児は、絨毛性と双胎間体重の不一致により、MCDA-D（出生時体重不一致のMCDA双子、すなわち選択的FGR）、MCDA-C（出生時体重一致のMCDA双子）、DCDA-D（出生時体重不一致のDCDA双子）およびDCDA-C（出生時体重一致のDCDA双子）の4群に分類された（オンライン補足図S3とオンライン補足表S1～S3）。

図3
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図3
子宮内環境の悪化が幼少期の腸内細菌叢に与える縦断的な影響。DCDA-CとDCDA-Dは、それぞれ出生時体重が一致したDC双子と不一致したDC双子を表す。MCDA-CとMCDA-Dは、それぞれ出生時体重が一致したMC双生児と不一致したMC双生児を表す。DCDA-D-LとDCDA-D-Sは、各DCDA-D双生児ペアの出生時体重に応じた大きい方の双生児と小さい方の双生児をそれぞれ表しています。MCDA-D-LとMCDA-D-Sは、MCDA-D双生児ペアの出生時体重により、それぞれ大きい双生児と小さい双生児を表している。(A) 生後数日の新生児腸内細菌叢の多様性。X軸のスケール1、2、3、≧4はそれぞれ初日、2日目、3日目、4日後を表す。P値は両側Wilcoxonの順位和検定により決定した。(B）生後数日以内の各群（DCDA-C群、DCDA-D群、MCDA-C群、MCDA-D群）の腸内細菌叢におけるα多様性。(C）生後数日以内の各群の出生後の微生物群集のBC距離の短期変化パターン。(D) DCDA-C、DCDA-D-L、DCDA-D-S、MCDA-C、MCDA-D-L、MCDA-D-S群におけるEnterococcusとAcinetobacterの存在量シフト。BC, Bray-Curtis; DC, dichorionic; DCDA, dichorionic-diamniotic; MC, monochorionic; MCDA, monochorionic-diamniotic.便の採取，DNA抽出，DNA解析は，DCDA-C, DCDA-D-L, MCDA-D-S, MCDA-D-Sで行った．

糞便サンプリング、DNA抽出、ハイスループットシークエンス
糞便サンプルは、最初の腸からの排出物（メコニウム）から、新生児科または産科病棟を退院するまで毎日採取された。各児童は、出生後少なくとも3日目から糞便サンプルを採取した。サンプリングは、以前に発表されたプロトコールに従って行われた14。約1〜1.5 gの糞便サンプルが、無菌プラスチックスプーンを用いてサンプリングされ、厳格な無菌条件下で無菌チューブに入れられた。すべての検体は、採取後直ちに-20℃で凍結し、DNA抽出とメタゲノムおよびメタボロームプロファイリングを行うまで-80℃で輸送・保管した。DNA抽出、PCR増幅、ライブラリー構築、配列決定作業は、厳密に管理された独立した無菌作業場で、無菌の道具と容器を用いて、統一されたプロトコルで実施された。環境または試薬源による汚染の可能性を排除するため、まずDNA抽出とPCR増幅においてDNAを含まない水を陰性対照として使用し、このプロセスで増幅産物が生じないことを確認した。515F (5'-GTGCCAGCCGTAA-3') と806R (5'-GGACTACHVGTWTCTAAT-3') プライマーを用いて16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を増幅し、イルミナハイセック2500プラットフォームでPE250配列決定を実行した。DNA抽出とPCR増幅の各バッチに、DNAを含まない水のネガティブコントロールを3つずつ入れた。陰性コントロールに増幅産物がない場合のみ、このバッチのサンプルを次の配列決定と解析に使用した。12組のII/III型選択的FGRおよび10組のMCDA-C双子からの糞便サンプルのメタゲノムDNA（サンプルあたり〜0.5μg）を、集束超音波装置（Covaris, Woburn, Massachusetts, USA）を用いて〜300 bp断片にせん断した。NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illuminaの説明書に従い、0.2 µgのDNAでメタゲノムライブラリーを構築した。メタゲノムシーケンスは、HiSeq 2500プラットフォームのPE150で行った。

16S rRNAデータ処理と微生物群集解析
16S rRNA の生データは QIIME2 で処理しました。27 対応する分類学上の位置付けは、q2-feature 分類器を用いて Greengenes データベースから取得した参照配列 (gg-13-8-99-nb-classifier) とアンプリコン配列変異体 (ASV) を比較することによって得ました 28。サンプル内の多様性を示すために、アルファ多様性（Shannon diversity index）を算出した。Bray-Curtis (BC) 距離行列は、標本間の多様性を表すために使用された。BC 距離を用いた主座標分析（PCoA）を行った。分類学的多様性は、各サンプルの総リードをsumで正規化した属レベルの相対存在度で表した。ゼロ値は対数変換前にプラス1して処分した。母親の年齢、体格指数（BMI）、その他の異常を含む母親因子を共変量として、DCDA-D群とDCDA-C群、MCDA-C群とMCDA-D群との間で差のある微生物種を特定するために、Tukeyの正直有意差（HSD）比較を可能にする線形モデルを使用した。Spearman相関の閾値がr>0.5である差属特徴は、RのPheatmapパッケージを使用してクラスタリングした。

遺伝率の計算
腸内細菌叢の組成と機能に対する遺伝的および環境的影響による変動量を決定するために、双子ベースのACEモデル29を採用して、遺伝的要因によって形成された特定の分類群の遺伝率を測定した。ACEモデルは、一卵性双生児（MZ）ペアと二卵性双生児（DZ）ペアの形質変動を比較することにより、加法的遺伝（A）および共通／共有（C）または固有（E）環境要因に関連する対象形質の変動を推定するものである。ACEモデルで推定される双子ペアの類似性（または相違性）は、遺伝子または遺伝、その共通環境（出生前環境、家庭環境、社会経済状況など、双子を互いに類似させる）、その固有（非共有）環境因子（我々の研究では胎盤やへその緒の違いなど何らかの特別な経験や病気、双子を互いに相違させる）により説明可能である。微生物遺伝率を計算する前に、生の計数表は以下のようにフィルタリングされ、変換された。(1) ACEモデルのデータは、MZ双子（MCDAグループの全双子）およびDZ双子（DCDAグループの異性の双子）から収集されたものである。(2) 分娩後初日の糞便サンプルの10%以上に存在する属レベルの分類群のみを使用し、生の微生物数はsumで正規化し、対数変換してスケーリングした。各分類群の遺伝率推定は、Rのmetsパッケージを使用して計算し、A、C、Eの計算において母体因子と新生児因子を制御することで実施した。

メタゲノム解析
出産後1日以内のサンプルのうち、双子の新生児それぞれについて0.2 µg以上のDNA量を持つメタゲノム配列決定のためのサブセットを選択し、MCDA-D-II/III群では12組、MCDA-C群ではランダムに10組を選択した。メタゲノム生リードからAdaptorおよび低品質リードを廃棄し、残りのリードはヒトゲノムリファレンスに基づいてヒト宿主DNAを除去するためにフィルタリングされた。得られたリードは、MetaPhlAn2 (V.2.5.0) を用いてデフォルトパラメータで分類学的プロファイリングを行った30。HUMAnN2を用いて、デフォルトパラメータで微生物群集の代謝経路を決定した31。

糞便サンプルのアンターゲットメタボロミクス解析
出産後1日以内の糞便サンプルを、MCDA-D-II/III群では同じ10組、MCDA-C群では9組をメタゲノムシークエンスに含むアンターゲットメタボロミクスに使用した。糞便サンプルをSpeedVac（LabconcoTM）で乾燥し、10 mg ±1 mgのサンプルを秤量した後、600 µlの100%メタノールに内部標準混合物（10 mM 2,3,3-d4-alanine; 10 mM 2,3,4,5,6-d5-phenylalanine; 2 mM 3,3-d2-tyrosine) を加えました。各便-溶媒混合物を Qiagen Tissuelyser-II (Qiagen, Hilden, Germany) を用いて 30 Hz、30 秒間ホモジナイズし、17 000 g、15 分間の遠心分離後、上清を分離し SpeedVac (Labconco, USA) を用いて乾燥させた。Smart らによって発表されたプロトコルに基づき、乾燥した代謝物をクロロギ酸メチル (MCF) アプローチで化学的に誘導体化しました32。誘導体化したサンプルは、電子衝撃イオン化 (70 eV) で MSD5975 に結合した Agilent GC7890 システム (Agilent, California, USA) によって分析され ました。ガスカラムは、ZB-1701 (30 m×250 µm id ×0.15 µm with 5 m guard column, Phenomenex)を使用しました。GCオーブンプログラムおよび質量分析パラメータは、Hanら33 に従って設定しました。誘導体化した試料は、パルススプリットレスモードで290℃のGCインレットに注入し、ヘリウムガスを1 mL/minに設定しました。補助装置、MS四重極、MSソースの温度は、それぞれ250℃、230℃、150℃に設定しました。検出質量範囲は38 µmから550 µmであった。スキャン速度は1.562 μs-1、溶媒遅延は5.5分であった。

化合物のデコンボリューションと同定には，化学標準物質で構築した MCF マススペクトルライブラリを用いた自動マススペクトルデコンボリューションおよび同定システムソフトを適用した．代謝物の相対量は、社内のMassOmics Rパッケージによって抽出された。糞便中の代謝物量は、内部標準物質と乾燥便の重量の相対値で正規化されました。代謝物の相対的存在量の差とPCoA解析を実施した。16S rRNA分類と代謝物データの両方を持つサンプルは、RのSpiecEasiパッケージ（V.1.0.7）のSPARCCを用いて、p値を推定するために200ブートストラップレプリカで関連解析を行うために採用されました。相関は、RのPheatmapパッケージを使用して、統計的有意性（*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 ）で表示されます。

身体的および神経認知的発達のフォローアップ調査
我々のコホート内の乳児は、生後2年または3年後に追跡調査に参加した。各幼児の身体評価は訓練を受けた専門の医師によって行われ、評価には身長と体重が含まれ、WHOの仕様にしたがって測定された。初めて歩いたり話したりした時期に関する情報は、両親へのインタビューによって得られた。乳児の神経行動発達は、コミュニケーション、粗大運動、微細運動、問題解決、個人的社会性の5つの発達領域を含む乳児用Ages and Stages Questionnaires, third edition（ASQ-3）を用いて評価し、各児童の複合評価で60点を獲得した34 35。すべてのフォローアップ調査は、電話またはオンラインアンケートによる口頭回答で実施された。身長と体重の測定値は Z スコアを用いて標準化し、5 歳以下の子どもについては WHO の Anthro プログラム（V.3.2.2）に従って年齢別身長と年齢別体重という 2 種類の Z スコアを得た。Spearmanの相関を用いて、システインの相対的存在量と、初めて歩いたり話したりする時期との相関を分析した。共変数に実年齢を含めたスピアマンの相関と偏相関を用いて、システイン相対豊度と身体発育の指標およびASQ-3の5つの発育領域との相関を求めた。

統計解析
微生物のα・β多様性、特定分類群の相対現存量差、身長・体重などの身体発育の追跡指標を含む群間比較は、多重検定補正付きWilcoxonの順位和検定を用いて実施した。微生物と代謝物については、Rのveganパッケージ内の「Adonis」関数を用いて、コミュニティの非類似度の有意性を検証するための並べ替え多変量分散分析が行われた。糞便中の微生物および代謝物の相対存在量の差の効果量はTukeyの検定を採用し、p値はBenjamini-Hochberg法を用いて0.05の偽発見率に従って調整した。さらに、16S rRNAシーケンス、メタゲノムシーケンス、アンターゲットメタボロミクスによって得られた細菌と代謝物の相関を、MIMOSAとmmvecを用いて計算しました36 37。

結果
双胎妊娠150例（MC73例、DC77例）を対象とした。胎児出生時体重の不一致により、MC双生児73組をMCDA-D群（30例）とMCDA-C群（43例）に、DC双生児77組をDCDA-D群（26例）とDCDA-C群（51例）に分けた（図1Aおよびオンライン補足表S4）。DCDA-C群には、DCDA-C-SS（同性のDCDA-C）34例とDCDA-C-OS（異性のDCDA-C）17例が含まれた。成長制限の重症度と成長制限胎児への臍帯血の関与に基づいて、MCDA-D群はさらにMCDA-D-I群（I型選択的FGRのMCDA-D、10例）とMCDA-D-II/III群（II/III型選択的FGRのMCDA-D、20例）に分けられた（オンライン補足図S3、オンライン補足表S1, S5）。出生時体重の不一致により、MCDA-D群の各双生児ペアのうち大きい方をMCDA-D-L、小さい方をMCDA-D-Sと称することにした。同様に、DCDA-D群の双子もDCDA-D-L（大きい方）、DCDA-D-S（小さい方）に分類した（オンライン補足表S5、S6）。

新生児の腸内細菌叢の形成には、子宮内環境が遺伝に優る
まず、子宮内環境の悪化による絨毛化やFGRが幼少期の微生物群集に影響を与えるかどうかを調べたところ、DCDA-C群の腸内細菌叢のα多様性はMCDA-C群に比べ有意に高かった（p=0.04、Wilcoxonの順位和検定）（図1B）。DC双生児、特にDZ双生児でα多様性が高いこと（オンライン補足図S4A）は、腸内細菌叢の形成における絨毛性の影響と微生物と遺伝子の関連性の可能性の存在を示唆するものであった。しかし、MCDA-D群の腸内細菌叢のα多様性は、MCDA-C群（p=0.069, Wilcoxonの順位和検定）およびDCDA-C群（図1B）に比べてわずかに高く、MCDA-D-II/III群はMCDA-C群のそれと比べて有意に高いα多様性を示した（p=0.000102, Wilcoxon's rank-sum test）。 000102, Wilcoxon's rank-sum test）およびMCDA-D-I群（p=0.000165, Wilcoxon's rank-sum test）よりも有意に高いα多様性を示した（オンライン補足図S4B）。これらの結果は、出生時の新生児マイクロバイオータのより多様な構成に寄与することで、早期の腸内細菌叢の形成において、子宮内環境による悪影響が遺伝に勝ることを示唆するものであった。注目すべきは、この効果がFGRの重症度と正の相関があることである。

図4
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図4
選択的胎児発育制限のある個体における微生物叢の異常と代謝異常。DCDA-CとDCDA-Dは、それぞれ出生時体重が一致したDC双子と不一致したDC双子を表す。MCDA-CとMCDA-Dは、それぞれ出生時体重が一致したMC双生児と不一致したMC双生児を表す。(A）DCDA-C、DCDA-D、MCDA-D、MCDA-C群における糞便中の代謝物の主座標分析プロット。楕円は95％CIを表す。(B）DCDA-C群とDCDA-D群、MCDA-D群とMCDA-C群を比較し、判別可能な代謝物を同定し、その差の程度によりランク付けした。青丸はDCDA-DまたはMCDA-Dにより制御された代謝物、赤丸はDCDA-DまたはMCDA-Dにより制御された代謝物をそれぞれ示す。(C) DCDA-D群とDCDA-C群で統計的に有意な、Pheatmapパッケージを用いた属レベルでの識別菌の相対存在量と糞便代謝物の相関（*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001). (D) Pheatmapパッケージによる識別属の相対的存在量と糞便中の代謝物の相関は、MCDA-D群とMCDA-C群で統計的に有意であった(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001) (E）メチオニンおよびシステイン合成経路に関与する高濃度の識別微生物遺伝子の相対的存在量と順位（Kruskal testによる）。DC, dichorionic; DCDA, dichorionic-diamniotic; MC, monochorionic; MCDA, monochorionic-diamniotic.

次に、各グループの個体間の微生物群集のBC距離をASVsレベルで算出した（図1C）。MCDA-C群のサンプル間のBC距離は、DCDA-C群のそれよりも有意に小さかった（p=0.038, Wilcoxonの順位和検定）（図1Cおよびオンライン補遺図S4C）。さらに、出生時体重不一致の双子（MCDA-DとDCDA-D）の微生物群集のBC距離は、不一致のない双子（MCDA-CとDCDA-C）のそれよりも有意に大きいことがわかった（p<0.01、Wilcoxonのランクサム検定）(図1C). また、MCDA-D-I群とMCDA-D-II/III群では、MCDA-C群よりも個人間コミュニティで有意な非類似が見られた（p<0.01、Wilcoxonの順位和検定）（オンライン補足図S4D）。これらの結果は、遺伝的環境と子宮内環境の両方が個体間コミュニティ変動に影響を与え、後者がより明白でポジティブな効果を示すことを示していた。

4群間の微生物群集のクラスタリング効果をさらに調べるために、PCoAを実施した。試料は各グループ内でクラスター化し、異なるグループ間で分離しており（p=0.001、Adonis test）、DCDA-CおよびMCDA-C試料の分布は、DCDA-DおよびMCDA-D試料よりも比較的分散していました（図1D）。特に、MCDA-Cサンプルの分布は、DCDA-C-SSおよびDCDA-C-OSサンプルの分布よりも分散していた（p=0.001、Adonis test）（オンライン補足図S4E）。逆に、MCDA-D-II/III群のサンプル分布は、MCDA-D-I群およびMCDA-C群よりもコンパクトであり（p=0.001、Adonis test）（オンライン補足図S4F）、FGRに関連する有害な子宮内環境が、異なる新生児の腸内細菌群集を同じ方向に形成する可能性があることが明らかにされた。

遺伝的要因と子宮内環境の悪影響がどの程度細菌分類群に影響するかを見分けるため、DCDA-D群とDCDA-C群、MCDA-D群とMCDA-C群に分けて、各分類群の平均相対存在度の比率を算出した（図1E）。DCDA-D群とDCDA-C群では、比率が1未満の分類群の数が1以上の分類群の数より明らかに多かったが、MCDA-D群とMCDA-C群ではほぼ同じであった。それぞれの対照群（MCDA-CまたはDCDA-C）と比較して、MCDA-D群ではDCDA-D群よりも特定の細菌分類群の存在量に大きな影響があり、これは子宮内環境の悪さの深刻さと関連している可能性が考えられた。低頻度菌の多くはMCDA-D群およびDCDA-D群で認められ、子宮内環境の悪化による腸内細菌叢の異常が示唆された。また、高頻度領域では、MCDA-D群の面積がDCDA-D群よりも大きく、MCDA-D群の方がDCDA-D群よりも差分菌の頻度が高いことが示された（図1F）。これらの結果から、子宮内環境が新生児腸内細菌叢の形成に大きな役割を果たすことがさらに確認されました。

各群の微生物分類と存在量のクラスタリング解析を行った結果、相対的な存在量に差があり、スピアマンの相関閾値がr>0.5の4群に21属が確認されました（図1G）。数十種類の属が濃縮または枯渇した他の3つのグループと比較して、アクチノバチルスだけがMCDA-Cグループでわずかに濃縮されており、遺伝と子宮内環境の影響が限られていることを考慮すると、MCDA-Cグループで最もα多様性が低いという結果と矛盾しない。

特定の分類群は、子宮内環境または遺伝的な悪因子に対応する
子宮内環境や遺伝的要因が特定の細菌分類群にどのような影響を与えるかを評価するために、双子データを出生時体重が一致する双子と出生時体重が不一致の双子に分離した（図2A）。その結果、選択的FGRが特定の細菌群に与える影響は、環境要因の割合が高く（青色点）、遺伝要因の割合が低く（赤色点）、明らかであることが確認されました。3つの成分源の変動を評価するために、A、C（共通環境）、Eの因子がこれら2つの双子グループの微生物群集に及ぼす影響を比較した。Eの影響を受けた特定の分類群の数は、AやCの影響を受けた分類群よりも有意に多く（オンライン補足図S5）、BilophilaやEubacteriumといった遺伝率0.2以上の高遺伝子蓄積細菌の相対量は、MCDA-C、DCDA-CS、DCDA-C-OS群で有意差があった（p < 0.05, Tukeyの検定）(オンライン補足図S6). これらの結果は、子宮内有害因子が出現すると、遺伝的および共通環境因子の微生物叢への影響が弱まることを示した。

図5
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図5
新生児期の糞便中の代謝物とその後の身体的および神経認知的発達との相関。DCDA-CとDCDA-Dは、それぞれ出生時体重が一致したDC双子と不一致したDC双子を表す。MCDA-CとMCDA-Dは、それぞれ出生時体重が一致したMCDA双生児と不一致のMCDA双生児を表す。(A-D）DCDA-C、DCDA-D、MCDA-C、MCDA-D群間の身長-年齢、体重-年齢、初発会話時間、初歩行時間の比較。統計的有意性はWilcoxonの順位和検定により決定した。(E) Ages and Stages Questionnaires第3版サブスケールの各発達領域について、4群におけるスコア領域の割合の比較。(F）糞便中システイン濃度と身体的・神経認知的発達の評価指標との相関。線形回帰の傾向線の周りの影は95％CIを示す。DC, 二絨毛膜性；DCDA, 二絨毛膜性-羊水膜；MC, 単絨毛膜性；MCDA, 単絨毛膜性-羊水膜。

次に、胎児出生時体重の不一致に関連する分類学的な差異を検討した。注目すべきは、MCDA-D群とMCDA-C群との腸内細菌叢の比較で、DCDA-C群DCDA-D群間のそれよりも顕著なdysbiosisを示し、MCDA-D群ではCoprococcus, Robinsoniella, Oscillospiraが増加、Acinetobacter, Enterococcus, Actinobacillusが減少していた(図2B). また、MCDA-D-II/IIIグループとMCDA-Cグループとの間でも、上記の属においてより有意な差が認められた（オンライン補足図S7）。これらの結果は、子宮内環境の悪さの重症度と腸内細菌叢の異常の間に正の相関があることを示している。次に、MCDA-D群またはDCDA-D群の小型双生児ペアで腸内細菌叢の異常の程度を探索した（オンライン補足図S8）。MCDA-D群またはDCDA-D群の大きい双子ペアと小さい双子ペアの間で比較を行い、大きい双子ペアまたは小さい双子ペアの対照との比較も行った。MCDA-D-SとMCDA-Cの間で最も明らかなdysbiosisが見られた（図2Cおよびオンライン補足図S8）。

最後に、MCDA-D-II/IIIの12組とMCDA-Cの10組を含む44サンプルについて、全ゲノムショットガンシーケンスを行った。MCDA-C、MCDA-D-L、MCDA-D-Sグループ間で判別可能な菌種を比較した。その結果、3群間で有意差を示すEnterococcus属の2種（Enterococcus faecium、Enterococcus faecalis）が検出された。例えば、E. faeciumはMCDA-C群でMCDA-D-S群およびMCDA-D-L群よりも有意に高い存在比を示した（p<0.05、Wilcoxon rank-sum test）（図2D）。16S rRNAとメタゲノム配列を組み合わせることで、選択的FGRの新生児における腸内細菌叢の異常は腸球菌の不在、特に選択的FGRの小さい双子におけるE. faeciumの存在量の減少によって特徴付けられることが明らかとなった。

子宮内環境の悪化が腸内細菌叢に与える縦断的影響
子宮内環境と遺伝的関連性が新生児の短期的な腸内細菌叢の発達にどのような影響を及ぼすかを調べるため、さらに出生後数日間の腸内細菌叢の動的変化を調査した。時系列解析の線形モデルによって、これらのすべてのグループで生後数日以内にα多様性が有意に減少した（図3A-B）。このことから、出生時の一部の細菌分類群が消滅し、出生後の環境変動に伴って新生児期の微生物叢の群集構造が徐々に単純化された可能性が考えられた。

次に、MCDA-C群、DCDA-C-SS群、DCDA-C-OS群を比較し、微生物叢の多様性の変化に及ぼす遺伝的関連性の影響を検討した。3群間のα多様性の差は、出生後数日の間に徐々に消失した（オンライン補足図S9A-B）。子宮内環境の悪影響の可能性を調べるため、MCDA-D-I群、MCDA-D-II/III群、MCDA-C群間での微生物相多様性の低下も比較したところ、MCDA-D-II/III群でのアルファ多様性は出生時の最高から、出生後3～4日で他の2群と同程度まで劇的に低下した（オンラインの補足図 S9C）。選択的FGRに伴う縦断的な微生物シフトを評価すると、EnterococcusとAcinetobacterの存在量の差がMCDA-D-S群、MCDA-D-L群、MCDA-C群で徐々に減少することがわかった（図3D）。

次に、4群の個体間の微生物群集のBC距離をASVsレベルで計算し、比較した（図3C）。MCDA-D群（p=0.37）、MCDA-C群（p=0.35）、DCDA-C群（p=0.15）では、生後数日以内に徐々に非類似度が増加したが、DCDA-D群（p=0.05）ではMCDA-D-I群と同様に個人間コミュニティ非類似度が顕著に低下していた。逆に、MCDA-D-II/III群ではBC距離の急激な増加が観察され（オンライン補足図S9D）、子宮内環境の悪化が出生後の個体間コミュニティ非類似度に寄与している可能性が示唆された。これらの縦断的な変動は、腸内細菌叢の形成において、遺伝よりも子宮内環境の悪影響がより劇的な役割を果たす可能性があり、その影響が出生後数日間持続することを示した。

選択的FGRにおける腸内細菌叢の異常に関連した代謝の変化
メコニウムの微生物シフトと相関する代謝パターンの変化を特徴づけるために、ガスクロマトグラフ質量分析法（GC-MS）を用いて糞便の代謝プロファイルを調査した。PCoAの結果、サンプルの代謝物は各グループ内でクラスター化し、異なるグループ間で分離していた（p=0.001、Adonis test）（図4A）。DCDA-C-OS群およびDCDA-C-SS群の代謝物をMCDA-C群の代謝物と比較すると、代謝プロファイルに対する遺伝的影響を反映して、同様の変化が観察された（オンライン補足図S10）。

DCDA-D群とDCDA-C群の間に比べて、MCDA-D群とMCDA-C群の間にはより多くの有意差代謝産物が存在した。MCDA-D群では、システイン、メチオニン、ジピコリン酸の濃度が低く、合計17種類の差分代謝産物が観察された（図4B）。システインとメチオニンの濃度低下は、MCDA-D-II/III群またはMCDA-D-I群のいずれでも、特に選択的FGRの小さい双子で確認された（オンライン補足図S11, S12）。さらに、腸内細菌叢の変化と糞便中の代謝産物との相関を調べた。DCDA-D群とDCDA-C群の比較で明らかになったように、Oscillospiraのみが4つの代謝産物と負の相関を示した（図4C）。一方、MCDA-DとMCDA-Cの個体では、13の属が異なる代謝産物と有意な相関を示した。注目すべきは、選択的FGR（図2）における腸内細菌叢のディスバイオーシスで、これらの代謝産物と有意な相関が見られた（図4D）。腸内細菌叢のディスバイオシスと一致して、MCDA-D群はDCDA-D群よりも顕著な代謝変化を示し、変化した腸内細菌とより有意な相関を示し、これはMIMOSA（参考）およびmmvec（参考）を用いた相関分析によってさらに確認された（オンライン補足図S13A-C）。

メタゲノム配列のデータでは、メチオニン合成経路は12の微生物遺伝子と密接に関連しており、その相対的な存在量はMCDA-C群よりもMCDA-D-L群およびMCDA-D-S群で少なかった。12の微生物遺伝子のうち、LysC、metB、metCの存在量は劇的に減少していた（p<0.05、クラスカルテスト）。システイン合成経路は4つの微生物遺伝子と密接な関係があり、その相対的な存在量はMCDA-D-L群およびMCDA-D-S群でMCDA-C群より低いことがわかった。4つの微生物遺伝子のうち、cysKとcysEの存在量は劇的に減少していた（p<0.05、クラスカルテスト）（図4E）。注目すべきは、メタゲノムデータで同定されたcysE、cysK、lysC、metBおよびmetC遺伝子が、メチオニン、ノルバリン、システイン、D-アスパラギン酸およびβ-アラニンなどのメタボロミクスで測定した多くのアミノ酸と有意に相関していたことだ（オンライン補足図S13D）。興味深いことに、メタゲノムデータによって分類された細菌と代謝物の相関を測定すると（オンライン補足図S13E）、これらのアミノ酸のほとんどがAcinetobacter baumannii、E. faecium、E. faecalisと有意に相関しており、これらの細菌の重要性がさらに浮き彫りになりました。

以上の結果から、MCDA-Dではシステインとメチオニンの代謝をダウンレギュレートすることにより、遺伝子の枯渇が選択的なFGRと関連していることがさらに確認された。MCDA-DにおけるE. faeciumとE. faecalisの著しい減少と合わせて、腸内細菌叢によるアミノ酸代謝のダウンレギュレーションが選択的FGRにおける病態障害に寄与していると推測された。さらに、MCDA-CとMCDA-Dの違いを比較するために、メタゲノムデータに基づいてこれらの遺伝子と代謝物の代謝経路濃縮解析を行ったところ、窒素代謝、葉酸代謝、ビオチン代謝経路がMCDA-Dで有意に濃縮されていた（オンライン補足図 S13F）。

新生児期のシステインレベルは、その後の身体的および神経認知的発達と相関していた
幼少期の代謝変化がその後の身体的・神経認知的発達に及ぼす影響の可能性を探るため、生後2-3年の乳児の糞便代謝物レベルと身体的・神経認知的発達の評価指標との相関を分析した。MCDA群とDCDA-D群の乳児の身長と体重は、いずれもDCDA-C群に比べ有意に低かった（図5A-B）。同様に、MCDA-C群の乳児の初発語時刻もDCDA-C群より遅かった（p＝0.035）（図5C）。4群間の初歩時間（図5D）、MCDA-C群、MCDA-D-I群、MCDA-D-II/III群の標準化体重・身長（オンライン補足図S14）、DCDA-D群とMCDA-D群の小さい双子と大きい双子の間（オンライン補足図S15）に有意差はみられなかった。

ASQ-3サブスケールは、コミュニケーション、粗大運動、微細運動、問題解決、個人的社会性の5つの発達領域を含み、ASQ-3の完全な合計得点として60点が可能であった。この60点をASQ-3の各ドメインごとに6区間に均等に分け、各ドメインの低得点（30点以下）の出現率をDCDA-D群とDCDA-C群、MCDA-D群とMCDA-C群で比較し、乳児の神経行動発達を評価した（図5E）。DCDA-D群では、DCDA-C群に比べ、個人-社会領域、コミュニケーション、問題解決領域で低スコア（20スコア以下）の出現頻度が高いことが示された。MCDA-D群とMCDA-C群の間でも、個人-社会領域で同様の傾向が見られた。注目すべきは、個人-社会領域において、MCDA-D-II/III群はMCDA-D-I群に比べ、低い得点間隔（10-20点）の頻度が非常に高かったことである（オンライン補足図S14）。MCDA-DとDCDA-D群では、5つの発達領域において、大小の双子ペアの間にほとんど差はなかった（オンライン補足図S15）。

DCDA-C群とDCDA-D群では、5つの領域のそれぞれが糞便中システイン濃度と有意な正の相関を示した。後期高齢者体重とシステイン値の相関はr=0.45（p=0.067）であったが、その差は統計的有意差には達しなかった。糞便中システインレベルと初回発声時間との間に有意な負の相関が認められた（p<0.05）（図5F）。このような関連はMCDA-C群およびMCDA-D群では現れず、これらの群ではより質の高い早期教育介入と出生後の集中的な育児に起因している可能性がある。これらの結果は、子宮内環境による悪影響が身体的・神経行動的発達、特に個人-社会的領域に比較的長期的に影響を及ぼすこと、またFGRの双胎児の場合、生後早期の便中システインの低値が身体的・神経行動的発達と相関する可能性を示している。

考察
疫学的研究により、宿主の遺伝、母親の医学的障害38や胎盤異常39を含む出生前環境、またはこれらの要因の組み合わせが出生時の新生児マイクロバイオータを形成することが明らかにされている。胎児および遺伝的要因の他に、FGRの多くは通常、胎児-母体界面の慢性低酸素による不利な子宮内環境下で発症する。しかし、子宮内環境と遺伝的要因が、特に選択的FGRの初期生育微生物の特徴をどのように決定しているかに焦点を当てた研究はない。我々は、選択的FGRの新生児における腸内細菌叢の異常と糞便代謝の変化を、MZおよびDZ双子のサンプルで調べることにより、新生児微生物群集のより重要なドライバーは遺伝より子宮内環境であること、選択的FGRにおける異種微生物叢は身体的および神経認知的発達に長期的に影響を与えることを証明した。

腸内細菌組成に対する子宮内環境の悪影響については、我々の結果から、選択的FGRにおける腸内細菌叢の異常の程度は、選択的FGRの重症度と高い相関があり、このことは、出生体重が乳児の微生物バランスを決定する基礎因子であることを示した先行研究と一致した40。42 例えば、FGRにおけるAcinetobacterの枯渇とStenotrophomonasの増加というdysbiosisパターンは、子宮内成長制限子豚に関する以前の報告と一致する。44 45 我々の研究では、選択的FGRを持つ個人の早期生活マイクロバイオームにおいてOscillospiraが豊富であることが判明した。さらに、Coprococcus属は低出生体重ブタの脂質代謝機能障害および炎症反応と正の相関があった46。OscillospiraとCoprococcusはともに酪酸産生菌であり47、これまでの研究で、酪酸はグルコース代謝48を調節して大腸上皮の主要エネルギー源となり、細胞内酸化ストレスおよび炎症のアップレギュレーションを介して虚血/再灌流障害を緩和することが明らかにされている49。したがって、選択的FGRにおける酪酸産生菌の増加は、エネルギー代謝の調節と炎症反応の抑制によって子宮内栄養不良を補うメカニズムである可能性があると推測される。

糞便サンプルの16S rRNAアンプリコンおよびメタゲノム配列決定により、Enterococcus属とその代表種（E. faecium）が選択的FGRに密接に関連していることが明らかになった。E. faeciumは、血清中の過剰なフリーラジカルを除去し、様々な抗酸化酵素の遊離を促進し、血清の抗酸化力を向上させることができる50。本研究では、EnterococcusおよびE. faeciumの存在量は、糞便試料中のメチオニンおよびシステインと正の相関があることが分かった。選択的FGRを有する個体では、メチオニンおよびシステインの代謝に関与する遺伝子の存在量が有意に減少していた。これまでの研究51 52により、メチオニンは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）依存性の抗酸化酵素（メチオニンスルホキシド還元酵素Aなど）の活性化因子として活性酸素種（ROS）の濃度を除去することにより酸化ストレスに対抗できることが明らかになっている53。54 新たな研究により、FGR患者の一般的な病理学的異常には、酸化ストレスの増加によって引き起こされる羊水を含む母体-胎盤-胎児循環における血管内皮の損傷55が含まれることが示された。56-58 したがって、早期生命のマイクロバイオームの動的変化と腸球菌コロニー化の減少は、メチオニンおよびシステインのレベルを低下させて、選択的FGR患者では過剰な酸化ストレス反応を介して血管損傷を導くと推察された。

メチオニンは、S-アデノシル-メチオニンの生合成に関与し、コハク酸、ホモシステインの前駆体として作用する主要な1C（炭素1つ）供与体です59。核酸合成およびタンパク質合成における1Cの役割60から、メチオニンおよびシステイン代謝は胎児の栄養および成長において重要な役割を担っています61。さらに、最近のいくつかの研究により、1 C代謝（メチル基転移酵素）によるドーパミン特異的因子63-65のプロモーター領域などのDNAメチル化の変化が、乳児期のFGR患者の神経行動発達異常と関連していることが示されています。したがって、メチオニンおよびシステインの低レベルは、1 C代謝を妨げ、DNA合成およびメチル化を阻害し、その結果、胚および胎児の成長を阻害する可能性がある。このことは、本研究において、FGRの個体におけるシステインの減少が、知恵遅れや神経認知発達異常と関連していたことを説明できるかもしれない。

結論として、我々は選択的FGRによる子宮内環境の悪い新生児における腸内細菌叢の異常と糞便代謝の変化を報告し、それらが短期的なマイクロバイオームの変化と長期的な神経行動学的発達に及ぼす可能性のある影響を探った。エンテロコッカスやアシネトバクターの減少がメチオニンやシステインレベルを低下させ、それによって過剰な酸化ストレスや低レベルの1-C代謝を引き起こしている可能性がある。これらの知見は、子宮内環境の悪化に伴う幼少期の腸内環境の乱れや代謝プロファイルの乱れに関する新しい洞察を提供し、幼少期の微生物コロニー形成の基本的なメカニズムの理解を深めるとともに、腸内細菌叢や関連代謝産物を標的とした、幼少期の有害事象の改善や関連代謝疾患の抑制に貢献すると期待されます。

データ提供について
データは合理的な要求があれば入手可能である。研究に関連するすべてのデータは、論文に含まれるか、補足情報としてアップロードされています。該当事項はありません。

倫理に関する記述
論文発表のための患者の同意
保護者の同意が得られています。

倫理的承認
本研究はヒトを対象とし、The Human Research Ethics Committee of Peking University Third Hospital (IRB00006761-2016145) によって承認された。参加者は、研究への参加に際してインフォームドコンセントを行った。

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補足資料
補足データ
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データ補足1
脚注
JY、LH、JWは等しく貢献した。

寄稿者 FZ は保証人として全体の内容に責任を持つ。FZ と YZ は本研究を構想した。JY, Jinfeng Wang, NY, YW, SY, KC, WZ, ZS, Jing Wang, HJ, NH, YY, ML, RS, YWは試料採取と実験を行った。JY, LH, Jinfeng Wang, LX, JZはデータを解析した。JY、LH、Jinfeng Wang、FZは原稿を執筆した。すべての著者が最終版の原稿を承認した。

資金提供 この研究は、中国国家自然科学基金（32025009、81971399、32070122）および国家重点研究開発プロジェクト（2021YFA1301000、2021YFC2300017）からの助成金により実施されたものである。

競合利益 なし。

証明と査読 委託ではなく、外部査読。

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