バクテロイデス由来のスフィンゴ糖脂質は腸内環境の恒常性維持と共生に重要である

2023年2月9日 10:55

記事| 25巻5号 p668-680.e7, 2019年05月08日号
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バクテロイデス由来のスフィンゴ糖脂質は腸内環境の恒常性維持と共生に重要である
エリック・M・ブラウン
柯暁波
ダニエル・ヒッチコック
ヘラ・ブラマキス
クラリ B. クリッシュ
ラムニック・J・ザヴィエル 10
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脚注を表示するオープンアーカイブDOI:https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.04.002
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ハイライト

スフィンゴ糖脂質欠損バクテロイデス株のコロニー形成は炎症促進性である

バクテロイデスのスフィンゴ糖脂質とその生合成経路をメタボロミクスで解明

IBD患者はバクテロイデスのスフィンゴ糖脂質が減少し、宿主のスフィンゴ糖脂質が増加する。
まとめ
スフィンゴ糖脂質は、膜の構造成分であり、真核生物の重要なシグナル伝達分子である。スフィンゴ糖脂質は炎症と免疫を制御しており、最近、炎症性腸疾患（IBD）患者の便に最も多く含まれる代謝物として同定された。バクテロイデス門の常在菌もスフィンゴ糖脂質を産生するが、これらの代謝物が宿主の経路に与える影響についてはほとんど解明されていない。そこで、スフィンゴ糖脂質が腸の健康に影響を与えるかどうかを調べるために、無菌マウスにスフィンゴ糖脂質欠損のBacteroides thetaiotaomicron株を接種した。Bacteroides由来のスフィンゴ糖脂質が欠損すると、マウスに腸の炎症が生じ、宿主のセラミドプールが変化することが判明した。リピドミクス解析により、スフィンゴ糖脂質の生合成経路を明らかにし、セラミドホスホイノシトールやデオキシスフィンゴ糖脂質など、バクテロイデス由来の多様なスフィンゴ糖脂質が存在することを明らかにした。IBDメタボロームデータセットに含まれるバクテロイデス類のスフィンゴ糖脂質に注釈をつけると、IBDでは存在量が少なく、炎症および宿主のスフィンゴ糖脂質生産と負の相関があることが明らかになりました。これらのデータは、腸内の恒常性維持と共生における細菌のスフィンゴ糖脂質の役割を明らかにするものです。
グラフの概要
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キーワード
スフィンゴ糖脂質
マイクロバイオーム
バクテロイデス
炎症性腸疾患
自然免疫
代謝
炎症
はじめに
スフィンゴ脂質は、すべての真核生物および一部の原核生物の細胞膜のユビキタスな構造成分として機能する脂肪族アミノアルコールである（Hannun and Obeid, 2008）。それらは、炎症、免疫、オートファジー、成長、および生存を制御する中心的な役割を持つ重要なシグナル伝達分子である（Hannun and Obeid, 2018, Köberlin et al., 2015, Maceyka and Spiegel, 2014, Merrill and Carman, 2015, Spiegel and Milstien, 2011）。スフィンゴ脂質を介した代謝および免疫シグナル伝達事象は、炎症性腸疾患（IBD）を含む自己免疫疾患および慢性炎症性疾患に関与している（Bryanら、2016、MaceykaとSpiegel、2014、Nielsenら、2017、NorrisとBlesso、2017）。
スフィンゴ脂質合成は、セリンとアシル-CoAチオエステル（例えば、パルミトイル-CoA）との反応を触媒して3-ケトスフィンガニンを形成する酵素セリンパルミトイル転移酵素（SPT）に依存している（Yardら、2007年）。SPTは、代わりにグリシンまたはアラニンを使用して、それぞれ1-デオキシケトスフィンガニンおよび1-デオキシメチルケトスフィンガニンを形成し得る（Duan and Merrill、2015）。原核細胞、真核細胞のいずれにおいても、このSPTを介した反応がスフィンゴ脂質生合成のコミットメントステップである。3つのスフィンゴイド骨格は、さらに触媒作用により、スフィンガニン、ジヒドロセラミド（DHCer）、および糖（例えば、ガラクトース）、リン酸、ホスホエタノールアミン、ホスホコリン、ホスホ糖（例えば、ホスホイノシトール［PI］）を含み得る特徴ある頭部基を有する複合脂質構造へと変化する（Futerman and Hannun、2004年）。
ほとんどのバクテロイデット類とある種のα-プロテオバクテリアはスフィンゴ糖脂質を合成するが、バクテロイデット類はスフィンゴ糖脂質を生産することが知られている唯一の腸内常在菌である (Olsen and Jantzen, 2001)。バクテロイデテスは、哺乳類の腸内細菌叢の中で最も豊富なメンバーであり、平均的な成人ヒトの腸には、この門の細胞が1兆個以上含まれている（Human Microbiome Project, 2012, Yatsunenko et al.）スフィンゴ脂質はバクテロイデスの総膜のかなりの部分を占め（Anら、2011）、ヒト腸内の潜在的に代謝的および免疫的に活性な代謝産物の大きなプールを提供し、健康および疾患における機能のほとんどが未知である（Heaverら、2018）。以前の研究では、Bacteroides fragilisスフィンゴ糖脂質α-ガラクトシルセラミドが抗原提示分子CD1dに結合し、腸内のナチュラルキラーT細胞（NKT-細胞）の数と機能および大腸炎マウスモデルの進行に影響を与えることが示された（Anら、2014年、Wieland Brownら、2013年）。しかしながら、バクテロイデス類のスフィンゴ糖脂質の全レパートリーと、哺乳類腸管における慢性炎症の自然免疫経路および代謝経路におけるその役割は、ほとんど知られていない（加藤ら、1995、Kunsman、1973、LaBach and White、1969、宮川ら、1979、Rizzaら、1970、Wieland Brownら、2013）。
IBDの間に調節された宿主スフィンゴ脂質代謝の以前の知見（Franzosaら、2019）に基づき、我々は健康および疾患の間の腸におけるBacteroidesスフィンゴ脂質産生の役割を理解しようと努めた。細菌スフィンゴ脂質に対する宿主応答の特徴づけにおいて、細菌スフィンゴ脂質産生の欠如が、マウスにおいて腸の炎症と宿主スフィンゴ脂質代謝物の変化をもたらすことを発見しました。リピドミクス解析により、ヒトのコホートにおいてIBDおよび炎症と負の相関を示す、これまで知られていなかった多くの細菌性スフィンゴ糖脂質が発見されました。これらのデータは、スフィンゴ脂質が腸内の共生とホメオスタシスを維持する役割を担っていることを示唆している。
研究成果
宿主産生スフィンゴ糖脂質の便中濃度はIBDの代謝的特徴である
便のメタボロームデータとメタゲノムデータのペアを持つIBDコホートにおいて、スフィンゴ糖脂質は潰瘍性大腸炎（UC）およびクローン病（CD）被験者のサンプルで最も有意に増加した代謝物クラスでした（Franzosaら、2019年）。ここでは、より感度の高いピークファインディングアルゴリズム（Progenesis QI）を使用してこの研究のメタボロームデータを再解析し、アノテーションできたスフィンゴ脂質の精度と解像度を向上させました（データS1）。IBDで最も有意に増加した上位25代謝物（Hochberg-Benjamini、偽発見率（FDR）<0.01）のうち13は、セラミド、スフィンゴミエリン、スフィンゴシンなどのホスト産生スフィンゴ脂質（18炭素単二重結合（d18：1）スフィンゴイドバックボーンで識別）でした（図1AおよびS1A～S1Y）。代謝物をHuman Metabolome Databaseのようにクラス分けすると、スフィンゴ脂質はt統計によってIBDで最も差のある量の特徴を維持した（図1B）。便中に同定された各ホストセラミド、スフィンゴミエリン、スフィンゴシンの正規化した相対量を合計し、UC、CD、非IBD対照での存在にビン分けし、有意性について解析した（Hochberg-Benjamini；FDR＜0.01）。宿主産生セラミドとスフィンゴシンの量は、UCよりもCDの方が多く、スフィンゴミエリンはUCの方が多かった（図1C-1E；データS1）。
図サムネイルgr1
図1宿主産生スフィンゴ脂質の増加は、IBDの便中における最も重要な代謝物シグネチャーである。
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便の代謝産物は、食事由来、宿主由来、微生物由来の分子を表しています。バクテロイデススフィンゴ脂質産生株がIBD中にどのような影響を受けるかを理解するために、Franzosaら、2019が作成したIBD患者の同じペアメタゲノムおよびメタボロームデータに頼りました。Bacteroidetes種の存在量はCD中に低く（Hochberg-Benjamini、FDR < 0.01）（図1F）、サンプルあたりのBacteroidetes存在量はサンプルあたりのホスト産生セラミド存在量と負の相関を示しました（図1G）。このことから、バクテロイデテス属細菌は宿主産生スフィンゴ糖脂質のバランスを保つために必要であり、宿主の健康を守る役割を担っている可能性が示唆された。
スフィンゴ糖脂質欠損バクテロイデス株の合成と特性評価
Bacteroidesのスフィンゴ糖脂質が腸の健康に果たす役割を機構的に解明するため、スフィンゴ糖脂質を産生できない変異体を作製した。スフィンゴ糖脂質の生合成は、SptがセリンとアシルCoAを3-ケトスフィンガニンに変換することから始まる（図2A）。我々は、酵母や哺乳類のSPTに相同なspt遺伝子（BT_0870）を持つ遺伝学的に扱いやすいB. thetaiotaomicron株を同定した。そこで、B. thetaiotaomicron VPI-5482株のspt遺伝子をtdk-vectorシステム（Wieland Brown et al, 2013）を用いて欠失させた。その後、薄層クロマトグラフィー（TLC）を用いて、野生型株とspt変異株から調製した脂質抽出物を分離し、比較した。変異株ではスフィンゴ糖脂質が存在しないことを確認するために、アミン基と反応して比色ピンク色のバンドを生成するニンヒドリン噴霧を用いた。この方法は、B. fragilisで以前同定されたスフィンゴ糖脂質セラミドホスホエタノールアミン（CerPE）を標識するものである（図2B）。B. thetaiotaomicron spt 変異体 (BTΔSPT) から分離した脂質には期待した CerPE バンドが見られなかったが、このバンドは B. thetaiotaomicron 野生型 (BTWT) 株の脂質抽出物と精製 CerPE 標準物質の C12 sphingosyl-PE (C12 SPE) には現れた (図 2B)。spt欠失後のCerPEおよび他の細菌スフィンゴ脂質の喪失をさらに確認するため、各株の脂質抽出物を液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）を用いて分析した。以前の研究（Anら、2014、Wieland Brownら、2013）で確立されたCerPEの既知の質量（679、693、および707 m/z）に対応するピークは、BTWT抽出物にのみ存在した（図2Cおよび図2D）。BTΔSPT抽出物からのCerPEの不在は、タンデム質量分析（MS／MS）を使用してさらに確認され、そこで、以前の研究（Anら、2014、Wieland Brownら、2013）において確立されたCerPE質量と一致したC12 SPE標準（図S2A）と同様のホスファチジルエタノールアミン（PE）頭部基に対応する141 m／zのニュートラルロスが同定された。さらに、Sptの機能性を示し、BTΔSPT株の相補化後にCerPE産生を回復させることで、Sptタンパク質単独がスフィンゴ脂質合成に必要であることを確認した（図2E）。
図サムネイル gr2
図2B. thetaiotaomicronのセリンパルミトイル基転移酵素の遺伝子欠損によるスフィンゴ糖脂質欠損菌の発生
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細菌の遺伝子発現プロファイルに対するspt欠失の影響を調べるために、リッチおよびミニマル培地におけるBTWTおよびBTΔSPT単培養体のRNA-seqを行った（データS2）。予想通り、spt遺伝子はBTWT培養物において有意に発現が上昇し、その欠失が確認された（図2F）。最小培地とリッチ培地で培養したBTWT株とBTΔSPT株の発現プロファイルを比較すると、外膜タンパク質、脂質トランスポーター、リポポリサッカライド（LPS）生合成遺伝子に変化（ |log2FC| > 2 ）が見られた（図2F; 表S1）。トランスクリプトミクスによって示唆された膜の違いは、ネガティブ染色したBTWT株とBTΔSPT株の電子顕微鏡写真でも明らかであり、BTΔSPT株ではBTWTに比べ膜に沿ってより濃い染色が見られ、膜組成が著しく変化していることが示された（図S2Bおよび図S2C）。膜の超微細構造、転写、およびスフィンゴ脂質産生の変化は、BTΔSPTではBTWTと比較してコロニーサイズと成長速度が減少したことと対応していた（図S2D-S2F）。重要なことは、BTΔSPT株でspt遺伝子を相補することにより、成長速度が野生型レベルに回復したことであり、オフターゲット効果ではなくspt遺伝子の欠如がこの表現型を生み出したことが確認された（図S2F）。
スフィンゴ糖脂質欠損B. thetaiotaomicron株の無菌マウスへの単包接は、腸内炎を引き起こす
スフィンゴ糖脂質欠損バクテロイデス株を確認した後、我々はバクテロイデス菌のスフィンゴ糖脂質が粘膜免疫や腸内脂質代謝に果たすin vivoでの役割について、IBDにおける宿主スフィンゴ糖脂質代謝の変化を説明できるような形で直接考察しようとした。我々は、適応免疫とは独立したバクテロイデススフィンゴ脂質の自然免疫および代謝効果を特異的に解析するために、無菌（GF）マウスにBTWTまたはBTΔSPTを3日間モノコロニー化した（図3A）。GFマウスのコロニー形成に、in vivoでの有意差は認められなかった（図3A）。驚くべきことに、BTΔSPTコロニー化マウスの回腸および大腸切片を調べると、上皮層における炎症の病理組織学的徴候が明らかになり（図3B）、クリプト高さで測定したクリプト過形成によって強調された（図3Cおよび3D）。さらに、BTΔSPTコロニー化マウスの回腸切片は、絨毛あたりの杯細胞の数が多く、杯細胞の過形成を示唆した（図3E）。細胞増殖を評価するためにKi67で染色した上皮は、回腸のクリプトあたりのKi67+細胞の局在や数に異常を示さず（図S3A）、上皮が安定した増殖能力を維持しており、観察された表現型はこれとは無関係であることが示された。腸の炎症は、結腸のサイトカインプロファイルを解析したときにも明らかであった。IL-6およびMCP-1の濃度は、BTΔSPTコロニー化マウスの培養上皮細胞の上清において増加した（＞2倍、Mann-Whitney；p＜0.01）（図3Fおよび図3G）。観察されたIL-6とMCP-1の増加に関連する免疫細胞集団の変化を明らかにするために、BTWT-およびBTΔSPT-コロニー化マウスから大腸固有リンパ球（LPL）を単離した。より多くのF4/80+マクロファージが、BTΔSPT-コロニー化マウスのLPLにおいて見出され（図3H）、この観察は、免疫組織化学によってさらに確認され、BTΔSPT-のLPLに存在するF4/80+細胞がBTWT-コロニー化マウスと比較して増加していることが確認された（図3I）。
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図3スフィンゴ糖脂質欠損B. thetaiotaomicron株の無菌マウスへの単コロニー化により、腸の炎症とバリア機能不全が生じる。
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BTWT-およびBTΔSPT-colonizedマウスの免疫学的特徴をさらに検討するために、小腸の上皮内リンパ球（IEL）とLPLを分離し、染色し、数えた。BTΔSPTコロニー化マウスでは、総IEL数はわずかに減少したが、LPLの細胞数は変化せず、T細胞サブセットの頻度には有意差はなかった（図S3BおよびS3C）。LPLの他のCD45+細胞を分析すると、BTΔSPT-colonizedマウスの小腸ではF4/80+マクロファージの数が約2倍増加し（図S3C）、大腸での知見と一致した。各菌株に対するB細胞応答を理解するために、BTWT-およびBTΔSPT-コロニー化マウスの糞便ペレットについて、フローサイトメトリーに基づくIgA結合アッセイを用いてsIgA結合効率を解析した。これは、タンパク質特異的な適応型sIgAではないため、適応免疫反応に依存しない天然型sIgAの測定であった。B. thetaiotaomicron外膜へのsIgA結合頻度は、BTWTコロニー化マウスと比較してBTΔSPTコロニー化マウスで高く（図S3D）、血清または糞便中のIgAの総量の違いによって混乱することはなかった（図S3E）。
sIgAの結合と内腔への移動の増加は、腸管バリアのリークを示唆しているのかもしれない。粘液層はバリア機能において重要な役割を果たし、MUC2転写レベルはBTΔSPTコロニー化マウスの結腸において著しく減少した（図S3F）；しかしながら、この観察の機能的出力を測定するために組織において一貫した粘液層を検出することができなかった。抗菌ペプチドα-ディフェンシン（DEFA）の発現は、BTΔSPTコロニー化マウスの結腸において上昇した（ただし、統計的に有意ではない；p＝0.054）（図S3G）。スフィンゴ脂質欠損バクテロイデスのコロニー形成がバリア機能に与える影響をさらに解析するために、まず大腸のタイトジャンクションタンパク質TJP1およびCLDN2の転写レベルを調べたが、両者はBTWT-およびBTΔSPT-コロニー化マウス間で変化しなかった（図S3Hおよび図S3I）。次に、試験管内で大腸上皮単層培養を行い、刺激物としてBTWT株およびBTΔSPT株の脂質抽出物を使用した。24時間後の単層膜の経上皮電気抵抗（TEER）を比較すると、BTWTまたはBTΔSPT抽出物で刺激した単層膜の間に差は認められなかった（図S3J）。次に、バクテロイデススフィンゴ糖脂質が単層膜の損傷後の修復能力を変化させるかどうかを、カルシウムスイッチアッセイを行うことによって試験したが、BTWTまたはBTΔSPT抽出物で刺激した単層膜間の回復に差は認められなかった（図S3K）。したがって、我々のin vivoデータに見られるバリア機能障害および炎症は、おそらく免疫成分および脂質-上皮相互作用だけではないものが関与していると思われる。
B. thetaiotaomicronのコロニー形成は、腸内で生物学的に利用可能なスフィンゴ糖脂質に広範な変化をもたらす
腸内におけるバクテロイデスのスフィンゴ糖脂質の変化がどのように炎症につながるかをさらに理解するために、BTWTおよびBTΔSPTのコロニー形成が宿主および細菌由来のスフィンゴ糖脂質プールにどのように影響するかを明らかにすることを目指した。この目的のために、BTWT-およびBTΔSPT-コロニー化マウスおよびナイーブGFマウスの細菌およびセカール抽出物についてアンターゲットリピドミクスを行った（図S4A；データS3およびS4）。どの脂質の特徴が細菌または宿主によって産生され、SPT依存性であるかを決定するために、細菌および糞便の総含有量を正規化し、脂質を抽出してLC-MSによって分析した。約4,600の代謝物特徴が同定され、そのうち443はBTWT-およびBTΔSPT-コロニー化マウス間で有意に変化した（FDR < 0.01）（データS4）。部分最小二乗判別分析（PLS-DA）を用いた盲腸のリピドームの広範な分析、およびピアソン-ワード法による上位250の豊富な特徴のクラスタリングは、BTWT-およびBTΔSPT-入植マウスの間で生物学的利用可能脂質の有意な変化を示した（図S4B）。BTWT-コロニー化マウスのリピドームフィーチャーは、BTΔSPT-コロニー化マウスのリピドームとは別にクラスタリングされた（図S4C）。
SPT依存性および非依存性の宿主および細菌のリピドミクス特徴のこのデータセットを用いて、BTWT-およびBTΔSPT-コロニー化マウスにおいて、細菌のスフィンゴ脂質産生が宿主スフィンゴ脂質プールをどのように変化させるかを理解しようと努めた。各脂質の相対量を用いて、GF、BTWT-、BTΔSPT-マウス間のスフィンゴ糖脂質プールの差異を評価した。宿主産生セラミドは、骨格に偶数の炭素と二重結合を持つが（例えば、セラミドd18：1）、アシル鎖構造は変化しうる。しかし、細菌が産生するセラミドは、これまで骨格に二重結合を持つことが観察されておらず、骨格やアシル鎖の炭素数が奇数であったり偶数であったりする。なお、最小限の培地で単独培養したBTWTでは、注釈付きの宿主産生セラミドが微量に観察された（データS3）。宿主産生セラミドについては、GF、BTWT-、BTΔSPT-コロニー化マウスの間でアシル鎖プールの組成に有意差が見られた（図4AおよびS4D）。このセラミドプールの広範な違いをPCAを用いて定量化したところ、BTWT-およびBTΔSPT-コロニー化マウスのセラミド組成に有意なクラスタリングが見られた（図4B）。炭素数が奇数のアシル鎖（C15、C17、C19）のサブセットが、BTWT-ではなくBTΔSPT-colonizedまたはGFマウスのサンプルにのみ出現することを観察した（図4AおよびS4D）。総セラミドおよび偶数炭素鎖長の存在量は、BTWT-およびBTΔSPT-コロニー化マウスの間で変化しなかった（図4Cおよび4D）。奇数鎖長のセラミドは、BTWTコロニー化マウスでより豊富に存在した（図4E）。スフィンゴミエリン（SM）の存在量は、BTWT-およびBTΔSPT-コロニー化マウス間で変化しなかったが、BTΔSPT-コロニー化マウスではSM（14：0）が増加したことを除いては（図S4E）、BTWT-コロニー化マウスではSM（14：0）は増加した。PEおよびホスファチジルコリン（PC）を含む、哺乳類SPTとは無関係に産生される脂質も評価した（図S4Fおよび図S4G）。いくつかのPEは、GF、BTWT-、およびBTΔSPT-コロニー化マウス間で存在量に有意な変化を示したが（図S4F）、PCレベルはBTWT-とBTΔSPT-コロニー化マウス間で変化しなかった（図S4G）、PC生産がBacteroidesコロニー化から独立していることとPE生産が影響を受けることが示された。
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図4B. thetaiotaomicronの単コロニー化は宿主セラミドプールを有意に変化させる
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バクテロイデス菌のスフィンゴ糖脂質の同定と特性解析
Spt酵素の下流で腸内で生産される未知のBacteroidesスフィンゴ糖脂質のアノテーションを行うため、まずデータセット中の各リピドミクスフィーチャーの相対的重要度をfold-change (>10) およびFDR (<0.01) に基づいてランク付けしました。付加体を除外し、GFマウスで有意に多く存在する脂質を削除した。したがって、BTWT-colonized盲腸でin vivoに存在し、BTΔSPT-colonized盲腸で存在しない特徴のみが解析に含まれることになった。その結果、144種類のユニークなSpt依存性細菌脂質のリストを得ることができた。MSデータ、市販のスフィンゴ脂質標準、CerPEを分離する能力（図2）、および以前の研究（Anら、2014、Wieland Brownら、2013）に基づき、BTWTに存在しBTΔSPT株に存在しない35のユニークなBacteroidesスフィンゴ脂質を、以前の想定よりも大幅に多く注釈した（Table S2）。このアノテーションの信頼度は、これまでの代謝物同定のフレームワーク (Sumner et al., 2007) に基づいてレベル3以上とし、相対量、化学式、ヒト便中での検出量を提示した (Table S2)。我々は、Bacteroides属の1株において、これらのスフィンゴ糖脂質のアノテーションを行うため、B. ovatusのsptノックアウト株を作製した。BTΔSPTと同様に、B. ovatus spt欠失株（BOΔSPT）はB. ovatus WT（BOWT）株と比較してスフィンゴ脂質の生産が欠損しており（データS3）、BOWTと比較して膜構造の変化が見られ（図S5AおよびS5B）、BOWTと比較して増殖率が低下しているがspt遺伝子を補うことにより回復可能（図S5C）であった。
どのSpt依存性および非依存性代謝産物の特徴が細菌内で保存されているかを確立するために、まず、BOΔSPT培養物ではなくBOWTに存在するスフィンゴ脂質含有量をアノテーションした（表S2）。次に、BTWT株とBOWT株の両方からアノテーションされたすべてのメタボロームフィーチャーを組み合わせて、Bacteroides由来の代謝物フィーチャーのデータセットを作成しました。このデータセットから、BTWT株とBTΔSPT株で培養されたマウスの毛細血管に含まれる代謝物のうち、FDRで最も差のある上位50成分をランキングしました（図5A）。予想通り、スフィンガニン、DHCer、CerPEなどのアノテーションされたスフィンゴ糖脂質のほとんどが、海馬間で高い差異を示した（図5A）。スフィンゴ糖脂質のうち、BTWTマウス盲腸で最も多く存在するのはCerPEとDHCerであった（図5B、5C）。また、BTΔSPT膜のスフィンゴ脂質の不足を補う可能性のある、BTΔSPTコロニー化マウス盲腸で有意により多く存在するPEのサブセットを発見した（図5AおよびS4F）。インビボで最も差のあるPEは、PE 32:0とPE 35:0であった（図5Dおよび5E）。
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図5リピドミクス解析により、腸内のセリンパルミトイル基転移酵素に依存する細菌脂質量の広範なシフトと洞察が明らかになった
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これらのデータを総合して、ケトスフィンガニンからスフィンガニン、そしてより複雑なDHCerへの移行に基づくスフィンゴ脂質の代替生合成経路を予測した（図6）。DHCerとCerPEはBTWTが定着したマウス盲腸において最も多く存在する2つの特徴で、それぞれ少なくとも4つの異なる尾の長さで存在した。ここでは、簡略化のため、C17型スフィンゴ糖脂質とC18型デオキシスフィンゴ糖脂質の存在量とその予測される構造を示す（図6）。注目すべきは、BTWTおよびBOWT細菌抽出物において、以前に発表されたα-ガラクトシルセラミドに相当する質量（Wieland Brown et al.、2013）を検出できなかったことである。その代わりに、セラミドホスホイノシトール（CerPI）と予想される豊富なスフィンゴ脂質の特徴が観察され、これらの細菌ではスフィンゴイドバックボーンにガラクトシル糖ではなくイノシトールが合成されていることが示された（図6）。このことは、PI頭部基の質量に対応する260.0289 m/zの同じ中性損失がCerPIとPI 18:1脂質標準物質で同定されたことでさらに確認された（図S5D)。現在までのところ、CerPIは腸内バクテロイデス株によって産生されることも、哺乳類細胞で検出されることも報告されていない（Ren and Hannun, 2016）。
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図6バクテロイデスで最も豊富なスフィンゴ糖脂質代謝物の特徴のスフィンゴ糖脂質生合成経路の提案
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イノシトールの質量はマンノースなどの他の糖と似ていることから、イノシトールを主成分とする頭部基が組み込まれていることのさらなる生物学的根拠を探った。CerPIは酵母膜の共通の特徴であり、CerPI合成に必要な遺伝子はアノテーションされている（Ren and Hannun, 2016）。我々は、酵母CerPI合成酵素遺伝子と我々のBTWTおよびBOWTゲノムのBLAST検索を行い、推定CerPI合成酵素遺伝子（BT_1522；BACOVA_04257）を、PI合成酵素と膜タンパク質を含むオペロンで囲んだ遺伝子群を発見し、ヒスチジンキナーゼ2成分系で制御されていると予想しました（図S5E、図S5F）。我々は、PIがPI合成酵素（BT_1526；BACOVA_0426）により内因的に作られるDHCer骨格へのPIの組み込みに基づくCerPI合成酵素機構を提案した（図S5G）。実際、イノシトールや酵母エキスを含まない最小限の培地でBTWTとBOWTの両方からCerPIが合成されたことから、これらのBacteroidesはイノシトールを内因的に合成してPI頭部基を持つ脂質を作ることができることがわかった（図S5H）。CerPI遺伝子群はBacteroidesの一部の株のみに存在し（図S5I）、α-ガラクトシルセラミド産生B. fragilis ATCC株には存在しなかった。
BTWTおよびBOWT抽出物は、セリンの代わりにアラニンを用いて哺乳類SPTによって合成される、研究されていないが特徴的なスフィンゴ糖脂質である哺乳類1-デオキシスフィンガニンの質量と一致する脂質を保有した（Duan and Merrill、2015）（図6）。BTWTとBOWTはいずれも前駆体のデオキシケトスフィンガニンと生成物のデオキシDHCerも生成しており、これらのアラニン系スフィンゴ糖脂質がバクテロイデスでデノボ合成されていることが示された。この分子がSptによって酵素的に生成されたことを確認するため、炭素源が1つの最小培地にD4標識したアラニンを加えたところ、予測されるアラニンベースのデオキシスフィンガニンおよびデオキシDHCerに対応する質量のみが、セリンベースの対応するものと比較して重水素シフトした（図S6AおよびS6B; データS5）。BTWT株とBOWT株で測定されたデオキシスフィンゴ脂質の割合には有意差があり（図S6CおよびS6D）、Sptタンパク質の株変異がアラニン取り込みに対する親和性に影響を与える可能性があると推測された。以前の研究では、哺乳類のSPT酵素の残基変化がアシルCoAとのアラニン統合を促進することを決定している（Gable et al.）
バクテロイデスにおけるデオキシスフィンガニンの同定は、哺乳類産の市販標準物質を用いた液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（LC-MS/MS）によりさらに確認された（図S6E）。バクテリアの脂質の分岐アシル鎖構造はよく知られており、我々の研究では、同一のBacteroidesスフィンゴ脂質のNMRデータから、この以前の観察に基づいて構造を組み立てた（An et al.、2014、Wieland Brown et al.、2013）。スフィンガニン骨格構造のさらなる証拠を提供するために、等分岐BacteroidesスフィンガニンのLC-MS/MS分析を非分岐スフィンガニン標準品と比較した（図S6F）。C18スフィンガニンとiso-C17スフィンガニンのMS/MSスペクトルは、ほぼ同一であった（図S6F）。逆に、C18 DHCerの哺乳類標準物質とBacteroides DHCerのMS/MSスペクトルは同一ではなかった。これは、細菌が第3の水酸基と奇数鎖長のバックボーンを持つ独自のDHCerを合成することを示している（Figure S6G）。残念ながら、これらのDHCerベースの細菌スフィンゴ脂質の精度を確認するための商業的な基準は存在しない。したがって、我々は、既報の研究（Anら、2014、Wieland Brownら、2013）からの前述のNMRデータに基づいて予測した。本データは、バクテロイデスSptがN-アシル化脂質をもたらす反応を触媒し、これまで認識されていたよりも多くの脂質生成物を担っていることを示すものである。
バクテロイデス菌のスフィンゴ糖脂質は、ヒトの炎症およびIBDと負の相関があること
新たにアノテーションされたバクテロイデス類のスフィンゴ糖脂質と腸の炎症との関連性を調べるため、図1に記載したIBD便メタボロミクスデータセットを検索したところ、メタボロームの94%（155サンプル中146サンプル）で細菌産生のスフィンガニン、DHCer、CerPE、CerPIが見つかりました（図S7A）。Bacteroides属のスフィンゴ糖脂質を含まない9サンプルはCDまたはUC被験者に相当し、そのうち7サンプルはBacteroidetes門にマッピングされた腸内細菌叢が0.1%未満であったことも判明した。CerPEの存在量とBacteroidetesの存在量（図S7B）およびspt遺伝子（図S7C）の両方に正の相関（Pearsonの；p＜0.01）を検出し、Bacteroidetesが腸内の非宿主スフィンゴ脂質の大部分を生産していることが示唆された。
UCおよびCDでは、Bacteroidetesのスフィンゴ糖脂質生産が有意に減少していた（Hochberg-Benjamini、FDR < 0.05） (Figure 7)。細菌のスフィンガニン、DHCerおよびCerPE量は、非IBD対照と比較してUC患者で有意に低かった（図7A〜7D）。CD患者のDHCerとCerPE量は、対照群の半分以下であった（q = 0.021; q = 0.027）（図7Cおよび7D）。スフィンガニンは、CDではなくUCで有意に減少し（p = 0.048）、スフィンガニンレベルが高いサンプルのサブセットが存在した（図7B）。CerPIもまたUCで減少していたが、これは統計的な有意差には達しなかった（図7E）。デオキシスフィンゴ脂質、具体的にはデオキシスフィンガニンとデオキシDHCerもヒトの便で検出されたが、UCまたはCDでは対照試料と比較して減少していなかった（図7Fおよび7G）。便中カルプロテクチン値（腸内炎症のバイオマーカー）を用い、UCおよびコントロールサンプルを、便中カルプロテクチン値が100μg/g便未満（低炎症）、100μg/g便以上（高炎症）の2群にバッチ処理した。これらのサンプル間でCerPE、DHCer、スフィンガニン、およびデオキシスフィンゴ糖脂質の存在量を層別化すると、細菌のスフィンゴ糖脂質存在量と有意な腸の炎症（50パーセンタイル、μg/g便）の間に負の相関があることが明らかになった（図7H）。さらに、糞便カルプロテクチン値とBacteroides由来のCerPE、DHCer、およびスフィンガニン量との間には負の相関があった（Pearsonの；p＝0.008、p＝0.0071、およびp＝0.024、それぞれ）（図S7D-S7F）。デオキシスフィンゴ糖脂質は、炎症レベルが高いサンプルでは減少を示さなかった（図7H）。UCおよびCDサンプルのスフィンゴ糖脂質量を疾患活動性で層別化すると、疾患が活発なサンプルではDHCer、CerPE、スフィンガニンの減少が見られた（CDはHarvey-Bradshaw index > 3、UCはSCCI [Simple clinical colitis index] > 5）（図7Iおよび図7J）。メタゲノム解析によるBacteroidetesの対応する存在量も、活動的なCDで低かったが、統計的な有意差はなかった（図7K）。
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図7バクテロイデス類のスフィンゴ糖脂質はIBDで有意に減少し、腸の炎症と負の相関がある。
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宿主とバクテロイデスの両方が産生するC18スフィンガニンとC18デオキシスフィンガニンは、疾患と有意な相関はなかった（図S7Gおよび7H）。さらに、C18スフィンゴシンの存在量は、細菌性スフィンゴ脂質が存在するBTWT-コロニー化マウスと比較して、BTΔSPT-で増加した（図S7I）。この相関は、IBDコホートにおいても観察された：腸内細菌叢の1％未満がバクテロイデーテスであるUC患者のサブセットにおいて、宿主産生C18スフィンゴシンの存在量が他の試料と比較して顕著に高かった（図S7J）。対照試料とUC試料において、宿主セラミド存在量とBacteroides DHCer存在量の間に負の相関（Pearson；p＝0.008）を見出した（図S7K）。また、C17スフィンガニンとC18スフィンガニン産生量には、コントロールとUCサンプル間で負の相関があり（図S7L）、C17スフィンガニンが検出されないサンプルでは、より高濃度のC18スフィンガニンが検出された（図S7M）。SCCI indexのデータがあるUCサンプルでは、スフィンゴミエリンの総量は、寛解期に比べ、疾患活動期にある患者において約10倍高かった（図S7N）。活動期のUCサンプルは、Bacteroides DHCerの存在量が有意に低かった（図7I）。これらのデータは、IBD発症時に細菌が産生するスフィンゴ脂質の不足を宿主が補っている可能性を示している。
考察
腸内細菌叢の代謝産物は宿主にシグナルを送り、IBDの健康アウトカムにプラスにもマイナスにも寄与します（Lee-Sarwarら、2018、Wlodarskaら、2015）。これらのシグナルを解読するための大きな障害は、微生物叢が産生する代謝産物の根本的な理解の欠如です。細菌由来の腸内代謝物の同定と特徴付けは、細菌と宿主の代謝物の特徴を区別できないこともあり、依然として困難です。本研究では、宿主と細菌のスフィンゴ糖脂質の分離に成功し、IBD患者の便ではバクテロイデスのスフィンゴ糖脂質が有意に減少し、腸の炎症と負の相関があること、一方、IBD便では宿主スフィンゴ糖脂質が増加し、バクテロイデスの存在量と負の相関があることを見いだしました。我々のin vivoマウス研究は、これらのヒトコホートデータを裏付け、細菌と宿主のスフィンゴ脂質経路の両方が、炎症とIBDの間に制御されなくなるという証拠を提供した。この発見は、IBD発症に関連する経路（例えば、オートファジー、ERストレス、自然免疫応答、およびGタンパク質共役受容体シグナル伝達）におけるスフィンゴ脂質シグナルの中心的役割、健康なヒト腸内のスフィンゴ脂質生産細菌の高い存在（Bryanら、2016）、およびいくつかのIBDコホートで観察されたバクテロイデテス存在量の著しい減少（Geversら、2014、ZhouおよびZhi、2016）から、重大なものです。
野生型またはスフィンゴ糖脂質欠損バクテロイデス株でコロニー形成したGFマウスを3日後に分析することにより、細菌スフィンゴ糖脂質の有無に対する自然免疫応答を明らかにした。B. thetaiotaomicron株およびB. ovatus株のいずれにおいても、NKT細胞相互作用因子であるα-ガラクトシルセラミドを同定することができなかった。BTWT-colonizedマウスは、以前の研究（Goodmanら、2009、Leeら、2013、Wexler and Goodman、2017）と一致して、炎症および病理組織学的特徴の変化を欠いた。BTΔSPT-colonizedマウスは、炎症の徴候を示し、最も強い免疫シグナルは、IELおよびLPL集団におけるマクロファージの増加であった。マクロファージの存在の増加は、これらの細胞に炎症環境およびケモカインシグナルを提供するMCP-1分泌の対応する増加によって説明され得る。
BTΔSPTコロニー形成マウスにおける炎症が、どの程度、細菌のスフィンゴ糖脂質欠乏の直接的影響であるかは、他の下流の変化がこの観察結果を混乱させる可能性があるため、まだ不明である。我々のトランスクリプトーム解析により、これらのマウスでは多くの多糖類遺伝子の発現も異なっていることが明らかになった。逆に、これらの炎症性シグナルは、スフィンゴ糖脂質が媒介する細菌からの寛容性シグナルの消失に起因している可能性もある。宿主免疫系は、共生細菌によるコロニー形成に対して概ね寛容に反応するように進化しており、保存された外膜成分はバクテロイデス共生能力において役割を果たすことができます（Donaldsonら、2018年、Roundら、2011年、Vatanenら、2016年）。RNA発現プロファイル、メタボローム解析、sIgA結合、膜超構造を通して、スフィンゴ糖脂質欠損バクテロイデス株の外膜は野生型と大きく異なり、共生宿主相互作用を阻害する可能性があると結論付けました。
我々は、Bacteroidesのスフィンゴ脂質の全レパートリーを特徴付け、ヒトとマウスの便に最も多く含まれる代謝物の特徴としてDHCerスフィンゴ脂質を同定した。バクテリアのDHCerはC15からC20のスフィンガニンで合成されるが、C17、C18、C19ベースの脂質が最も豊富であった。細菌のスフィンゴ脂質のアシル鎖長の違いによる機能的な違いは不明であるが、哺乳類のセラミドでは鎖長の違いがシグナル伝達能力に影響を与えることが知られている（Grösch et al.）ここでは、バクテロイデス菌のスフィンゴ糖脂質が分岐したアシル鎖を持ち、スフィンガニン骨格に結合した2級アシル鎖に余分な水酸基があることを示す過去の文献に基づいて、構造を推定した（Wieland Brown et al.、2013）。研究は、分岐したアシル鎖とヒドロキシル基がより強力なシグナル伝達能を付与する可能性を示唆している（Hannun and Obeid, 2008, Siddique et al, 2015）。
既知の細菌性スフィンゴ脂質に加え、我々の細菌データセットでは、これまで真核細胞でのみ報告されていたデオキシスフィンゴ脂質が同定されました。これらのデオキシスフィンガニンおよびデオキシDHCerは、セリンではなくアラニンが組み込まれた結果、特徴的なメチルヘッドグループを有する（Duan and Merrill, 2015）。重要なのは、デオキシDHCerの頭部基に遊離水酸基がないため、この分子はより複雑な頭部基の酵素による付加を受けられず、経路の行き止まりにつながるという点である。デオキシDHCerの蓄積は、プロテインキナーゼC-zetaを活性化するなどの独自のシグナル伝達特性を持ち、インスリンシグナルの変化を介して糖尿病などの疾患に影響を与える可能性がある（Duan and Merrill, 2015）。また、腸内細菌は、酵母で一般的に合成されるスフィンゴ糖脂質であるCerPIと一致するスフィンゴ糖脂質代謝物を生成することを明らかにしました（Ren and Hannun, 2016）。デオキシスフィンゴ脂質やCerPIの宿主や細菌のプロセスにおける正確な機能は不明であり、これらのスフィンゴ脂質の生産に対する真菌の貢献も不明であるが、本研究は、バクテロイデスがスフィンゴ脂質の生産を哺乳類宿主との共生関係の維持に必須であることを示唆している。
STAR★Methods
主要リソース一覧
試薬またはリソースソース IDENTIFIER
抗体
Anti-mouse-IgA (mA-6E1) ebioscience RRID: AB_465917; Cat. # 12-4204-82
抗 CD3e (eBio500A2) ebioscience RRID: AB_837128; Cat. # 48-0033-82
抗 CD45 (30F-11) ebioscience RRID: AB_467251; Cat. # 45-0451-82
抗 CD4 (RM4-5) ebioscience RRID: AB_467067、Cat. # 11-0042-82
抗 CD8 (53-6.7) ebioscience RRID: AB_467087; Cat. # 17-0081-82
抗 F4/80 ebioscience RRID: AB_2277854、Cat. # 47-4801-80
抗γδTCR（eBioGL3） ebioscience RRID: AB_842756; Cat. # 12-5711-82
抗 CD38 (90) ebioscience RRID: AB_467219; Cat. # 12-0381-82
抗 CD11b（M1/70） ebioscience RRID: AB_467108; Cat. # 48-0112-82
抗 CD11c (3.9) ebioscience RRID: AB_1659668; Cat. # 35-0116-42
抗 F4/80 (IF/IHC) Abcam Cat. # Cat.
抗 Ki67（IHC）バイオレジェンド社 Cat. # 652402
菌種
大腸菌 PIR2 本試験 N/A
E. coli S17-1 λ pir この研究 N/A
B. thetaiotaomicron VPI-5482 Δtdk Koropatkin et al, 2008 N/A
B. thetaiotaomicron VPI-5482 Δtdk Δspt この研究 N/A
B. thetaiotaomicron VPI-5482 Δtdk Δspt att1::pNUB2-PBT1311 この研究結果 N/A
B. thetaiotaomicron VPI-5482 Δtdk Δspt att1::pNUB2-PBT1311-BT0870 この試験結果 N/A
B. thetaiotaomicron VPI-5482 Δtdk Δspt att1::pNUB2-PBT1311-BACOVA_02588 この試験結果 N/A
バクテロイデス・オヴァタス ATCC 8483 Δtdk ハリー・ブルマー（Tamura et al., 2017） N/A
Bacteroides ovatus ATCC 8483 Δtdk Δspt この研究 N/A
生体試料
非 IBD および IBD 対象者のヒト便 MGH の PRISM コホート (Franzosa et al., 2019) IRB ref # 2004-P-001067
化学物質と代謝物
C12 スフィンゴシル PE (d17:1) Avanti Cat. # 860529
C17 セラミド（d18:1/17:0） Avanti Cat. # 860517
スフィンゴシン(d17:1) Avanti Cat. # 860640
1-デオキシスフィンガニン（m18:0） Avanti Cat. # 860493
スフィンガニン（d17:0） Avanti Cat. # 860654
C18ジヒドロセラミド（d18:0/18:0） Avanti Cat. # 860627
N-C16-deoxysphinganine Avanti Cat. # 860462
18:1 PI Avanti の Cat. # 850149
L-アラニン-2,3,3,3-d4 Sigma Cat. # 485845
5-フルオロ-2′-デオキシウリジン Sigma Cat. # 856657
Percoll GE Healthcare Cat. # 17-0891-02
コラゲナーゼシグマ社製 Cat.#C5138
ウシ胎児血清 Thermo Fischer Cat. # 10438026
クロロホルム Sigma Cat. # 650471
メタノール Sigma Cat. # 34860
ニンヒドリン Sigma Cat. # 151173
Isopropapanol Sigma Cat. # 34863
M9ソルト Teknova Cat. # M8008
アンピシリン Sigma Cat. # A0166
ゲンタマイシン Sigma Cat. # G1397
エリスロマイシン Sigma Cat. # E0774
セロビオース Becton Dickinson Cat. # 216010
マルトース Hardy Diagnostics の Cat. # C6220
フルクトース Sigma Cat. # F0127
L-システイン Sigma Cat. # 168149
市販のアッセイキット
Qiagen RNeasy Plus Mini Kit Qiagen Cat. # 74136
マウス炎症サイトカインビーズアレイ BD Biosciences社 Cat. # 552364
SuperScript III reverse transcriptase kit Invitrogen Cat. # 18080051
Direct-Zol RNA MiniPrep Plus Zymo Research Cat. # R2060
マウスIL-6 ELISAセット BD Biosciences社 Cat. # 555240
Mouse MCP-1 ELISA Set BD Biosciences社製 Cat. # 555260
寄託データ
メタボローム解析本試験 www.metabolomicsworkbench.org; Metabolomics Workbench: PR000754
参照標準を用いたMS/MS解析この研究のGNPS: MSV000083552
RNA-sequencingデータ本試験 Sequence Read Archive; SRA: PRJNA517943
実験モデル
C57BL/6N マウス Taconic B6-F
プラスミド
pExchange_tdk Harry Brumer (Tamura et al., 2017) N/A
pExchange_tdk_BT0870_DEL この研究 N/A
pExchange_tdk_BACOVA_02588_DEL この研究 N/A
pNBU2_erm Koropatkin et al., 2008 N/A
pNBU2-PBT1311 この研究 N/A
pNBU2-PBT1311-BT0870 この研究 N/A
オリゴヌクレオチド(5'-3')
BT0870_Up700b_BamHI_F- ctgactGGATCCgagataagtca この試験 N/A
BT0870_Down1kb_NotI_R- ATATATGCGGCCGCGTAATG この研究 N/A
BT0870_Up1kb_F-cacagcccgtcgaatacaacこの研究N/A
BT0870_Down1150b_R- tctgctaccaagttctacatgaac この研究 N/A
BACOVA_02588_Up1kb_F- GGATGCACAACTGCTTGCAG この研究結果 N/A
BACOVA_02588_Down1kb_R- GGCATAATGTGGAGCTGTTG この研究 N/A
NdeI-SPT-F- TGAGCTCATatgggattacaagagaagttagc この研究 N/A
BamHI-BACOVA_02588-R- ACGATAGGATCCTTATAAAAGATC

CAATGCTTTAAATG この研究 N/A
BamHI-BT0870-R- ACGATAGGATCCttacaaaggtactaaagctttg この研究 N/A
BT_att1_F- CCTTTGCACCGCTTTCAACG この研究 N/A
BT_att1_R- TCAACTAAACATGAGATACTAGC この研究 N/A
BT_att2_F- TATCCTATTCTTTAGAGCGCAC この研究 N/A
BT_att2_R- GGTGTACCTGGCATTGAAGG この研究はN/Aである。
ソフトウェアとアルゴリズム
Prism 7 グラフパッドソフトウェア https://www.graphpad.com/
FlowJo v11 FlowJo LLC https://www.flowjo.com
Tracefinder Thermo Fischer https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30491
Progenesis QI Nonlinear Dynamics http://www.nonlinear.com/progenesis/qi/
edgeR Robinson et al., 2010 Pubmed ID # 19910308
CellQuest Becton Dickinson www.bdbiosciences.com
メディア
1%ビタミンK1-hemin溶液 Becton Dickinson Cat. # 212354
1%ビタミンサプリメント ATCC Cat. # MD-VS
1%微量ミネラルサプリメント ATCC Cat. # MD-TMS
Brain Heart Infusion Becton Dickinson Cat. # 241830
ルリアベルタニ(LB) Sigma Cat. # L3522
RPMI 1640 Thermo Fischer Cat. # 11875093
DMEM Thermo Fischer Cat. # 11965-084
その他
アルミニウム TLC プレート Sigma Cat. # 60778
HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs社製Cat. # E2621S
Q5 High Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs社製 Cat. # M0491S
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試薬・リソース共有に関するお問い合わせ先
試薬に関するお問い合わせは、Lead ContactであるRamnik J. Xavier (xavier@molbio.mgh.harvard.edu)までお願いします。
実験モデルおよび被験者の詳細
マウス実験
6週齢の雌のC57BL/6N無菌マウスをTaconic USAから購入し、University of British ColumbiaまたはJoslin Diabetes Center at Harvard Medical Schoolのいずれかの施設にて維持した。各施設において、マウスは1ケージあたり3匹でケージに収容され、滅菌された餌と水を自由に摂取できるようにした。マウスは実験群にランダムに割り当てられた。接種後、マウスはUBCではバリア施設、Joslinでは無菌施設に収容され、実験終点まで3日間無菌状態が維持された。すべての実験手順は、各施設のInstitutional Animal Care and Use Committee（IACUC）により承認されたプロトコルの下で実施された。
ヒト被験者
非炎症性腸疾患（IBD）対照者またはクローン病（CD）もしくは潰瘍性大腸炎（UC）患者の便試料は、MGHのIBD研究における前向き登録（PRISM）から採取された。この患者レジストリの詳細は、以前に詳細に説明されており、すべてのデータは公に利用可能である（Ananthakrishnanら、2014年、Franzosaら、2019年）。簡単に説明すると、PRISMは、内視鏡、放射線、組織学的分析からの標準的な基準に基づいて研究に選ばれた成人IBD患者（18歳以上）の前向きコホートである。コントロールは、事前に適格性を審査され、予約前に募集されます。コホートは合計155人（n=155）で構成され、そのうち34人が非IBDコントロール、53人がUC患者、68人がCD患者であった。サンプルは、男性74名、女性81名からなり、平均年齢は42歳（±16.9歳、標準偏差）であった。これらのサンプルの解析では、Franzosaら, 2019から得られたデータからの解析との整合性を図るため、また、成人のコホートであり、IBDの診断と治療は男女とも同じであることから、被験者の性別や年齢を考慮しなかった。本研究は、Partners HealthcareのInstitutional Review Boardの承認を得ており（文献2004-P-001067）、すべての患者からインフォームドコンセントを得ている。
方法詳細
細菌株と増殖条件
使用した菌株はすべてKey Resources Tableに記載されている。使用したBacteroides株は、いずれもB. ovatus ATCC 8483株とB. thetaiotaomicron VPI-5482株から作成したもので、それぞれtdk遺伝子の欠失を既報（Larsbrink et al, 2014, Martens et al, 2008）と同様に有している。バクテロイデス株を、1％ビタミンK1-ヘミン溶液（VitK/Hemin, Becton Dickinson）を添加した液体Brain Heart Infusion（BHI、Becton Dickinson）培地で、または1％VitK/Heminを添加したBHI寒天（Becton Dickinson）で37℃で嫌気性培養をした。培養は、20% CO2、5% H2、75% N2の雰囲気で37℃の嫌気性チャンバー（Coy Laboratory Products）内で増殖および操作された。R6K pir プラスミドの増殖および導入には、大腸菌 PIR2 (Invitrogen) 株および S17-1 λ pir 株をそれぞれ使用した。大腸菌はLuria-Bertani（LB）培地を用いて37℃で好気的に培養した。必要に応じて、アンピシリン100μg/mL、ゲンタマイシン200μg/mL、エリスロマイシン25μg/mLのような抗生物質を培地に添加した。
分子クローニング
本研究で使用したプラスミドは、Key Resources Tableに記載した。この研究で使用されたすべてのプライマーは、Integrated DNA Technologies (IDT) によって合成され、Key Resources Table にリストアップされている。クローニング手順およびコロニーPCRのためのDNA増幅は、Q5 High Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs)を用いて行った。プラスミドおよびBacteroides株に生じた遺伝子改変は、Sanger sequencing (Genewiz)により確認した。オーバーラップエクステンション（SOE）PCR（Bryksin and Matsumura, 2010）を利用してB. ovatus spt欠失構築物を作製し、その後、制限消化/ギブソンクローニング（HiFi DNA Assembly Master Mix, New England Biolabs）により、B. ovatus spt欠失構築物を得た。
B. thetaiotaomicron および B. ovatus における無標の染色体欠失
B. thetaiotaomicron Δtdk のセリンパルミトイル転移酵素遺伝子（spt）のインフレーム欠失は、対選択的対立遺伝子交換手順（Koropatkin et al.、2008）を用いて作製した。すなわち、上流700bp、SPT遺伝子の最初の291bp（BT_0870）、および1kbの下流配列を連結した2kb断片をIDTにより合成し、SPTのフレーム内欠失を検出した。sptのインフレーム欠失は、B. thetaiotaomicron Sptタンパク質の最初の97アミノ酸のみをコードしている。この2kb断片をプライマー対BT0870_Up700b_BamHI _FおよびBT0870_Down1kb_NotI_Rを用いて増幅し、自殺ベクターpExchange_tdk（UBCのハリー・ブルマー博士から入手）（Tamura et al, 2017）にライゲーションさせた。得られたpExchange_tdk_BT0870_DELベクターを大腸菌S17-1 λ pirにエレクトロポレーションし、B. thetaiotaomicron VPI-5482にコンジュゲートさせた。ゲンタマイシンおよびエリスロマイシンを含むBHI寒天培地プレートで単一組換え体を選択し、抗生物質なしで液体BHI培地で一晩培養し、200μg/mL 5-fluoro-2-deoxyuridine (FUdR) を含むBHI寒天培地にプレーティングした。spt欠失候補のシングルコロニーを診断用プライマーBT0870_Up1kb_FとBT0870_Down1150b_Rを用いたPCRにより確認した。B. ovatusのspt欠失変異体も同様の方法で作製した。簡単に言うと、B. ovatus sptの上流と下流に約900bpの断片がある。ovatus spt（BACOVA＿02588）をクローニングし、プライマー対ΔSPT Xba1-UPF（5'AGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3' ）、BamH1 UPR-（5'-GGCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCTG-3' ）を用いて融合させた。EcoR1-DNF (5'-GTTGTAAAACGACGGCCAGT-3') および HindIII-DNR (5'-GGCGTAATCATGGTCATAGC-3') を、それぞれ、pExchange_tdkにライゲーションさせた。得られたpExchange_tdk_BACOVA_02588_DELベクターを大腸菌S17-1 λ pirにエレクトロポレートし、B. ovatus ATCC 8483にコンジュゲートした。ゲンタマイシンおよびエリスロマイシンを含むBHI寒天プレート上で単一組換え体を選択し、液体BHIプラス培地［BHIに5％熱不活性化牛胎児血清、1％ビタミンK1-ヘミン溶液（Becton Dickinson）、1％微量ミネラル補充剤（ATCC）、1％ビタミン補充剤（ATCC）、2. 9 mM (+)-セロビオース (Becton Dickinson), 2.9 mMマルトース (Hardy Diagnostics), 5.8 mM D-(-)-Fructose (Sigma) and 2.8 mM L-Cysteine hydrochloride monohydrate (Sigma)] 抗生物質なしで一晩培養し、200 μg/mL FUdRを含むBHIプラス寒天プレートにプレーティングする。spt欠失候補のシングルコロニーをスクリーニングし、診断用プライマーBACOVA_02588 _Up1kb_F と BACOVA_02588 _Down1kb_R を用いたPCRにより確認した。
Sptの相補性
BT_1311 (rpoD; σ70)プロモーターの300塩基対をSPT遺伝子に接合して、構成的に発現するSPTコンストラクトを構築した。SPT遺伝子を保有するpNBU2ベクターのB. thetaiotaomicronゲノムへのシングルコピー導入およびゲノム挿入部位位置の決定は、以前に記載したように行った（Koropatkinら、2008年、Larsbrinkら、2014年、Martenら、2008年）。大腸菌S17-1 λ pirドナー株をアンピシリンを含むLB培地で1000倍に希釈し、BacteroidesレシピエントをBHI培地で250倍に希釈し、それぞれ指数関数期初期（OD600〜0.3）まで増殖させた一晩培養物を用意した。ドナー株とレシピエント株をドナー：レシピエントの培養量比1：1で合わせ、4,000rpmで5分間遠心分離し、1mLのBHI-VitK/Hemin液体培地に再懸濁し、非選択的BHIプラス寒天プレートに水たまりとして37℃で12時間好気的条件でプレーティングし抱合させた。交配芝からのバイオマスをゲンタマイシンおよびエリスロマイシンを含むBHIプラス寒天培地プレートにストリークし、コンジュガントを選択した。挿入部位の位置はPCRで確認した。
細菌培養細胞からのスフィンゴ糖脂質の単離および精製
B. ovatus Δtdk ATCC 8483, B. ovatus Δtdk ΔSPT ATCC 8483, B. thetaiotaomicron Δtdk VPI-5482, および B. thetaiotaomicron ΔSPT ATCC 8483 の細胞培養液からスフィンゴ糖脂質を単離・精製した。thetaiotaomicron Δtdk ΔSPT VPI-5482をビタミンK/ヘミン添加の1 LバッチBHIで培養し，収穫した細胞をCHCl3：MeOH：H2Oの1：2：0.8比で18時間抽出した（試薬はすべてSigma-Aldrichから購入）。その後、CHCl3とH2Oの2:1の比率を細胞懸濁液に加え、CHCl3:MeOH:H2Oの1:1:0.9の最終溶媒比とした。下層のクロロホルム相を除去し、この有機抽出物を乾燥させ、-20℃で保存し、後に所望の溶媒に再懸濁させた。CerPEの単離のために、粗抽出物は、CerPE移動標準C12 SPE（Avanti）とともに、CHCl3：MeOH：AcOH：H2Oを100：20：12：5の割合で流した2mmシリカ分取TLCプレート（Sigma-Aldrich）により精製された。細菌のCerPEは、C12スフィンゴシル-PE（Avanti）標準と等しい移行Rfとニンヒドリン（Sigma-Aldrich）による染色によって確認された。得られたCerPEスフィンゴ脂質画分を掻き取り切除し（Rf=0.35）、0.2mmTLCプレート（Sigma-Aldrich）上で上記と同様の分離溶媒と抽出技術を用いて再精製した。溶出した脂質は、ガラスバイアルに入れ、-20℃で乾燥保存した。
転写解析
培養したB. thetaiotaomicron VPI-5482 Δtdk および Δtdk Δspt の培養液を1.100 倍に希釈した。一晩の培養から、1％ビタミンK1-ヘミン（Becton Dickinson）または最小培地［1x M9塩（Teknova）、1％滅菌ろ過牛胎児血清（Sigma-Aldrich）を補充したBHI培地5mLに100を添加した。1％ビタミンK1-ヘミン溶液（Becton Dickinson）、1％微量ミネラル補足物（ATCC）、1％微量ビタミン補足物（ATCC）、1g／L D-(+)-セロビオース（Sigma-Aldrich）、1g／L D-(+)-マルトース（Sigma-Aldrich）、1g／L D-(+)-フラクトース（Sigma-Aldrich）および0. 5 g/L L-システイン (Sigma-Aldrich)]を添加し、嫌気条件下で指数期 (OD600 ∼ 0.4) まで増殖させた。各培養物を嫌気性チャンバー内でペレット化し、上清をデカントし、ペレットを500μL Trizolに再懸濁した。Trizol懸濁液は、約500μLの0.1mmシリカビーズ（BioSpec）を用いたビーズビートのステップを経た。RNAは、Direct-Zol RNA MiniPrep Plus (Zymo Research)を用いて、製造元の指示に従って抽出された。
RNA配列決定データの作成
イルミナcDNAライブラリーは、RNAtag-seqプロトコルの修正版（Shishkinら、2015）を用いて生成した。簡潔には、500ng〜1μgの総RNAを断片化し、ゲノムDNAを枯渇させ、脱リン酸化し、5'リン酸および3'ブロッキング基を有する既知の配列の5'-AN8-3'バーコードを有するDNAアダプターにライゲーションさせた。バーコード付きRNAをプールし、RiboZero rRNA depletion kit（Epicentre社）を用いてrRNAを除去した。バーコードRNAのプールは、主に2つのステップでIllumina cDNAライブラリに変換された。(i) SMARTScribe (Clontech) を用いたテンプレートスイッチングによるcDNAの3'末端へのアダプターの付加により、バーコード化アダプターの一定領域に設計されたプライマーを用いてRNAを逆転写する (Zajac et al., 2013)、(ii) PCR増幅する。2013）；（ii）5'末端が3'または5'アダプターの一定領域を標的とし、3'末端が完全なイルミナP5またはP7配列を含むプライマーを用いたPCR増幅。 cDNAライブラリーは、モノカルチャー転写データについてはイルミナNextSeqで、転写データについてはペアエンドリードを生成するためにイルミナHiSeq 2500プラットフォームで配列決定された。
RNAシークエンス解析
各サンプルからのシーケンスリードは、カスタムスクリプトを使用して、関連するバーコード配列に基づいてデマルチプレックスされました。バーコードのミスマッチは、そのリードを別のバーコードに割り当てることができない場合に限り、1つまで許容されました。バーコード配列は、テンプレートスイッチング中にSMARTScribeによって追加された可能性のある2番目のリードの末端Gと同様に、最初のリードから削除されました。Burrows-Wheeler Alignment tool (BWA)を用いてリードのアラインメントを行い、カスタムスクリプトを用いてリードカウントを遺伝子や他のゲノム機能に割り当てた。差分発現解析はedgeR (Robinson et al., 2010)を用いて実施した。ゲノム配列と遺伝子アノテーションに関連した生シーケンスデータおよびカバレッジプロットの可視化は、GenomeViewを使用して実施された。
電子顕微鏡観察
B. thetaiotaomicron および B. ovatus の WT および ΔSPT 培養物を、ヘミンおよびビタミン K を添加した 5 mL の BHI で 24 時間培養した。得られた培養物の密度を規格化した。細胞は、カーボンフィルムでコーティングされた新鮮なイオン化 EM グリッドに吸着させた。グリッドを0.5%モリブデン酸アンモニウムでネガテイブ染色した。FEI Technai Spirit透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて、30,000倍および49,000倍の倍率で試料を観察した。
バクテリアカクテルの調製と植菌
嫌気性チャンバーにおいて，凍結ストックからの細菌培養物をまずヘミンとビタミンKを添加したBHI上にプレーティングし，その後，純粋な培養物を選択し，滅菌還元リン酸緩衝塩水（PBS）中で1：1の比率で混合した．PBS中の細菌混合物を嫌気チャンバーから取り出し、直ちに動物施設に輸送し、経口投与実験を行った。マウス1匹あたりが受ける混合液の量は100μLで、109cells/mLの濃度とした。細胞/mLでの混合物の濃度はUVスペクトロメーターを用いて測定し、接種物をバックタイトリングすることにより、ガベージの投与量を確認した。
フローサイトメトリー
sIgA結合菌の定量には、約109 cells/mLのBacteroidesを含む10 mgの便の希釈液を、PBS中の2%ウシ血清アルブミン（BSA）中の抗マウスIgA（eBioscience）の1/50希釈液で氷上染色をした。細菌培養物をPBSで洗浄し、CytoFLEX（Beckman-Coulter）でCellQuestおよびFlowJoバージョン11のソフトウェアパッケージを使用して解析した。宿主免疫細胞プロファイリングのために、マウスあたり約10万個の細胞を、CD45、CD3_25B、CD4、CD8、CD38、CD11b、CD11c、F4/80、およびγδTCR（eBioscience）に対する蛍光色素標識抗体で染色し、それらの集団をLSR IIフローサイトメーター（BD Biosciences）、CytofLEX（Beckman-Coulter）によって、CellQuestおよびFlowJo version 11からソフトウェアパッケージを使用して分析した。
上皮内リンパ球および腸管固有層のリンパ球の分離
マウスの回腸と遠位結腸を約5cm切除し、付着脂肪とパイエル板を除去した後、組織を縦に切断し、さらに氷冷PBSで洗浄して管腔内内容物を除去した。上皮細胞は、1mM EDTA、1mM DTT、5% FBSを含むPBSバッファーを用いて、37℃で10分間振盪して単離した。上皮内リンパ球（IEL）を分離するために、無傷の腸組織を、1 mM EDTA、1 mM DTTおよび5% FBSを含む追加のPBS緩衝液に再懸濁し、37℃で20分間振盪した。残った組織を1μg/mL DNaseと0.5mg/mLコラゲナーゼで37℃、30分間消化し、層状突起リンパ球（LPLs）を精製した。消化後、リンパ球は40％パーコール勾配でさらに精製し、5％FBS入りRPMI1640に再懸濁し、血球計で計数した。
サイトカインプロファイリング
ex vivoでのサイトカイン分泌量を定量するために、小腸上皮を完全な組織培養培地（RPMI、10％FBS、1％グルタミン、1：1ペニシリン／ストレプトマイシン）で洗浄し、1mLの同培地を用いて24穴プレートで37℃、5％炭酸ガスで24時間培養を行った。得られた上清を用い、マウス特異的ELISAキット（BD Biosciences社製）およびCBA flexセット（BD Biosciences社製）を用いて、標準曲線に対する各サイトカインの量を製造者の推奨に従って測定した。
RT-qPCR
マウス大腸組織からRNAを抽出し、RNeasyキット（Qiagen）を用いてさらに精製し、1μgを用いてiScript合成キット（Bio-Rad）を用いてcDNAを作製した。その後、SYBR Green Super mix（Bio-Rad）を用いてqPCRを実施した。各サンプルは、総量10μLで、以下の構成のPCRプログラムを用いて実行した：95℃での初期変性10分間、95℃15秒および60℃1分間の40サイクル、72℃10分間の最終伸長。各遺伝子に使用したプライマーは、Key Resources Tableに記載されている。
組織学および免疫組織化学的解析
マウスの回腸と結腸から長さ1cmの腸管切片を採取し、直ちに10％緩衝ホルマリンに室温で一晩浸漬した。パラフィン包埋組織を5μmのスライスに切り、標準的な手法でヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色した。H&E染色した組織を光学顕微鏡で可視化し、顕微鏡ソフトウェアとImageJを用いて、組織の各ヴィラス長およびクリプト深さを列挙した。粘液糖の可視化のために，パラフィン包埋組織を5 μmのスライスに切り出し，標準的な手法でAlcan blue-periodic acid（AB-PAS）染色を行った．免疫組織化学のために、組織切片は標準的な方法で焼成、脱パラフィン、染色、洗浄を行った。Ki67は、BioLegendから購入した抗Ki67抗体の1/80希釈液を使用して可視化した（652402）。F4/80 は、Abcam (ab6640) から購入した抗 F4/80 抗体の 1/75 希釈液で可視化した。
マウス大腸スフェロイド培養
C57BL/6Nマウスから大腸陰窩を単離し、以前に記載されたように培養した（Miyoshi and Stappenbeck, 2013）。簡単に言えば、陰窩は、PBS中の8mM EDTA中で結腸組織を4℃で60分間インキュベートし、続いてピペッティングによって組織を手動で破壊することによってマウスから単離した。陰窩は15μlのマトリゲル基底膜（Corning）にプレーティングし、50％のL-WRN調整培地（20％FBS、GlutaMAX、およびペニシリン-ストレプトマイシンを補充した高度DMEM F-12で希釈したL-WRN調整培地）中で維持された。培地は2日ごとに交換し、スフェロイドは3-4日ごとに継代した。
2次元マウス腸管単層培養
2Dマウス腸単層培養は、以前に記載されている（Mohananら、2018、Moonら、2014）。簡潔には、3日目の結腸スフェロイドをTrypLE Expressを用いて単細胞に解離させ、70μmのフィルターを通して10μM Y27632（R＆D Systems）を含む50％L-WRN調整培地に通過させた。3x105個の細胞を、PBSで希釈した1:40マトリゲルでコーティングした24ウェルのトランスウェルインサート（Costar、#3470）上にプレーティングした。150μLの培地を上部コンパートメントに、600μLの培地を下部コンパートメントに添加した。24時間後、両方のコンパートメントの培地を50%L-WRN培地に交換した。さらに24時間後、培地を5%L-WRN培地に交換し、分化を誘導した。培地は毎日交換し、単層は最大5日間維持された。
上皮貫通電気抵抗の測定
オーム計（EVOM2, World Precision instruments）を用いて、単層膜の電気抵抗を測定した。抵抗値は、オーム（Ω）単位で測定し、ブランクインサートの経上皮電気抵抗（TEER）値を差し引き、その差にトランスウェルインサートの成長表面積を乗じることで得た。
カルシウムキレートアッセイ
上記のように、単層を播種してから48時間後に、上下の区画の培地を5％L-WRN調整培地で置き換えた。5%L-WRN培地で16時間インキュベートした後、モノレイヤーを、上部コンパートメント培地に2mM EDTAを8分間加えることによって処理し、その後培地を5%L-WRN培地に置き換えた。TEERはアッセイ中、繰り返し測定された。
リピドームプロファイリング
B. thetaiotaomicronとB. ovatusのWTおよびΔSPT培養物を、ビタミンKとヘミンを添加した5mLのBHI液体培地で培養した。24時間後、培養液をOD600で規格化し、8,000 rpmで10分間遠心分離して細胞をペレット化した。得られたペレットを洗浄し、さらに2回遠心分離して残留培地を除去した。得られたペレットを5 mL イソプロパノール + 0.1 ng/μL C24:0 PCに再懸濁し、RTで1時間インキュベートし、10,000gで10分間遠心分離した。各サンプルから2μLをQ-Exactive Focusにインジェクションした。並行して、B. thetaiotaomicron WTまたはΔSPT変異体でコロニー形成した無菌マウスの糞便サンプルを秤量し、各湿重量サンプル20 mgを200 μL isopropanol + 0.1 ng/μL C24:0 PCで抽出、RTで1時間インキュベート、10,000gで10分間遠心分離した。各サンプルから2μLをQ-Exactive Focusにインジェクションした。これらの糞便内容物からのサンプルは、バクテリアペレットからの代謝物強度に中央値でスケーリングされました。脂質抽出物は、Exactive Plus orbitrap質量分析計（Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA）に連結したNexera X2 U-HPLC（Shimadzu, Marlborough, MA）を用いて分析した。抽出物 (10μL) を ACQUITY UPLC BEH C8 カラム (1.7μm, 2.1 × 100 mm; Waters; Milford, MA) に注入した。カラムは、まず80%移動相A (95:5:0.1 vol/vol 10mM ammonium acetate/methanol/formic acid) を450μL/minの流速で1分間、次に80%移動相B (99.9:0.1 vol/vol methanol/formic acid) へ2分間で線形グラジエント、100%移動相Bへ7分で線形グラジエント、さらに100%移動相Bで3分間溶出させた。質量分析（MS）分析は、エレクトロスプレーイオン化法によるポジティブイオンモード（ソース電圧3kV、ソース温度300℃、シースガス50.0、補助ガス15）で、m/z 200〜1100にわたるフルスキャン分析、分解能70000で実施した。代謝物の同定は、参照標準とMS/MSピークを使用して確認しました。生データは、TraceFinder 3.1 (Thermo Fischer) と Progenesis QI (Nonlinear dynamics) を使用して処理されました。タンデム質量分析は、Q Exactive Plus ハイブリッド四重極オービトラップ質量分析計 (Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA) を使用して収集しました。Parallel Reaction Monitoring (PRM) を使用して、MS/MSは関心のあるすべての質量で収集された。使用したコリジョンエネルギーは10、20、30、40、50であった。分離ウィンドウは1.0 m/zで、分解能は35,000であった。
アラニンラベリング
B. thetaiotaomicronとB. ovatusのWTおよびΔSPT培養物を、10μMの重水素（D4）標識アラニン（Sigma）または10μMの非標識アラニン（Sigma）を添加した5mLの最小培地［M9 salts (Teknova), 1% vitamin K1-hemin solution (Becton Dickinson), 1% trace mineral supplement (ATCC), 1% trace vitamin supplement (ATCC), 2% lactose］中で生育させた。） 48時間後、得られた培養物を8,000rpm、10分間の遠心分離によってペレット化し、細胞密度を正規化した。脂質はイソプロパノールで抽出し、リピドミクス解析に回した。
定量と統計解析
統計解析
2つの処理群間の差の統計的有意性は、特に断らない限り、両側Studentのt検定またはMann-Whitney U検定（ノンパラメトリックデータの場合）を用いて算出した。メタボローム解析およびRNA-seq解析については、Hochberg-Benjamini手順を用いた偽発見率（FDR）解析により統計的有意性を決定した。3つ以上のグループ間の統計的有意性を評価するために、一元配置分散分析およびポストホックTukey's検定を利用した。各図の説明で報告されている「n」数は、マウス、ヒト、培養単層細胞研究の生物学的複製を意味する。統計解析は、R-Studio、Metaboanalyst version 4.0 または GraphPad Prism version 7.0 の支援を受けて実施した。統計的有意性は、＊＊p値＜0.001；＊＊p値＜0.01；＊＊p値＜0.05；NS（有意ではない）p値＞0.05で与えた。結果は、特に断りのない限り、平均値および平均値の標準誤差（SEM）で表した。
データおよびソフトウェアの利用可能性
メタボロミクスデータは、NIH Common Fund's Metabolomics Data Repository and Coordinating Center (supported by NIH grant, U01-DK097430) website, the Metabolomics Workbench, http://www.metabolomicsworkbench.org, where it has been assigned Project ID PR000754.で入手可能です。データは、プロジェクトDOI: 10.21228/M8709G から直接アクセスできます。MS/MSスペクトルライブラリは、The Global Natural Product Social Molecular Networking (GNPS) データベースに寄託され、そのプロジェクト MassIVE ID MSV000083552, doi:10.25345/C5862T で一般に公開されています。RNA-sequencingデータはSequence Read Archive (SRA)にアップロードされ、プロジェクトID PRJNA517943で公開されている。処理したRNA-sequencingとメタボロミクスデータは補足資料（Data S1、S2、S3、S4、S5）に掲載されています。
謝辞
B. ovatus株を提供してくださったHarry Brumer博士、B. thetaiotaomicron株を提供してくださったThomas Cullen氏とEric Martens氏に感謝する。また、JoslinおよびUBCの動物施設には無菌マウス実験を円滑に進めるための協力を、Massachusetts General HospitalのPRISM IBDコホートには研究への参加を、Theresa Reimelsには原稿を改善するために文章と図の編集を、Jonathan LivnyとBroad Institute Microbial 'Omics CoreにはRNA配列データを作成してもらったことに感謝する。E.M.B.はCanadian Institutes of Health (CIHR) のポストドクトラルフェローシップの支援を受けています。A.D.K.は、Smith Family Foundation Award for Excellence in Biomedical ResearchとAmerican Diabetes Association Pathway to Stop Diabetes Initiator Awardによる資金援助を受けています。B.B.F.はCIHRの助成金によって資金援助を受けている。R.J.X.は、National Institutes of Health (P30 DK043351, R24 DK110499, and R01 AT009708), the Crohn's and Colitis Foundation of America, and the Center for Microbiome Informatics and Therapeutics at MITから資金援助を受けています。
著者協力
E.M.B.、R.J.X.、X.K.、D.H.は実験の構想・設計を行った。E.M.B.、X.K.、S.J.、N.W.、T.N.、D.H.、N.F、T.D.A、および C. Heimは、実験を行った。E.M.B., X.K., D.H., E.A.F., S.J., J.A.-P., T.N., N.F.はデータを解析した。C. Huttenhower, H.V., G.D., J.A.P., D.B.G., H.J.H., B.B.F., A.D.K., C.B.C., and R.J.X. supervised the project.C.Huttenhower.は、このプロジェクトを監督した。E.M.B.とR.J.X.は論文を執筆した。
利害関係の宣言
R.J.XはNovartisおよびNestleのコンサルタントである。
補足情報
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ドキュメントS1. 図S1～S7、表S1、S2
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データS1. PRISMコホートにおける便からのメタボローム解析、図1および図7に関連するもの
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データS2. RNA-Seq：ミニマルおよびBHI培地、図2関連
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データS3. 細菌メタボロミクス。最小限の培地とBHI培地、図4、5、6関連
.xlsxのダウンロード (4.78 MB)
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データS4. メタボロミクス。無菌マウス、図4および図5関連
.xlsxのダウンロード (.54 MB)
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データS5. D4-アラニン標識、図6関連
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出版履歴
掲載されました。2019年5月8日（木
受理されました。2019年4月2日（木
改訂版で受理 2019年2月19日（木
受理されました。2018年11月6日（木
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図のサムネイル gr1
図1宿主産生スフィンゴ脂質の増加がIBDの便中における最も重要な代謝物シグネチャーである。
図1.gr2
図2B. thetaiotaomicronのセリンパルミトイル基転移酵素の遺伝子欠損によるスフィンゴ糖脂質欠乏菌の発生
図3.サムネイルgr3
図3スフィンゴ脂質欠損B. thetaiotaomicron株の無菌マウスへの単独コロニー形成による腸内炎症とバリア機能障害
図サムネイル gr4
図4B. thetaiotaomicronの単コロニー化が宿主のセラミドプールを大きく変化させた例
図5リピドミクス解析
図5リピドミクス解析による腸内セリンパルミトイル基転移酵素に依存した菌体脂質の広範な変化と洞察
図のサムネイルgr6
図6バクテロイデスで最も豊富なスフィンゴ糖代謝産物の特徴から推定されるスフィンゴ糖脂質生合成経路
図サムネイルgr7
図7バクテロイデスのスフィンゴ糖脂質はIBD発症時に有意に減少し、腸管炎症と負の相関がある。
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